CN107847526A - 用于预防上皮细胞的增殖和上皮‑间充质转换的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了预防或减少上皮细胞的增殖和上皮‑间充质转换(EMT)的胎儿支持组织的组合物和制剂，其中所述上皮细胞可以是人上皮细胞，并且所述人上皮细胞可以是结膜、视网膜、角膜、角膜缘或肾上皮细胞。还提供了预防或减少有需要的个体中上皮细胞的增殖、细胞迁移和EMT的方法，其中所述上皮细胞可以是人上皮细胞，并且所述人上皮细胞可以是结膜、视网膜、角膜、角膜缘或肾上皮细胞。还提供了预防或治疗有需要的个体中的增生性玻璃体视网膜病变的方法。

Description

用于预防上皮细胞的增殖和上皮-间充质转换的组合物和 方法

交叉引用

本申请要求2015年5月20日提交的美国临时申请号62/164,281的权益和优先权，该美国临时申请通过引用以其全文并入本文。

发明内容

在某些实施方案中，本文公开了用于预防或减少有需要的个体中上皮细胞的增殖、细胞迁移或上皮-间充质转换(EMT)的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的组合物，该组合物包含：(a)胎儿支持组织的制剂；和(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体，从而预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移或EMT，其中所述上皮细胞不是视网膜色素上皮细胞。在一些实施方案中，EMT与除了增生性玻璃体视网膜病变(PVR)以外的疾病或病症有关。在一些实施方案中，EMT与选自癌症、增生性糖尿病视网膜病变、纤维化病变和角膜后膜的疾病或病症有关。在一些实施方案中，该胎儿支持组织选自：胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水及其组合。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是冷冻的或预先冷冻的。在一些实施方案中，该上皮细胞选自结膜上皮细胞、角膜上皮细胞、角膜缘上皮细胞和肾上皮细胞。在一些实施方案中，该上皮细胞是人上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是视网膜色素上皮细胞(RPE)。在一些实施方案中，该人上皮细胞是结膜上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是角膜上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是角膜缘上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是肾上皮细胞。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂是胎儿支持组织的提取物、匀浆、粉末、颗粒化的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、纯化的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，该组合物是凝胶、溶液或悬浮液。在一些实施方案中，该组合物是可注射形式。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含基本分离的HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂由基本分离的HC-HA/PTX3组成。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含重建的HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含通过共价键与间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)的重链交联的高分子量透明质酸(HA)，所述高分子量HA具有大于1000kDa的分子量。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含五聚环蛋白3(PTX-3)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含肿瘤坏死因子刺激的基因6蛋白(TSG-6)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含血小板反应蛋白-1(TSP-1)。在一些实施方案中，该组合物中总蛋白质与HA之比在500份蛋白质:1份HA与500份HA:1份蛋白质之间。在一些实施方案中，该组合物通过阻碍生长因子与细胞因子的作用来预防上皮细胞的增殖和EMT。在一些实施方案中，该生长因子和细胞因子选自：EGF、FGF-2、PDGF-A、PDGF-AB、PDGF-B、PDGF-C、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、CTGF、HGF、IGF-1、G-CSF、IL-6、MCP-1、TNF-α、VEGF和IFN-γ。在一些实施方案中，该组合物进一步包含水性佐剂。在一些实施方案中，该组合物用于局部施用。在一些实施方案中，该组合物被配制用于注射。在一些实施方案中，该组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射(sub-Tenon's injection)。

在某些实施方案中，本文公开了用于治疗或预防有需要的个体中的增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的可注射组合物，该组合物基本上由以下成分组成：(a)基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合；和(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体，从而治疗或预防PVR。在一些实施方案中，该组合物由以下成分组成：(a)基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合；和(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。在一些实施方案中，该组合物由重建的HC-HA/PTX3和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体组成。在一些实施方案中，该组合物由基本分离的HC-HA/PTX3和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体组成。在一些实施方案中，该基本分离的HC-HA/PTX3从胎儿支持组织中分离，所述胎儿支持组织选自：胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水及其组合。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是冷冻的或预先冷冻的。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人、非人灵长类动物、牛或猪的胎儿支持组织。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人胎儿支持组织。在一些实施方案中，基本分离的HC-HA/PTX3通过超速离心从胎儿支持组织中分离。在一些实施方案中，该治疗有效量有效地预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移或EMT。在一些实施方案中，该上皮细胞是视网膜色素上皮细胞(RPE)。在一些实施方案中，该上皮细胞是人上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是视网膜上皮细胞。在一些实施方案中，所述可注射组合物是凝胶、溶液或悬浮液。在一些实施方案中，该组合物包含通过共价键与间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)的重链交联的高分子量透明质酸(HA)，所述高分子量HA具有大于1000kDa的分子量。在一些实施方案中，该组合物包含五聚环蛋白3(PTX-3)。在一些实施方案中，该组合物包含肿瘤坏死因子刺激的基因6蛋白(TSG-6)。在一些实施方案中，该可注射组合物中总蛋白质与HA之比在500份蛋白质:1份HA与500份HA:1份蛋白质之间。在一些实施方案中，该可注射组合物通过抑制或阻止一种或多种生长因子或细胞因子的活性来预防上皮细胞的增殖和EMT。在一些实施方案中，该生长因子和细胞因子选自：EGF、FGF-2、PDGF-A、PDGF-AB、PDGF-B、PDGF-C、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、CTGF、HGF、IGF-1、G-CSF、IL-6、MCP-1、TNF-α、VEGF和IFN-γ。在一些实施方案中，该可注射组合物进一步包含水性佐剂。在一些实施方案中，该可注射组合物用于局部施用。在一些实施方案中，该可注射组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射。在一些实施方案中，该组合物被配制用于玻璃体内注射。

在某些实施方案中，本文公开了用于治疗或预防有需要的个体中的增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的可注射组合物，该组合物基本上由以下成分组成：(a)基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合；(b)附加治疗剂；和(c)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体，从而治疗或预防PVR。在一些实施方案中，该组合物由以下成分组成：(a)基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合；(b)附加治疗剂；和(c)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。在一些实施方案中，该附加治疗剂是用于治疗PVR的附加药剂。在一些实施方案中，该附加治疗剂选自：口服异维甲酸、玻璃体内曲安奈德、雷珠单抗、贝伐珠单抗、达沙替尼、哌加他尼钠、N-乙酰-半胱氨酸(NAC)、吡格列酮、葡糖胺、染料木苷、格尔德霉素、法舒地尔、白藜芦醇、肝细胞生长因子(HGF)、BMP-7、LY-364947、薯蓣皂苷配基、大黄素、己酮可可碱、双嘧达莫、过氧化物酶体增殖性激活受体-γ(PPARγ)激动剂、雌性激素和抗氧化剂(oral Accutane,intravitrealtriamcinolone acetonide,ranibizumab,bevacizumab,dasatinib,pegaptanib sodium,N-acetyl-cysteine(NAC),pioglitazone,glucosamine,genistin,geldanamycin,fausdil,resveratrol,hepatocyte growth factor(HGF),BMP-7,LY-364947,diosgenin,emodin,pentoxyfilline,dipyridamole,a peroxisome proliferative-activatedreceptor-gamma(PPARγ)agonist,a female sex hormone,and an antioxidant)。在一些实施方案中，该雌性激素包含雌二醇或孕酮。在一些实施方案中，该抗氧化剂包含β胡萝卜素、维生素C、维生素E、叶黄素、玉米黄质(zeaxanthin)和ω-3脂肪酸。在一些实施方案中，该附加治疗剂是用于治疗炎症的附加药剂。在一些实施方案中，该组合物由以下成分组成：(a)基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合；(b)附加治疗剂；和(c)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。在一些实施方案中，该组合物由重建的HC-HA/PTX3、附加治疗剂和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体组成。在一些实施方案中，该组合物由基本分离的HC-HA/PTX3、附加治疗剂和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体组成。在一些实施方案中，该基本分离的HC-HA/PTX3从胎儿支持组织中分离，该胎儿支持组织选自：胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水及其组合。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是冷冻的或预先冷冻的。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人、非人灵长类动物、牛或猪的胎儿支持组织。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人胎儿支持组织。在一些实施方案中，基本分离的HC-HA/PTX3通过超速离心从胎儿支持组织中分离。在一些实施方案中，该组合物进一步包含附加治疗剂。在一些实施方案中，该治疗有效量有效地预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移或EMT。在一些实施方案中，该上皮细胞是视网膜色素上皮细胞(RPE)。在一些实施方案中，该上皮细胞是人上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是视网膜上皮细胞。在一些实施方案中，所述可注射组合物是凝胶、溶液或悬浮液。在一些实施方案中，该组合物包含通过共价键与间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)的重链交联的高分子量透明质酸(HA)，所述高分子量HA具有大于1000kDa的分子量。在一些实施方案中，该组合物包含五聚环蛋白3(PTX-3)。在一些实施方案中，该组合物包含肿瘤坏死因子刺激的基因6蛋白(TSG-6)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含血小板反应蛋白-1(TSP-1)。在一些实施方案中，该可注射组合物中总蛋白质与HA之比在500份蛋白质:1份HA与500份HA:1份蛋白质之间。在一些实施方案中，该可注射组合物通过抑制或阻止一种或多种生长因子或细胞因子的活性来预防上皮细胞的增殖和EMT。在一些实施方案中，该生长因子和细胞因子选自：EGF、FGF-2、PDGF-A、PDGF-AB、PDGF-B、PDGF-C、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、CTGF、HGF、IGF-1、G-CSF、IL-6、MCP-1、TNF-α、VEGF和IFN-γ。在一些实施方案中，该可注射组合物进一步包含水性佐剂。在一些实施方案中，该可注射组合物用于局部施用。在一些实施方案中，该可注射组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射。在一些实施方案中，该组合物被配制用于玻璃体内注射。

在某些实施方案中，本文公开了用于治疗或预防有需要的个体中的增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的可注射组合物，该组合物包含：含有HC-HA/PTX3和胎儿支持组织的至少另外一种组分的胎儿支持组织的制剂；和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体，从而治疗或预防PVR。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水或其组合。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是冷冻的或预先冷冻的。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人、非人灵长类动物、牛或猪的胎儿支持组织。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人胎儿支持组织。在一些实施方案中，该治疗有效量是有效地预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移或EMT的量。在一些实施方案中，该上皮细胞是视网膜色素上皮细胞(RPE)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂是胎儿支持组织的提取物、微粒化的胎儿支持组织、匀浆、粉末、颗粒化的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、纯化的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，该组合物是凝胶、溶液或悬浮液。在一些实施方案中，该组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射。

在某些实施方案中，本文公开了用于预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移和/或上皮-间充质转换(EMT)的组合物，其包含：(a)胎儿支持组织的制剂；和(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体，其中所述上皮细胞不是视网膜色素上皮细胞。在一些实施方案中，EMT与除了增生性玻璃体视网膜病变以外的疾病或病症有关。在一些实施方案中，EMT与选自癌症、增生性糖尿病视网膜病变、纤维化病变和角膜后膜的疾病或病症有关。在一些实施方案中，该胎儿支持组织选自：胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水以及其组合。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是冷冻的或预先冷冻的。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人、非人灵长类动物、牛或猪的胎儿支持组织。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人胎儿支持组织。在一些实施方案中，该组合物处于预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移或EMT的治疗有效量。在一些实施方案中，该上皮细胞选自结膜上皮细胞、角膜上皮细胞、角膜缘上皮细胞和肾上皮细胞。在一些实施方案中，该上皮细胞是人上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是视网膜色素上皮细胞(RPE)。在一些实施方案中，该人上皮细胞是结膜上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是角膜上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是角膜缘上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是肾上皮细胞。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂是胎儿支持组织的提取物、微粒化的胎儿支持组织、匀浆、粉末、颗粒化的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织或纯化的HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，该组合物是凝胶、溶液或悬浮液。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含基本分离的HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂由基本分离的HC-HA/PTX3组成。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含重建的HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含通过共价键与间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)的重链交联的高分子量透明质酸(HA)，所述高分子量HA具有大于1000kDa的分子量。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含五聚环蛋白3(PTX-3)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含肿瘤坏死因子刺激的基因6蛋白(TSG-6)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含血小板反应蛋白-1(TSP-1)。在一些实施方案中，该可注射组合物中总蛋白质与HA之比在500份蛋白质:1份HA与500份HA:1份蛋白质之间。在一些实施方案中，该可注射组合物通过抑制生长因子与细胞因子的作用来预防上皮细胞的增殖和EMT。在一些实施方案中，该生长因子和细胞因子选自：EGF、FGF-2、PDGF-A、PDGF-AB、PDGF-B、PDGF-C、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、CTGF、HGF、IGF-1、G-CSF、IL-6、MCP-1、TNF-α、VEGF和IFN-γ。在一些实施方案中，该可注射组合物进一步包含水性佐剂。在一些实施方案中，该可注射组合物用于局部施用。在一些实施方案中，该组合物被配制用于注射。在一些实施方案中，该可注射组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射。

在某些实施方案中，本文公开了用于治疗或预防增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的可注射组合物，其包含：(a)基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合；和(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。在一些实施方案中，该组合物由以下成分组成：(a)基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合；和(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。在一些实施方案中，该组合物由重建的HC-HA/PTX3和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体组成。在一些实施方案中，该组合物由基本分离的HC-HA/PTX3和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体组成。在一些实施方案中，该基本分离的HC-HA/PTX3从胎儿支持组织中分离，该胎儿支持组织选自：胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水以及其组合。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是冷冻的或预先冷冻的。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人、非人灵长类动物、牛或猪的胎儿支持组织。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人胎儿支持组织。在一些实施方案中，基本分离的HC-HA/PTX3通过超速离心从胎儿支持组织中分离。在一些实施方案中，所述可注射组合物处于预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移或EMT的治疗有效量。在一些实施方案中，该上皮细胞是视网膜色素上皮细胞(RPE)。在一些实施方案中，该上皮细胞是人上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是视网膜上皮细胞。在一些实施方案中，所述可注射组合物是凝胶、溶液或悬浮液。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含通过共价键与间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)的重链交联的高分子量透明质酸(HA)，所述高分子量HA具有大于1000kDa的分子量。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含五聚环蛋白3(PTX-3)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含肿瘤坏死因子刺激的基因6蛋白(TSG-6)。在一些实施方案中，该可注射组合物中总蛋白质与HA之比在500份蛋白质:1份HA与500份HA:1份蛋白质之间。在一些实施方案中，该可注射组合物通过抑制或阻止生长因子和/或细胞因子的活性来预防上皮细胞的增殖和EMT。在一些实施方案中，该生长因子和细胞因子选自：EGF、FGF-2、PDGF-A、PDGF-AB、PDGF-B、PDGF-C、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、CTGF、HGF、IGF-1、G-CSF、IL-6、MCP-1、TNF-α、VEGF和IFN-γ。在一些实施方案中，该可注射组合物进一步包含水性佐剂。在一些实施方案中，该可注射组合物用于局部施用。在一些实施方案中，该可注射组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射。

在某些实施方案中，本文公开了用于治疗或预防增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的可注射组合物，其基本上由以下成分组成：(a)基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合；(b)附加治疗剂；和(c)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。在一些实施方案中，该组合物由以下成分组成：(a)基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合；(b)附加治疗剂；和(c)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。在一些实施方案中，该组合物由重建的HC-HA/PTX3、附加治疗剂和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体组成。在一些实施方案中，该组合物由基本分离的HC-HA/PTX3、附加治疗剂和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体组成。在一些实施方案中，该基本分离的HC-HA/PTX3从胎儿支持组织中分离，该胎儿支持组织选自：胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水以及其组合。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是冷冻的或预先冷冻的。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人、非人灵长类动物、牛或猪的胎儿支持组织。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人胎儿支持组织。在一些实施方案中，基本分离的HC-HA/PTX3通过超速离心从胎儿支持组织中分离。在一些实施方案中，该附加治疗剂选自：口服异维甲酸、玻璃体内曲安奈德、雷珠单抗、贝伐珠单抗、达沙替尼、哌加他尼钠、N-乙酰-半胱氨酸(NAC)、吡格列酮、葡糖胺、染料木苷、格尔德霉素、法舒地尔(fausdil)、白藜芦醇、肝细胞生长因子(HGF)、BMP-7、LY-364947、薯蓣皂苷配基、大黄素、己酮可可碱、双嘧达莫、过氧化物酶体增殖性激活受体-γ(PPARγ)激动剂、雌性激素和抗氧化剂。在一些实施方案中，该雌性激素包含雌二醇或孕酮。在一些实施方案中，该抗氧化剂包含β胡萝卜素、维生素C、维生素E、叶黄素、玉米黄质和ω-3脂肪酸。在一些实施方案中，所述可注射组合物处于预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移或EMT的治疗有效量。在一些实施方案中，该上皮细胞是视网膜色素上皮细胞(RPE)。在一些实施方案中，该上皮细胞是人上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是视网膜上皮细胞。在一些实施方案中，所述可注射组合物是凝胶、溶液或悬浮液。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含通过共价键与间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)的重链交联的高分子量透明质酸(HA)，即具有大于1000kDa的分子量的高分子量HA。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含五聚环蛋白3(PTX-3)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含肿瘤坏死因子刺激的基因6蛋白(TSG-6)。在一些实施方案中，该可注射组合物中总蛋白质与HA之比在500份蛋白质:1份HA与500份HA:1份蛋白质之间。在一些实施方案中，该可注射组合物通过抑制或阻止生长因子和/或细胞因子的活性来预防上皮细胞的增殖和EMT。在一些实施方案中，该生长因子和细胞因子选自：EGF、FGF-2、PDGF-A、PDGF-AB、PDGF-B、PDGF-C、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、CTGF、HGF、IGF-1、G-CSF、IL-6、MCP-1、TNF-α、VEGF和IFN-γ。在一些实施方案中，该可注射组合物进一步包含水性佐剂。在一些实施方案中，该可注射组合物用于局部施用。在一些实施方案中，该可注射组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射。

在某些实施方案中，本文公开了用于治疗或预防增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的可注射组合物，其包含：含有HC-HA/PTX3和胎儿支持组织的至少另外一种组分的胎儿支持组织的制剂；和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体；其中所述组合物适合于注射。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水或其组合。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是冷冻的或预先冷冻的。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人、非人灵长类动物、牛或猪的胎儿支持组织。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是人胎儿支持组织。在一些实施方案中，该组合物的量有效地预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移或EMT。在一些实施方案中，该上皮细胞是视网膜色素上皮细胞(RPE)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂是胎儿支持组织的提取物、微粒化的胎儿支持组织、匀浆、粉末、颗粒化的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、纯化的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，所述组合物是凝胶、溶液或悬浮液。在一些实施方案中，该组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射。

附图说明

图1示出了EMT调节中的信号传导途径，其中具有或不具有生长因子引起的增殖。

图2A-图2D示出了HC-HA/PTX3形成和从人AME中纯化的HC-HA/PTX3的表征。图2A提供了HC-HA/PTX3形成的示意图。图2B示出了从人AME中纯化的HC-HA/PTX3。图2C示出了从AME中纯化的HC-HA/PTX3包含HC1。图2D示出了从AME中纯化的HC-HA/PTX3包含PTX3。

图3A-图3B示出了在LEPC/LNC中，固定化的HC-HA/PTX3抑制典型Wnt信号传导，而不抑制非典型Wnt信号传导。图3A示出了在人角膜缘上皮祖细胞(LEPC)和角膜缘龛细胞(LNC)中，HC-HA/PTX3下调典型Wnt信号传导。图3B示出了在基质胶(Matrigel)或固定化HC-HA/PTX3上接种的β-联蛋白和C-JUN的免疫染色。

图4A-图4D示出了在人角膜成纤维细胞(HCF)中TGF-β和TGF-β受体的表达。图4A示出了在添加和不添加外源性TGF-β1的情况下，在接种于塑料、HA或HC-HA/PTX3上的人角膜成纤维细胞(HCF)中的TGF-β1表达。图4B示出了在添加和不添加外源性TGF-β1的情况下，在接种于塑料、HA或HC-HA/PTX3上的HCF中的TGF-β2表达。图4C示出了在添加和不添加外源性TGF-β1的情况下，在接种于塑料、HA或HC-HA/PTX3上的HCF中的TGF-β3表达。图4D举例说明了Northern印迹，其显示了在添加和不添加外源性TGF-β1的情况下，在接种于塑料、HA或HC-HA/PTX3上的HCF中的TGF-βRI、TGF-βRII和TGF-βIII的表达。图4E举例说明了由外源性TGF-β1的添加而引起的pSmad2/3的核转位。图4F举例说明了由外源性TGF-1的添加而引起的α-SMA的阳性细胞质表达。

图5A-图5C示出了当用EGF+FGF-2刺激时，HC-HA/PTX3抑制ARPE-19细胞的增殖。图5A示出了HC-HA/PTX3不影响正常ARPE-19细胞的活力。图5B利用免疫染色示出了ARPE-19细胞的增殖。图5C示出了ARE-19细胞的增殖。

图6A-图6B示出了HC-HA/PTX3抑制APRE-19细胞中pSmad2/3的核转位。图6A利用免疫染色示出了磷酸化pSmad2/3的核定位。图6B示出了磷酸化Smad2/3的核定位。

图7A-图7D示出了兔子中PVR的发展。图7A举例说明了不具有PVR的正常兔子眼睛的眼底照片。图7B举例说明了在气体玻璃体切除术和玻璃体内注射RPE细胞四周之后，具有牵引性PVR的兔子。图7C举例说明了在摘出术之后不具有PVR的正常兔子眼睛的横截面。图7D举例说明了在摘出术之后具有伴随视网膜脱离的牵引性PVR的兔子的眼睛的横截面。

图8示出了添加胶原凝胶(Col)、AM提取物AME或与AM提取物混合的胶原凝胶(Col+AME)对抑制TGF-β启动子活性的影响。BSA用作对照。

图9示出了与仅用BSA的对照测定相比，用AME、HA或HA+AME处理对抑制TGF-β活性的影响。启动子活性显示为相对萤光素酶单位(RLU)。

图10示出了通过琼脂糖凝胶电泳分离的AM提取物中透明质酸的分子量范围。采用或不采用透明质酸酶对用缓冲液A、B、C提取的羊膜进行处理，并通过0.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离。

图11示出了通过琼脂糖凝胶电泳分离的AM提取物中透明质酸的分子量范围。采用或不采用透明质酸酶(10单位/ml，在Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl中)对用缓冲液PBS提取的羊膜在37℃下处理2hr，并通过0.5％琼脂糖凝胶运行。HA：阳性透明质酸对照；L：低速离心后的AM提取物；H：高速离心后的AM提取物。

图12示出了Western印迹，其证实在AM提取物中存在间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)。尽管尿抑胰酶素的信号非常弱(约39kDa)，但在AM提取物A和C中存在IαI。在转移至Western印迹之前，将提取物在4-15％变性丙烯酰胺凝胶上进行分离。

图13示出了免疫印迹，其证实即使在低速(LS)或高速(HS)离心之后，在AM提取物中也存在间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)。

图14示出了采用(+)或不采用(-)透明质酸酶处理的TSG-6(肿瘤坏死因子刺激的基因6)的免疫印迹。样品包括未离心的总AM提取物(T)，在等渗低盐缓冲液(缓冲液A)、高盐缓冲液(B)或4M盐酸胍(C)中提取之后的AM提取物，如实施例2中详述。TSG-6存在于总提取物、缓冲液A提取物和缓冲液C提取物中。透明质酸酶的添加似乎没有改变提取物中的TSG-6水平。

图15示出了AM中TSG-6的去糖基化的免疫印迹分析。采用(+)或不采用20单位/ml的肽-N-聚糖酶F(PNGase F)对AM提取物A、B和C在37℃下处理3小时。随后通过Western印迹法分析AM中TSG-6的糖基化。人角膜成纤维细胞(HCF)的细胞裂解物用作阳性对照。

图16示出了通过用硫酸软骨素ABC裂合酶消化对AM中潜在TSG-6复合物的免疫印迹分析。不采用(-)或采用(+)1单位/ml的ABC裂合酶对AM提取物A、B和C在37℃下处理2小时。随后利用抗-TSG-6抗体RAH-1:1:1000通过Western印迹法对TSG-6复合物的可能的破坏进行分析。

图17示出了通过用硫酸软骨素ABC裂合酶消化对AM中潜在TSG-6复合物的免疫印迹分析。除使用了不同的TSG-6抗体之外，这与图16中所示的实验相同。在此，抗-TSG-6抗体从R&D Systems(目录号MAB2104)获得。

图18示出了利用从Alexis Biochemicals获得的大鼠单克隆抗-PTX3抗体的免疫印迹，其证实了AM中五聚环蛋白(PTX3)的存在。HCF：人角膜成纤维细胞，T、A、B、C分别为：总AM提取物，AM提取物A、B、C；HAse：透明质酸酶。

图19示出了免疫印迹，其证实AM中存在TSP-1。示出了单体TSP-1(180kDa)和推定的三聚体TSP-1(540kD_a)。阳性对照TSP-1从人血小板中纯化(Calbiochem，目录号605225)，并以100ng/泳道加载。

图20示出了免疫印迹，其证实AM中存在Smad 7。AM用PBS或尿素(2M尿素，在50mMTris-HCl，pH 7.5中)提取。每一种提取物加载20μg总蛋白质。用山羊抗人Smad 7(AF2029，1:1000，R&D Systems)检测Smad 7。Smad 7以约51kDa的条带迁移。

图21示出了从六个随机的显微视野中计数得到的迁移细胞数(n＝4，*表示与PBS+EGF+FGF-2+TGF-β1比较时，p<0.05)。

图22示出了组之间比较的凝胶收缩的百分比(n＝4，*表示与PBS+TGF-β1比较时，p<0.05)。

具体实施方式

本申请描述了用于预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移和/或上皮-间充质转换(EMT)的组合物和方法，其中所述上皮细胞为人上皮细胞，并且该人上皮细胞选自：视网膜色素上皮细胞、结膜、视网膜、角膜、角膜缘或肾上皮细胞。此外，本申请描述了用于预防和治疗有需要的个体中的增生性玻璃体视网膜病变的组合物和方法。

已知当上皮细胞，例如视网膜色素上皮细胞、人结膜、视网膜、角膜、角膜缘或肾上皮细胞在体外或体内暴露于生长因子和细胞因子，例如EGF、FGF-2、PDGF-A、PDGF-AB、PDGF-B、PDGF-C、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、CTGF、HGF、IGF-1、G-CSF、IL-6、MCP-1、TNF-α、VEGF或IFN-γ以及乙二醇四乙酸(EGTA)时，发生细胞迁移和EMT。

此外，已知将冷冻保存的羊膜(AM)组织移植到眼表面上在角膜上皮细胞和角膜缘上皮细胞二者中提供了抗增殖、抗炎性、抗瘢痕形成和抗血管发生作用，以促进伤口愈合。

所需要的是一种组合物，该组合物预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移和EMT的，可在不需要手术移植的情况下施用，并且还可施用于非表面的上皮细胞，例如，视网膜上皮细胞和肾上皮细胞。

以下描述了某些实施方案。可以理解，本申请的特定实施方案通过示例的方式示出，并且其并非构成对本申请的限制。

某些术语

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与如所请求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，本发明全文所涉及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GENBANK序列、网站及其他公布的资料均通过引用整体并入本文。在本文中的术语存在多个定义时，以本节中的定义为准。当提及URL或其他此类标识符或地址时，应当理解，此类标识符可能变化，并且在互联网上的特定信息可能变化不定，但等效信息是已知的，并且可容易地进行访问，如通过搜索互联网和/或适当的数据库。参考文献证明了这些信息的可用性和公开传播。

如本文所用，范围和量可表示为“约”特定值或范围。“约”还包括准确的量。因此，“约5μg”指“约5μg”，并且还指“5μg”。通常，术语“约”包括预计在实验误差内的量。

如本文所用，术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用。这些术语均不应解释为需要医疗专业人员(如医生、护士、医师助理、护理员、临终关怀机构员工)的监督。如本文所用，受试者为任何动物，包括哺乳动物(例如，人或非人动物)和非哺乳动物。在本文提供的方法和组合物的一个实施方案中，哺乳动物是人。

如本文所用，术语“治疗”或“处理”以及其他语法上的等同词包括：减轻、缓和或改善疾病或病况的一种或多种症状。在一些实施方案中，治疗是减轻、缓和或改善上皮-间充质转换的一种或多种症状。在一些实施方案中，治疗是减轻、缓和或改善增生性玻璃体视网膜病变的一种或多种症状。在一些实施方案中，治疗是减轻、缓和或改善炎症的一种或多种症状。在一些实施方案中，治疗是预防或降低疾病或病况的一种或多种附加症状的出现、严重性或频率。在一些实施方案中，所述方法包括预防或降低上皮-间充质转换的一种或多种附加症状的出现、严重性或频率。在一些实施方案中，所述方法包括预防或降低增生性玻璃体视网膜病变的一种或多种附加症状的出现、严重性或频率。在一些实施方案中，所述方法包括预防或降低炎症的一种或多种附加症状的出现、严重性或频率。在一些实施方案中，所述方法包括改善或预防疾病或病况的一种或多种症状的潜在代谢病因，抑制疾病或病况，例如，阻止疾病或病况的发展，减轻疾病或病况，使疾病或病况消退，减轻由疾病或病况引起的病况，或在预防和/或治疗上抑制疾病或病况的症状。

如本文所用，“胎儿支持组织”意指用来支持胎儿发育的组织。胎儿支持组织的实例包括但不限于(i)胎盘羊膜(PAM)或基本分离的PAM，(ii)脐带羊膜(UCAM)或基本分离的UCAM，(iii)绒毛膜或基本分离的绒毛膜，(iv)羊膜-绒毛膜或基本分离的羊膜-绒毛膜，(v)羊膜基质或基本分离的羊膜基质，(vi)胎盘或基本分离的胎盘，(vii)脐带或基本分离的脐带，(viii)羊水，或(ix)其任何组合。胎儿支持组织还可与“妊娠组织”互换使用。在一些实施方案中，妊娠组织是“哺乳动物的妊娠组织”或“人的妊娠组织(“HGT”)”。在一些实施方案中，该胎儿支持组织从哺乳动物中获得。在一些实施方案中，该胎儿支持组织来自人、非人灵长类动物、牛或猪。在一些实施方案中，该胎儿支持组织来自人。在一些实施方案中，该胎儿支持组织是磨碎的、粉碎的、颗粒化的、移植物、粉末、凝胶、匀浆或提取物。在一些实施方案中，该胎儿支持组织被无菌处理。在一些实施方案中，该胎儿支持组织被最终灭菌。

如本文所用，“胎盘”意指将发育中的胎儿连接到母体子宫壁以允许进行营养吸收、废弃物排泄以及通过母体血液供应进行气体交换的器官。胎盘由三层组成。围绕胎儿的最内层的胎盘层称为羊膜。尿囊是胎盘的中间层(衍生自胚胎后肠)；来源于肚脐的血管穿过这层膜。胎盘的最外层，即绒毛膜，与子宫内膜接触。绒毛膜和尿囊融合形成绒毛尿囊膜。

如本文所用，“绒毛膜”意指由胚外中胚层和两层滋养层形成的膜。绒毛膜绒毛从绒毛膜伸出，侵入子宫内膜，并允许营养物质从母血转移至胎血。绒毛膜由以下两层组成：由滋养层形成的外层和由体壁中胚层形成的内层；羊膜与后者接触。滋养层由立方体或棱柱形细胞内层，细胞滋养层或朗汉斯(Langhans)层，以及缺乏细胞边界的核丰富的原生质外层(即合体细胞滋养层)组成。无血管羊膜附着在绒毛膜的内层。

如本文所用，“羊膜-绒毛膜”意指包含羊膜和绒毛膜的产物。在一些实施方案中，羊膜和绒毛膜不分离(即，羊膜自然地附着在绒毛膜的内层)。在一些实施方案中，羊膜最初与绒毛膜分离，且随后在处理过程中与绒毛膜合并。

如本文所用，“脐带”意指将发育中的胎儿连接到胎盘的器官。脐带由华顿氏胶(Wharton’s jelly)，即一种主要由黏多糖制成的胶状物质组成。它包含一条静脉(其将含氧的营养丰富的血液携带至胎儿)，以及两条动脉(其将脱氧的营养耗尽的血液带走)。在一些实施方案中，已从脐带组织上基本上去除血管。在一些实施方案中，已去除一部分华顿氏胶。在一些实施方案中，已去除血管和一部分华顿氏胶。

如本文所用，“胎盘羊膜”(PAM)意指从胎盘衍生的羊膜。在一些实施方案中，PAM基本被分离。

如本文所用，“脐带羊膜”(UCAM)意指从脐带衍生的羊膜。UCAM是半透明膜。UCAM具有多个层：上皮层(基膜)；致密层；成纤维细胞层；和海绵层。它缺乏血管或直接的血液供应。在一些实施方案中，UCAM是基本分离的。在一些实施方案中，UCAM包含所有华顿氏胶。在一些实施方案中，UCAM包含一部分华顿氏胶。在一些实施方案中，UCAM包含血管和/或动脉。在一些实施方案中，UCAM包含所有华顿氏胶和血管和/或动脉。在一些实施方案中，UCAM包含部分华顿氏胶和血管和/或动脉。

如本文所用，“基本分离的”或“分离的”是指胎儿支持组织产品已与来源于原始来源生物体的不期望的材料(例如，红细胞、血管和动脉)分离。纯度，或“分离”，可以通过标准方法来测定，并且将通常为至少约10％纯，更通常地至少约20％纯，一般至少约30％纯，并且更一般地至少约40％纯；在进一步的实施方案中，至少约50％纯，或更常见的是至少约60％纯；在其他实施方案中，至少约95％纯。

如本文所用，“生物活性”是指多肽和多糖的活性。在一些实施方案中，在脐带(和基本分离的脐带)、UCAM(和基本分离的UCAM)、胎盘(和基本分离的胎盘)、PAM(和基本分离的PAM)、绒毛膜(和基本分离的绒毛膜)或羊膜-绒毛膜(和基本分离的羊膜-绒毛膜)中发现了多肽和多糖的活性。在一些实施方案中，生物活性是抗瘢痕形成活性、抗炎活性、抗血管发生活性和伤口愈合。在一些实施方案中，生物活性是抗炎活性。在一些实施方案中，生物活性包括胎儿支持组织制剂或组合物的生物活性。在一些实施方案中，生物活性包括HC-HA/PTX3的生物活性。

如本文所用，生物活性或结构完整性的基本保持是指当与未处理的组织的生物活性和结构完整性相比时，胎儿支持组织产品的生物活性和结构完整性只降低了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％或约60％。

如本文所用，“冷冻”是指将胎儿支持组织产品暴露于低于大约或处于0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃或-100℃约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时或更长的一段时间。

如本文所用，“粉末”是指处于细干颗粒或基质的形式的物质。在一些实施方案中，颗粒的大小是不均一的。在一些实施方案中，颗粒的大小基本上是均一的。

如本文所用，“研磨”是指使胎儿支持组织减小至小颗粒或粉末的任何方法。术语研磨包括微粉化、磨碎、均化、锉削、碾磨、摩擦、捣碎和破碎。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指所施用的药剂或化合物的充足量，该量将会在一定程度上减轻所治疗的疾病或病况的一种或多种症状。结果可以是疾病的指征、症状或病因的减少和/或缓和，或生物系统的任何其他期望的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供疾病症状的临床显著减少而没有过度不良副作用所需的包含如本文公开的化合物的组合物的量。在任何个别情况下，可以使用诸如剂量递增研究的技术来确定合适的“有效量”。术语“治疗有效量”包括例如预防有效量。本文公开的化合物的“有效量”是有效实现期望的效果或治疗改善而没有过度不良副作用的量。应理解，由于可注射组合物代谢，个体的年龄、体重、总体状况，所治疗的病况，所治疗病况的严重程度和处方医师的判断的变化，“有效量”或“治疗有效量”可根据个体的不同而变化。在一些实施方案中，有效量是预防或减轻PVR的症状的量。在一些实施方案中，有效量是减少、抑制或预防上皮细胞的细胞迁移、细胞增殖和/或EMT的量。

上皮-间充质转换(EMT)是这样一种过程，通过该过程，上皮细胞失去其细胞极性和细胞-细胞粘附，而增加了迁移和侵袭特性。EMT发生在诸如中胚层形成、神经管形成、伤口愈合以及关于癌进展的转移引发的过程中。EMT可以通过若干信号传导途径引起，包括TGF-β、FGF、EGF、HGF、Wnt/β-联蛋白和Notch。

增生性玻璃体视网膜病变(PVR)是一种作为孔源性视网膜脱离(rhegmatogenousretinal detachment)的并发症而发生的疾病。当来自玻璃体液的流体进入视网膜的孔中并在视网膜下间隙中积累时，玻璃体在视网膜上的牵引力是导致孔源性视网膜脱离的原因。在该过程中，视网膜细胞层与玻璃体细胞因子接触，这可引发视网膜色素上皮(RPE)增殖和迁移。RPE细胞经受上皮-间充质转换(EMT)并发展了迁移到玻璃体中的能力。在RPE的迁移过程中，这些细胞建立(lay down)纤维膜，从而收缩和拉动视网膜，并可能导致原发性视网膜脱离手术后的继发性视网膜脱离。

组合物

在某些实施方案中，本文公开了用于预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移和/或上皮-间充质转换(EMT)的组合物，其包含：胎儿支持组织的制剂；和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。在某些实施方案中，本文进一步公开了用于预防或减轻有需要的个体中的增生性静脉视网膜病变(PVR)的可注射组合物，其包含：胎儿支持组织的制剂；和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。在某些实施方案中，本文进一步公开了用于预防或减轻有需要的个体中的增生性静脉视网膜病变(PVR)的可注射组合物，其基本上由以下成分组成：基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)；和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。在某些实施方案中，本文进一步公开了用于预防或减轻有需要的个体中的增生性静脉视网膜病变(PVR)的可注射组合物，其基本上由以下成分组成：基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)；附加治疗剂；和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。

在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含通过共价键与间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)的重链交联的高分子量透明质酸(HA)，所述高分子量HA具有大于1000kDa的分子量。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含五聚环蛋白3(PTX-3，PTX3)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含肿瘤坏死因子刺激的基因6蛋白(TSG-6)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含血小板反应蛋白-1(TSP-1)。在一些实施方案中，所述组合物中总蛋白质与HA之比小于500份蛋白质:1份HA。在一些实施方案中，所述组合物中HA与总蛋白质之比小于500份HA:1份蛋白质。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含基本上纯化的HC-HA/PTX3复合物。

在一些实施方案中，所述上皮细胞是人上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是视网膜色素上皮细胞(RPE)。在一些实施方案中，该人上皮细胞是角膜上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是角膜缘上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是结膜上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是肾上皮细胞。

在一些实施方案中，所述组合物通过抑制生长因子和细胞因子的活性来预防上皮细胞的增殖和EMT。在一些实施方案中，该生长因子和细胞因子选自：EGF、FGF-2、PDGF-A、PDGF-AB、PDGF-B、PDGF-C、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、CTGF、HGF、IGF-1、G-CSF、IL-6、MCP-1、TNF-α、VEGF和IFN-γ。在一些实施方案中，该组合物抑制上皮细胞中的信号传导途径以抑制增殖和EMT。在一些实施方案中，该信号传导途径是典型Wnt信号传导和TGF-β-诱导的Smad/ZEB信号传导。

在一些实施方案中，所述组合物包含胎儿支持组织的制剂和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。在一些实施方案中，该组合物进一步包含水性佐剂。在一些实施方案中，该组合物用于局部施用。在一些实施方案中，该组合物被配制用于注射。在一些实施方案中，该组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射。

胎儿支持组织的制剂

在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含胎盘组织、脐带组织、胎盘羊膜组织、绒毛膜组织、羊膜基质、羊膜-绒毛膜组织、UCAM组织、羊水或其组合。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂是胎儿支持组织的提取物、微粒化的胎儿支持组织、胎儿支持组织的匀浆、胎儿支持组织的粉末、颗粒化的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、纯化的HC-HA/PTX3或其组合。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂由新鲜、冷冻或预先冷冻的胎儿支持组织制备。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂由冷冻或预先冷冻的胎儿支持组织制备。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含HA、IαI、TSG-6、PTX-3、TSP-1或其组合。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含纯化的HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含超速离心的HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂由纯化的HC-HA/PTX3组成。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含重建的HC-HA/PTX3。

在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂抑制TGF-β启动子活性；增加巨噬细胞的凋亡；减少增殖，减少迁移，并增加人血管内皮细胞的凋亡；降低人成纤维细胞的活力；减轻炎症；并预防暴露于储存和损伤的上皮细胞的凋亡。在一些实施方案中，本文所述的胎儿支持组织的制剂和可注射组合物用来治疗与TGF-β上调相关的疾病，如血管发生、伤口愈合和组织炎症。

TGF-β是参与组织炎症以及伤口愈合和瘢痕形成的原型细胞因子。哺乳动物细胞表达三种不同的TGF-β：TGF-β1、TGF-β2和TGFβ3。TGF-β是通过上调α-SMA、整联蛋白α5β1和含有EDA结构域的纤连蛋白(Fn)在多种细胞类型(包括成纤维细胞)中的表达来促进肌成纤维细胞分化的最有效的细胞因子。TGF-β还上调诸如胶原和蛋白聚糖的基质组分的表达，下调蛋白酶和基质金属蛋白酶，并上调其抑制物。总的来说，这些作用导致细胞-基质相互作用和粘附性增加，以及瘢痕组织的沉积和形成。

TGF-β通过与细胞膜上的TGF-β受体(TGF-βR)结合发挥其作用。在人细胞中，有三种TGF-βR，即TGF-βR类型I(TGF-βRI)、类型II(TGF-βRII)和类型III(TGF-βRIII)。TGF-β作为配体与由TGF-βRI和TGF-βRII构成的丝氨酸、苏氨酸激酶受体复合物结合；这种结合由并非丝氨酸、苏氨酸激酶受体的TGF-βRIII促进。与TGF-βRII的结合激活TGF-βRI，TGF-βRI负责称作Smads的效应蛋白家族的直接磷酸化，Smads调节许多参与瘢痕形成的靶基因(包括本文所述的那些)的转录。

TGF-β的抑制可通过中和抗TGF-β抗体和调解由TGF-β介导的信号传导的试剂如核心蛋白聚糖来实现。大多数文献显示，在调节TGF-β激活、与其受体结合或其信号转导的水平上，实现了TGF-β的抑制。已证明羊膜可在转录水平上实现这种抑制，即关闭TGF-β1基因的转录。特别是，已表明羊膜抑制人角膜和角膜缘成纤维细胞以及人结膜和翼状胬肉体成纤维细胞中的TGF-P信号传导。

透明质酸(HA)是在关节液、眼玻璃体液、软骨、血管、细胞外基质、皮肤和脐带中发现的天然糖。在一些实施方案中，HA的交联是通过与另一分子如蛋白质之间的共价键而实现的。在一些实施方案中，HA与间-α-抑制剂(IαI)的重链共价结合。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂中蛋白质与HA之比小于约500:1、小于约200:1、小于约100:1、小于约50:1或小于约10:1的蛋白质:HA。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂中HA与蛋白质之比小于约500:1、小于约200:1、小于约100:1、小于约50:1或小于约10:1的HA:蛋白质。

TSG-6是在细胞外基质重塑、细胞增殖和白细胞迁移中发挥作用的透明质酸结合蛋白。TSG-6可与丝氨酸蛋白酶抑制剂间-α-抑制剂(IαI)形成复合物，并催化重链由IαI转移至HA。PTX-3是具有五聚体盘状结构且存在于血浆中的Ca²⁺依赖性配体结合蛋白。TSP-1(血小板反应蛋白1)是具有有效的抗血管发生和其他生物活性的同源三聚体糖蛋白。TSP-1由多种细胞类型分泌至细胞外基质中。

在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含选自HA、IαI、TSG-6、PTX-3、TSP-1、HC-HA/PTX3或其组合的纯化组分。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含重建的HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含纯化的HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂由HC-HA/PTX3组成。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含高浓度的纯化HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3为25至750μg/ml、50至500μg/ml、50至250μg/ml，或约250ug/ml、约500ug/ml或约750ug/ml的浓度。在一些实施方案中，纯化的组分从任何合适的来源获得。在一些实施方案中，纯化的组分从胎儿支持组织获得。在一些实施方案中，胎儿支持组织的纯化的组分从商业来源获得。在一些实施方案中，胎儿支持组织的纯化的组分从转基因生物体中分离。在一些实施方案中，胎儿支持组织的纯化组分的蛋白质序列与人蛋白质序列具有至少90％、93％、95％、97％、99％或99.5％的相似性。在一些实施方案中，胎儿支持组织的纯化的组分是纯化的、基本上纯化的、部分纯化的或存在于粗提取物中。在一些实施方案中，胎儿支持组织的纯化的组分为HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的纯化组分在所述过程的任何时间从胎儿支持组织的制剂中分离。

在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含Smad7。在一些实施方案中，Smad7从任何合适的来源，如羊膜、商业来源获得或从转基因生物体中分离。在一些实施方案中，Smad7是纯化的、基本上纯化的、部分纯化的或存在于粗提取物中。

在一些实施方案中，HA、IαI、TSG-6、PTX-3、TSP-1和任选的Smad7从胎儿支持组织的制剂获得。在一些实施方案中，制备含有HA、IαI、TSG-6、PTX-3、TSP-1和任选的Smad7的胎儿支持组织的制剂。

在一些实施方案中，在均化胎儿支持组织之后，经离心以去除不可溶物质。在一些实施方案中，在均化胎儿支持组织之后，不可溶物质留在胎儿支持组织的制剂中。在一些实施方案中，将胎儿支持组织的制剂干燥。在一些实施方案中，根据实施例1中所述的方法制备胎儿支持组织的制剂。

在一些实施方案中，胎儿支持组织(经IRB批准)从诸如Bio-Tissue,Inc.(Miami,FL)和Baptist Hospital(Miami,FL)的来源获得。在一些实施方案中，该胎儿支持组织以新鲜、冷冻或预先冷冻的状态获得。在一些实施方案中，洗涤胎儿支持组织以去除过量的储存缓冲液、血液或污染物。在一些实施方案中，使用短暂的离心步骤或通过其他手段去除过量的液体。在一些实施方案中，使用液氮或其他冷却手段将胎儿支持组织冷冻以利于后续的均化。在一些实施方案中，胎儿支持组织的来源是哺乳动物。在一些实施方案中，胎儿支持组织的来源是人。在一些实施方案中，使用胎儿支持组织的其他来源，如非人灵长类动物、牛或猪。

在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂从AM胶质中获得。在一些实施方案中，AM胶质从新鲜的AM组织中获得。在一些实施方案中，AM胶质在新鲜的AM组织冷冻之前获得。在一些实施方案中，AM胶质在新鲜的AM组织冷冻之后获得。在一些实施方案中，AM胶质从冷冻的或预先冷冻的AM组织中获得。在一些实施方案中，AM胶质被冷冻。在一些实施方案中，按照本文所述的AM制剂的程序将AM胶质冷冻磨碎。在一些实施方案中，将AM胶质离心。在一些实施方案中，将AM胶质冻干。

在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂由AM的基质制备。在一些实施方案中，该基质与新鲜的、冷冻的、解冻的或以其他方式处理的AM膜的层分离。在一些实施方案中，该基质去除通过酶法、机械法或通过任何其他合适的手段进行。在一些实施方案中，该基质是新鲜的、冷冻的或预先冷冻的。在一些实施方案中，按照本文所述的由AM生成胎儿支持组织制剂的程序将该基质磨碎或冷冻磨碎。在一些实施方案中，将基质离心。在一些实施方案中，将基质冻干。

在一些实施方案中，所述制剂是磨碎的胎儿支持组织。在一些实施方案中，该胎儿支持组织在磨碎过程之前进行冷冻。在一些实施方案中，冷冻步骤通过任何合适的冷却过程进行。在一些实施方案中，该胎儿支持组织使用液氮快速冷冻。在一些实施方案中，将该胎儿支持组织放置在异丙醇/干冰浴中或在其他冷却剂中快速冷冻。在一些实施方案中，使用商购可得的快速冷冻过程。在一些实施方案中，将该胎儿支持组织放置在冰箱中并使之更缓慢地平衡到储存温度，而非快速冷冻。在一些实施方案中，该胎儿支持组织在任何所需温度下储存。在一些实施方案中，该胎儿支持组织在-20℃或-80℃下储存。

在一些实施方案中，所述制剂是粉碎的胎儿支持组织。在一些实施方案中，该胎儿支持组织在冷冻时粉碎。在一些实施方案中，在磨碎步骤中使用新鲜的、部分解冻的或解冻的胎儿支持组织。在一些实施方案中，采用合适的装置如解剖刀将胎儿支持组织(新鲜的、冷冻的或解冻的)切成所需大小的片，随后使用BioPulverizer(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,OK)或其他合适的装置磨成微细颗粒，并采用均化装置如Tissue Tearor(Biospec Products,Inc.,Dremel,WI)在合适的溶液中均化，以形成匀浆。溶液的非限制性实例包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、DMEM、NaCl溶液和水。在一些实施方案中，根据需要调节溶液的pH。在一些实施方案中，pH范围为约5.5或6.0至约8.5。在一些实施方案中，将冷冻组织在pH约6.3至约7.8的溶液中磨碎。

在一些实施方案中，所述制剂是胎儿支持组织的匀浆。在一些实施方案中，该匀浆在任何合适的速度、温度或其他参数下混合。在一些实施方案中，该混合在约1℃或3℃至约6℃、10℃、15℃或20℃的温度范围下进行。在一些实施方案中，该混合在约4℃下进行。在一些实施方案中，将匀浆混合例如少于约1分钟、10分钟或20分钟至约1、2、3小时或更长。

在一些实施方案中，将匀浆离心以去除任何剩余的不可溶物质和/或细胞碎片。在一些实施方案中，使用任何合适范围的时间、温度、蛋白质浓度、缓冲液和速度进行离心。在一些实施方案中，离心在约1,000、5,000或10,000xg至约20,000xg的范围下进行。在一些实施方案中，离心在约15,000xg下进行。在一些实施方案中，进行离心的持续时间少于1分钟、5分钟、10分钟、20分钟至约40分钟、60分钟、1.5小时或更长。在一些实施方案中，收集上清液并在-80℃下以等分试样储存。在一些实施方案中，使用任何合适的商业蛋白质分析试剂盒如BCA测定(Pierce,Rockford,IL)对总蛋白质进行定量。实施例2、表1和图13描述了在低速或高速离心之后对AM制剂的分析。

在一些实施方案中，为了生物化学表征和纯化，向以上溶液补充蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的示例性混合物如下：1μg/ml抑酶肽、1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml胃蛋白酶抑制剂A和1mM PMSF。在一些实施方案中，如果胎儿支持组织的制剂将添加至肝细胞或组织中，则不将蛋白酶抑制剂添加至胎儿支持组织的制剂中。

在一些实施方案中，所述制剂是胎儿支持组织的提取物。在一些实施方案中，用任何合适的缓冲液或液体来制备胎儿支持组织的提取物。实施例2考察了各种提取缓冲液(高盐、低盐、PBS等)对胎儿支持组织提取物中的总蛋白质含量和HA的用途(表1)。实施例2使用若干提取方法考察了特定蛋白质TSG-6(图14)、PTX-3(图18)、TSP-1(图19)和Smad7(图20)的水平。

在一些实施方案中，测试胎儿支持组织的制剂以确认特定组分或蛋白质的存在。在一些实施方案中，针对包括但不限于HA、IαI、TSG-6、PTX-3、TSP-1和Smad7的分子的存在，测试胎儿支持组织的制剂。在一些实施方案中，测试胎儿支持组织的制剂以确认在制备过程期间中的任何时间点不存在病原体。

在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂是干粉末。在一些实施方案中，干粉末在储存过程中不需要冷藏或冷冻来避免干粉末随时间降解。在一些实施方案中，将干粉末储存并在使用前重建。在一些实施方案中，通过制备如本文所述的冷冻磨碎的胎儿支持组织，随后去除胎儿支持组织的制剂中的至少一部分水来制备干粉末。在一些实施方案中，通过任何合适的手段从胎儿支持组织的制剂中去除过量的水。在一些实施方案中，通过使用冻干来去除过量的水。在一些实施方案中，冻干胎儿支持组织的制剂包括使用商购可得的冻干器或冷冻干燥器。在一些实施方案中，合适的设备可见于例如Virtis(Gardiner,NY)；FTSSystems(Stone Ridge,NY)；和SpeedVac(Savant Instruments Inc.,Farmingdale,NY)。在一些实施方案中，去除的水的量为约5％、10％、20％、30％至约60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多。在一些实施方案中，从胎儿支持组织的制剂中去除基本上全部过量的水。在一些实施方案中，储存干粉末。在一些实施方案中，储存温度从小于约-196℃、-80℃、-50℃或-20℃到大于约23℃不等。在一些实施方案中，干粉末在储存前进行表征(重量、蛋白质含量等)。

在一些实施方案中，在使用前将干粉末在合适的溶液或缓冲液中重建。溶液的非限制性实例包括但不限于PBS、DMEM和BSS。在一些实施方案中，根据需要调节溶液的pH。在一些实施方案中，干粉末用足够体积的溶液重建以产生高浓度的胎儿支持组织重建组合物。在一些实施方案中，干粉末用足够体积的溶液重建以产生低浓度的胎儿支持组织重建组合物。

在一些实施方案中，将干粉末在乳膏、软膏、凝胶、泡沫或洗剂中重建。

在一些实施方案中，使用胎儿支持组织的制剂来实现AMSC从肌成纤维细胞到成纤维细胞的表型逆转。在一些实施方案中，使用胎儿支持组织的制剂来防止或减缓各种细胞类型的分化。在一些实施方案中，许多类型的细胞用胎儿支持组织的制剂来处理。

分离的nHC-HA/PTX3复合物

在一些实施方案中，所述组合物包括分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。

在一些实施方案中，所述nHC-HA/PTX3复合物从分离的细胞中分离。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3复合物从培养的细胞中分离。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3复合物从干细胞中分离。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3复合物从由诸如脐带或羊膜的组织制备的提取物的水溶性级分中分离。在一些实施方案中，该水溶性级分使用等渗盐溶液提取。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3复合物从由诸如脐带或羊膜的组织制备的提取物的水不溶性级分中分离。在一些实施方案中，该不溶性级分使用GnHCl提取。

在一些实施方案中，分离的nHC-HA/PTX3复合物是从羊膜组织中分离的。在一些实施方案中，分离的nHC-HA/PTX3复合物是从羊膜或脐带中分离的。在一些实施方案中，分离的nHC-HA/PTX3复合物是从新鲜的、冷冻的或先前冷冻的胎盘羊膜(PAM)，新鲜的、冷冻的或先前冷冻的脐带羊膜(UCAM)，新鲜的、冷冻的或先前冷冻的胎盘，新鲜的、冷冻的或先前冷冻的脐带，新鲜的、冷冻的或先前冷冻的绒毛膜，新鲜的、冷冻的或先前冷冻的羊膜-绒毛膜，或其任何组合中分离的。此类组织可获自任何哺乳动物，例如，但不限于人、非人灵长类动物、牛或猪。

在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3通过任何合适的方法进行纯化。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物通过离心(例如，超速离心、梯度离心)、色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和羟基磷灰石色谱法)、凝胶过滤或差别溶解法、乙醇沉淀法或通过用于蛋白质纯化的任何其他可行技术(参见，例如，Scopes,ProteinPurification Principles和Practice,第2版,Springer-Verlag,New York,1987；Higgins,S.J.和Hames,B.D.(编著),Protein Expression:A Practical Approach,OxfordUniv Press,1999；以及Deutscher,M.P.,Simon,M.I.,Abelson,J.N.(编著),Guide toProtein Purification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series,Vol182),Academic Press,1997，所有这些文献均通过引用并入本文)进行纯化。

在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3从提取物中分离。在一些实施方案中，该提取物由羊膜提取物制备。在一些实施方案中，该提取物由脐带提取物制备。在一些实施方案中，该脐带提取物包含脐带基质和/或华顿氏胶。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含在通过超速离心制备的提取物中。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含在通过使用CsCl/4-6M盐酸胍梯度进行的超速离心制备的提取物中。在一些实施方案中，该提取物通过至少2轮超速离心而制备。在一些实施方案中，该提取物通过多于2轮超速离心而制备(即nHC-HA/PTX3，第2)。在一些实施方案中，该提取物通过至少4轮超速离心而制备(即nHC-HA/PTX3，第4)。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含小亮氨酸丰富蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含HCl、HA、PTX3和/或小亮氨酸丰富蛋白聚糖。

在一些实施方案中，在等渗溶液中对通过提取制备的提取物进行超速离心。在一些实施方案中，该等渗溶液是PBS。例如，在一些实施方案中，使组织在PBS中均化，以制备匀浆样品。随后将匀浆样品通过离心分离成可溶性部分和不溶性部分。在一些实施方案中，对PBS提取的组织的可溶性部分进行超速离心。在此类实施方案中，将通过对PBS提取的组织进行超速离心而纯化的nHC-HA/PTX3称为nHC-HA/PTX3可溶性复合物。在一些实施方案中，nHC-HA可溶性复合物包含小亮氨酸丰富蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3可溶性复合物包含HCl、HA、PTX3和/或小亮氨酸丰富蛋白聚糖。

在一些实施方案中，对通过对羊膜和/或脐带组织进行直接盐酸胍提取(例如4-6MGnHCl)制备的提取物进行超速离心。在一些实施方案中，随后对GnHCl提取物组织进行离心，以产生GnHCl可溶性和GnHCl不溶性部分。在一些实施方案中，对GnHCl可溶性部分进行超速离心。在此类实施方案中，将通过对盐酸胍提取的组织进行超速离心而纯化的nHC-HA/PTX3称为nHC-HA/PTX3不溶性复合物。在一些实施方案中，nHC-HA不溶性复合物包含小亮氨酸丰富蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3不溶性复合物含有HCl、HA、PTX3和/或小亮氨酸丰富蛋白聚糖。

在一些实施方案中，对通过对PBS-提取的组织的不溶性部分进行进一步的盐酸胍提取而制备的提取物进行超速离心。例如，在一些实施方案中，使组织在PBS中均化以制备匀浆样品。随后将匀浆样品通过离心分离成可溶性部分和不溶性部分。然后将不溶性部分在盐酸胍(例如，4-6M GnHCl)中进一步提取，并进行离心以产生盐酸胍可溶性部分和不溶性部分。在一些实施方案中，对盐酸胍可溶性部分进行超速离心。在此类实施方案中，将通过对盐酸胍提取的组织进行超速离心而纯化的nHC-HA/PTX3称为nHC-HA/PTX3不溶性复合物。在一些实施方案中，nHC-HA不溶性复合物包含小亮氨酸丰富蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3不溶性复合物包含HCl、HA、PTX3和/或小亮氨酸丰富蛋白聚糖。

在一些实施方案中，对分离的nHC-HA/PTX3提取物进行纯化的方法包括：(a)将分离的提取物(例如，通过本文所述的可溶性或不溶性方法制备的)溶解于初始密度为1.35g/ml的CsCl/4-6M盐酸胍中，以产生CsCl混合物，(b)将氯化铯混合物在15℃下以125,000x g离心48h，以产生第一纯化提取物，(c)提取第一纯化提取物并将其相对于蒸馏水进行透析以除去氯化铯和盐酸胍，从而产生透析液。在一些实施方案中，对分离的提取物进行纯化的方法进一步包括：(d)在0℃下将透析液与含有1.3％(w/v)乙酸钾的3倍体积的95％(v/v)乙醇混合1h，以产生第一透析液/乙醇混合物，(e)将第一透析液/乙醇混合物在15,000x g下进行离心，以产生第二纯化提取物，以及(f)提取第二纯化提取物。在一些实施方案中，对分离的提取物进行纯化的方法进一步包括：(g)采用乙醇(例如，70％乙醇)洗涤第二纯化提取物，以产生第二纯化提取物/乙醇混合物；(h)对第二纯化提取物/乙醇混合物进行离心，以产生第三纯化提取物；以及(i)提取第三纯化提取物。在一些实施方案中，对分离的提取物进行纯化的方法进一步包括：(j)采用乙醇(例如，70％乙醇)洗涤第三纯化提取物，以产生第三纯化提取物/乙醇混合物；(k)对第三纯化提取物/乙醇混合物进行离心，以产生第四纯化提取物；以及(l)提取第四纯化提取物。在一些实施方案中，纯化的提取物包含nHC-HA/PTX3复合物。

在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物通过免疫亲和色谱法进行纯化。在一些实施方案中，产生抗HC1抗体、抗HC2抗体或两者，并将其附着在固定支持体上。在一些实施方案中，使未纯化的HC-HA复合物(即，流动相)通过支持体。在某些情况下，HC-HA复合物与抗体结合(例如，通过(a)抗HC1抗体和HCl，(b)抗HC2抗体和HC2，(c)抗PTX抗体和PTX3，(d)抗SLRP抗体和SLRP，或(e)它们的任何组合的相互作用)。在一些实施方案中，洗涤(例如，采用PBS)支持体以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，随后采用能够从支持体上洗脱nHC-HA/PTX3复合物的溶液(例如，1％SDS、6M盐酸胍或8M尿素)洗涤支持体。

在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物通过亲和色谱法进行纯化。在一些实施方案中，产生HABP并将其附着在固定支持体上。在一些实施方案中，使未纯化的nHC-HA/PTX3复合物(即，流动相)通过支持体。在某些情况下，nHC-HA/PTX3复合物与HABP结合。在一些实施方案中，洗涤(例如，用PBS)支持体以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，随后采用能够从支持体上洗脱HC-HA复合物的溶液洗涤支持体。

在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物通过HABP亲和色谱法以及使用抗HC1抗体、抗HC2抗体、抗PTX3抗体、针对SLRP或SLRP的组合的抗体或其抗体的任何组合进行的免疫亲和色谱法进行纯化。

在一些实施方案中，使用一种或多种抗体从如本文所述的不溶性级分中纯化nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，使用抗SLRP抗体从如本文所述的不溶性级分中纯化nHC-HA/PTX3复合物。

在一些实施方案中，从如本文所述的可溶性级分中纯化nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，使用抗PTX3抗体从如本文所述的可溶性级分中纯化nHC-HA/PTX3复合物。

在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含I类、II类或II类SLRP。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自I类SLRP，如饰胶蛋白聚糖(decorin)和双糖链蛋白聚糖(biglycan)。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自II类SLRP，如纤调蛋白聚糖(fibromodulin)、腔蛋白聚糖(lumican)、PRELP(脯氨酸精氨酸丰富端亮氨酸丰富蛋白质，proline arginine rich end leucine-rich protein)、角膜蛋白聚糖(keratocan)和骨黏附蛋白聚糖(osteoadherin)。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自III类SLRP，如骺蛋白聚糖(epipycan)和骨甘蛋白聚糖(osteoglycin)。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自尿抑胰酶素(bikunin)、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白质包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖包含硫酸角质素。

rcHC-HA/PTX3复合物

在一些实施方案中，所述组合物包含具有或不具有SLRP的重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。

在一些实施方案中，用于产生重建的HC-HA/PTX3复合物的方法包括：(a)使固定化的高分子量透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)在适当的条件下接触，以形成PTX3/HA复合物，以及(b)使PTX3/HA复合物与IαI和肿瘤坏死因子刺激的基因6(TSG-6)接触。本文提供了通过该方法生产的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，TSG-6催化间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HCl)向HA的转移。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，该方法的步骤(a)和(b)按顺序相继进行。

在一些实施方案中，用于产生重建的HC-HA/PTX3复合物的方法包括使PTX3/HA复合物与IαI和TSG-6接触。在一些实施方案中，TSG-6催化间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HCl)向HA的转移。本文提供了通过该方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。

在一些实施方案中，用于产生与PTX3结合的HA的复合物的方法包括使固定化的高分子量透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)在适当的条件下接触，以形成PTX3/HA复合物。本文提供了通过该方法产生的PTX3/HA复合物。

在一些实施方案中，用于产生重建的HC-HA/PTX3复合物的方法包括(a)使固定化的高分子量透明质酸(HMW HA)与针对HA的IαI和TSG-6接触以形成预结合至TSG-6的HC-HA复合物，以及(b)使HC-HA复合物与五聚环蛋白3(PTX3)在适当的条件下接触，以形成rcHC-HA/PTX3复合物。本文提供了通过该方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，该方法的步骤(a)和(b)按顺序相继进行。在一些实施方案中，该方法包括使预结合至TSG-6的HC-HA复合物与PTX3接触。

在一些实施方案中，所述方法包括：首先使高分子量透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)在适当的条件下接触，以形成PTX3/HA复合物，然后使PTX3/HA复合物与IαI和TSG-6接触。

在一些实施方案中，使IαI蛋白与TSG-6蛋白以约1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、15：1或20：1(IαI：TSG-6)的摩尔比接触而形成复合物。在一些实施方案中，IαI：TSG-6的比例范围为约1：1至约20：1，例如约1：1至约10：1，例如约1：1至约5：1，如约1：1至约3：1。在一些实施方案中，IαI：TSG-6的比例范围为3：1或更高。在一些实施方案中，IαI：TSG-6的比例为3：1。

在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)和(b)按顺序相继进行。在一些实施方案中，所述方法包括使PTX3/HA复合物与IαI和TSG-6接触。

在某些情况下，TSG-6与IαI相互作用并与IαI的HCl和HC2形成共价复合物(即HCl·TSG-6和HC2·TSG-6)。在某些情况下，在HA的存在下，使HC向HA转移，以形成rcHC-HA。在一些实施方案中，将TSG-6·HCl复合物添加至预结合的PTX3/HA复合物中以催化HCl向HA的转移。在一些实施方案中，所述方法包括：首先使固定化的高分子量透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)在适当的条件下接触，以形成PTX3/HA复合物，然后使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物接触。在一些实施方案中，将HC1·TSG-6复合物和HC2·TSG-6复合物的组合添加至PTX3/HA复合物中。

在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时后、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长的时间。在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤进行至少2小时或更长的时间。在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤进行至少2小时。在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤在37℃下进行。在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤在于PBS中的5mM MgCl₂中进行。

在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与针对HA的IαI和TSG-6接触的步骤进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长的时间。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC2·TSG-6复合物接触的步骤进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长的时间。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC2·TSG-6复合物接触的步骤进行至少2小时或更长的时间。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC2·TSG-6复合物接触的步骤进行至少2小时。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC1·TSG-6复合物接触的步骤在37℃下进行。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC1·TSG-6复合物接触的步骤在于PBS中的5mM MgCl₂中进行。

在一些实施方案中，所述方法包括使高分子量透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)蛋白质、包含重链1(HCl)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白质和肿瘤坏死因子α刺激的基因6(TSG-6)在适当的条件下同时接触，以形成HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，使HMWHA与PTX3、IαI和TSG-6的接触进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长的时间。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤在37℃下进行。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤在于PBS中的5mM MgCl₂中进行。

在一些实施方案中，所述方法包括使高分子量透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)蛋白质、包含重链1(HCl)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白质和肿瘤坏死因子α刺激的基因6(TSG-6)在适当的条件下以任何顺序相继接触，以形成HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，使HMW HA与PTX3、IαI和TSG-6的接触进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长的时间。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤在37℃下进行。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤在于PBS中的5mM MgCl₂中进行。

在一些实施方案中，用于生产rcHC-HA/PTX3复合物的方法进一步包括添加一种或多种小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，用于产生重建的HC-HA/PTX3复合物的方法包括：(a)使固定化的高分子量透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)在适当的条件下接触，以形成PTX3/HA复合物，(b)使PTX3/HA复合物与IαI和肿瘤坏死因子刺激的基因6(TSG-6)接触，以及(c)使PTX3/HA复合物与一种或多种SLRP接触。本文提供了通过该方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，TSG-6催化间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HCl)向HA的转移。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，按顺序相继进行该方法的步骤(a)、(b)和(c)。在一些实施方案中，同时进行该方法的步骤(a)、(b)和(c)。在一些实施方案中，进行该方法的步骤(a)，且随后按顺序相继进行该方法的步骤(b)和(c)。在一些实施方案中，进行该方法的步骤(a)，且随后同时进行该方法的步骤(b)和(c)。

在一些实施方案中，用于产生重建的HC-HA/PTX3复合物的方法包括：(a)使固定化的高分子量透明质酸(HMW HA)与针对HA的IαI和TSG-6接触以形成预结合至TSG-6的HC-HA复合物，(b)使HC-HA复合物与五聚环蛋白3(PTX3)接触，以及(c)使HC-HA复合物与一种或多种SLRP在适当的条件下接触，以形成rcHC-HA/PTX3复合物。本文提供了通过该方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，该方法包括：使预结合至TSG-6的HC-HA复合物与PTX3接触。在一些实施方案中，按顺序相继进行该方法的步骤(a)、(b)和(c)。在一些实施方案中，同时进行该方法的步骤(a)、(b)和(c)。在一些实施方案中，进行该方法的步骤(a)，且随后按顺序相继进行该方法的步骤(b)和(c)。在一些实施方案中，进行该方法的步骤(a)，且随后同时进行该方法的步骤(b)和(c)。

在一些实施方案中，SLRP选自I类、II类或II类SLRP。在一些实施方案中，SLRP选自I类SLRP，如饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自II类SLRP，如纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、PRELP(脯氨酸精氨酸丰富端亮氨酸丰富蛋白质)、角膜蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自III类SLRP，如骺蛋白聚糖和骨甘蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自尿抑胰酶素、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白质包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖包含硫酸角质素。

PTX3

在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从一个细胞或多个细胞(例如，组织提取物)中分离。适于表达PTX3的示例性细胞包括但不限于动物细胞(包括但不限于，哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞、啮齿类动物细胞、昆虫细胞、细菌以及酵母)和植物细胞(包括但不限于藻类、被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物)。在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从人细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从采用一种或多种促炎细胞因子刺激以上调PTX3表达的细胞中分离。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从羊膜细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从来自脐带的羊膜细胞中分离。在一些实施方案中，所述羊膜细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从脐带细胞中分离。在一些实施方案中，所述脐带细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从羊膜上皮细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从脐带上皮细胞中分离。在一些实施方案中，所述羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从羊膜基质细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从脐带基质细胞中分离。在一些实施方案中，所述羊膜基质细胞或脐带基质细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3为从细胞中分离的天然PTX3蛋白。在一些实施方案中，所述细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，PTX3通过重组技术制备。在一些实施方案中，PTX3从重组表达载体表达。在一些实施方案中，编码PTX3的核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方案中，编码PTX3的核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，PTX3在转基因动物中表达。在一些实施方案中，PTX3是重组蛋白。在一些实施方案中，PTX3是从细胞中分离的重组蛋白。在一些实施方案中，PTX3是在无细胞提取物中产生的重组蛋白。

在一些实施方案中，PTX3从羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊水或它们的组合中纯化。在一些实施方案中，PTX3从羊膜细胞中纯化。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是脐带上皮细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是羊膜基质细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是脐带基质细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，所述促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，PTX3不从一个细胞或多个细胞(例如，组织提取物)中分离。

在一些实施方案中，PTX3包含具有SEQ ID NO:33所示序列的多肽或其变体，该变体与具有SEQ ID NO:33所示序列的多肽具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性。示例性的变体包括，例如，物种变体、等位基因变体和包含保守和非保守氨基酸突变的变体。在一些实施方案中，PTX3包括足以与HA结合并促进rcHC-HA/PTX3复合物的形成的PTX3片段。在一些实施方案中，PTX3包括人PTX3的Glu18至Ser277。用于所提供的方法的PTX3的变体包括具有氨基酸修饰(该修饰为氨基酸置换(替代)、缺失或插入)的变体。在一些实施方案中，该修饰改善了PTX3多肽的一种或多种性质，如改善了rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种治疗性质(例如，如本文所述的抗炎、抗免疫、抗血管发生、抗瘢痕形成、抗粘连、再生或其他治疗活性)。

在一些实施方案中，PTX3蛋白从商业来源获得。PTX3的示例性商业来源是但不限于PTX3(目录号1826-TS；R&D Systems，Minneapolis，MN)。

在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3蛋白是多聚体蛋白质。在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3蛋白是同源多聚体。在一些实施方案中，所述同源多聚体是二聚体、三聚体、四聚体、六聚体、五聚体或八聚体。在一些实施方案中，PTX3同源多聚体是三聚体、四聚体或八聚体。在具体的实施方案中，PTX3同源多聚体是八聚体。在一些实施方案中，对多聚化结构域进行修饰，以改善PTX3蛋白的多聚化。在一些实施方案中，采用当与PTX3融合时改善PTX3的多聚化的异源多聚化结构域(例如，Fc多聚化结构域或亮氨酸拉链)替代多聚化结构域。

TSG-6

]在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从一个细胞或多个细胞(例如，组织提取物)中分离。适合用于表达TSG-6的示例性细胞包括但不限于动物细胞(包括但不限于，哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞、啮齿类动物细胞、昆虫细胞、细菌以及酵母)以及植物细胞(包括但不限于藻类、被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物)。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从人细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6表达的细胞中分离。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从羊膜细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从来自脐带的羊膜细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6表达的羊膜细胞中分离。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从脐带细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6表达的脐带细胞中分离。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从羊膜上皮细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从脐带上皮细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6表达的羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞中分离。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从羊膜基质细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从脐带基质细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6表达的羊膜基质细胞或脐带基质细胞中分离。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6为从细胞中分离的天然TSG-6蛋白。在一些实施方案中，所述细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6的表达。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，TSG-6通过重组技术制备。在一些实施方案中，TSG-6从重组表达载体表达。在一些实施方案中，编码TSG-6的核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方案中，编码TSG-6的核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，TSG-6在转基因动物中表达。在一些实施方案中，TSG-6是重组蛋白。在一些实施方案中，TSG-6是从细胞中分离的重组蛋白。在一些实施方案中，TSG-6是在无细胞提取物中产生的重组蛋白。

在一些实施方案中，TSG-6从羊膜、羊膜、绒毛膜、羊水或其组合中纯化。在一些实施方案中，PTX3从羊膜细胞中纯化。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，所述羊膜上皮细胞是脐带上皮细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是羊膜基质细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是脐带基质细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6的表达。在一些实施方案中，该促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。

在一些实施方案中，TSG-6不从一个细胞或多个细胞(例如，组织提取物)中分离。

在一些实施方案中，TSG-6包括足以促进或催化IαI的HC1向HA转移的TSG-6片段。在一些实施方案中，TSG-6包括TSG-6的连接模块。在一些实施方案中，TSG-6包含TSG-6的氨基酸Trp18至Leu277。在一些实施方案中，TSG-6包括具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽或其变体，该变体与具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性。示例性的变体包括，例如，物种变体、等位基因变体和含有保守和非保守氨基酸突变的变体。人TSG-6的天然等位基因变体包括，例如含有氨基酸置换Q144R的TSG-6。用于所提供的方法的TSG-6的变体或其HA结合片段包括具有氨基酸修饰(该修饰为氨基酸置换(替代)、缺失或插入)的变体。在一些实施方案中，该修饰改善了TSG-6多肽的一种或多种性质，例如改善了IαI的HC1向HA的转移或者改善了在IαI的HC1向HA转移之后TSG-6多肽从rcHC-HA/PTX3复合物中的释放。

在一些实施方案中，TSG-6包含亲和标签。示例性的亲和标签包括但不限于：血凝素标签、聚组氨酸标签、myc标签、FLAG标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签。此类亲和标签在本领域中公知用于纯化。在一些实施方案中，这样的亲和标签作为融合蛋白或通过化学连接体引入TSG-6多肽中。在一些实施方案中，TSG-6包含亲和标签，且将未结合的TSG-6通过亲和纯化从rcHC-HA/PTX3复合物中除去。

在一些实施方案，TSG-6蛋白从商业来源获得。TSG-6的示例性商业来源是但不限于TSG-6(目录号2104-TS R&D Systems，Minneapolis，MN)。

IαI

在一些实施方案中，所述IαI包含HC1链。在一些实施方案中，所述IαI包含HC1和HC2链。在一些实施方案中，所述IαI包含HC1和尿抑胰酶素。在一些实施方案中，所述IαI包含HCl和HC2链以及尿抑胰酶素。在一些实施方案中，所述IαI包含由硫酸软骨素链连接的HCl和HC2链以及尿抑胰酶素。

在一些实施方案中，IαI从生物样品中分离。在一些实施方案中，所述生物样品是来自哺乳动物的生物样品。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述生物样品是血液、血清、血浆、肝脏、羊膜、绒毛膜或羊水样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液、血清或血浆样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血清样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血浆样品。在一些实施方案中，所述IαI从人的血液、血浆或血清中纯化。在一些实施方案中，IαI从人血清中分离。在一些实施方案中，IαI并不从血清中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在羊膜细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在脐带细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在来自脐带的羊膜细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在羊膜上皮细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在脐带上皮细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在羊膜基质细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在脐带基质细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在肝细胞中产生。在一些实施方案中，IαI通过重组技术制备。

在一些实施方案中，IαI的HC1从生物样品中分离。在一些实施方案中，所述生物样品是来自哺乳动物的生物样品。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述生物样品是血液、血清、血浆、肝脏、羊膜、绒毛膜或羊水样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液、血清或血浆样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血清样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血浆样品。在一些实施方案中，IαI的HC1从人的血液、血浆或血清中纯化。在一些实施方案中，IαI从人血清中分离。在一些实施方案中，IαI的HC1并不从血清中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC1通过重组技术制备。在一些实施方案中，IαI的HC1从肝细胞中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC1从羊膜细胞中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC1从羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC1从羊膜基质细胞或脐带基质细胞中纯化。

在一些实施方案中，HC1包含具有SEQ ID NO:47所示序列的多肽或与具有SEQ IDNO:47所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性的多肽。

在一些实施方案中，IαI的HC2从生物样品中分离。在一些实施方案中，所述生物样品是来自哺乳动物的生物样品。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述生物样品是血液、血清、血浆、肝脏、羊膜、绒毛膜或羊水样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液、血清或血浆样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血清样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血浆样品。在一些实施方案中，IαI的HC2从人的血液、血浆或血清中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC2从人血清中分离。在一些实施方案中，IαI的HC2从人血清中分离。在一些实施方案中，IαI的HC2并不从血清中分离。在一些实施方案中，IαI的HC2通过重组技术制备。在一些实施方案中，IαI的HC2从肝细胞中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC2从羊膜细胞中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC2从羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC2从羊膜基质细胞或脐带基质细胞中纯化。

在一些实施方案中，HC2包含具有SEQ ID NO:49所示序列的多肽或与具有SEQ IDNO:49所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性的多肽。

在一些实施方案中，IαI包含尿抑胰酶素。在一些实施方案中，尿抑胰酶素包括具有SEQ ID NO:53所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:53所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，IαI包含硫酸软骨素链。

HA

在一些实施方案中，HA从细胞、组织或流体样品中纯化。在一些实施方案中，HA从商业供应商(例如，Sigma Aldrich或Advanced Medical Optics，Irvine，CA(例如，Healon))获得。在一些实施方案中，HA作为粉末从商业供应商获得。在一些实施方案中，HA在细胞中表达。适合用于表达HA的示例性细胞包括但不限于动物细胞(包括但不限于哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞、啮齿类动物细胞、昆虫细胞、细菌以及酵母)和植物细胞(包括但不限于藻类、被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物)。在一些实施方案中，HA在人细胞中表达。在一些实施方案中，HA在转基因动物中表达。在一些实施方案中，HA从表达透明质酸合酶(例如，HAS1、HAS2和HAS3)的细胞中获得。在一些实施方案中，所述细胞含有表达HA合酶的重组表达载体。在某些情况下，HA合酶在被挤压穿过细胞膜进入细胞外隙时通过将葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺反复添加到新生多糖上而使透明质酸延长。

用于所述方法的HA通常为高分子量(HMW)HA。在一些实施方案中，HMW HA的重均分子量大于约500千道尔顿(kDa)，例如，约500kDa至约10,000kDa、约800kDa至约8,500kDa、约1100kDa至约5,000kDa或约1400kDa至约3,500kDa。在一些实施方案中，HMW HA的重均分子量为约3000kDa。

附加组分

在一些实施方案中，加入一种或多种附加组分以产生rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，加入小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)以产生rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，SLRP是I类、II类或II类SLRP。在一些实施方案中，SLRP选自I类SLRP，如饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP选自II类SLRP，如纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、PRELP(脯氨酸精氨酸丰富端亮氨酸丰富蛋白质)、角膜蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP选自III类SLRP，如骺蛋白聚糖和骨甘蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP选自尿抑胰酶素、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，SLRP包含硫酸角质素。

HA固定化

在一些实施方案中，通过任何合适的方法将HMW HA固定化。在一些实施方案中，HMW HA固定于固体支持体，如培养皿、珠子、柱或其他合适的表面，例如，植入式医学装置的表面或其一部分，或固定在随后与如本文所述的植入式医学装置连接或合并的表面上。在一些实施方案中，HMW HA直接固定于固体支持体，例如通过化学连接。在一些实施方案中，HMW HA通过连接体或中间蛋白质间接附接至固体支持体上。用于在氨基和硫醇基之间形成共价键并将硫醇基引入蛋白质的众多异双功能交联试剂是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，HMW HA通过与固体支持体交联而直接固定于固体支持体上。在一些实施方案中，HMW HA直接固定于固体支持体而不与固体支持体交联。在一些实施方案中，HMW HA直接固定于固体支持体上作为涂层。在一些实施方案中，HMW HA固定于Covalink^TM-NH表面上。在一些实施方案中，HMW HA直接固定于固体支持体上作为涂层。在一些实施方案中，HMW HA在4℃下固定于Covalink^TM-NH表面上约16h。

在一些实施方案中，所述方法包括将HMW HA通过与固体支持体直接连接(即没有中间蛋白质)而固定于固体表面上。在一些实施方案中，在使固定化的HA与PTX3接触之前洗涤固体支持体以除去未结合的HMW HA。在一些实施方案中，在使固定化的HA与PTX3接触之前用8M GnHCl和PBS的洗液洗涤固体支持体，以除去未结合的HMW HA。

在一些实施方案中，所述方法包括通过中间蛋白质或连接体将HA固定于固体表面上。在一些实施方案中，所述连接体是肽连接体。在一些实施方案中，所述中间蛋白质是HA结合蛋白质(HABP)。在一些实施方案中，首先将HABP附接至固体支持体上(例如，通过交联、化学连接或通过化学连接体)。在一些实施方案中，随后使包含HABP的固体支持体与HA(例如，HMW HA)接触，以通过将HABP与HA结合而将HA固定于固体支持体上。在一些实施方案中，在使固定化的HMW HA与PTX3接触之前洗涤固体支持体以除去未结合的HMW HA。在一些实施方案中，在使固定化的HA与PTX3接触之前用8M GnHCl和PBS的洗液洗涤固体支持体，以除去未结合的HMW HA。

在一些实施方案中，所述方法包括通过将肽连接体附接至固体支持体以及将HA附接至肽连接体而将HA固定于固体表面上。在一些实施方案中，所述肽连接体包含蛋白酶切割位点。

在一些实施方案中，所述方法包括通过附接可切割的化学连接体(例如，但不限于二硫化物化学连接体)而将HA固定于固体表面上。

在一些实施方案中，选择用于所述方法的HABP是在rcHC-HA/PTX3复合物形成后从HA上解离的HABP。在一些实施方案中，HABP与HA非共价结合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用一种或多种解离剂从HABP上解离rcHC-HA/PTX3复合物。用于破坏非共价相互作用的解离剂(例如，盐酸胍、尿素和各种洗涤剂，例如，SDS)是本领域已知的。在一些实施方案中，所述解离剂是尿素。在一些实施方案中，所述解离剂是盐酸胍。在一些实施方案中，所述解离剂为约4M至约8M的盐酸胍。在一些实施方案中，所述解离剂为约4M、约5M、约6M、约7M、约8M的盐酸胍。在一些实施方案中，所述解离剂为在PBS中的约4M至约8M的pH 7.5的盐酸胍。

在一些实施方案中，采用此类解离剂从中间物HABP上解离rcHC-HA/PTX3复合物。选择用于所述方法的HABP使得对于HA的结合亲和力足够强以允许rcHC-HA/PTX3复合物的组装，但可采用合适的解离剂从rcHC-HA/PTX3复合物上解离下来。在一些实施方案中，所述解离剂是盐酸胍。

用于与本文提供的方法一起使用的示例性HABP包括但不限于，HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖(aggrecan)、多能蛋白聚糖(versican)、神经蛋白聚糖(neurocan)、短小蛋白聚糖(brevican)、磷酸蛋白聚糖(phosphacan)、TSG-6、CD44、斯塔比林(stabilin)-1、斯塔比林-2或足以结合HA的其一部分(例如，其连接模块)。在一些实施方案中，HABP包含具有SEQ ID NO:54-99中任一个所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:54-99中任一个所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，HABP是多能蛋白聚糖。在一些实施方案中，HABP是重组蛋白。在一些实施方案中，HABP是重组哺乳动物蛋白质。在一些实施方案中，HABP是重组人蛋白质。在一些实施方案中，HABP是重组多能蛋白聚糖蛋白质或足以与HA结合的其一部分。在一些实施方案中，HABP是重组聚集蛋白聚糖蛋白或足以与HA结合的其一部分。在一些实施方案中，HABP是天然HABP或足以与HA结合的其一部分。在一些实施方案中，天然HABP从哺乳动物组织或细胞中分离。在一些实施方案中，HABP从牛鼻软骨中分离(例如，来自Seikagaku的含有聚集蛋白聚糖的HA结合结构域和连接蛋白质的HABP)。

在一些实施方案中，HABP包含HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、TSG-6、CD44、斯塔比林-1或斯塔比林-2的连接模块。在一些实施方案中，包含连接模块的HABP包括具有SEQ ID NO:54-99的任何连接结构域所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:54-99的任何连接结构域所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，HABP包含多能蛋白聚糖的连接模块。在一些实施方案中，包含连接模块的HABP是重组蛋白。在一些实施方案中，包含多能蛋白聚糖的连接模块的HABP是重组蛋白。

在一些实施方案中，中间蛋白质，诸如HABP，包含由位点特异性蛋白酶(如费林蛋白酶(furin)、3C蛋白酶、胱天蛋白酶、基质金属蛋白酶或TEV蛋白酶)识别并水解的蛋白酶切割序列。在此类实施方案中，通过使固定化的复合物与切割特异性切割序列的蛋白酶接触而从固体支持体上释放组装的rcHC-HA/PTX3复合物。

在一些实施方案中，对rcHC-HA/PTX3复合物进行纯化。在一些实施方案中，通过任何合适的方法或这些方法的组合来对rcHC-HA/PTX3复合物进行纯化。下文描述的实施方案并非是排他性的，仅仅是示例性的。

在一些实施方案中，通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和羟基磷灰石色谱法)、凝胶过滤、离心(例如，梯度离心)或差别溶解法、乙醇沉淀法或通过用于蛋白质纯化的任何其他可行技术对rcHC-HA/PTX3复合物进行纯化。

在一些实施方案中，通过免疫亲和色谱法对rcHC-HA/PTX3复合物进行纯化。在一些实施方案中，产生针对rcHC-HA/PTX3复合物的组分的抗体(例如，抗HCl、抗PTX、抗rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种SLRP的抗体，例如，抗尿抑胰酶素、抗饰胶蛋白聚糖、抗双糖链蛋白聚糖或抗骨黏附蛋白聚糖)并将其附着在固体支持体上。在一些实施方案中，使未纯化的rcHC-HA/PTX3复合物(即，流动相)通过支持体。在某些情况下，rcHC-HA/PTX3复合物与抗体结合。在一些实施方案中，洗涤(例如，用PBS)支持体以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，随后使用能够从支持体洗脱rcHC-HA/PTX3复合物的溶液(例如，1％SDS，6M盐酸胍或8M尿素)洗涤支持体。在一些实施方案中，从解离的rcHC-HA/PTX3复合物中除去解离剂。在一些实施方案中，通过包括但不限于离子交换色谱法、透析、凝胶过滤色谱法、超滤或渗滤的方法从解离的rcHC-HA/PTX3复合物中除去解离剂。

在一些实施方案中，通过亲和色谱法对rcHC-HA/PTX3复合物进行纯化。在一些实施方案中，HABP用于与rcHC-HA/PTX3复合物结合以纯化该复合物，并附着在固定的支持体上。在一些实施方案中，使未纯化的rcHC-HA/PTX3复合物(即，流动相)通过支持体。在某些情况下，rcHC-HA/PTX3复合物与HABP结合。在一些实施方案中，洗涤(例如，用PBS)支持体以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，随后用能够从支持体洗脱rcHC-HA/PTX3复合物的溶液(例如，解离剂)洗涤支持体。在一些实施方案中，通过包括但不限于离子交换色谱法、透析、凝胶过滤色谱法、超滤或渗滤的方法从解离的rcHC-HA/PTX3复合物中除去解离剂。

在一些实施方案中，通过HABP亲和色谱法与使用针对rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种组分的抗体进行的免疫亲和色谱法的组合来对rcHC-HA/PTX3复合物进行纯化。

在一些实施方案中，本文公开的rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种组分包含亲和标签(例如，PTX3或HC1与亲和标签的融合蛋白)。在一些实施方案中，引入rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种组分中的示例性亲和标签包括但不限于血凝素标签、聚组氨酸、myc标签、FLAG标签或谷胱甘肽-S-转移酶序列。在一些实施方案中，亲和标签的配体附着在固体支持体上。在一些实施方案中，使未纯化的rcHC-HA/PTX3复合物通过支持体。在某些情况下，rcHC-HA/PTX3复合物与配体结合。在一些实施方案中，洗涤(例如，用PBS)支持体以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，随后用能够从支持体洗脱本文公开的rcHC-HA/PTX3复合物的溶液洗涤支持体。在一些实施方案中，通过包括但不限于离子交换色谱法、透析、凝胶过滤色谱法、超滤或渗滤的方法从解离的rcHC-HA/PTX3复合物中除去洗脱剂。

在一些实施方案中，将PTX3、TSG-6和/或HC1与标记偶联。“标记”指直接或间接地与多肽偶联以便产生标记的多肽的可检测的化合物或组合物。在一些实施方案中，标记是自身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，催化可检测的底物化合物组成的化学变化。标记的非限制性实例包括荧光部分、染料、荧光标签、绿色荧光蛋白或萤光素酶。

赋形剂

在一些实施方案中，所述组合物包含赋形剂。在一些实施方案中，该赋形剂选自pH调节剂、缓冲液、胶原、HA、抗生素、表面活性剂、稳定剂、蛋白质及其组合。在一些实施方案中，赋形剂包括细胞外基质(ECM)组分。在一些实施方案中，该ECM组分包括胶原、纤维蛋白、HA或其组合。

胶原是见于体内的主要结构蛋白。它提供对于组织的支持，连接组织与骨，并提供身体的结构。当身体处于愈合过程中时，胶原在帮助建立细胞结构中发挥作用。透明质酸是在关节液、眼玻璃体液、软骨、血管、细胞外基质、皮肤和脐带中发现的天然糖。纤维蛋白是参与血液凝结的蛋白质。

在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂与胶原、纤维蛋白或HA混合。胶原、纤维蛋白和HA可以是合适的递送媒介物，因为与胶原或HA混合的AM制剂被证明对TGF 13启动子活性产生抑制作用。尽管在本文所述的实验中胎儿支持组织的制剂与胶原凝胶和HA凝胶混合，但在一些实施方案中使用任何可溶形式(例如，液体)的胶原和HA或其他ECM组分(例如，纤维蛋白)。在一些实施方案中，胶原、纤维蛋白或HA来源于任何合适的来源。在一些实施方案中，AM与胶原、纤维蛋白或HA之比是变化的。在一些实施方案中，AM与胶原、纤维蛋白或HA之比小于约0.001:1、0.01:1、0.05:1或0.1:1至约1:1、1.5:1、2:1、5:1、10:1、100:1或1000:1或使用更大的比例。

在一些实施方案中，胶原凝胶通过用0.1N乙酸稀释原液(4mg/ml)，并将其与适当体积比的20x的DMEM或合适的缓冲液和1N NaOH混合来制备，如实施例1所述。在一些实施方案中，组合物中的胶原以小于约2mg/m1至大于约4mg/ml的范围存在。

在一些实施方案中，HA是高分子量(MW)HA。在一些实施方案中，各种稀释度的高MWHA通过在DMEM或合适的缓冲液中稀释商业制备的HA(Healon^TM(10mg HA/nil)(Pharmacia,LaJolla,CA)来制备。在一些实施方案中，胎儿支持组织制剂的干粉末和水溶形式在溶液如PBS、DMEM或其他溶液中稀释成所需的胶原浓度。在一些实施方案中，胎儿支持组织制剂中的HA以小于约2μg/ml至大于约129μg/ml的范围存在。

说明性制剂

实施例8至实施例15代表了用于制备本文所述及使用的胎儿支持组织制剂的说明性方法。

组合物

在一些实施方案中，包含胎儿支持组织的制剂的组合物被配制用于作为非固体剂型施用。在一些实施方案中，非固体剂型包括将制剂与递送媒介物组合以产生组合物，如溶液、滴剂、悬浮液、糊剂、喷雾、软膏、油、乳液、气雾剂、包衣绷带、贴剂、乳膏、洗剂、凝胶等。使用的制剂将取决于具体应用。凝胶可用于施用组合物，因为它们允许活性成分在引入部位更好地保留，以使活性成分在其清除之前在更长的时间内发挥其作用。在一些实施方案中，该组合物被配制为延长释放固体剂型(包括口服剂型)。

在一些实施方案中，使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制组合物，所述载体包括促进胎儿支持组织的制剂加工成药学上使用的组合物的赋形剂和助剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。可以适当地且如本领域所理解的那样使用任何公知的技术、载体和赋形剂。

在一些实施方案中，胎儿支持组织的组合物为液体、悬浮液、凝胶或冻干粉末的形式或其他形式。在一些实施方案中，该组合物是可注射的。在一些实施方案中，胎儿支持组织的组合物包含抗微生物剂。在一些实施方案中，该抗微生物剂是抗生素或抗真菌剂。在一些实施方案中，胎儿支持组织的组合物包含附加物质以稳定并且/或者保存胎儿支持组织的组合物。在一些实施方案中，胎儿支持组织的组合物在使用前被包装并储存在室温、-20℃或-80℃。

在某些实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。在一些实施方案中，该组合物进一步包含其他活性成分，如在联合疗法中。在一些实施方案中，该组合物包含其他药物或药剂，载体，佐剂如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂，溶液促进剂，和用于调节渗透压的盐，缓冲液，或其组合。在一些实施方案中，该组合物包含附加治疗剂。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包含化学组分，如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、赋形剂或其组合。在一些实施方案中，该组合物有利于该制剂施用于个体。在一些实施方案中，治疗有效量的胎儿支持组织的组合物作为可注射组合物施用于患有待治疗的疾病、病症或病况的个体。在一些实施方案中，该个体是哺乳动物。在一些实施方案中，该哺乳动物是人。在一些实施方案中，该治疗有效量根据个体的疾病严重程度、年龄和相对健康以及所使用的组合物的效力和其他因素而变化。在一些实施方案中，该组合物单独使用或作为混合物的组分与一种或多种治疗剂组合使用。

眼用组合物：

在一些实施方案中，眼用组合物包含胎儿支持组织的制剂；和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。在一些实施方案中，眼用组合物基本上由基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合物，以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体组成。在一些实施方案中，该组合物被制备用于局部递送至眼。在一些实施方案中，该组合物系统地施用，如静脉内施用。在一些实施方案中，该组合物局部施用于眼。在一些实施方案中，该组合物被配制成多种局部可施用的眼用组合物。在一些实施方案中，该局部可施用的眼用组合物包括溶液、悬浮液、凝胶或软膏。在一些实施方案中，该组合物被配制用于注射到眼中。在一些实施方案中，该组合物通过玻璃体内注射到眼中来施用。在一些实施方案中，该组合物通过眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周施用、结膜下注射、球后注射、前房内注射(包括注射到前房或玻璃体房中)或筋膜下注射来施用。在一些实施方案中，该组合物通过植入物、眼用溶液、眼用悬浮液、眼用软膏、眼植入物和眼插入物、眼内溶液、使用离子电渗疗法、引入手术灌洗液和棉塞(packs)(仅举例来说，将饱和棉拭子插入穹窿中)来施用。

在一些实施方案中，所述组合物是液体组合物，其中胎儿支持组织的制剂存在于溶液、悬浮液中或两者中。在一些实施方案中，该组合物包括凝胶制剂。在其他实施方案中，该液体组合物是水性的。在一些实施方案中，该组合物是软膏。

在一些实施方案中，所述组合物是水性组合物。在一些实施方案中，该水性组合物是水溶液、悬浮液或溶液/悬浮液。在一些实施方案中，该水性组合物呈现为滴眼剂的形式。在一些实施方案中，所需剂量经由已知的滴数施用于眼中。例如，对于一滴体积为25μl来说，施用1-6滴将递送25-150μl组合物。在一些实施方案中，水性组合物包含约0.01％至约50％重量/体积的胎儿支持组织的制剂或纯化组分。在一些实施方案中，水性组合物包含约0.1％至约20％重量/体积的胎儿支持组织的制剂或纯化组分。在一些实施方案中，水性组合物包含约0.2％至约10％重量/体积的胎儿支持组织的制剂或纯化组分。在一些实施方案中，水性组合物包含约0.5％至约5％重量/体积的胎儿支持组织的制剂或纯化组分。在一些实施方案中，水性组合物具有眼部可接受的pH和重量摩尔渗透压浓度(osmolality)。关于制剂、组合物或成分的“眼部可接受的”通常意指对所治疗的眼或其功能，或对正在治疗的受试者的总体健康不具有持续的有害效应。瞬态效应如轻度刺激或“刺痛”感在局部眼部施用药剂中是常见的，并且与所讨论的制剂、组合物或成分为“眼部可接受的”是一致的。

在一些实施方案中，所述组合物是水性组合物并包含聚合物作为悬浮剂。在一些实施方案中，该水性组合物包含多于一种聚合物作为悬浮剂。在一些实施方案中，该聚合物包括水溶性聚合物、水不溶性聚合物或其组合。在一些实施方案中，该水溶性聚合物包括纤维素聚合物。在一些实施方案中，该纤维素聚合物包括羟丙基甲基纤维素。在一些实施方案中，该水不溶性聚合物包括交联的含羧基聚合物。在一些实施方案中，该水性组合物包含眼部可接受的粘膜粘附聚合物。在一些实施方案中，该粘膜粘附聚合物包括羧甲基纤维素、卡波姆(丙烯酸聚合物)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚卡波非、丙烯酸/丙烯酸丁酯共聚物、海藻酸钠、葡聚糖或其组合。

在一些实施方案中，所述组合物包含眼部可接受的增溶剂以帮助胎儿支持组织的制剂在该组合物中的溶解度。在一些实施方案中，该组合物包含眼部可接受的增溶剂以帮助纯化的HC-HA/PTX3在该组合物中的溶解度。术语“增溶剂”一般包括导致胶束溶液的形成的试剂或该试剂的真溶液。在一些实施方案中，该眼部可接受的增溶剂是非离子型表面活性剂。在一些实施方案中，该非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯80、二醇、聚二醇、聚乙二醇400、二醇醚或其衍生物或其任何组合。

在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种眼部可接受的pH调节剂或缓冲剂。在一些实施方案中，该pH调节剂包括酸。在一些实施方案中，该酸选自以下列表：乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸。在一些实施方案中，该pH调节剂包括碱。在一些实施方案中，该碱选自以下列表：氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷。在一些实施方案中，该缓冲剂选自以下列表：柠檬酸盐/右旋糖，碳酸氢钠和氯化铵。在一些实施方案中，以一定的量包含酸、碱或缓冲液，该量是将组合物的pH维持在眼部可接受的范围内所需的量。

在一些实施方案中，所述组合物包含一定量的眼部可接受的盐，该量是使该组合物的重量摩尔渗透压浓度处于眼部可接受的范围内所需的量。在一些实施方案中，该盐包含钠、钾或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子。在一些实施方案中，该盐选自以下列表：氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫酸铵或其组合。

在一些实施方案中，所述组合物包含眼部可接受的防腐剂以抑制微生物活性。在一些实施方案中，该防腐剂包含含汞物质、稳定的二氧化氯、季铵化合物或其组合。在一些实施方案中，该含汞物质包括苯汞(merfen)、硫柳汞或其组合。在一些实施方案中，该季铵化合物包括苯扎氯铵、溴化十六烷基三甲铵、西吡氯铵或其组合。

在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种眼部可接受的表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。在一些实施方案中，该表面活性剂包括非离子型表面活性剂。在一些实施方案中，该非离子型表面活性剂选自以下列表：聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯昔醇10、辛苯昔醇40。

在一些实施方案中，所述组合物在必要时包含一种或多种抗氧化剂以增强化学稳定性。在一些实施方案中，该抗氧化剂包括抗坏血酸、焦亚硫酸钠或其组合。

在一些实施方案中，所述组合物被包装在不可再封闭的单剂量容器中。在一些实施方案中，该组合物被包装在可再封闭的多剂量容器中。在一些实施方案中，当包装在可再封闭的多剂量容器中时，该组合物进一步包含防腐剂。

在一些实施方案中，所述组合物为被插入在眼与眼睑之间或插入在结膜囊中的固体制品的形式，在其中它释放所述制剂。在一些实施方案中，该制剂被释放至浸湿角膜表面的泪液，或直接释放至该固体制品通常密切接触的角膜自身。在一些实施方案中，适合于植入眼中的固体制品包含聚合物。在一些实施方案中，适合于植入眼中的固体制品是可生物降解或不可生物降解的。

可注射组合物：

在一些实施方案中，所述组合物是可注射组合物。在一些实施方案中，该可注射组合物包含胎儿支持组织的制剂；和药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。在一些实施方案中，该可注射组合物基本上由基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合，以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体组成。在一些实施方案中，该可注射组合物适合于眼内、肌内、皮下或静脉内注射。在一些实施方案中，该可注射组合物包含生理上可接受的无菌水溶液或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液以及用于重建为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的非限制性实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、克列莫佛等)、其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。在一些实施方案中，通过使用涂料、表面活性剂或其组合来保持适当的流动性。在一些实施方案中，该涂料为卵磷脂。在一些实施方案中，该可注射组合物包含添加剂。在一些实施方案中，该添加剂选自以下列表：防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂或其组合。在一些实施方案中，该可注射组合物包含抗细菌剂或抗真菌剂。在一些实施方案中，该抗细菌剂或抗真菌剂包括对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸或其组合。在一些实施方案中，该可注射组合物包含等渗剂。在一些实施方案中，该等渗剂包括糖、氯化钠或其组合。在一些实施方案中，该可注射组合物包含吸收延迟剂。在一些实施方案中，该吸收延迟剂包括单硬脂酸铝、明胶或其组合。

在一些实施方案中，静脉内施用所述可注射组合物。在一些实施方案中，该可注射组合物被配制在水溶液中、生理学上相容的缓冲液中，如汉克溶液、林格溶液、生理盐水缓冲液或另一种合适的溶液中。在一些实施方案中，对于经粘膜施用，在制剂中使用适合于待穿透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域公知的。在一些实施方案中，对于肠胃外注射，合适的制剂包括水性或非水性溶液，优选具有生理学上相容的缓冲液或赋形剂。这样的赋形剂是本领域公知的。

在一些实施方案中，肠胃外注射包括弹丸注射或持续输注。在一些实施方案中，所述组合物以单位剂型提供，例如，在安瓿中，或在具有添加的防腐剂的多剂量容器中提供。在一些实施方案中，该可注射组合物是适合于作为在油性或水性媒介物中的无菌悬浮液、溶液或乳液进行肠胃外注射的制剂的形式。在一些实施方案中，该可注射组合物包含配制剂。在一些实施方案中，该配制剂为悬浮剂、稳定剂、分散剂或其组合。在一些实施方案中，用于肠胃外施用的可注射组合物包含水溶形式的胎儿支持组织制剂的水溶液。在一些实施方案中，活性化合物的悬浮液被制备成油性注射悬浮液。在一些实施方案中，该可注射组合物包含亲脂性溶剂或媒介物。亲脂性溶剂或媒介物的非限制性实例包括但不限于，脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。在一些实施方案中，该可注射注射组合物含有提高该悬浮液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。在一些实施方案中，该可注射组合物含有合适的稳定剂或提高化合物的溶解度的试剂以允许制备高度浓缩的溶液。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂是粉末形式，以在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水来重建。

给药方法和治疗方案：

在一些实施方案中，所述组合物通过任何合适的技术来施用。在一些实施方案中，将组合物直接施用于目标部位(例如，眼表面、玻璃体等)。在一些实施方案中，局部施用该组合物。在一些实施方案中，肠胃外(例如，皮下)施用该组合物。在一些实施方案中，眼内施用组合物。

在一些实施方案中，施用所述组合物以用于预防性和/或治疗性应用。在一些实施方案中，将组合物施用至已经罹患疾病或病症的个体。在一些实施方案中，对于这一用途有效的量将取决于疾病或病况的严重程度和病程，既往治疗，个体的健康状况、体重和对药物的反应，以及治疗医生的判断。

在一些实施方案中，将所述组合物施用至怀疑患有特定疾病、病症或病况或处于特定疾病、病症或病况的风险中的个体。这样的量被定义为“预防有效量或剂量”。在该用途中，精确量还取决于个体的健康状况、体重等。在一些实施方案中，使用剂量递增试验来确定预防有效量。在一些实施方案中，使用任何合适的方法来确定预防有效量。在一些实施方案中，预防有效量取决于疾病、病症或病况的严重程度和病程，既往治疗，个体的健康状况和对药物的反应，以及治疗医生的判断。

在个体的状况没有好转的情况下，基于医生的判断，长期施用所述组合物，即，持续延长的一段时间，包括贯穿个体生命的整个持续时间，以改善或以其他方式控制或限制个体的疾病或病况的症状。

在个体的状况确实好转的情况下，基于医生的判断，连续施用所述组合物或者暂时减少施用的药物的剂量或暂停一定的时间长度(即“休药期”)。在一些实施方案中，休药期的长度在2天至1年之间不等，仅举例来说，包括，2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。在一些实施方案中，休药期期间的剂量减少10％-100％，仅通过举例的方式，包括，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

一旦发生个体的状况的改善，如有需要则施用维持剂量。随后，施用的剂量或频率或这两者均作为症状的函数降低至保持改善的疾病、病症或病况的水平。在一些实施方案中，一旦出现任何症状复发，个体需要长期的间歇治疗。

在一些实施方案中，施用于个体的组合物的量根据诸如疾病或病况及其严重程度、需要治疗的个体的特征(例如，体重、性别、年龄、整体健康)等因素而变化。在一些实施方案中，根据关于病例的具体情况，包括例如施用的具体制剂、组合物或制品、施用途径、所治疗的病况以及治疗的个体，以本领域已知的方式来确定施用的组合物的量。在一些实施方案中，用于成人治疗的量或剂量在0.02-5000mg/天的范围内，优选1-1500mg/天。在一些实施方案中，所需剂量以单剂量提供，或以同时施用(或在短的时间段内)或以适当间隔施用的分剂量，例如每天二、三、四个或更多个亚剂量来提供。

在一些实施方案中，所述组合物是适于单次施用精确的量或剂量的单位剂量形式。在单位剂量形式中，组合物被分成包含合适的量或剂量的组合物的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量是包含离散量的组合物的包装的形式。非限制性实例是包装在小瓶或安瓿中的粉末。在一些实施方案中，组合物被包装在不可再封闭的单剂量容器中。在一些实施方案中，使用可再封闭的多剂量容器，在这种情况下，一般在组合物中包含防腐剂。在一些实施方案中，用于肠胃外注射的组合物以包括但不限于安瓿的单位剂量形式提供，或者在添加有防腐剂的多剂量容器中提供。

在一些实施方案中，适合于所述组合物的每日剂量是约0.01至2.5mg/kg体重。所指示的每日剂量在约0.5mg至约100mg的范围内，方便地以分剂量施用，包括但不限于每天至多四次或为延长释放的形式。上述范围仅是建议性的，因为关于个体治疗方案的变量数目庞大，并且相当大地偏离这些推荐值的情况并不少见。在一些实施方案中，剂量根据许多变量而变化，这些变量不限于组合物的活性、待治疗的疾病或病况、给药方式、个体的要求、所治疗的疾病或病况的严重程度和医师的判断。

在一些实施方案中，通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定这样的治疗方案的毒性和治疗功效，包括但不限于，LD₅₀(在群体中50％致死的剂量)和ED₅₀(在群体中50％治疗有效的剂量)的测定。在一些实施方案中，有毒的和治疗的效果之间的剂量比是治疗指数，它可表示为LD₅₀和ED₅₀之间的比率。优选表现出高治疗指数的组合物。在一些实施方案中，使用获自细胞培养测定或动物研究的数据来制定在个体中使用的剂量范围。在一些实施方案中，该组合物的剂量在包括具有最小毒性的ED₅₀的循环浓度范围内。在一些实施方案中，剂量在此范围内变化，这取决于采用的剂型和使用的给药途径。

联合治疗

在一些实施方案中，所述组合物与附加治疗化合物共施用。在一些实施方案中，该附加治疗剂不在同一组合物中施用。在一些实施方案中，该附加治疗剂通过与该组合物的不同的途径施用。施用方式的确定以及在同一组合物中施用(可能时)的可取性完全在熟练临床医师的知识范围内。在一些实施方案中，根据本领域已知的确立方案进行初始施用，随后基于所观察到的效果、施用剂量、方式和施用次数，由熟练的临床医师进行修改。

在一些实施方案中，所使用的附加治疗化合物的具体选择取决于主治医师的诊断和其对个体病况的判断，以及适当的治疗方案。在一些实施方案中，该附加治疗化合物可以并发(例如，同时、基本上同时或在同一治疗方案内)或依次施用，这取决于疾病、病症或病况的性质，个体的状况，以及所使用的化合物的实际选择。在评估正在治疗的疾病和个体的状况后，施用顺序和治疗方案期间每种治疗剂的施用重复次数的确定完全在熟练医师的知识范围内。

在一些实施方案中，当组合物在联合治疗中使用时，治疗有效剂量有所变化。在一些实施方案中，使用任何合适的方法来确定用于在联合治疗方案中使用的药物和其他药剂的治疗有效剂量。在一些实施方案中，节律给药(即，提供更频繁、更低的剂量以使毒副作用最小化)用来确定用于在联合治疗中使用的药物和其他药剂的治疗有效剂量。在一些实施方案中，联合治疗包括在不同的时间开始和结束的周期性治疗，以辅助个体的临床管理。

在一些实施方案中，附加治疗剂的剂量根据采用的联合药物的类型、采用的具体药物、正在治疗的疾病或病况等而变化。在一些实施方案中，当与一种或多种附加治疗剂共施用时，组合物与该附加治疗剂同时或依次施用。如果依次施用，则主治医师将决定该组合物与附加治疗剂联合施用的适当顺序。

在一些实施方案中，多种附加治疗剂与所述组合物联合施用。在一些实施方案中，多种附加治疗剂以任何顺序或甚至同时施用。如果同时施用，则该多种附加治疗剂以单一的统一形式，或以多种形式(仅举例而言，作为单个丸剂或作为两个单独的丸剂)提供。在一些实施方案中，这些附加治疗剂中的一种以多个剂量给予，或者两者都可以以多个剂量给予。在一些实施方案中，如果不是同时施用，则多次给药之间的时间可在超过零周至小于四周之间变化。

在一些实施方案中，用于治疗、预防或改善寻求缓解的病况的剂量方案根据多个因素进行修改。在一些实施方案中，这些因素包括个体患有的病症，以及个体的年龄、体重、性别、饮食和医疗状况，或其组合。在一些实施方案中，剂量方案变化很大，并且偏离本文所述的剂量方案。

在一些实施方案中，构成联合治疗的组合物和附加治疗剂是组合剂型，或是旨在用于基本同时施用的单独的剂型。在一些实施方案中，构成联合治疗的组合物和附加治疗剂依次施用，其中组合物或附加治疗剂通过要求两步施用的方案进行施用。在一些实施方案中，该两步施用方案要求组合物和附加治疗剂的依次施用，或组合物和附加治疗剂的空间分离的施用。在一些实施方案中，多个施用步骤之间的时间段在数分钟至数小时的范围内，这取决于每种药剂的性质，如组合物或附加治疗剂的效力、溶解性、生物利用度、血浆半衰期和动力学谱。在一些实施方案中，组合物或治疗剂浓度的昼夜节律(Circadian)变化决定最佳的给药间隔。

在一些实施方案中，所述组合物与可向个体提供附加或协同益处的程序联合使用。仅举例而言，预期个体经本文所述的方法获得治疗和/或预防益处，其中将该组合物或该组合物与附加治疗剂的组合与遗传检测组合，以确定个体是否是已知与某些疾病或病况有关的突变基因的携带者。

在一些实施方案中，所述组合物和联合疗法在疾病或病况发生之前、过程中或之后施用，并且施用含有化合物的组合物的时间有所不同。在一些实施方案中，该组合物用作预防药并持续施用于有发生病况或疾病的倾向的个体，以预防该疾病或病况的发生。在一些实施方案中，该组合物在症状发作过程中或发作之后尽可能快地施用于个体。在一些实施方案中，该组合物的施用在症状发作的最初48小时内开始，优选在症状发作的最初48小时内，更优选在症状发作的最初6小时内，最优选在症状发作的3小时内。在一些实施方案中，首次施用经由任何可行的途径，例如，静脉内注射、弹丸注射、经5分钟至约5小时的输注，等等，或其组合。在一些实施方案中，在检测到或怀疑疾病或病况发作之后在可行的情况下尽快施用组合物，并持续疾病治疗所需的时间长度，例如，约1个月至约3个月。在一些实施方案中，治疗的时间长度对于每个个体都不同，且该时间长度使用已知标准来确定。在一些实施方案中，该组合物施用至少2周，优选约1个月至约5年，更优选约1个月至约3年。

治疗方法：

在某些实施方案中，本文公开了用于预防或减少有需要的个体中上皮细胞的增殖、细胞迁移和/或EMT的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的可注射组合物，该组合物包含：(a)胎儿支持组织的制剂；和(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体，从而预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移和/或EMT。在一些实施方案中，EMT与除了PVR以外的疾病有关。

在某些实施方案中，本文公开了用于治疗或预防有需要的个体中的增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的可注射组合物，该组合物包含：(a)胎儿支持组织的制剂；和(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体，从而治疗或预防PVR。

在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含纯化的HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含超速离心的HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂由纯化的HC-HA/PTX3组成。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含重建的HC-HA/PTX3。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含通过共价键与间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)的重链交联的高分子量透明质酸(HA)，所述高分子量HA具有大于1000kDa的分子量。在一些实施方案中，该制剂包含五聚环蛋白3(PTX-3)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含肿瘤坏死因子刺激的基因6蛋白(TSG-6)。在一些实施方案中，胎儿支持组织的制剂包含血小板反应蛋白-1(TSP-1)。在一些实施方案中，所述组合物中总蛋白质与HA之比小于500份蛋白质:1份HA。在一些实施方案中，所述组合物中HA与总蛋白质之比小于500份HA:1份蛋白质。

在一些实施方案中，所述上皮细胞是人上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是视网膜色素上皮细胞(RPE)。在一些实施方案中，该人上皮细胞是肾上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是角膜上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是角膜缘上皮细胞。在一些实施方案中，该人上皮细胞是结膜上皮细胞。

在一些实施方案中，所述组合物通过抑制或阻止生长因子或细胞因子的活性来预防上皮细胞的增殖和EMT。在一些实施方案中，该生长因子和细胞因子选自：EGF、FGF-2、PDGF-A、PDGF-AB、PDGF-B、PDGF-C、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、CTGF、HGF、IGF-1、G-CSF、IL-6、MCP-1、TNF-α、VEGF和IFN-γ。在一些实施方案中，该组合物抑制上皮细胞中的信号传导途径以抑制增殖和EMT。在一些实施方案中，该信号传导途径是典型Wnt信号传导和TGF-β-诱导的Smad/ZEB信号传导。

在一些实施方案中，所述组合物包含由胎盘组织、脐带组织、脐带羊膜组织、胎盘羊膜组织、羊膜基质组织、羊膜-绒毛膜组织、绒毛膜组织、羊水或其组合制备的胎儿支持组织的制剂。在一些实施方案中，将胎盘组织、脐带组织、羊膜组织、绒毛膜组织或其组合均化、粉碎或磨碎。在一些实施方案中，胎盘组织、脐带组织、羊膜组织、绒毛膜组织或其组合是新鲜的、冷冻的或已预先冷冻的。在一些实施方案中，组合物包含胎儿支持组织的制剂和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。在一些实施方案中，该组合物进一步包含水性佐剂。在一些实施方案中，该组合物用于局部施用。在一些实施方案中，该组合物用于注射。在一些实施方案中，该组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射。

本文公开的方法具有许多用途，包括研究和临床应用。在一些实施方案中，将所述方法应用于组织或细胞以获得所需的生理学的调节。在一些实施方案中，将所述方法用于细胞培养物或组织培养物以获得所需的效果。

在一些实施方案中，所述方法用来预防、减轻或治疗组织中的凋亡。在一些实施方案中，所述方法用来减少或预防已受损伤的组织中的凋亡。在一些实施方案中，所述方法用来延长移植前储存的器官的寿命。在一些实施方案中，所述方法用来治疗或预防手术过程中或手术之后的损伤。

在一些实施方案中，方法可用于在移植前保存组织(例如，角膜)。在一些实施方案中，所述方法减轻由储存过程引起的细胞损伤。在一些实施方案中，所述方法用来减少在移植或手术前储存的组织中发生的降解的量。在一些实施方案中，将制剂或组合物添加到具有或不具有胶原和/或HA的贮存培养基中。储存的组织如眼、器官、皮肤等可受益于当添加组合物时发生的细胞凋亡的减少。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括在获得供体组织后将供体组织储存在贮存培养基中直到移植。在一些实施方案中，将组合物添加到贮存培养基中以防止细胞凋亡。在一些实施方案中，将组合物添加到贮存培养基中以保存角膜缘上皮干细胞。在一些实施方案中，将组合物添加到细胞培养基或消化培养基中以防止细胞(例如，角膜细胞)凋亡。因为本文所述的研究表明，在分散酶消化(一种治疗方法，其模拟手术和病理性损伤，分别如PRK中的准分子消融(excimer ablation)和复发性角膜糜烂)过程中组合物的温育显著减少了上皮细胞和角膜细胞的凋亡。在一些实施方案中，将该组合物施用于接受机械刮擦或准分子激光光消融的眼睛，以试图减少角膜细胞凋亡，从而减少角膜混浊。在一些实施方案中，所述方法用于外科病况或疾病，如复发性角膜糜烂或圆锥角膜(keratoconus)，其中基膜被溶解以减少角膜细胞凋亡。

在一些实施方案中，所述方法用来实现AMSC从肌成纤维细胞到成纤维细胞的表型逆转。在一些实施方案中，所述方法用来防止或减缓各种细胞类型的分化。在一些实施方案中，许多类型的细胞采用该方法处理。该方法尤其可用于在不引起培养物分化为不希望的细胞类型的情况下扩大细胞培养。

药剂盒/制品：

为了在本文所述的方法中使用，本文还描述了药剂盒和制品。在一些实施方案中，药剂盒包含被分区以接纳一个或多个容器如小瓶、管等的载具、包装或容器，其中每个容器包含将要在本文所述方法中使用的一种单独的元素。在一些实施方案中，容器为瓶、小瓶、注射器或试管。在一些实施方案中，容器由多种材料如玻璃或塑料形成。在一些实施方案中，包含一个或多个预填充注射器的药剂盒包含本文公开的组合物。

在一些实施方案中，制品含有包装材料。用于包装药品的包装材料是本领域技术人员公知的。药物包装材料的非限制性实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适合于选定的制剂以及预期的施用方式和治疗的任何包装材料。本文提供的制剂和组合物的多种配制剂都被考虑用作任何疾病、病症或病况的多种治疗。

在一些实施方案中，容器包含一种或多种胎儿支持组织的制剂，该胎儿支持组织的制剂任选地在组合物中或与本文公开的另一种药剂组合。在一些实施方案中，容器包含无菌进入孔。在一些实施方案中，该容器是静脉内溶液袋或小瓶。在一些实施方案中，该无菌进入孔是可被皮下注射针刺穿的塞子。在一些实施方案中，该药剂盒包含组合物以及关于其在本文所述方法中的使用的标识性描述或标签或说明书。

在一些实施方案中，药剂盒包含一个或多个额外的容器，每个容器具有从商业和用户角度来看对用于包含胎儿支持组织的组合物所需的多种材料(如试剂(任选地为浓缩的形式)，和/或装置)中的一种或多种。这类材料的非限制性实例包括但不限于缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器；载具、包装、容器、小瓶和/或管标签(其列出内容物)和/或使用说明，以及具有使用说明的包装插页。在一些实施方案中，包含一系列说明。

在一些实施方案中，标签在容器之上或与容器相关联。在一些实施方案中，当构成标签的字母、数字或其他字符附接、模制或蚀刻到容器自身中时，标签在容器之上。在一些实施方案中，当标签存在于(例如作为包装插页)同样容纳容器的器皿(receptacle)或载具内时，标签与容器相关联。在一些实施方案中，标签用于说明内容物将用于特定治疗应用。在一些实施方案中，标签说明关于内容物的使用，如在本文所述方法中使用的指导。

在某些实施方案中，可注射组合物被提供在包装或分配器装置中，该包装或分配器装置含有一个或多个含有本文提供的可注射组合物的单位剂量形式。在一些实施方案中，该包装含有金属或塑料箔，如泡罩包装。在一些实施方案中，该包装或分配器装置伴随有施用说明书。在一些实施方案中，该包装或分配器装置伴随有管制药品制造、使用或销售的政府机构规定的形式的与容器相关联的通知，该通知反映出该机构批准该药物形式用于人或兽医施用。在一些实施方案中，该通知是被美国食品和药品管理局批准用于处方药的标签，或批准的产品插页。在一些实施方案中，制备可注射组合物，将其置于合适的容器中，并标出用于指定病况的治疗。

以下实施例中进一步详细地提供了本文所述的组合物和方法。这些实施例仅以说明的方式提供，而并非旨在以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1：实例制剂

如下制备可注射组合物：将HA、TSG-6、PTX-3和TSP-1各10mg混合，每一种均从商业来源获得，其中100mg的制剂包含：胎盘组织、脐带组织、羊膜组织、绒毛膜组织或其组合；随后与10mL的0.9％无菌盐水混合。将该混合物并入适合于通过注射施用的剂量单位形式中。

实施例2：羊膜组分的表征

材料和方法

每一种提取物中的蛋白质浓度都通过BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce,Rockford,IL.)来定量。使用由制造商提供的通过系列稀释HA制作的标准曲线，采用透明质酸(HA)定量测定试剂盒(Corgenix,Westminster,CO.)根据ELISA来测定每一种提取物中的透明质酸(HA)浓度。

通过透明质酸酶消化分析HA分子量范围

提取物的HA分子量范围根据Lee和Cowman(Lee H.G.和Cowman,M.K.An AgaroseGel Electrophoretic Method for Analysis of Hyaluronan Molecular WeightDistribution.Analytical Biochemistry,1994,219,278-287)所述的方法通过琼脂糖凝胶电泳来分析。对样品进行0.5％琼脂糖凝胶电泳，接着使用50％乙醇中的0.005％Stains-All(Sigma，目录号23096-0)染色。将凝胶在室温下在光防护罩下染色过夜(3-4hr的较短染色期也可给出可接受的结果)。在通过将凝胶转移到H₂O中并暴露于室内光线约6hr进行脱色之后，HA显示为蓝色条带。分子量标准包括MW范围为0.9至5.7x10⁶的λDNA-BstE II消化的限制片段(目录号D9793，Sigma)。HA的真实性进一步如下验证：在37℃下将提取物在有或没有10单位/ml透明质酸酶(Sigma#H1136)的情况下在反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，0.1M NaCl，1％Triton X-100，0.1％BSA，补充有上述蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中温育2h，使用从人脐带中纯化的高MW HA(目录号H1876，Sigma)作为阳性对照。

Western印迹分析

将上述提取物在4-15％变性丙烯酰胺凝胶上电泳并转移到硝酸纤维素膜上，随后用兔抗人间-α-胰蛋白酶抑制剂(兔多克隆抗体(目录号A0301)，1:1000的DAKO)、兔抗人TSG-6多克隆抗体(由Tony Day博士提供，1:1000稀释)、大鼠单克隆抗-PTX3抗体(AlexisBiochemicals，ALX-804-464，1μg/ml)、从Calbiochem获得的抗血小板反应蛋白-1抗体(目录号BA24)和山羊抗人Smad 7抗体(AF2029，1:1000，R&D Systems)进行免疫印迹分析。通过Western Lighting^TM化学发光试剂(PerkinElmer)检测免疫反应性蛋白质条带。

结果

实验表明，当水溶性AM提取物在90℃下预热10分钟时，所观察到的对TGFβ1启动子活性的抑制作用消除，这表明起作用的组分最可能含有蛋白质，该蛋白质的构象是重要的。

AM提取物中HA和蛋白质的定量

表1中总结的结果表明，所有AM和胶质提取物都含有HA和蛋白质。一般而言，对于AM，离心之后总提取物中的蛋白质与HA的重量比高于上清液(例如，PBS的L和H，缓冲液A的A)，这表明大多数含蛋白质的物质通过离心已去除。然而，在AM胶质中则未表现出这种趋势，这表明AM提取物比胶质含有更多蛋白质(参见PBS下的T和A/B/C下的T)。对于AM和AM胶质，蛋白质与HA之比也从提取物A到提取物B和C增加，这进一步证明HA大部分以可溶形式存在，反之亦然，蛋白质更多在水不溶性组分中被发现。此外，在A/B/C中离心之后，HA从AM胶质中大量地去除。

表1

[注释]：T：总提取物；L：总提取物低速离心之后的上清液；H：总提取物高速离心之后的上清液；A、B、C：提取物，参见本文。

不同AM提取物中的HA具有大于一百万道尔顿的分子量

高分子量(>10⁶道尔顿)的HA存在于总提取物和提取物A中(图10)。然而，更高MW的HA存在于提取物B中，而在提取物C中则在甚至更高MW的窄条带中发现HA(图10)。所有含HA的组分在透明质酸酶消化之后均消失，这证明它们的确含有HA。相比于从Sigma获得的HA(目录号H1136)的阳性对照，在低速和高速离心之后获得的两种上清液中也都发现了相似高分子量(>10⁶道尔顿)的HA(图11)。再次，这些含HA的条带在透明质酸酶消化之后消失。对于AM胶质则得到了相似的结果。

间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)存在于不同的AM提取物中且其重链(HC)与HA共价连接

图12显示，在用透明质酸酶消化之前，游离的重链存在于不同的复合物中，并且还存在少量的轻链(UTI或尿抑胰酶素)。然而，在所有的提取物中，即，总提取物和提取物A、B和C中，在HA与IαI的重链之间也存在共价连接复合物，因为后者仅在透明质酸酶消化之后释放。在通过两种不同速度的离心获得的提取物H和L中得到了相同的结果(图13)。

肿瘤坏死因子刺激的基因6(TSG-6)也存在于AM提取物中

图14显示，TSG-6(约38kDa)存在于总提取物、提取物A和提取物C中。在提取物A中，存在约38kDa的条带，它靠近纯化的TSG-6(35kD)的条带迁移。约45和55kDa的其他条带的身份是未知的。总AM提取物(没有离心)“T”显示两个条带(均大于35KD)，并且较高的一个(55kD)发现于提取物A(离心后)中，而较低的一个(45kD)发现于提取物C中。当用透明质酸酶(图14)或F-糖苷酶(图15)处理样品时，所有这些条带都没有显著改变。然而，使用抗体RAH-1(图16)而非使用抗体MAB2104(图17)时，用硫酸软骨素ABC裂合酶消化导致更多显著的38kD条带。

五聚环蛋白-3(PTX-3)仅仅存在于水溶性AM提取物中并与HA形成复合物

图18显示，PTX3还存在于AM提取物中，并且仅在水溶性提取物A中与HA复合。

血小板反应蛋白-1(TSP-1)存在于不同的AM提取物中

图19显示，所有AM提取物都具有TSP-1的高分子量条带，而总提取物(T)和提取物C还具有一些35-120kDa的条带。除了一些条带变得略强或略弱之外，透明质酸酶消化未改变反应模式。

Smad 7大部分存在于水不溶性AM提取物中

Smad 7发现于AM的PBS提取物和尿素提取物中(图20)。

实施例3：信号传导途径控制上皮细胞的增殖和EMT

功能障碍的上皮细胞的增殖和EMT是两个主要的病理过程。在孔源性视网膜脱离(RRD)的过程中，视网膜色素上皮(REP)细胞分散到玻璃体中，如最近所确定的，玻璃体含有增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的生物活性所需的许多生长因子和细胞因子(例如，EGF、FGF、PDGF、TGF-β、VEGF和IFN-γ)。为了理解生长因子如何促成分散的RPE细胞的增殖和EMT，使用了ARPE-19细胞的体外培养模型，这些细胞在汇合七天之后表现出接触抑制。

在EGTA干扰接触抑制之后，细胞增殖(BrdU标记)和EMT(失去N-钙粘着蛋白、ZO-1、Na,K-ATP酶和RPE65的正常RPE表型标志物，以及波形蛋白、S100A4和α-SMA的间充质表型标志物的表达)仅在EGF和/或FGF-2的存在下被诱导。该病理过程需要激活典型Wnt信号传导，如由β-联蛋白和LEF的核水平和相互作用增加所证明的，以及上调TCF/LEF转录激活。在阻断或救援实验中，通过使用Wnt抑制剂XAV939和组成型活性β-联蛋白(S33Y)的过表达来证实典型Wnt信号传导的激活。通过激活Smad/ZEB1/2信号，TGF-β1的加入也导致了EMT，这抑制增殖和典型Wnt信号传导的激活。此外，由EGF+FGF-2引发的典型Wnt信号传导与TGF-β1协同作用且足以导致EMT(图1)。这些发现为我们提供了针对这两种信号传导途径的机制观点以便预防PVR。利用ARPE-19细胞系的体外模型基于低细胞密度而非通过向汇合细胞添加EGTA来启动增殖来进一步优化，以更好地模拟PVR。结果表明，在分别用EGF+FGF-2和EGF+FGF-2+TGF-β1刺激之后，HC-HA/PTX3不伤害非刺激的ARPE-19细胞(图5A)，但显著抑制增殖(图5B和图5C)和磷酸化Smad2/3的核定位(图6A和图6B)。这样的体外模型的建立允许在本文提供的兔PVR动物模型中确定HC-HA/PTX3的最优给药以用于体内测试(图7A-图7D)。

实施例4：PVR的动物模型的开发

通过气体压缩玻璃体切除术使玻璃体脱离，之后玻璃体内注射兔RPE细胞，成功地在兔子中重现了PVR(参见图7A-图7D)，以模拟人PVR。选择兔子是因为它们可以发生髓翼脱离(medullary wing detachment)，其模拟人的视网膜脱离并显示类似PVR的特征。

在进行前房穿刺术以降低眼内压并降低由压力急性增加引起的眼损伤的可能性后，使用间接检眼镜检查，通过在直接显示下使用32号1/2“针头于角巩膜缘后方3mm处向玻璃体腔内注射0.3ml的100％C3F8气体，通过玻璃体内气体注射对NZW兔子(雌性，3-7个月龄，体重1.5至5.0kg)进行玻璃体切除术。进行间接检眼镜检查以确保在视网膜中有正常的血管流量。使用Perkins眼压计检查眼内压，直到眼内压低于20mmHg。通过经由32号1/2″针头以0.1ml总体积玻璃体内注射2.0x 10⁵个兔RPE细胞来产生PVR，所述细胞由组织培养的同源原代兔RPE细胞制备，其中斜面朝上，并且(缓慢地，以防止视网膜损伤)注射至视神经头正前方的玻璃体腔内。如果HC-HA/PTX3的处理与RPE细胞同时进行，则将PBS或两种不同剂量的HC-HA/PTX3分别类似地注射到对照兔子或经处理的兔子的玻璃体腔内。如果HC-HA/PTX3的处理在RPE细胞之后进行，则将PBS和HC-HA/PTX3在一周后注射至玻璃体腔内。在每一种条件下，使兔子立即平躺1h以使细胞和试剂沉降在视网膜的血管翼上。

在玻璃体内HC-HA/PTX3或盐水注射四周之后，通过Euthasol(390mg/mL/kg，静脉内)过量麻醉用安乐死处死兔子。将眼球与所有结膜组织摘出，并在10％福尔马林中固定。对眼睛进行外部检查，随后去除上部的帽以允许进行内部检查。摘出的眼睛的全面解剖检查使用Nikon D600相机拍照(图7C和图7D)。

实施例5：HC-HA/PTX3是唯一与AM的治疗作用相关的基质组分

HC-HA/PTX3复合物最初在排卵卵母细胞周围的卵丘-卵母细胞复合物中发现，其在受精中发挥关键作用。HC-HA/PTX3大量地存在于人AM中，并且该发现导致若干令人兴奋的发现：(1)AM上皮和基质细胞表达HC-HA/PTX3生物合成所需的所有组分(HA、HC1、HC2、尿抑胰酶素、TSG-6和PTX3)(图2A)；(2)由AM提取物(AME)纯化的HC-HA/PTX3由HMW HA(>3000kDa)与共价连接的IαI的HC1和紧密结合的PTX3(图2B-图2D)而非HC2、尿抑胰酶素或TSG-6组成，和(3)HC-HA/PTX3与以下简单总结的AM的治疗作用相关。

为了确保由每批AM供体制备的HC-HA/PTX3在生物化学和功能上保持一致，建立了在GMP设施下使用优化的SOP的制造工艺。尽管来自不同AM供体的HC-HA/PTX3的产量不同，但是在效力测定中没有观察到显著差异，所述测定是根据破骨细胞中抗酒石酸酸性磷酸酶活性的抑制和IFN-γ/LPS刺激的巨噬细胞中巨噬细胞M2极化的促进而研发的。因此，建立了在体外和体内研究中使用的用来验证每批HC-HA/PTX3的释放的参考物质。

涉及嗜中性粒细胞和巨噬细胞的炎症在PVR发展中发挥重要作用。将巨噬细胞注射到兔子玻璃体中诱导视网膜外膜、后部玻璃体分离和视网膜脱离。巨噬细胞可以转分化为成纤维细胞样细胞并分泌生长因子(例如，PDGF)，这促成RPE细胞的增殖和EMT，它们是PVR发病机制中的两个关键事件。可溶性HC-HA/PTX3而非HA显著促进了(由fMLP或LPS)激活的而不是静息的嗜中性粒细胞的凋亡。类似地，可溶性HC-HA/PTX3而非HA剂量依赖性地促进了(由IFN-γ、LPS或IFN-γ/LPS)激活的而不是静息的巨噬细胞的凋亡。此外，可溶性和固定化HC-HA/PTX3促进了巨噬细胞对凋亡的嗜中性粒细胞的吞噬作用，而HA则不然。固定化HC-HA/PTX3促进了LPS-或IFN-γ/LPS-激活的巨噬细胞的抗炎性M2极化。此外，这种M2极化与IL-23的显著下调偶联，IL-23由激活的巨噬细胞和树突细胞产生以激活Th17细胞。因此，结膜下注射HC-HA/PTX3延长了小鼠中同种异体角膜移植物的存活。这些数据支持以下观点：HC-HA/PTX3是可抑制由嗜中性粒细胞和巨噬细胞二者介导的炎症的新型复合物。

实施例6：HC-HA/PTX3在人角膜缘上皮祖细胞和龛细胞中下调典型Wnt信号传导

AM通过下调β-联蛋白的表达、磷酸化和核转位来抑制人结膜上皮的鳞状化生(squamous metaplasia)。此外，在人角膜缘上皮祖细胞(LEPC)和龛细胞(LNC)中，HC-HA/PTX3下调典型Wnt信号传导。具体地，固定化HC-HA/PTX3上调LEPC/LNC中的非典型而不是典型Wnt配体(例如，Wnt 2B、Wnt 3A、Wnt 5A、Wnt 5B、Wnt7A)、Wnt负调节物和平面细胞极性(PCP)因子的转录物表达，如通过Wnt Signaling Pathway RT2Profiler PCR阵列板所测量的(图3A)。免疫染色数据进一步证实了固定化HC-HA/PTX3防止β-联蛋白的核转位，如接种于3D基质胶中的阳性对照细胞所示。相反，当接种于固定化HC-HA/PTX3而非3D基质胶时(图3A)，在LNC中显现了C-JUN(非典型Wnt(PCP)信号传导的关键参与者)的转录物表达(图3A)和核转位(图3B)。应当注意，已知非典型Wnt(PCP)信号传导的激活抑制典型Wnt信号传导的激活。

实施例7：HC-HA/PTX3在人角膜成纤维细胞(HCF)中下调典型TGF-β1/Smad信号传导

已报道，TGF-β1、2、3和TGF-βRII转录物的表达(使用Northern印迹法)在AM基质上培养的HCF和人角膜缘和结膜成纤维细胞中下调。AME诱导细胞聚集并防止肌成纤维细胞表达α-SMA。接种在AM基质上的人和小鼠角膜细胞保持它们的正常表型，而不引发pSmad2/3的核转位，即使它们暴露于血清或TGF-β1。可溶性HC-HA/PTX3抑制HCF的TGF-β1启动子活性(图4)。已知在接种于塑料和固定化HA二者上的HCF中，外源性TGF-β1意料之中地上调TGF-β1，而不上调TGF-β2(图4B)。然而，在固定化HC-HA/PTX3上没有观察到TGF-β1上调。出乎意料地，在有或没有TGF-β1的情况下，TGF-β3——一种抗瘢痕形成同种型——仅被HC-HA/PTX3上调(图4C)。在TGF-β1攻击之后，在HC-HA/PTX3上TGF-βRII的表达减少至接近零(图4D)。正如所预期的，在塑料和HA上的HCF中，外源性TGF-β1导致pSmad2/3的核转位(图4E)和α-SMA的阳性细胞质表达(图4F)。然而，HC-HA/PTX3有效地阻断了HCF中这些TGF-β1诱导的变化。总之，HC-HA/PTX3在HCF中下调典型TGF-β1信号传导并防止由外源性TGF-β1触发的肌成纤维细胞分化。

实施例8：保存的人胎儿支持组织的制备

人胎盘在选择性剖宫产时收集。胎盘在硝酸纤维素纸(Hybond N+,Amersham,England)上加以平整，其中上皮表面向上。胎儿支持组织样品在-80℃下储存在DMEM/甘油1:2(v/v)中直到使用。

实施例9：羊膜提取物制剂

新鲜且冷冻的人胎盘从Bio-tissue,Inc.(Miami,FL)获得。无菌进行用于制备总人AM提取物(AME)的制剂的整个程序，以用于后续基于细胞培养的实验。将AM切成小片以适应BioPulverizer(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,OK)的桶(barrel)而置入其中，在液氮中冷冻，粉碎成微细粉末并称重。将含有蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂混合物，P8340，Sigma，并且补充有1mM PMSF)和磷酸酶抑制剂(50mM氟化钠和0.2mM钒酸钠)的冷1xPBS缓冲液，pH 7.4，以1:1(ml/g)添加至粉末。将混合物保持在冰上并用Tissue Tearor(Biospec Products,Inc.,Dremel,WI)均化5次，每次1分钟，冷却间隔为2分钟。将这些水溶性提取物命名为“总”AM提取物(AME)。

将总AM提取物分到两个50ml锥形离心管中。在4℃下，一个以高速(HS，48,000xg)离心，而另一个则以低速(LS，15,000xg)离心。将HS和LS上清液的等分试样转移到无菌1.5ml Eppendorf管中，并分别命名为AM/HS和AM/LS。在冻干前，所需的AM/HS样品在-20℃下冷冻1h。随后将样品放置在盖上带有孔的FreeZone(Labconco,Kansas City,MO)的室中。将样品在-50℃下在0.85mBar的真空下冻干5小时。使用前，用无菌蒸馏H₂O将样品重建至相同体积。相同的方法也用来由AM胶质制备提取物，该AM胶质容易从AM基质上的附着材料上刮取。

实施例10：总可溶性人羊膜和羊膜胶质提取物制剂

冷冻的人胎盘材料从Bio-Tissue,Bio-tissue,Inc.(Miami,FL)获得。无菌进行用于制备总人AM提取物(AME)的制剂的整个程序，以用于后续基于细胞培养的实验。将AM切成小片以适应BioPulverizer(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,OK)的桶而置入其中，在液氮中冷冻，粉碎成微细粉末并称重。将含有蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂混合物，P8340，Sigma，并且补充有1mM PMSF)和磷酸酶抑制剂(50mM氟化钠和0.2mM钒酸钠)的冷1xPBS缓冲液，pH 7.4，以1:1(ml/g)添加至粉末。将混合物保持在冰上并用Tissue Tearor(Biospec Products,Inc.,Dremel,WI)均化5次，每次1分钟，冷却间隔为2分钟。将这些水溶性提取物命名为“总”AM提取物(AME)。

总水溶性提取物在4℃下混合1hr，随后在4℃下以两种不同的离心速度(即15000xg和48000xg)分级分离30min，并将得到的上清液分别命名为L和H。将每一种上清液分成等分试样并在-80℃下储存。该方法也用来由AM胶质制备提取物，该AM胶质容易从AM基质上的附着材料上刮取。

实施例11：通过不同缓冲液和分级分离方法获得的总可溶性人羊膜和羊膜胶质提取物

在检查不同提取缓冲液中的制剂时，将如上所述制备的粉末称重，并通过在4℃下搅拌1hr，以1:1的AM与缓冲液(m1)的湿重(g)比，与以下缓冲液A(等渗低盐)混合：100mMTris-HCl，pH 7.6，150mM NaCl，4mM EDTA，1％Triton X-100。在48000xg下离心后，随后通过在4℃下搅拌1hr，用以下缓冲液B(高盐)提取所得沉淀物：100mM Tris-HCl，pH 7.6，1MNaCl，4mM EDTA，1％Triton X-100。再次，在48000xg下离心后，最终通过在4℃下搅拌24hr，用以下缓冲液C(4M盐酸胍)提取沉淀物：100mM乙酸钠，pH 5.8，4M盐酸胍，4mM EDTA，1％Triton X-100。所有上述三种缓冲液均补充有以下蛋白酶和磷酸酶抑制剂：1μg/ml抑酶肽、1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml胃蛋白酶抑制剂A、0.5mM PMSF、50μM氟化钠和0.2μM钒酸钠。将所得上清液分别命名为提取物A、B和C，针对补充有0.5mM PMSF的透析缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.5,0.15M NaCl)在4℃透析6hr，并将透析缓冲液更换两次，每次500x(透析缓冲液:样品的体积比)。透析后，测量每个样品的体积并将其调整为与透析缓冲液相同的体积。相同的方法也用来由AM胶质制备提取物，该胶质是AM基质上可容易刮取的附着材料。

实施例12：PBS中的总可溶性人羊膜提取物的制备

无菌进行用于制备总可溶性人AM提取物(T)的制剂的整个程序，以用于后续基于细胞培养的实验。冷冻的人胎盘从Bio-Tissue,Inc.(Miami,FL)获得，从该胎盘中获取AM。将AM切成小片以适应BioPulverizer(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,OK)的桶而置入其中，在液氮中冷冻，随后粉碎成微细粉末。将粉末称重，并与具有蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂混合物，P8340，Sigma，并且补充有1mM PMSF)和磷酸酶抑制剂(50mM氟化钠和0.2mM钒酸钠)的冷PBS缓冲液(通过将蒸馏H₂O添加至1xPBS，pH 7.4中，由10xPBS，目录号70011-044，Invitrogen，Carlsbad，CA制备)以1:1(ml/g)混合。将混合物保持在冰上并用Tissue Tearor(Biospec Products,Inc.,Dremel,WI)均化5次，每次1min，冷却间隔为2min。将该水溶性提取物命名为“总提取物”(T)。将总水溶性提取物在4℃下混合1hr，在4℃下以48000xg离心30min。将该上清液分成等分试样并在-80℃下储存。

实施例13：水溶性AM基质提取物的制备

使用无菌技术将从Bio-Tissue,Inc.(Miami,FL)获得的冷冻的人AM用HBSS短暂地洗涤2-3次，以去除原始的贮存培养基。通过刮刀刮取AM基质，在液氮的气相中冷冻，并通过BioPulverizer(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,OK)磨成微细颗粒，接着在冰上用Tissue Tearor(Biospec Products,Inc.,Dremel,WI)在PBS，pH 7.4中均化1min。通过旋转将匀浆混合1h，并在4℃以14,000xg离心30min。随后收集PBS中的上清液并在-80℃下以等分试样储存。蛋白质浓度通过BCA测定来确定。将该水溶性蛋白质提取物命名为羊膜基质提取物(ASE)，用于本文所述的实验。

实施例14：AM基质提取物制备

无菌进行用于制备蛋白质提取物的整个程序。将从Bio-Tissue(Miami,FL)获得的冷冻的人AM用HBSS(Invitrogen,Carlsbad,CA)短暂地洗涤2-3次，以去除贮存培养基。通过刮刀从AM的基质侧刮取AM基质，以用于AM基质提取物制备。将从Baptist Hospital(Miami,FL)获得的人胎盘以及绒毛膜用HBSS冲洗3次以去除血液。为了制备水溶性蛋白质提取物，将总AM、刮取的AM基质、基质去除的AM、胎盘和绒毛膜各自在液氮的气相中冷冻，并且使用BioPulverizer(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,OK)将其各自磨成微细颗粒，接着在冰上用Tissue Tearor(Biospec Products,Inc.,Dremel,WI)在PBS(pH 7.4)中均化1min。将每种匀浆混合1h并在4℃下以14,000g离心30min。随后收集每种上清液(PBS中)并在-80℃下以等分试样(0.5ml)储存。利用BCA测定(Pierce,Rockford,IL)来定量不同提取物中的总蛋白质。

实施例15：制备水溶性和冻干粉末形式的人AM提取物

为了制备人AM提取物，无菌进行整个程序。除非另有说明，在该程序的步骤中在室温下处理AM提取物。首先，新鲜或冷冻的人AM优选从Bio-Tissue,Inc.(Miami,FL)获得。冷冻的AM用HBSS(Invitrogen,Carlsbad,CA)短暂地洗涤2-3次，以去除贮存培养基。新鲜的人胎盘或绒毛膜用HBSS冲洗3次以去除血液。

为了制备水溶性形式的AM提取物，将AM(例如，AM基质、基质去除的AM、胎盘、绒毛膜)转移到无菌50ml离心管，并在4℃下以5000xg离心5min以去除过量的液体。将AM称重，转移到100mm或150mm无菌培养皿中，并在液氮容器的气相中冷冻20min以促进后续的均化。随后用一次性解剖刀将冷冻的AM切成小片或使用BioPulverizer(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,OK)或其他合适的装置磨成微细颗粒，并用Tissue Tearor(BiospecProducts,Inc.,Dremel,WI)或其他合适的装置在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或中性pH的不含酚红的DMEM中均化。为了生物化学表征和纯化，向上述溶液补充以下蛋白酶抑制剂：1μg/ml抑酶肽、1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml胃蛋白酶抑制剂A和1mM PMSF。然而，如果该提取物将要直接添加到细胞培养物中，则不添加蛋白酶抑制剂。将匀浆在4℃下混合30min并以15,000x.g离心30min。收集上清液(即，AM提取物)并在-80℃下以等分试样(0.5ml)储存。利用BCA测定(Pierce,Rockford,IL)来定量每种AM提取物中的总蛋白质。

为了制备冻干粉末形式的AM提取物，使用BioPulverizer(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,OK)或其他合适的装置将冷冻的AM磨成微细颗粒，并进一步如本文所述均化。在4℃下通过SpeedVac(Savant Instruments Inc.,Farmingdale,NY)将约0.5ml的等分试样冻干4h，以使重量从280mg降至32mg(减少约89％)。将冻干的粉末称重并在-80℃下储存。在使用前，将冻干的粉末在合适的缓冲液中重建。

为了制备AM基质提取物，从完整的总AM的基质表面上刮取AM基质，而使基膜和羊膜上皮完整，并如本文所述使用BioPulverizer磨碎冷冻的AM基质。在4℃下将基质用中性pH的PBS提取30min并以15,000xg离心30min。收集上清液并在-80℃下以等分试样(0.5ml)储存。利用BCA测定(Pierce,Rockford,IL)来定量AM基质提取物中的总蛋白质。

实施例16：TGF-β1启动子活性的抑制

本文所述的胎儿支持制剂和组合物抑制如本文所示的TGF-β1启动子活性；因此，本文所述的胎儿支持制剂和组合物可用于抗瘢痕形成、抗炎性和抗血管发生疗法。冷冻的羊膜的胎儿部分比新鲜的羊膜的胎儿部分具有显著更高的抗瘢痕形成作用；冷冻的羊膜的胎盘部分也比新鲜的羊膜具有显著更高的抗瘢痕形成作用。因此，冷冻的胎儿支持组织，无论是胎盘部分还是胎儿部分，在TGF-β中都显示出比新鲜的胎儿支持组织更有效的抑制作用。由从冷冻的胎儿支持组织获得的总胎儿支持组织提取物介导的这种抑制作用在0.4至125μg/ml的范围内是剂量依赖性的(图8)。此外，这样的抑制作用不能被单独的高MW HA(超过100x的等同的AM提取物)代替，并且在用透明质酸酶消化后消失(图9)，这表明该抑制作用由HA-IαI之间的复合物介导。低速或高速离心不显著影响该抑制作用。然而，后续的冻干和重建产生了更有效的抑制作用。此外，AM的总体抑制作用比AM胶质的抑制作用更有效。

实施例17：用于培养细胞的胎儿支持组织制剂和纯化的组合物

为了检验胎儿支持组织对细胞分化过程的作用，将第2次传代时由AMSC分化的肌成纤维细胞传代培养到AM的基质上，并与在胶原I包被的培养皿上作为对照传代培养的那些细胞进行比较。在含有10％FBS的DMEM中培养7天之后，胶原I上的AMSC仍然保持肌成纤维细胞的形状。相反，接种于胎儿支持组织基质上的细胞表现出圆形、纺锤形、细长形以及树枝状的混合形状。因此，在一些实施方案中，胎儿支持组织制剂具有去分化能力，并且用来减缓细胞分化。

实施例18：HC-HA/PTX3对细胞迁移和胶原凝胶收缩的作用

细胞培养和处理

ARPE-19是人二倍体RPE细胞系，它在37℃下，5％CO₂的湿润空气中，在补充有10％FBS、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的HEPES缓冲的DMEM和Ham’s F-12(1:1)中培养。对于汇合后实验，在测试前100％汇合时将细胞继续培养7天。对于低细胞密度测定，将细胞以1x10⁴/cm²或其他密度接种过夜(20-24h)，接着用生长因子和细胞因子处理24-120h或48h(在优化后)。在血清饥饿的情况下，将细胞在无血清(SF)培养基中温育24h，接着用生长因子和细胞因子处理24-120h。在终止生长因子/细胞因子处理之前，BrdU(10μM)标记进行4h。

从人AM中纯化HC-HA/PTX3

HC-HA/PTX3由Bio-Tissue,Inc.(Miami,FL)提供的冷冻保存的人胎盘来制备。如所报道的，用PBS(pH 7.4)提取来自相同供体的AM以生成PBS提取物。随后通过在15℃下以CsCl梯度，在4M GnHCl中1.35g/ml的初始密度下，以35,000rpm超速离心48h对该提取物进行分级分离(LM8型，SW41转子，Beckman Coulter，Indianapolis，IN)。从每个超速离心管中收集总计12个级分(1ml/级分)。测量每个级分的重量以计算密度。在生物化学分析(HAELISA，BCA蛋白质测定和Western印迹法，参见下文)之后，将含有HA但不含蛋白质或含有极少蛋白质的级分合并，并以CsCl梯度，以1.40g/ml的初始密度进行第二轮超速离心。将选择性的级分(含有HA，但检测不到蛋白质，通过BCA测定测量，并被命名为HC-HA/PTX3)合并，并针对蒸馏水进行透析，冻干，并在-80℃下储存。因此，HC-HA/PTX3的量根据复合物中存在的HA的量来表示。

细胞迁移

通过将不具有或具有EGF(10ng/ml)、FGF-2(20ng/ml)和TGF-β1(10ng/ml)的0.5mlDMEM/F12(1:1)添加在下面隔室中，而将用PBS(媒介物对照)、HA(25μg/ml)或HC-HA/PTX3(25μg/ml)处理的DMEM/F12(2x 10⁶/ml)中重悬的0.1ml ARPE-19细胞添加到上面隔室中，在24孔Transwell板(孔径8μm，Costar，Kennebunk，ME)中进行迁移测定。在37℃下温育4h之后，用棉拭子去除未通过孔迁移的细胞，而朝向下面隔室的过滤器上的细胞采用5％戊二醛固定，用1％结晶紫染色，并对每个对照或处理组从六个随机的显微视野中计数。

胶原凝胶收缩

将0.25ml在冷DMEM/F12中的I型胶原溶液(Corning,Bedford,MA)(2.5mg/ml)添加至24孔板的每个孔中，接着在37℃下温育1h，之后添加0.5ml的不具有或具有TGF-β1(10ng/ml)的ARPE-19细胞或原代人RPE细胞(各自为5x 10⁵/ml)并在胶原凝胶的顶部用PBS(媒介物对照)、HA(25μg/ml)或HC-HA/PTX3(25μg/ml)处理。24h之后，用小刮刀将凝胶从培养孔的壁上剥离。胶原凝胶的照片图像被数字化并用NIH ImageJ 1.45软件测量面积。通过测量72h时的凝胶大小并与初始大小(在0h时)相比，来确定凝胶收缩的百分比，并且在组之间进行比较。

结果

在EGF(10ng/ml)、FGF-2(20ng/ml)和TGF-β1(10ng/ml)的刺激下，HC-HA/PTX3(25μg/ml)以及HA(25μg/ml)完全抑制了ARPE-19细胞的迁移(图21)。相反，HC-HA/PTX3在ARPE-19细胞和原代人RPE细胞两者中均显著减少了TGF-β1诱导的胶原凝胶收缩，而HA则不然(图22)。

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尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员而言显而易见的是：这些实施方案仅以示例的方式提供。现在可以进行各种变更、更改和替换。应当理解，本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。其意图在于，下列权利要求限定本发明的范围并且从而涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等价物。

Claims (29)

1.一种用于预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移或上皮-间充质转换(EMT)的组合物，其包含：

(a)胎儿支持组织的制剂；和

(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述胎儿支持组织选自胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述胎儿支持组织是冷冻的或预先冷冻的。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述上皮细胞选自视网膜色素上皮细胞(RPE)、结膜上皮细胞、角膜上皮细胞、角膜缘上皮细胞和肾上皮细胞。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述上皮细胞为人上皮细胞。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述胎儿支持组织的制剂是胎儿支持组织的提取物、匀浆、粉末、颗粒化的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、纯化的HC-HA/PTX3或其组合。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是凝胶、溶液或悬浮液。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述制剂包含HC-HA/PTX3。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于局部施用。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射。

11.一种用于治疗或预防增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的可注射组合物，其基本上由以下成分组成：

(a)基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合；和

(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体；其中所述组合物适合于注射。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述HC-HA/PTX3从胎儿支持组织中分离，其中所述胎儿支持组织是胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质或其组合。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述胎儿支持组织是冷冻的或预先冷冻的。

14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物的量有效地预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移或EMT。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述上皮细胞是视网膜色素上皮细胞(RPE)。

16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述上皮细胞为人上皮细胞。

17.根据权利要求11所述的组合物，其中所述基本分离的HC-HA/PTX3通过超速离心从胎儿支持组织中分离。

18.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物是凝胶、溶液或悬浮液。

19.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射。

20.一种用于治疗或预防增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的可注射组合物，其基本上由以下成分组成：

(a)基本分离的HC-HA/PTX3、重建的HC-HA/PTX3或其组合；

(b)附加治疗剂；和

(c)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体；其中所述组合物适合于注射。

21.一种用于治疗或预防增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的可注射组合物，其包含：

(a)含有HC-HA/PTX3和胎儿支持组织的至少另外一种组分的胎儿支持组织的制剂；和

(b)药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体；其中所述组合物适合于注射。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述胎儿支持组织是胎盘、胎盘羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、羊膜基质、羊膜胶质、羊水或其组合。

23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述胎儿支持组织是冷冻的或预先冷冻的。

24.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物的量有效地预防或减少上皮细胞的增殖、细胞迁移或EMT。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述上皮细胞是视网膜色素上皮(RPE)细胞。

26.根据权利要求21所述的组合物，其中所述胎儿支持组织的制剂是胎儿支持组织的提取物、微粒化的胎儿支持组织、匀浆、粉末、颗粒化的胎儿支持组织、粉碎的胎儿支持组织、磨碎的胎儿支持组织、纯化的HC-HA/PTX3或其组合。

27.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物是凝胶、溶液或悬浮液。

28.根据权利要求21所述的组合物，其中所述胎儿支持组织是人、非人灵长类动物、牛或猪的胎儿支持组织。

29.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物被配制用于眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、眼周注射、结膜下注射、球后注射、前房内注射或筋膜下注射。