CN107530360A - 眼用组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明包括可用于眼睛各种病症的眼用组合物，特别是角膜病症。还包括利用这些组合物的方法和包括这些组合物的试剂盒。

Description

眼用组合物及其使用方法

相关申请

本申请要求2015年3月5日提交的新西兰临时专利申请第NZ705727号的权益，其内容在此全部并入本文。

技术领域

本公开涉及可用于治疗和/或预防眼睛病症的组合物和方法。具体地，本公开涉及可用于增强和再生角膜以及校正眼睛屈光不正的组合物和方法。

背景技术

以前认为，分化的细胞失去了它们倒退到较早状态的能力。然而，这种观点受到多功能干细胞(细胞重编程)的诱导和显示分化的细胞可以转变为另一种表型的证据的挑战(Takahashi和Yamanaka 2006；Wernig等2007；Yamanaka和Blau 2010；Gurdon和Melton2008；Peran等2011)。此外，现在认为细胞的微环境(包括周围的细胞、细胞外基质以及生长和分化因子)在引起细胞分化的重定向中起重要作用(和Collas 2002)。有了这些信息，研究人员已经开始研发利用细胞重编程和干细胞技术的疗法。

眼睛的角膜占眼睛的总屈光力(聚焦力)的三分之二以上。即使是角膜形状的微小变化也会对图像聚焦于视网膜的清晰度产生显著影响。角膜的基质层(清晰的眼睛前表面)包括大部分的角膜组织，并且由高度组织的薄片组成，其由紧密包装的胶原蛋白纤维构成，主要是I型和V型胶原蛋白(Marshall等1993)。胶原蛋白纤维的均匀排列产生的基质层的独特结构赋予角膜韧性和透明度的特性(Funderburgh 2000)。

当从角膜去除基质细胞(角膜基质细胞，corneal keratocyte)并以单层培养时，它们呈现出成纤维细胞的形态学特征并从星状细胞转变为多核梭形细胞(Funderburgh等2001)。角膜基质细胞的另一种常见观察表型是损伤后的角膜中所看到的肌成纤维细胞形式(Jester等1987)。认为外源生长因子和细胞因子的变化会带来这些表型的变化(Funderburgh等2001)。

已知TGFβ家族生长因子是软骨形成(软骨)分化的最有效的诱导物(Heng，Cao和Lee 2004；Johnstone等1998；Menetrey等2000)。TGFβ1通过鸡胚成纤维细胞刺激胶原蛋白和纤维连接蛋白的合成(Ignotz和Massague 1986)。对于角膜基质细胞，已知TGFβ1和TGFβ2引起与瘢痕形成相关的ECM沉积，可能是由于角膜基质细胞转化成肌成纤维细胞表型(Funderburgh，Mann，Funderburgh，Corpuz和Roth 2001)。与此相反，已经显示TGFβ3会诱导角膜成纤维细胞产生由I型胶原蛋白构成的ECM沉积，而没有纤维化或瘢痕形成(Karamichos，Hutcheon和Zieske 2011)。已知某些非蛋白质化学化合物如地塞米松(Johnstone，Hering，Caplan，Goldberg和Yoo 1998)、抗坏血酸(Farquharson，Berry，Barbara Mawer，Seawright和Whitehead 1998)和乙醇(Kulyk和Hoffman 1996)也会在体外促进软骨形成分化。

影响角膜的病症有很多，包括各种缺陷、损伤、疾病和退行性病症。近视是由于角膜曲率过大，使得进入眼睛的光聚焦在视网膜前方。这是世界范围内最普遍的视力障碍，影响了一些亚洲国家中70％至90％的人口以及欧洲和美国30％至40％人口的视力(Frederick 2002)。在大多数情况下，近视首先发生在学龄儿童中，并且一直持续到大约20岁。这也与成年期黄斑变性、视网膜脱离和青光眼患病率增加有关(Ebenstein和Pruitt2006)。

最常见的是使用处方眼镜或隐形眼镜来矫正近视。然而，这些装置不能为病症提供永久性治疗，并且它们不适合在某些活动中使用。隐形眼镜还与眼部感染和更严重的病症(包括角膜擦伤和溃疡)有关。在某些情况下，屈光手术或角膜矫正术用于近视。然而，这些治疗只能为轻度至中度近视提供临时矫正；它们并不是永久性的治疗，它们不适合严重的病例。

圆锥形角膜是一种与称为前弹性层(Bowman’s layer)的部分角膜的基质的变薄和破坏有关的角膜营养不良症。角膜基质的逐渐变薄通常发生在几十年内，导致角膜发育成圆锥形状。由于不规则散光和近视，导致视力障碍。圆锥形角膜的发病机制尚不清楚，但与诸如经常的眼睛摩擦和隐形眼镜摩擦等因素有关(Krachmer，Feder和Belin 1984；Sherwin&Brookes 2004)。它最早出现在青春期并持续发展直到生命的第三个或第四年个十年。

估计圆锥形角膜在全世界总人群中的发病率约为2000人中1人(Rabinowitz1998)，而且对性别没有偏好。由于圆锥形角膜的发病通常在成年早期，并继续到主要的赚钱和育儿的年龄，因此生活质量的丧失和圆锥形角膜治疗的经济负担是一个重大的公共卫生问题。圆锥形角膜是西方社会角膜移植的主要指标，研究人员确定其构成了法国角膜移植的28.8％(Legeais等2001)，并且构成了美国角膜移植的11.4％至15.4％(Cosar等2002；Dobbins等2000)。在新西兰，圆锥形角膜的患病率非常高，其中帕斯菲卡和毛利人口的发病率不成比例地高(Patel等2005；Patel和McGhee 2013)。在新西兰，所有实施的角膜移植中约有50％用于圆锥形角膜(Edwards等2002)。

尽管对圆锥形角膜进行了几项研究，但潜在的生物化学过程仍然知之甚少。圆锥形角膜的家族性发生表明其中一种病因是遗传性的(Ihalainen，1985)。病症也与某些生物化学和生物力学因素有关。例如，已经确定圆锥形角膜的角膜变薄是细胞外基质(ECM)组分损失的结果。然而，这可能是由于它们的破坏、缺陷的形成或这些的组合(Klintworth和Damms 1995；Klintworth 1999；Jhanji等2011)。在角膜基质中，与圆锥形角膜相关的变化包括薄片和角膜基质细胞数量的减少(Ku，Niederer，Patel，Sherwin和McGhee 2008；Sherwin和Brookes 2004)，以及薄片组织和胶原蛋白纤维质量分布的变化(Meek等2005)。

据认为，基质层的降解可能是由于异常的蛋白水解酶活性(Fukuchi，Yue，Sugar和Lam，1994)。已知圆锥形角膜具有水平降低的酶抑制剂和水平增加的降解酶(Kenney和Brown 2003)。生物力学因素包括由紫外线辐射和机械创伤引起的氧化损伤造成角膜的变薄和刚度的降低(Kenney和Brown 2003)。圆锥形角膜的生物力学研究显示弹性和刚度降低；然而，这种情况的原因仍然未知(Edmund，1988)。有研究表明胶原蛋白交联的减少可能是一个原因(Wollensak和Buddecke，1990)。目前没有令人满意的圆锥形角膜动物模型，并且研究主要局限于离体环境。

取决于病症的严重程度，减缓圆锥形角膜进展的尝试包括使用特定的眼镜和隐形眼镜。在严重病例中，角膜植入物、角膜基质环或角膜移植是必要的(Jhanji，Sharma，&Vajpayee 2011)。穿透性角膜移植术(其中去除的角膜的整个厚度并由供体角膜组织代替的过程)是用于治疗晚期圆锥形角膜病例的最常用的外科手术操作(Rabinowitz 1998)。圆锥形角膜是全世界角膜移植手术的主要指标，其中受圆锥形角膜影响的人中约12～20％需要角膜移植(Pramanik，Musch，Sutphin，&Farjo 2006)。

用于圆锥形角膜的早期治疗方案(例如称为Rose K镜片的定制的透气性镜片)已经注重改善视觉灵敏度。较新的治疗旨在减缓疾病的进展。称为角膜胶原蛋白交联(CXL)的治疗着眼于增加角膜刚度和生物力学稳定性。在这个过程中，上皮被清除，局部给药核黄素滴剂，并将角膜暴露于370nm的紫外线A光下约30分钟(Ashwin和McDonnell2010；G.Wollensak，Spoerl和Seiler 2003)。认为UV-A光激活核黄素，从而产生诱导角膜基质中的胶原蛋白分子之间形成共价键的活性氧(Spoerl，Huhle和Seiler 1998；G.Wollensak等2003)。然而，由于内皮细胞损伤的可能性，因此不建议该过程用于治疗薄于400μm的角膜。虽然这种治疗导致更硬的角膜，但它并没有解决角膜变薄的问题。

因此，存在用于解决眼睛病症的治疗组合物和方法的持续需要，包括影响角膜的病症。特别存在相对非侵入性且容易给药的疗法的需要。

发明内容

发明人开发了用于调节角膜细胞的组合物和方法，以改变角膜组织中的胶原蛋白表达和细胞外基质的形成。这些组合物和方法可用于再生角膜和/或增强角膜，从而治疗和/或预防角膜的各种病症和眼睛的屈光不正。

一方面，本发明包括治疗或预防与角膜变薄或不规则有关的病症的方法，该方法包括：使所述角膜与包含TGFβ3多肽或其变体或片段以及地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物接触，从而治疗或预防病症。

在各个方面：

所述TGFβ3多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

所述地塞米松是磷酸地塞米松。

所述组合物包含10～100ng/ml的TGFβ3多肽。

所述组合物包含40～4000ng/ml的地塞米松。

将所述组合物配制成眼滴剂。

所述组合物用结冷胶(gellan gum)配制。

所述组合物每天给药一次或每天给药两次。

将所述组合物与一种或多种额外的眼用试剂共同给药。

所述一种或多种额外的眼用试剂选自由麻醉剂、抗炎剂、抗微生物剂和润滑剂组成的组。

将所述组合物与隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环的使用结合给药。

所述隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环调试成在用组合物治疗期间和/或之后用于塑形或保持角膜形状。

所述隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环调试成用作所述组合物的载体或者用作组合物洗脱装置。

所述该组合物与角膜胶原蛋白交联联合给药。

所述组合物的给药在交联之前和/或之后。

所述病症选自由圆锥形角膜、近视和散光组成的组。

在另一方面，该方法包含共同给药包含TGFβ3多肽或其变体或片段的组合物、以及包含地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物。

在另一方面，本发明包含治疗或预防角膜的损伤或损害的方法，该方法包含：将角膜与包含TGFβ3多肽或其变体或片段、以及地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物接触，从而治疗或预防角膜的损伤或损害。

在各个方面：

所述TGFβ3多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

所述地塞米松是磷酸地塞米松。

所述组合物包含10～100ng/ml的TGFβ3多肽。

所述组合物包含40～4000ng/ml的地塞米松。

将所述组合物配制成眼滴剂。

所述组合物用结冷胶配制。

所述组合物每天给药一次或每天给药两次。

将所述组合物与一种或多种额外的眼用试剂共同给药。

所述一种或多种额外的眼用试剂选自由麻醉剂、抗炎剂、抗微生物剂和润滑剂组成的组。

将所述组合物与隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环的使用结合给药。

所述隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环调试成用作组合物的载体或者用作组合物洗脱装置。

角膜的损伤或损害与以下中的一种或多种相关：擦伤、撕裂伤、溃疡、烧伤、刺伤和手术。

在另一方面，该方法包含共同给药包含TGFβ3多肽或其变体或片段的组合物、以及包含地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物。

在另一方面，本发明包含治疗或预防眼睛的屈光不正的方法，该方法包含：将其眼睛与包含TGFβ3多肽或其变体或片段、以及地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物接触，从而治疗或预防眼睛的屈光不正。

在各个方面：

所述TGFβ3多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

所述地塞米松是磷酸地塞米松。

所述组合物包含10～100ng/ml的TGFβ3多肽。

所述组合物包含40～4000ng/ml的地塞米松。

将所述组合物配制成眼滴剂。

所述组合物用结冷胶配制。

所述组合物每天给药一次或每天给药两次。

将所述组合物与一种或多种额外的眼用试剂共同给药。

所述一种或多种额外的眼用试剂选自由麻醉剂、抗炎剂、抗微生物剂和润滑剂组成的组。

将所述组合物与隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环的使用结合给药。

所述隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环调试成用于在用所述组合物治疗期间和/或之后用于塑形或保持角膜形状。

所述隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环调试成用作组合物的载体或者用作组合物洗脱装置。

屈光手术之前或之后实施该方法。

眼睛的屈光不正与以下中的一种或多种有关：近视、远视、散光和老花眼。

在另一方面，该方法包含共同给药包含TGFβ3多肽或其变体或片段的组合物，以及包含地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物。

在另一方面，本发明包括一种试剂盒，其包含：

包含TGFβ3多肽或其变体或片段、以及地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物；以及

一个或多个隐形眼镜。

在各个方面：

所述隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环调试成在用组合物治疗期间和/或之后用于塑形或保持角膜形状。

所述隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环调试成用作所述组合物的载体或者用作组合物洗脱装置。

TGFβ3多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

所述地塞米松是磷酸地塞米松。

所述组合物包含10～100ng/ml的TGFβ3多肽。

所述组合物包含40～4000ng/ml的地塞米松。

将所述组合物配制成眼滴剂。

所述组合物用结冷胶配制。

该组合物每天给药一次或每天给药两次。

将所述组合物与一种或多种额外的眼用试剂共同配制。

所述试剂盒包括用于眼睛的一种或多种额外的试剂。

所述一种或多种额外的眼用试剂选自由麻醉剂、抗炎剂、抗微生物剂和润滑剂组成的组。

所述试剂盒包括隐形眼镜溶液。

所述试剂盒包括使用说明书。

所述试剂盒用于治疗或预防眼睛的屈光不正。

所述试剂盒用于治疗或预防选自由圆锥形角膜、近视、远视、散光、老花眼和基质营养不良组成的组中的角膜病症。

所述试剂盒用于治疗选自由擦伤、撕裂伤、溃疡、烧伤、刺伤、角膜融解和手术损害组成的组的角膜病症。

在另一方面，所述试剂盒包括作为单独组分的含有TGFβ3多肽或其变体或片段的组合物、以及包含地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物。

在另一方面，本发明包括在角膜基质细胞中诱导II型胶原蛋白表达的方法，该方法包含：将角膜基质细胞与包含TGFβ3多肽或其变体或片段、以及地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物接触，从而在角膜基质细胞中诱导II型胶原蛋白表达。

在各个方面：

TGFβ3多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

所述地塞米松是磷酸地塞米松。

所述组合物包含10～100ng/ml的TGFβ3多肽。

所述组合物包含40～4000ng/ml的地塞米松。

将所述组合物配制成通过隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环给药。

将所述组合物配制成以溶液、凝胶、霜剂或乳液给药。

所述方法在体内实施。

所述方法离体实施。

在另一方面，该方法包含共同给药包含TGFβ3多肽或其变体或片段的组合物、以及包含地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物。

上面的概述广泛地描述了本发明某些实施例的特征和技术优点。进一步的技术优点将在本发明的具体实施方式以及随后的实施例中描述。

当结合任何附图和实施例考虑时，可以从本发明的具体实施方式中更好地理解被认为是本发明特性的新特征。然而，本文提供的附图和实施例旨在帮助说明本发明或协助开发对本发明的理解，而不是为了限制本发明的范围。

附图说明

图1A：显示由角膜曲率增加引起近视而使得进入眼睛的光不会聚焦到视网膜上的示意图。

图1B：正常角膜(A)和圆锥形角膜(B)各自的视图。(C)：严重圆锥形角膜的向甫鲁(Scheimpflug)图像。可观察到角膜在角膜中心显著变薄。

图2：器官型切片培养的建立。

图3：生长因子眼滴剂注入成年雄性Wistar大鼠的眼睛中。

图4：针对大鼠眼睛成像设置的Phoenix Micron IV体内眼睛成像系统。

图5为以下的示意图：(A)纳米压痕仪系统，(B)：在压痕过程期间获得的用于计算角膜弹性和滞后的典型负荷—位移曲线。P_max＝施加的最大载荷；h_max＝穿透深度；h_c＝接触深度(尖端和样品之间的接触高度)；h_f＝最终深度；S＝卸载刚度。

图6：纳米压痕机设计成保持人类角膜钮状体(A)和大鼠球体(B)。使用显微镜(C)定位角膜的中心部分，以及一旦定位使用压头探头(D)。

图7：接种在软骨形成分化培养基中的角膜基质细胞。在含有TGFβ3和地塞米松的软骨形成分化培养基中培养角膜基质细胞3周形成球体，其被标记为：(A)球体周围的巢蛋白；(B)核心内的II型胶原蛋白。然后将培养基换成含有成纤维细胞增殖培养基的血清1周，使来自球体的细胞展开并填充培养皿(C)。单层细胞对于II型胶原蛋白是阴性的，而细胞簇对于II型胶原蛋白保持阳性(D)。

图8：在含有成纤维细胞增殖培养基的血清中接种角膜基质细胞。在对照成纤维细胞增殖培养基中培养3周的角膜基质细胞对巢蛋白(A)和II型胶原蛋白(B)为阴性。然后将融合的成纤维细胞在含有TGFβ3和地塞米松的软骨形成分化培养基中培养3周(C)。细胞对II型胶原蛋白保持阴性(D)。(E)：融合的成纤维细胞在软骨形成分化培养基中的团块培养(pellet culture)。在培养3周后，将细胞团块切片并标记为对角膜基质细胞标记物角膜蛋白阳性(F)，对软骨细胞特异性II型胶原蛋白阴性(G)。

图9：在对照培养基(A)和(D)中培养2周的人类角膜切片分别对II型胶原蛋白阴性且对I型胶原蛋白阳性。在软骨形成分化培养基中培养1周(B)和(E)，以及2周(C)和(F))的人类角膜切片，并标记为II型胶原蛋白(B)和(C)，I型胶原蛋白(E)和(F)。在治疗2周的角膜切片中观察到II型胶原蛋白的强烈标记，而仅治疗1周的切片对II型胶原蛋白是阴性的。尽管当与对照治疗的切片相比，在软骨形成分化培养基中培养的切片在两个时间段内，虽然没有那么强烈地标记，但对于天然角膜I型胶原蛋白仍是阳性的。

图10：在(A)对照培养基和(B)软骨形成分化培养基中培养2周并对II型胶原蛋白进行标记的人类角膜切片。获得如图9所示的类似结果。体内实验显示(C)：未治疗的角膜；(D)和(E)：在TGFβ3和地塞米松治疗的大鼠角膜中具有广泛II型胶原蛋白标记的治疗角膜。在角膜前(上)部分看到更强的标记(D)。II型胶原蛋白显示纤维状且均匀分布在整个ECM中。

图11：在对照培养基(A)、(C)和(E)以及软骨形成分化培养基(B)、(D)和(F)中体外培养圆锥形角膜钮状体2周，并分别标记为II型胶原蛋白(A)和(B)以及波形蛋白(C)至(F)。与正常人类角膜中的标记相比，治疗的圆锥形角膜(B)中II型胶原蛋白的标记较弱。然而，II型胶原蛋白的沉积与之前在正常人类和大鼠角膜的体外和体内治疗后所看到的模式相似。当与未治疗的半数圆锥形角膜(C)和(E)相比，治疗的半数圆锥形角膜钮状体(D)和(F)中的成纤维细胞数量增加，并且角膜基质细胞似乎更健康且具有完整的多个长细胞过程(F)。

图12：在对照培养基(A)和(C)以及软骨形成分化培养基(B)和(D)中培养离体培养的人类圆锥形角膜3周，并且对α平滑肌肌动蛋白(αSMA)(A)和(B)以及III型胶原蛋白(C)和(D)进行标记。与在软骨形成分化培养基中培养的角膜相比，对照培养基(A)中培养的角膜基质层中的αSMA的标记更强。在两种培养基中的任意一种中培养的角膜，并没有对III型胶原蛋白标记阳性。

图13：体内治疗角膜的角膜透明度。治疗的角膜(A)和(C)，未治疗的角膜(B)和(D)。3周后，治疗和未治疗的角膜彼此无法区分。角膜(A)和(B)的前视图显示了透明角膜，光可以很容易地通过该角膜以非常清晰地显示出眼睛背面的血管。在8周时，角膜横截面的体内成像显示出光很容易通过的清晰透明角膜，不存在角膜混浊或瘢痕形成的迹象。

图14：体内治疗角膜中II型胶原蛋白(A)和I型胶原蛋白(B)的定量基因表达。治疗1周后II型胶原蛋白表达有初始的增加。戒断治疗后，Ⅱ型胶原蛋白表达有明显的降低(A)。天然角膜I型胶原蛋白表达也初始上调，然而，当长期治疗(最多7周)时，其表达与对照未治疗的角膜相当(B)。

图15：体内治疗1周和未治疗的角膜的比较没有显示出硬度(H)和折减弹性模量(Er)的显著差异。

图16：体内治疗和未治疗的两只大鼠角膜3周所获得的载荷变形曲线。具有绘制值的相应图表清晰地显示了治疗的角膜中弹性模量(Er)和硬度(H)的增加。

图17：治疗8周和对照人类圆锥形角膜的弹性模量和硬度的比较显示出在治疗的角膜中的两个参数的显著增加。

图18：通过将体内细胞重编程与刚性隐形眼镜结合以在治疗期间保持所需的角膜形状而重塑羊眼中的角膜。

图19：(A)Phoenix Micron IV体内眼睛成像系统。该成像系统能够测量角膜厚度，曲率和透明度。(B)OCT附件使得可以观察眼前和测量角膜的厚度和完整性，类似于此处所见的图像。(C)纳米压痕机和(D)用于评估羊离体角膜生物力学装置的示意图。输出显示为负荷—位移曲线，可以分析得到的杨氏弹性模量和硬度测量值。在大型动物如羊中，以微米表示角膜厚度(E)，使用便携式获得角膜曲率测量值(F)。对于角膜曲率(F)，宽间距的颜色轮廓表示大的曲率半径；较窄的轮廓表示较陡峭曲率的区域。数字表示每个点的曲率半径。

图20：仅TGFβ3与地塞米松结合产生II型胶原蛋白沉积。在(A)BMP6、(B)BMP6+氢化可的松、(C)TGFβ3+氢化可的松、(D)BMP6+地塞米松、(E)TGFβ3+泼尼松、(F)TGFβ3+(G)和(H)TGFβ3+地塞米松中培养羊角膜组织(放大倍数分别为20倍和60倍)，并标记为软骨特异性II型胶原蛋白。

图21：TGFβ3和地塞米松组合的剂量反应研究。将羊角膜培养3周，并标记II型胶原蛋白。

具体实施方式

以下描述阐述了许多示例性结构、参数等。然而，应当认识到，这样描述的目的不是为了对本发明的范围进行限制，而是提供作为示例性实施例的描述。

定义

在本文的每个实例中，在本发明的描述、方面、实施方式和实施例中，术语“包含(comprising)”、“包括(including)”等将被广义地无限制地理解。因此，除非上下文另有明确说明，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”、“包括”等将被理解为与排他性含义相反的包括性含义，也就是说为“包括但不限于”的意思。

如本文所用的，“增强”是指增加角膜(包括角膜组织，例如基质层)的厚度、硬度、弹性模量、拉伸强度和规则性中的一个或多个的方法。增强可用于将特定形状施加于角膜，即角膜曲率。增强方法可以在存在或不存在眼睛或角膜特定病症时进行。增强可能涉及角膜细胞外基质中组分的增加(例如II型胶原蛋白)。增强也可以涉及增加角膜中的细胞数量(例如角膜基质细胞)。例如可以通过将这些细胞的增殖状态从静止改变为活跃来增加细胞的数量。

“共同给药”或“结合给药”是指试剂的组合使用，例如用于眼睛的治疗剂，并且包括给药共同制剂(即组合制剂)以及同时或顺序给药单独的制剂。类似地，“联合”是指治疗组合物和治疗装置/程序的组合使用。这可以包括在使用装置/程序之前、与装置/程序同时、和/或使用装置/程序之后使用组合物。

角膜的“病症”是指角膜的疾病、缺陷、损伤、损害、变性或功能障碍的状态。该病症可影响角膜组织(例如基质层)或角膜细胞(例如角膜基质细胞)。该病症可能是急性病症，例如擦伤或溃疡，或者可能是慢性病症，例如圆锥形角膜或近视。

本文所用的“角膜”是指眼睛的透明前部，其覆盖眼睛的虹膜、瞳孔和前房。它包括角膜上皮、前弹性层、角膜基质、后弹力层和角膜上皮。特别令人感兴趣的是角膜的基质层(也称为固有质)，其包括与角膜基质细胞一起规则排列的胶原蛋白纤维的细胞外基质。

与化学衍生物有关的“衍生物”是指经化学改性的化合物。本公开内容包括本文所述的每种化合物及其任何衍生物，包括化学改性形式，例如盐、氢化物、酯和原始化合物的其它改性。

如本文所用的“分离的”(特别是指多肽)是指从其天然环境中分离的分子。可以通过本领域已知和使用的任何方法或方法的组合获得分离的分子，包括生物化学、重组和合成技术。为了获得分离的组分，可以通过至少一种纯化或富集步骤制备多肽。特别令人感兴趣的是通过人工手段(即非天然的手段)获得的多肽和肽。这包括但不限于合成化学、重组技术、纯化方案等。包括从天然、重组或合成来源中分离的多肽。还包括通过化学合成产生的多肽，或者通过质粒、载体或可以被引入细胞或无细胞翻译系统的其它表达构建体。这些多肽能够与天然存在的多肽清楚地区分开，而不需要人为干预。

为简单起见，术语“蛋白质”或“多肽”(例如SEQ ID NO：1)和其它这些术语是指本文所述的分子。这些术语并不意味着提供这些分子的完整表征。因此，蛋白质或多肽可以在本文中被表征为具有特定的氨基酸序列、特定二维结构的代表，但是应当理解的是，所保护的实际分子具有其它特征，包括三维结构，某些键的迁移率和分子作为一个整体的其它性质。本公开所涵盖的是分子本身及其作为整体的性质。术语“蛋白质”或“多肽”在本文中可互换使用。

如本文详细描述，TGFβ3“多肽”是指从任何来源获得的多肽，例如分离的天然存在的多肽、重组多肽和合成多肽，并且包括具有天然存在的氨基酸序列的多肽以及具有变体氨基酸序列的多肽、以及这些序列的片段。TGFβ3在本领域中也可称为转化生长因子β3、TGFB3、ARVD和FLJ16571。

氨基酸“序列一致性”是指两种或多种多肽的氨基酸与氨基酸的比较。测试序列可以与参考序列一致(即共有100％的一致性)，或者可以包括一个或多个氨基酸取代。在优选方面，与参考氨基酸相比，氨基酸取代可以具有类似的化学和/或物理性质，例如电荷或疏水性。序列一致性通常可以通过在同源性最高的区域的序列比对来确定。序列比对算法，例如序列比对程序，是本领域已知和广泛使用的。基于序列比对，可以确定比较的多肽序列之间的百分比一致性。

本文所用的“屈光不正”是指眼睛聚焦光的误差。屈光不正可包括球面误差和柱面误差，包括低阶像差和高阶像差。具体包括的作为屈光不正的眼睛病症诸如近视、远视、散光、屈光参差和老花眼。

关于角膜的“再生”是指角膜的形状、厚度、规则性、硬度、弹性模量和拉伸强度中的一种或多种的恢复，包括角膜组织(例如基质层)的恢复。可以使用再生方法将特定形状施于角膜，即角膜曲率。可以在治疗眼睛或角膜特定病症时实施再生方法。再生可能涉及角膜细胞外基质中组分的增加(例如II型胶原蛋白)。再生还可以涉及角膜中细胞(例如角膜基质细胞)数量的增加。例如可以通过将这些细胞的增殖状态从静止改变为活跃来增加细胞数量。

诸如角膜细胞(例如角膜基质细胞)的细胞的“重编程”是指分化状态的变化。重编程与细胞形态、细胞基因表达(例如胶原蛋白表达，包括I型和/或II型胶原蛋白表达)或细胞增殖状态(例如静止或活跃)中的一个或多个变化相关。

术语“受试者”是指人类或非人类的动物。

“预防”是指阻止或延缓病症的发作，例如眼睛病症，特别是角膜病症，例如角膜的紊乱或其它缺陷。如果出现症状，预防措施将导致一种或多种病症症状的停止或减轻，或会延缓症状。如本文详细描述，预防角膜病症可能涉及增强角膜。

“治疗”是指减轻、改善或解决病症，例如眼睛病症，特别是角膜病症，例如角膜的紊乱或其它缺陷。治疗将导致一种或多种病症症状的减轻、改善或消除。如本文详细描述，角膜病症的治疗可能涉及角膜的再生。如本文详细描述，本发明的组合物和方法可用于治疗各种病症，用于预防各种病症，或同时用于治疗和预防各种病症。

细胞和组织的再生

细胞和组织再生技术在治疗方法中具有相当大的前途。如本文所公开的，发明人开发了使用原位细胞重编程来调节细胞的组合物和方法，以影响角膜组织中的II型胶原蛋白表达和细胞外基质(ECM)沉积。这又反过来用于加强和/或增强眼睛的角膜。因此，发明人为角膜基质的原位/体内再生和增强提供了独特的方法。

因此，所公开的方法可以用于角膜的各种病症(包括近视和圆锥形角膜)的体内组织工程治疗。如上所述，近视的特征在于角膜过大的曲率(图1A)，而圆锥形角膜是导致角膜变薄特征模式的渐进性角膜营养不良(图1B；图像改编自Romero-Jiménez，antodomingo-Rubido和Wolffsohn 2010)。

角膜基质细胞相对静止，并且通常只有当它们转换成成纤维细胞或肌成纤维细胞表型时才产生大量的细胞外基质(ECM)。与这些表型相关的ECM沉积通常导致角膜纤维化和透明度的丧失(Kadler，Baldock，Bella和Boot-Handford 2007)。软骨细胞(构成软骨的细胞)分泌II型胶原蛋白，该蛋白是与角膜中发现的I型相似的纤维状胶原蛋白。II型胶原蛋白也在鸡角膜发育过程中由角膜基质细胞表达，且仅在成熟的鸡基质中被I型替代(Linsenmayer等1990)。

发明人先前已经表明，当用神经元谱系特异性生长因子(neuronal lineagespecifying growth factors)治疗时，来自成年人和大鼠角膜的基质细胞可以被重编程以产生神经元特异性蛋白质(Greene等2013)。该数据表明，通过在体外和体内的生长因子环境的调节，可以简单地对成年人细胞群进行重编程。

现在，如本文所证明的，发明人表明，通过用转化生长因子β3(TGFβ3)和地塞米松治疗细胞，可以在体外和离体诱导角膜基质细胞以产生软骨特异性纤维胶原蛋白，II型胶原蛋白(实施例8和9)。特别地，发明人已经证明，当用这两种化合物进行治疗时，人类圆锥形角膜活检中的角膜基质细胞能够表达II型胶原蛋白(实施例8)。此外，通过动物研究，发明人已经证明，可以使用眼滴剂在体内递送TGFβ3和地塞米松这两种化合物，以刺激II型胶原蛋白沉积(实施例9)。值得注意的是，II型胶原蛋白的沉积是均匀的，能够改善角膜的生物力学，而没有纤维化或瘢痕形成，并且对角膜透明度没有影响(实施例11和13)。

不希望受到理论的束缚，假设胶原蛋白沉积是通过将基质内的细胞重编程为软骨细胞表型而产生的。已知软骨细胞分泌II型胶原蛋白，其不仅是类似于在角膜中发现的I型的纤维状胶原蛋白，而且在鸡角膜的发育过程中也会表达(Linsenmayer等1990)。随后仅在成熟基质中被I型胶原蛋白取代(Linsenmayer等1990)。

在本文所述的结果中，在用TGFβ3和地塞米松治疗角膜基质细胞时观察到I型胶原蛋白初始表达的增加(实施例12)。然而，发明人认为观察到的I型胶原蛋白沉积的水平将不足以使角膜变硬/重塑。此外，作为治疗策略，认为II型胶原蛋白的沉积更可行。应当注意的是，II型胶原蛋白对酶降解较不敏感，例如对存在于圆锥形角膜中的酶。

根据发明人的结果，可以使用角膜基质细胞的重编程来产生新的ECM分子以作为改善角膜生物力学特征的有效治疗。如上所述，这种方法被认为是有利的，因为它降低了角膜酶降解的敏感性。所公开的治疗模块不仅用于稳定角膜，而且还为眼睛的病症(包括眼睛的各种角膜病症和屈光不正)提供补救措施。因此，本发明的方法可用于例如治疗扩展性角膜中的圆锥形角膜的角膜基质细胞。此外，如本文详细描述，本发明的方法可以用于治疗角膜的近视和各种其它病症。

影响眼睛和角膜的病症

本文所述的组合物特别用于再生或增强角膜(例如基质层)以及角膜细胞(例如角膜基质细胞)。组合物可用于解决角膜变薄、减弱、细胞损失、组织损失、基质损失、胶原蛋白损失和/或不规则性。以这种方式，本文所述的组合物可以用于影响眼睛的各种病症，包括涉及角膜缺陷、疾病、损伤、损害和/或变性的病症以及眼睛的屈光不正。

在具体方面中，本发明包括用于治疗角膜缺陷的方法。在某些情况下，本发明的方法也可用于预防角膜缺陷。该缺陷可能与角膜的特定病症有关。如本文详细描述，示例性的病症包括圆锥形角膜和相关病症，其包括诸如球形角膜的角膜扩张，透明边缘性变性和后圆锥形角膜(参见例如Arffa 1997；Krachmer等1984；Rabonitz 2004；Jinabhai等2010)。具体包括的缺陷是近视、老花眼和散光，其包括规则和不规则的散光。角膜先天性缺陷也包括在内。其中包括扁平角膜和小角膜，后者可能与胎儿酒精综合征、特纳综合征、埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、韦尔-马尔斯马尼综合征(Weill-Marchesanisyndrome)、瓦登堡综合征(Waardenburg's syndrome)、南斯-霍兰综合征(Nance-Horansyndrome)和德朗热综合征(Cornelia de Lange's syndrome)有关。还包括可能与埃勒斯-当洛斯IV型综合征相关的球形角膜(如上所述)。

在另外的方面中，本发明包括用于治疗角膜损伤或退化的方法。在某些情况下，本发明的方法可用于预防角膜损伤。损伤或退化可能与角膜的特定病症有关。具体包括角膜融解，例如与炎症性紊乱(例如类风湿性关节炎)相关的角膜融解。其它示例性病症包括角膜炎，如边缘性角膜炎、基质角膜炎、暴露性角膜炎、神经营养性角膜炎、丝状角膜炎、酒渣鼻性角膜炎(rosacea keratitis)、病毒性角膜炎(包括疱疹角膜炎、真菌性角膜炎、原虫角膜炎(protozoal keratitis))和其它感染性角膜炎(例如肠型间质性角膜炎、微孢子虫病角膜炎、斯哥森氏表层点状角膜炎(Thygeson's keratitis)和感染性结晶性角膜病变。还包括溃疡性角膜炎，也称为外周溃疡性角膜炎(PUK)，其包括与全身性疾病相关的溃疡性角膜炎，例如类风湿性关节炎韦格纳肉芽肿、系统性红斑狼疮、复发性多软骨炎和结节性多动脉炎。还包括眼内炎。还包括慢性角膜水肿、蚕蚀性角膜溃疡、凹陷、小水疱病、特芮安氏(Terrien)变性、萨尔兹曼变性(Salzman's degeneration)，球状变性和角膜内皮营养不良(Fuch’s dystrophy)。这些病症是本领域公知的且很好地被表征(参见例如Jackson 2008；Denniston 2009和Willshaw等)。另外包括基质营养不良，例如晶格角膜营养不良(例如1型和2型)、颗粒状角膜营养不良(例如1型和2型)、黄斑角膜营养不良、施奈氏角膜营养不良、先天性基质角膜营养不良和斑点角膜营养不良。

在另外的方面中，本发明包括治疗角膜损害的方法。包括由于物理损伤、化学损伤、辐射损伤和/或特定药物损伤而造成的损害。损害可能与角膜擦伤、角膜侵蚀、角膜刺伤、膜破裂、角膜瘢痕形成或角膜溃疡有关，包括溶化性溃疡、无痛性溃疡和浅表性溃疡。还包括与眼科手术相关的损害和其它损伤，包括手术伤口、放射状角膜切开术后的角膜损伤以及角膜成形术后的急性问题，包括持续性上皮缺陷。还包括与角膜融解相关的损害，例如眼睛的手术或者其它治疗后的角膜融解(例如局部NSAID给药)。角膜融解可能归因于感染性，炎性或营养性原因。还包括与老化有关的角膜的损害和损伤。

在另外的方面中，本发明包括用于治疗或预防眼睛屈光不正的方法。这种屈光不正可能与特定病症相关，包括近视、远视、老花眼、屈光参差、高阶像差和各种散光。高阶像差包括但不限于昏迷、三叶形、四边形、球面像差和由数学表达式(例如泽尼克多项式)确定的像差。

可以通过各种方法(包括荧光素染色)来诊断角膜的病症，其可以包括塞德尔试验(Seidel's test)、镜面显微术、角膜断层扫描、等轴断层扫描、厚度测量法、超声、裂隙灯、角膜刮擦和活组织检查。诊断也可能涉及视觉灵敏度和/或混浊的评估。角膜病症可能与一种或多种症状有关：疼痛、畏光、异物感、视觉灵敏度降低、水肿、白细胞浸润、荧光素摄取、血管化、发红，以及全身症状，如头痛、恶心和疲劳。类似地，屈光不正的症状可以包括但不限于：视觉灵敏度降低以及视力模糊、双重视觉、视觉模糊、视觉疲劳、异物感、有问题的眩光或光晕、星芒图案、鬼像、夜间视力衰退、斜视、过度凝视、过度眨眼、头痛、揉眼睛、眼睛疲劳、眼睛表面干燥、眼睛刺激、发红和眼睛痉挛。

治疗的组合物

如上所述，本文所述的组合物可用于治疗和/或预防眼睛的各种病症，包括影响角膜的病症和眼睛的屈光不正。该组合物可以包括TGFβ3多肽或其变体或片段以及地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂。

在各个方面，可以将组合物配制成包括组分(TGFβ3多肽(或其变体或片段)+地塞米松(或其衍生物或相关的甾体试剂剂))的组合，或者可以配制成包括第一组分(TGFβ3多肽(或其变体或片段)或可替代的地塞米松(或其衍生物或相关的甾体试剂))，给药前再加入的第二组分。或者，可以将组合物配制成包括第一组分(TGFβ3多肽(或其变体或片段)或可替代的地塞米松(或其衍生物或相关的甾体试剂))，其与包括第二组分的制剂同时或者按顺序使用以给药。

在一个方面，TGFβ3多肽可以至少包括以下氨基酸序列：ALDTNYCFRN LEENCCVRPLYIDFRQDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILYYVGRTPKVEQ LSNMVVKSCK CS(SEQ ID NO：1)(GenBank Reference CAR70088.1)。TGFβ3多肽可以包括如上所示的至少112个氨基酸，并且可以具有25.5kDa的分子量。或者，TGFβ3多肽可以衍生自GenBank Reference CAA33024.1中鉴定的前体多肽序列的氨基酸644～850(207个氨基酸)；GenBank登录号CAA33024；或NCBI参考序列NP_003230.1。

在其它方面，如文中所述，可以使用TGFβ3变体或片段。例如变体或片段可以显示与SEQ ID NO：1至少75％的序列一致性，优选至少80％一致性，更优选至少85％，最优选至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或约100％的SEQ ID NO：1序列一致性。特别感兴趣的是，TGFβ3变体表现出生物学活性，例如与非变体多肽相比具有相似或改善的活性。

在另外的方面，可以使用特定片段。例如TGFβ3片段可包含SEQ ID NO：1的至少80个氨基酸，至少85个氨基酸，更优选SEQ ID NO：1的至少90个氨基酸，至少91个氨基酸，至少92个氨基酸，至少93个氨基酸，至少94个氨基酸，至少95个氨基酸，至少96个氨基酸，至少97个氨基酸，至少98个氨基酸，至少99个氨基酸，最优选至少100个氨基酸，至少101个氨基酸，至少102个氨基酸，至少103个氨基酸，至少104个氨基酸，至少105个氨基酸，至少106个氨基酸、107个氨基酸、108个氨基酸、109个氨基酸、110个氨基酸或111个氨基酸。特别令人感兴趣的是，TGFβ3的功能片段例如显示生物活性(例如与参考多肽相比相似或改善的活性)的片段。

在特定方面，TGFβ3多肽或其变体或片段可以作为重组多肽提供。例如多肽可以在本领域广泛已知和使用的细胞或无细胞表达系统中表达。其中包括细菌、真菌、植物和哺乳动物表达系统。具体包括使用大肠杆菌细胞、CHO细胞、HEK细胞和烟草细胞(Nicotianabenthamiana)的表达系统。TGFβ3多肽或其变体或片段可以作为人类或非人类表达系统中表达的人类重组多肽提供。根据已知方法，TGFβ3多肽或其变体或片段可作为二硫键连接的同型二聚体、非糖基化的多肽链提供。

可以通过标准方法(包括已知的色谱技术)从重组表达系统中分离TGFβ3多肽或其变体或片段。TGFβ3多肽或其变体或片段可以包括促进多肽剪切、分离和/或定位的序列标签。根据本发明，TGFβ3多肽可以从各种商业来源获得。例如重组人类TGFβ3可以从R&DSystems(目录号243-B3-002；243-B3-010)、BioVision，Inc.(目录号4344-500；4344-50；4344-5)或Prospec Protein Specialists(目录号CYT-113；CYT-319)获得。

可以根据广泛已知和使用的方法测量TGFβ3多肽或其变体或片段的生物活性。例如可以通过多肽抑制貂肺上皮(Mv1Lu)细胞增殖的能力在培养物中测量生物活性(参见例如Premaraj等2006)。该测量的示例性活性由ED₅₀(≤50ng/ml)表示。或者，可以通过IL-4诱导的小鼠HT-2细胞增殖(在存在IL-2的情况下由绵羊红细胞激活的BALB/c脾)的剂量依赖性抑制来测量生物活性(参见例如Tsang等1995)。该测量的示例性活性通常为0.1～0.5ng/ml。或者，可以使用下述方法测量包括在本文所述的试剂组合中的组合物的生物活性。例如，角膜基质细胞中II型胶原蛋白(例如II型胶原蛋白，α1)的诱导可以通过以下一种或多种方法来评估：免疫组织化学测定、蛋白质测定、蛋白质印迹分析、聚合酶链反应(PCR)分析和定量PCR技术。

如本文所述，该组合物还可包括地塞米松、其衍生物和/或相关的甾体试剂。地塞米松的特征在于具有以下化学结构：

地塞米松的商品名称包括例如 和

各个方面，可以使用地塞米松的衍生物，包括其任何酯和盐。示例性衍生物包括但不限于：地塞米松-17-乙酸酯(CAS RN：1177-87-3)、地塞米松磷酸二钠(CAS RN：2392-39-4)、地塞米松戊酸酯(CAS RN：14899-36-6)、地塞米松-21-异烟酸酯(CAS RN：2265-64-7)、地塞米松棕榈酸酯(CAS RN：33755-46-3)、地塞米松丙酸酯(CAS RN：55541-30-5)、乙呋地塞米松(CAS RN：83880-70-0)、地塞米松-21-半乳糖苷(CAS RN：92901-23-0)、地塞米松21-硫代新戊酸酯、地塞米松21-硫代戊酸酯、地塞米松21-硫醇-2-甲基丁酸酯、地塞米松21-硫醇-3-甲基-丁酸酯、地塞米松21-硫代己酸酯、地塞米松21-硫醇-4-甲基-戊酸酯、地塞米松21-硫醇-3,3-二甲基-丁酸酯、地塞米松21-硫醇-2-乙基-丁酸酯、地塞米松21-硫辛酸酯、地塞米松21-硫醇-2-乙基-己酸酯、地塞米松21-硫代壬酸酯、地塞米松21-硫代癸酸酯、地塞米松21-对氟硫代苯甲酸酯或其组合。具体包括地塞米松乙醇和地塞米松磷酸钠。还包括如US 4177268中所述的地塞米松衍生物。

该组合物可以包括相关的甾体试剂，代替或补充地塞米松。例如，可以使用其它皮质类固醇激素(corticoid steroids)来替代地塞米松或与地塞米松一起使用。优选用作相关类固醇的是根据库普曼(Coopman)分类的C组类固醇，其包括倍他米松型类固醇，例如地塞米松、地塞米松磷酸钠、倍他米松、倍他米松磷酸钠和氟可龙。其它相关的甾体试剂包括但不限于：氟米龙、氯替泼诺、甲羟松、泼尼松龙、泼尼松、利美索龙(rimexolone)，氢化可的松，洛度沙胺或其任何衍生物或组合。具体包括醋酸氟米龙、乙醇氟米龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、依碳酸氯替泼诺、醋酸氢化可的松和洛度沙胺氨丁三醇。可以理解的是，对于本公开的任何化学品，化学品可以是各种改性形式，例如乙酸盐形式和磷酸钠形式，钠盐等。

该组合物可以包括例如0.04ng/ml至4ng/ml；或0.04ng/ml至0.4ng/ml；或0.4ng/ml至4ng/ml；或4～40ng/ml；或40ng/ml至400ng/ml或40ng/ml至4000ng/ml的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂；或约0.04ng/ml，约0.08ng/ml，约0.12ng/ml，约0.4ng/ml，约0.8ng/ml，约1.2ng/ml，约4ng/ml，约12ng/ml，约24ng/ml，约40ng/ml，约80ng/ml，约120ng/ml，约240ng/ml，约400ng/ml，约800ng/ml，约1000ng/ml，约1600ng/ml，约2000ng/ml，约2400ng/ml，约3200ng/ml，或约4000ng/ml的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂。

作为进一步的实施例，该组合物可以包括0.4μg/ml至40μg/ml；或0.4μg/ml至4μg/ml；或4μg/ml至40μg/ml的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂；或约0.4μg/ml，约0.8μg/ml，约1μg/ml，约1.2μg/ml，约2μg/ml，约4μg/ml，约8μg/ml，约12μg/ml，约20μg/ml或约40μg/ml的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂。

作为另外的实施例，该组合物可以包括0.1mg/ml至1mg/ml；或0.5mg/ml至5mg/ml；或1mg/ml至10mg/ml的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂；或约0.1mg/ml，约0.5mg/ml，约1mg/ml，约2mg/ml，约5mg/ml或约10mg/ml的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂。

该组合物可以包括例如1ng/ml至1μg/ml；或1ng/ml至10ng/ml；或10ng/ml至100ng/ml；或100ng/ml至1μg/ml的TGFβ3多肽或其变体或片段，或约1ng/ml，约5ng/ml，约10ng/ml，约20ng/ml，约50ng/ml，约100ng/ml，约200ng/ml，约500ng/ml，约800ng/ml或约1μg/ml的TGFβ3多肽或其变体或片段。在特定方面，该组合物可以至少包括40ng/ml的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂以及至少4ng/ml的TGFβ3多肽或其变体或片段。

该组合物还可以包括一种或多种抗炎剂。示例性的抗炎剂至少包括富马酸酮替芬、双氯芬酸钠、氟比洛芬钠、酮咯酸氨丁三醇(ketorlac tromethamine)、舒洛芬、塞来考昔(celecoxib)、萘普生、罗非考昔(rofecoxib)或其任何衍生物或其组合。特别包括非甾体的抗炎药(NSAID)。该组合物还可以包括一种或多种麻醉剂。示例性的麻醉剂至少包括局部麻醉剂如丙美卡因(proparacaine)、利多卡因和丁卡因，以及其任何衍生物或其组合。可以选择包括在组合物中用于眼睛的其它试剂；这些可以由技术人员根据治疗中的受试者的病症和需要来选择。

本文所述的并根据已知的方法，可以配制如本文所述的组合物以用于局部给药。在某些情况下，可能需要眼内给药。该组合物可以以适于对眼睛给药的任何形式提供。示例性制剂至少包括在合适的眼科赋形剂中的溶液、悬浮液、乳液(分散体)、凝胶、霜剂或软膏剂。例如，该组合物可以以眼滴剂、半固体凝胶或喷雾剂的形式提供。在某些方面，可以用本发明的组合物浸渍成型的隐形眼镜或其它插入物/植入物。以这种方式，当受试者佩戴隐形眼镜时，可以将该组合物以缓释的方式持续地传递至角膜。

对于局部眼睛给药，该组合物可以配制成pH范围为5.0至8.0。该pH范围可以通过向溶液中加入缓冲剂来实现。优选的制剂在缓冲溶液中是稳定的。也就是说，缓冲剂和活性剂之间没有导致该组合物不稳定的不利的相互作用，例如通过沉淀或聚集。该组合物可以是高渗的(5％至40％，优选约10％，20％，30％或40％)或低渗的(0％至5％，优选约1％，2％，3％或4％)，这取决于受试者(例如工作需要、休息时间、睡眠等)的需要，如本文详细描述，当与隐形眼镜模制组合时，可以使用高渗组合物(例如40％)。

该组合物可以包括一种或多种合适的防腐剂作为任选成分。可以加入合适的防腐剂以防止污染，例如细菌污染。这些试剂可以包括但不限于苯扎氯铵、硫柳汞(thimerosal)、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯(methyl paraben)、对羟基苯甲酸丙酯(propyl paraben)、苯乙醇、EDTA、山梨酸、 M以及本领域技术人员已知的其它试剂或其任何组合。防腐剂的用量通常为组合物重量的0.001％至1.0％。

该组合物可以含有任选的共溶剂。本发明组合物组分的溶解度可以通过组合物中的表面活性剂或其它合适的共溶剂增强。这样的共溶剂/表面活性剂包括例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80、聚氧乙烯/聚氧丙烯表面活性剂(例如PluronicF-68、F-84和P-103)，环糊精、泰洛沙泊和本领域技术人员已知的其它试剂及其任何组合。共溶剂的用量通常可以为组合物重量的0.01％至2％。

渗透强化剂可用于增加组合物进入眼睛的摄取量。示例性试剂至少包括氯化十六烷吡啶(cetylpyridinium chloride)、诸如拉沙里菌素的离子载体、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯、吐温20、皂角苷、Brij 35、Brij 78、Brij 98、乙二胺四乙酸、胆汁盐和胆汁酸(例如胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨脱氧胆酸钠(sodium glycodeoxycholate)、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺胆酸、鹅脱氧胆酸和熊脱氧胆酸)、癸酸，氮酮、夫西地酸、六亚甲基月桂酰胺、皂角苷、六亚甲基辛酰胺和癸基甲基亚砜。

此外，生物粘附聚合物可以用于粘附到覆盖眼睛的粘蛋白涂层以延长组合物与眼睛的接触。生物粘附聚合物可以是具有许多亲水官能团的大分子亲水胶体，例如能够建立静电相互作用的羧基、羟基、酰胺和硫酸盐。示例性试剂至少包括聚丙烯酸(例如聚羧乙烯，卡波非和聚卡波非)和羧甲基纤维素。

也可以使用控释放系统；这样的系统可以包括原位凝胶、胶体颗粒、纳米颗粒和/或类脂质体(niosomes)。其它药物传递系统包括但不限于：非侵蚀的眼部插入物、可侵蚀的眼部插入物、水凝胶、胶原蛋白屏蔽物、脂质体、载药膜(例如)和离子电渗疗法。

该组合物还可以包括增加粘度的任选试剂。粘度增加到高于简单水溶液的粘度可以增加眼睛对活性化合物的吸收，减少配制剂时的变异性，减少制剂的悬浮液或乳液的组分的物理分离和/或以其它方式改善眼科制剂。这种增粘剂例如包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素，本领域技术人员已知的其它试剂或其组合。这些试剂通常的用量可以为组合物重量的0.01％至2％。

在具体方面，该组合物包括胶凝剂，例如高分子量水溶性多糖如结冷胶。该结冷胶可以从各种商业来源获得，例如以商品名出售。特别地， LT100可以用作形成柔软、弹性、非脆性凝胶的细网格、高酰基结冷胶。在具体方面，将结冷胶基的组合物配制成0.5％的滴眼剂。

其它试剂可用于进一步稳定或以其它方式加强组合物。例如EDTA、氯化钠、泰洛沙泊、硫酸钠和/或羟乙基纤维素中的一种或多种可以具有进一步稳定组合物的额外有益效果。

治疗方法

如上所述，发现本文所述的组合物在再生或增强角膜(例如基质层)以及角膜细胞(例如角膜基质细胞)中特别有用。特别地，该组合物可以用于提供角膜成形、厚度、规则性、硬度、弹性模量、拉伸强度或功能性(例如折射)加强。因此，本文所述的组合物可用于解决角膜的各种病症并矫正眼睛的屈光不正，并可用作其它眼部治疗的辅助疗法。

如前所述，该组合物可以以任何合适的方式配制以用于眼睛给药。该制剂包括眼科溶液、霜剂、乳液、软膏剂和凝胶。特别显著的是作为眼滴剂制得的制剂。在一个特定方面，该组合物可以使用市售的许多类型的眼滴剂分散体中的任何一种作为眼滴剂给药。作为示例，用于本发明组合物的容器可以是透明的、半透明的和不透明的，并且可以包含其它性质或性质的组合，例如为搪玻璃的，防破坏的，以单个或少量剂量等分试样包装的以及任何它们的组合。

该组合物可以以治疗有效量给药于受试者以实现期望的医学结果。特别地，该组合物可以以解决本文所述的眼科病症的量给药，或至少减轻此类病症中的一种或多种症状。该组合物的精确剂量(即量和时间表)可以由临床医生基于受试者和所呈现的病症来确定。示例性制剂(例如眼滴剂)可以每天1至24次，或每天1至12次，或每天1至6次，或每天1至4次，或每天1至3次，或每天1至2次，或每天1次、2次、3次、4次、6次、8次、12次、18次或24次。将该合物作为滴眼剂以通过在待治疗的每只眼睛中放置一滴来局部施用。或者，可以向每只眼睛施用2至3滴。

对于所描述的组合物，剂量范围可以是例如0.2pg至2.4ng；或2pg至2.4ng的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂；约0.2pg、约0.4pg、约0.6pg、约0.8pg、约1.2pg、约2.4pg、约2pg、约4pg、约6pg、约8pg、约12pg、约18pg、约24pg、约0.2ng、约0.26ng、约0.4ng、约0.6ng、约0.8ng、约1.2ng、约1.8ng或约2.4ng的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂，每只眼睛一剂。

作为其它实施例，剂量范围可以是12ng至1.3μg；或6ng至600ng的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂；约6ng、约8ng、约12ng、约16ng、约18ng、约24ng、约26ng、约30ng、约36ng、约40ng、约48ng、约52ng、约54ng、约60ng、约72ng、约78ng、约80ng、约90ng、约120ng、约130ng、约160ng、约180ng、约240ng、约260ng、约300ng、约360ng、约400ng、约480ng、约520ng、约540ng、约600ng、约720ng、约780ng、约900ng、约1.2μg、约1.3μg的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂，每只眼睛一剂。

作为其它实施例，剂量范围可以为1.5μg至150μg；2.6μg至260μg；或6.5μg至650μg的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂；或约1.5μg、约2μg、约3μg、约4.5μg、约6μg、约6.5μg、约7.5μg、约10μg、约15μg、约22.5μg、约32.5μg、约20μg、约26μg、约30μg、约40μg、约45μg、约60μg、约65μg、约75μg、约80μg、约90μg、约100μg、约120μg、约130μg、约150μg、约180μg、约225μg、约240μg、约260μg、约200μg、约300μg、约325μg、约450μg、约600μg或约650μg的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂，每只眼睛一剂。认识到地塞米松的具体制剂是可商购的，并且可以根据公认的剂量和时间表来使用。

任何上述地塞米松剂量可以以例如5pg至65ng的剂量范围共同给药；或0.5ng至65ng的TGFβ3多肽或其变体或片段；或约5pg、约10pg、约15pg、约20pg、约30pg、约45pg、约60pg、约0.05ng、约0.1ng、约0.15ng、约0.2ng、约0.3ng、约0.45ng、约0.5ng、约0.6ng、约0.65ng、约1ng、约1.5ng、约2ng、约3ng、约4ng、约4.5ng、约6ng、约6.5ng、约7.5ng、约9ng、约10ng、约12ng、约13ng、约15ng、约16ng、约20ng、约22.5ng、约24ng、约30ng、约32.5ng、约36ng、约40ng、约45ng、约48ng、约50ng、约52ng、约60ng或约65ng的TGFβ3多肽或其变体或片段，每只眼睛一剂。

一只眼睛的剂量可以是所公开组合物的约一滴。一滴组合物可以是10μl至200μl、10μl至120μl或50μl至80μl或其间的任何值。例如，移液器等分配器可以分配液滴1μl至300μl，两者之间的任何值。优选地，分配器在每一滴所公开的组合物中分出约15μl、约20μl、约30μl、约45μl、约60μl或约65μl。

当通过隐形眼镜或另一种插入物/植入装置给药该组合物时，隐形眼镜或插入物/植入物可以包括例如0.01mg至10mg的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂；或约0.01mg、约0.1mg、约0.5mg、约0.7mg、约1mg、约5mg或约10mg的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂。或者，隐形眼镜或插入物/植入物可以包括10ng至100ng的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂；或约1ng、约5ng、约10ng、约20ng、约50ng、约80ng或约100ng的地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂。作为另外的实施例，隐形眼镜或插入物/植入物可以包括约10ng至1μg的TGFβ3多肽或其变体或片段；或约10ng、约50ng、约100ng、约200ng、约500ng、约800ng或约1μg的TGFβ3多肽或其变体或片段。

本文所述的组合物可以与各种外科手术或其它治疗联合使用。例如，该组合物可与手术和非手术方法一起用于眼睛的屈光矫正。示例性方法包括但不限于：放射状角膜切开术(RK)，包括迷你不对称放射状角膜切开术(MARK)、六角角膜切开术(HK)、光折射角膜切开术(PRK)、角膜磨镶术、激光原位角膜磨镶术(LASIK)(例如)、激光上皮角膜磨镶术(LASEK)(例如Epi-LASEK)、自动层状角膜移植术(ALK)、激光角膜热成形术(LTK)、传导性角膜成形术(CK)、角膜缘松弛切口(LRI)、散光角膜切开术(AK)、前睫状巩膜切开术(ACS)、巩膜加固术、老花眼逆转术、老花眼激光逆转术(LRP)、角膜内环术(ICR)、基质内角膜环段植入术(例如)、可植入隐形眼镜、巩膜扩张带(SEB)和Kamra^TM嵌体。还包括热角膜成形术、角膜矫正术、酶角膜矫正术和化学角膜矫正术。

该组合物可以与非屈光病症的外科矫正联合使用，例如角膜撕裂伤的手术矫正。在具体方面，本文所述的组合物可以与在角膜上实施的特定手术方法联合使用。示例性方法包括但不限于：角膜移植手术、穿透性角膜移植术(PK)、治疗性激光角膜切除术(PTK)、翼状胬肉切除术、角膜纹身、人工角膜插入(例如KPro或Dohlman-Doane)和骨-牙齿-人工角膜插入(OOKP)。

该组合物可以与角膜胶原蛋白交联联合使用。角膜交联通常涉及使用通过暴露于UV-A光而激活的核黄素溶液。显著的交联方法包括但不限于：除去的上皮的角膜交联(德累斯顿方案或epi-off)，经上皮交联(epi-on)和加速交联。除此之外，交联程序通常可用，并以CXL、和角膜交联等销售。该组合物的给药可以在交联程序之前和/或之后进行。提出所公开的组合物可用于避免或抵消交联过程的有害影响，例如基质云雾状浑浊和细胞损失(下文更详细地描述)。此外，所公开的组合物的角膜再生可以允许对先前不符合这种程序的受试者实施交联，例如角膜厚度小于400μm的受试者。此外，所公开的组合物可用于减缓或终止进行性角膜变薄(其不能通过自身交联的使用来解决)。

本文所述的组合物可与一种或多种额外的眼用试剂共同给药。在各个方面，共同给药可以通过同时或随后使用这些试剂给药，或通过与这些试剂共同配制。根据所治疗或预防的病症，本文所述的组合物可以与一种或多种试剂共同给药，所述试剂包括但不限于：抗组织胺药、拟交感神经药、β受体阻滞剂、拟副交感神经药、副交感神经抑制剂、前列腺素、营养素、血管收缩剂、润滑剂、抗微生物剂和麻醉剂。具体包括各种抗炎剂，包括非甾体的抗炎药(NSAID)。该组合物还可以与眼睛润滑溶液和泪液替代溶液共同给药。

麻醉剂的非限制性实施例包括：苯唑卡因、丁哌卡因、可卡因、依替卡因、利多卡因、甲哌卡因、普莫卡因、丙胺卡因、氯普鲁卡因、普鲁卡因、丙美卡因、罗哌卡因和丁卡因。抗炎剂的非限制性实施例包括：阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、柳氮磺胺吡啶、奥沙拉嗪、水杨酸钠、三水杨酸胆碱镁、双水杨酯、二氟尼柳、双水杨酸、舒林酸、依托度酸、托美丁、双氯芬酸、酮咯酸、布洛芬、萘普生、氟比洛芬、酮洛芬、非诺洛芬、舒洛芬、奥沙普秦、甲灭酸、甲氯灭酸、昔康类、吡罗昔康、替诺昔康、吡唑烷二酮类、保泰松、奥吩塞宗、非尼拉敏、安他唑啉、萘丁美酮、COX-2抑制剂、阿扎丙宗、尼美舒利和齐留通。糖皮质激素如氢化可的松、泼尼松龙、氟米隆和地塞米松也可用作抗炎剂。

示例性的抗微生物剂包括但不限于：杆菌肽锌、氯霉素、氯四环素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、诺氟沙星、硫磺乙酰胺、磺胺异恶唑、多粘菌素B、四环素、妥布霉素、碘尿苷、曲氟尿苷、阿糖腺苷、阿昔洛韦、膦甲酸、更昔洛韦、纳他霉素、两性霉素B、克霉唑、益康唑、氟康唑、酮康唑、咪康唑、氟胞嘧啶、克林霉素、乙嘧啶、亚叶酸、磺胺嘧啶和甲氧苄啶-磺胺甲氧异恶唑。示例性的血管收缩剂包括但不限于：肾上腺素异戊酯、肾上腺素、苯肾上腺素、安普尼定、可卡因、羟基苯丙胺、萘唑啉、四氢唑啉、达哌唑、倍他洛尔、卡替洛尔、左布洛尔、美替洛尔和噻吗洛尔。营养素包括维生素、矿物质和其他有益试剂、如维生素A、维生素B₁、维生素B₆、维生素B₁₂、维生素C(抗坏血酸)、维生素E、维生素K和锌。

在具体方面，将本文所述的组合物配制成眼滴剂，并且这种眼滴剂与其它眼滴剂制剂联合使用。这样的其它眼滴剂可以包括但不限于：冲洗/润滑眼滴剂、干眼治疗、类固醇和抗生素眼滴剂、青光眼眼滴剂，过敏/抗炎眼滴剂和结膜炎眼滴剂。

该组合物可以与隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或基质内环联合使用以协助支撑或重塑受试者的角膜。角膜插入物包括角膜嵌体和角膜镶嵌装置。例如隐形眼镜、基质内环或其它插入物/植入物可以用于在用组合物处理之前、期间和/或之后模制或保持角膜形状。应注意，角膜“插入物”通常是指插入到角膜中的临时装置，而角膜“植入物”通常指的是更永久的装置。然而，许多众所周知的装置在本领域中可替换地描述为植入物/插入物。因此，本文所用的术语“插入物/植入物”不应被视为基于使用时间的严格限制。

隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或基质内环可以与所公开的组合物一起使用以治疗角膜缺陷、疾病、损伤、损害和/或退化以及眼睛的屈光不正。在各个方面，隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或基质内环可用作组合物或组合物洗脱装置的载体。在其他方面，如本文详细描述，隐形眼镜、基质内环或其它角膜插入物/植入物可与组合物一起使用，该组合物适用于眼睛给药，例如眼滴剂。在某些方面，可以使用计算机软件来确定最适合受试者的隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或基质内环和/或确定组合物制剂。在特定方面，眼睛手术(例如屈光或移植手术)之前或之后使用利用隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物与本文描述的组合物一起的治疗。

治疗可以包括评估受试者(例如受试者的年龄、工作需要、眼睛缺陷或疾病等)，依处方使用成型隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或基质内环以协助角膜前表面的曲率半径所需的变化，并且将本文描述的组合物与隐形眼镜或植入物/插入物联合使用。受试者处方使用的隐形眼镜或植入物/插入物可以用于对角膜施加机械力，从而引起角膜的形状变化，即屈光力的变化。

在某些优选方面，可以通过将所公开的组合物与角膜插入物、角膜植入物或基质内环联合使用以支撑或塑形角膜。市售设备的实例包括和KeraRing基质角膜内环。在另一方面，塑形的隐形眼镜可以与所公开的组合物联合使用。隐形眼镜可以是硬的或刚性的，或者它可以是软式眼镜。或者，隐形眼镜可以同时包括硬部分和软部分。如果使用柔软的隐形眼镜，角膜中可能会引起更多的正曲率或负曲率，并且当他或她适应隐形眼镜时，受试者眼睛的不适会减弱。如果使用硬隐形眼镜，则可以对角膜施加更多的机械压力。隐形眼镜可以是透气的。塑形的隐形眼镜可以从商业来源获得。市售眼镜的实例至少包括DreamLite、OK Lens、EyeDream、MiracLens、DreamLens、i-GO OVC、GOV、Wake and See、CRT、Fargo/iSee、Emerald和Wave隐形眼镜系统镜头。

一旦隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或基质内环被放置在受试者的眼睛上/眼中，本文所述的组合物(例如眼滴剂)可以对眼睛给药。在某些情况下，可能期望在放置隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或基质内环之前预先给药该组合物。有利地，隐形眼镜、基质内环或其它插入物/植入物和组合物可以联合使用以产生形状变化，从而产生角膜的屈光力。可以更频繁地给药组合物以允许角膜采取所需的形状变化。在某些方面，该组合物至少每24、12或8小时给药。在其它方面，每6小时组合物给药一次。在某些其他方面，大约每3小时组合物给药一次。在其它方面，大约每2小时组合物给药一次。在其它方面，每小时组合物给药一次。

不希望受任何特定理论的约束，隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或基质内环和本文所述的组合物的组合使用可能诱导角膜分子结构的变化，并且可能诱导角膜基质中发现的细胞和诸如胶原蛋白(例如II型胶原蛋白)的蛋白质的变化。角膜的表面由此变得更均匀。通过减少角膜表面的不规则性，提高了所有图像的质量和清晰度(即视敏度)。

对于成型隐形眼镜的计算，采用最平滑的角膜曲率法。本领域技术人员还可以使用更陡峭的角膜曲率法或两者的平均值，并且基于该角膜曲率进行必要的计算以使角膜前表面的曲率半径变平滑或陡峭，从而校正角膜的屈光缺陷。可以基于每个眼睛的屈光力的变化分别计算成型隐形眼镜的基本曲线。在特定方面，成型隐形眼镜的基本曲线可以从一到四个更平滑或更陡峭的屈光度开始计算，更优选一至三个更平滑或更陡峭的屈光度，甚至更优选一至二个更平滑或更陡峭的屈光度，这取决于屈光度所需的屈光不正。周边基线曲线取决于成型隐形眼镜的适应性，并且计算为比中心区域大0.5mm的半径，但是可以根据设计而变化。

根据本发明使用的成型隐形眼镜的直径可以为8.0mm至18.0mm。可以生产这样直径的市售眼镜。在某些方面，成型隐形眼镜可以是直径范围为8.0mm至12.0mm的硬性隐形眼镜。在其它方面，成型隐形眼镜可以是直径范围为13.0mm至15.0mm的软性隐形眼镜。软性隐形眼镜可能覆盖整个角膜，从巩膜到巩膜。在其它方面，成型隐形眼镜可以由硬质和软质材料构成。隐形眼镜在中心可能很硬，大约为12.0毫米、13.0毫米、14.0毫米或15.0毫米，然后外围柔软到16.0毫米、17.0毫米和18.0毫米。晚上可以使用较大的隐形眼镜作为塑形隐形眼镜，优选软性隐形眼镜。

成型隐形眼镜的屈光力可以被确定为受试者需要舒适地看到的最接近的可能屈光力。在使用成型隐形眼镜的适应过程中，如果视力不足以满足受试者的需要，则规定受试者在受试者接受治疗时的眼镜。由于角膜正在重塑或已经重塑，所以可以重复进行各种验光测量以确认治疗按计划进行并且是适当的。这样的测量可以包括近视和远视的视敏度评估、矫形、角膜曲率测量、客观和主观视网膜检查、成型隐形眼镜的适应图、成型隐形眼镜的移动以及成型隐形眼镜的舒适度。

进行测量之后，可以基于这些测量对治疗程序进行改变。通过每次评估，可以决定是否继续使用相同的成型隐形眼镜或者是否应该使用新的隐形眼镜。此外，对于与成型隐形眼镜一起使用的组合物，可以做出相同的决定。对成型隐形眼镜和/或组合物做出改变可以在几周内引起所需的角膜整形。在某些方面，在开始治疗后的前8周内每周定期进行修正。

本文所述的组合物诱导角膜的胶原蛋白含量的变化(例如II型胶原蛋白)。角膜的解剖学、组织学和生理学的其他方面也可能受到组合的影响。在某些方面，该组合物可以是高渗或低渗的以诱导角膜水化的变化。在其它方面，该组合物可用于改变角膜的分子结构(例如细胞外基质)，并且以这种方式增强或修复角膜，或将角膜重塑成所需的曲率。

当重塑角膜时，可能期望共同给药一种或多种酶以软化角膜。示例性酶包括但不限于透明质酸酶、软骨素酶ABC、软骨素酶AC、角蛋白酶和基质溶素，其已经显示可作用于角膜的各种蛋白多糖组分。还包括酶胶原酶、基质金属蛋白酶1(间质胶原酶)和基质金属蛋白酶2(明胶酶)。当组合物与任何这样的酶共同给药时，可能需要在组合物中包括赋形剂，如聚合物(例如甲基纤维素、聚乙烯醇，纤维素等)，以加强这些酶的作用。可以包括额外的试剂来激活金属蛋白酶，例如白细胞介素1α、肿瘤坏死因子α/β及其任何亚型、一水合尿酸单钠、4-氨基苯乙酸汞、人类血清淀粉样蛋白A、人类B₂微球蛋白和氯化铜。还可以包括尿素(脲)。也可以使用这些试剂的任何组合。

该组合物还可以与降解角膜中发现的其它糖或蛋白质的一种或多种酶共同给药。该组合物可以与一种或多种麻醉剂共同给药，以用于减少成型隐形眼镜或任何角膜插入物/植入物对角膜的刺激。该组合物可以与一种或多种润滑剂共同给药，以改善受试者在治疗期间的舒适度。在其它方面，该组合物可以与一种或多种抗微生物剂，如抗细菌剂、抗病毒剂和/或抗真菌剂共同给药。该组合物还可以与一种或多种血管收缩剂共同给药。本领域技术人员可以基于所治疗的病症来确定适合于受试者共同给药的试剂。

在某些方面，该组合物可以在试剂盒中提供。该试剂盒可以包括以下中的一种或多种：成型隐形眼镜、润滑眼滴剂、用于隐形眼镜的清洁剂或其它溶液、隐形眼镜携带盒、一对额外的隐形眼镜、以及佩戴隐形眼镜和使用组合物的使用说明。试剂盒提供的组合物可以被配制成包括组分(TGFβ3多肽(或其变体或片段)+地塞米松(或其衍生物或相关的甾体试剂))的所指出的组合，或该试剂盒可以包括作为单独制剂的组分，在给药前混合在一起，或一起给药，即同时或顺序给药。

实施例

为了说明本发明的具体实施方式和方面而提供本文所述的实施例，旨不在以任何方式限制本发明。普通技术人员可以利用本文的公开内容和教导来产生其他实施方式、方面和变化，而无需过多的实验。认为所有这些实施例、方面和变型都被是本发明的一部分。

实施例1：实验概述

在先前的实验中，发明人已经表明可以引导角膜基质细胞分化成神经元谱系。本文所述的实验旨在研究角膜基质细胞转换成分泌软骨特异性II型胶原蛋白的软骨细胞样细胞的潜力。认为这种类型的软骨是在发育过程中表达的(Linsenmayer等，1990)。进一步的目的是确定II型胶原蛋白沉积是否可以在活体大鼠的角膜中体内诱发，以及这种治疗是否对角膜的光学性质产生积极的影响。另一个目的是已经确定角膜组织中的角膜基质细胞是否可以适应于细胞重编程这种方法和随后的富含II型胶原蛋白的ECM的产生。最后，实验旨在使用纳米压痕测试来估计II型胶原蛋白沉积对的体内和离体已治疗角膜的生物力学性质的影响，这是一种能够分析硬度和弹性模量的生物工程方法。

实施例2：组织样品

人类组织

尸体的全人角膜，移植手术时获得的圆锥性角膜、人角膜缘和外科医生切除的DSEK囊膜(Descemet的剥离内皮角膜移植术的过多基质组织)从源自新西兰国家眼库(奥克兰，新西兰)的捐助者而获得。在角膜移植手术从角膜缘连接处留下2mm角膜边缘而移除中央角膜钮状体以后，收集人角膜缘。在使用组织之前，获得了北方X区域人类伦理委员会研究伦理批准和同意。使用前，将所有组织储存在新西兰眼库培养基(Eagles MEM中2％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1×Anti-Anti)中，并在新西兰眼库运输培养基(添加有5％葡聚糖的眼库培养基)中运输。

动物组织

从奥克兰动物伦理委员会(申请号R856)获得的动物研究伦理批准。在使用二氧化碳室的安乐死后，获得6～8周龄成年雄性Wistar大鼠的眼睛和软骨。将整个眼睛从动物中取出，并在解剖显微镜的帮助下，使用手术剪刀小心地切开角膜。用手术刀刀片切开作为胸骨一部分的剑突(Xiphoid process)，该胸骨在末端含有薄的、宽的软骨板。动物组织用聚维酮碘(PVP-I)和硫代硫酸钠洗涤。用刀片刮掉覆盖软骨的多余脂肪和组织。使用前，将新收集的眼睛和软骨短暂储藏在磷酸盐缓冲盐水溶液中。

实施例3：组织学分析

组织制备和冷冻切割

将角膜和软骨片(2mm×2mm)嵌入最佳切割温度化合物(OCT，Tissue-Tek，Sakura，荷兰)中，然后在液氮中快速冷冻。使用Microm HM550低温恒温器(美国Thermo-Scientific)切割成10～15μm厚的切片，并将其安装在SuperFrost^TM Plus静电切片(德国Menzel-Glenser)上。进一步使用前，将冷冻切片保存在﹣20℃。

细胞和组织培养

人类和大鼠角膜的组织消化和细胞制备

解剖角膜缘以在II类层流净化罩中分离基质与巩膜。之后，用角膜刀轻轻刮除角膜上皮和内皮并丢弃。DSEK罩也使用角膜刀轻轻地刮除以除去上皮细胞。然后将剩留的基质组织在37℃下在Hanks平衡盐溶液(Life Technologies)中用0.4％的II型胶原酶(Sigma-Aldrich)中消化，同时在定轨振荡器上轻轻混合。使用多种消化时间，5小时是最佳组织消化和细胞活力所需的时间。

组织消化完成后，通过以1200rpm离心7分钟使细胞成团块。然后将细胞重悬浮于最小量的合适的细胞培养基中，并使用Leica DM IL台式倒置显微镜和Neubauer血细胞计数器进行计数。使用加入台盼蓝溶液的1:1比例的细胞悬浮液(0.04％台盼蓝的PBS原液)，每个样品最少三次计数，并取平均值。

角膜基质细胞的细胞培养

使用无菌技术在II类层流净化罩中实施所有细胞操作。将分离的角膜基质细胞在塑料或玻璃盖玻片上的12或24孔板(Falcon)中的2～3ml细胞培养基中培养。将细胞在37℃用5％CO₂保存在湿润的培养箱中。24小时后，每隔两天更换一次培养基，如果需要，则更频繁地更换。每天用Leica DM IL台式倒置显微镜观察培养基。对于细胞团块培养，组织中新获得的细胞通过在塑料锥形管中在20℃下以300g离心7分钟成团块。向管中加入合适的培养基。在37℃下培养24小时后，细胞浓缩并形成不附着在管壁上的团块。将该团块在5％CO₂的湿润气氛中于37℃下在2ml培养基中培养3周。培养基每隔一天更改一次。

器官切片培养

在前后平面用刀片将人类和大鼠角膜和软骨组织薄片切片(1-2mm)，将该切片置于器官型气—液相培养系统中(图2)。简而言之，将健康组织的外植体在培养基和富CO₂环境之间的界面上在0.4μm孔径的细胞培养槽(法国Millicell)中培养。在具有3ml培养基的细胞培养板插入物上放置角膜切片，使得上皮侧向上。培养基每隔一天更换一次。

实施例3：体外重编程

培养基

使用如下表所述的几种定制的培养基。

表1：使用的细胞培养基

角膜基质细胞的软骨形成重编程

在软骨形成分化培养基中培养不同时间间隔的组织切片以确定生长因子处理所需的最佳时间。每个时间点收集样品(表2)。为了获得单层细胞，将角膜基质细胞以每平方厘米15×10⁴的密度接种在玻璃盖玻片上。使细胞附着在盖玻片上24小时，每隔一天更换培养基。培养保持长达3周。

表2角膜组织切片培养的实验时间点

实施例4：体内重编程

用于生长因子传递的凝胶眼滴剂制剂

使用由细菌假单胞菌(Pseudomonas elodea)产生的水溶性多糖的结冷胶配制眼滴剂。使用凝胶基质制剂可延长治疗剂的角膜滞留时间和增加的眼部生物利用度。由于聚合物结冷胶是阴离子聚合物，因此在单价和二价阳离子，如Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺和Na⁺的存在下，它会经历原位胶凝(Bakliwal和Pawar 2010)。存在于泪液中的电解质会导致当聚合物滴入眼睛时的凝胶化，这又导致更长的滞留时间和增加的药物的生物利用度(Ludwig 2005)。基于以前的制剂研究，聚合物制剂对于体内使用是无刺激性和安全的(Rupenthal，Green和Alany 2011)。

首先，通过将蒸馏水加热至80℃，随后在不断搅拌下加入结兰胶(美国Kelcogel^TM)来制备0.5％溶液。一旦粉末完全溶解，将溶液冷却并储存在4℃。在持续搅拌下将适量的生长因子加入到流动凝胶中。生长因子浓度比所使用的培养液高10倍，用于弥补通过鼻腔引流和眨眼而损失的药物。眼滴剂凝胶包括终浓度为100ng/ml的TGFβ3和约4μg/ml的地塞米松。

用神经源性和软骨形成因子治疗

人为约束动物，并将约15μL的眼滴剂滴入右眼(图3)。对侧眼用作对照眼。对于神经元特化(specification)，每日给药眼滴剂三次，持续5天，对于软骨形成的特化长达8周。

实施例5：免疫组化(IHC)分析

组织收获和处理

在处理结束时，使用二氧化碳室对动物进行安乐死。收集眼睛，并在磷酸盐缓冲盐水中漂洗。然后小心地切下角膜并在4％的多聚甲醛(PFA)中固定1小时，并用蔗糖溶液处理，以在冷冻和切片之前对组织进行冷冻保护。作为冷冻保护剂的蔗糖是防止冷冻组织切片中冰晶形成物的脱水剂。在缓慢冷冻组织的情况下，冷冻保护特别重要。

简言之，将角膜在4℃下浸入20％蔗糖溶液中5小时，然后移至30％蔗糖溶液并保持在4℃，直至组织沉淀(通常为过夜)。然后将角膜嵌入OCT化合物中并浸入液氮中以使其快速冷冻。进一步使用前，将冷冻的组织块储存在﹣80℃。将大约10～15μm厚的冷冻切片装在SuperFrost^TM Plus载玻片上，在使用前，并将该载玻片储存在﹣80℃。在细胞培养的情况下，用PBS漂洗在盖玻片上培养的细胞，用4％PFA固定15分钟。进一步使用前，将盖片浸入PBS中。

免疫组化

对于组织冷冻切片，在进行免疫组织化学之前，将载玻片在室温下保持15～20分钟。使用PBS冲洗掉OCT，并使用蜡笔划定组织周围的区域。首先，将组织切片用10％正常山羊血清的封闭溶液培养1小时，然后在4℃下用适当稀释的一抗进行过夜培养。然后将载玻片在PBS中漂洗三次，再用适当稀释的二抗进行培养。将二抗在室温下保持2小时。切片用核标记物4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染，并装在Citifluor抗褪色剂(澳大利亚ProSciTech)中。使用奥林巴斯FluoView^TMFV-1000共焦激光扫描显微镜(405nm、473nm和559nm波长激光)和Leica DMRA荧光显微镜进行成像。

表3：使用的抗体

实施例6：基因表达分析

RNA分离和cDNA合成

使用 RNA MicroKit(Invitrogen)进行样品的mRNA提取。简言之，将组织样品与0.75ml 和载体RNA混合，并使用手持式均质器(PRO Scientific，Inc.)匀浆。然后将样品与0.2ml氯仿一起培养，再以12000rpm和4℃离心15分钟。分离上相，并与乙醇混合，然后转移到收集管中。

通过以12000rpm离心1分钟在柱上收集RNA。弃去流出物，用脱氧核糖核酸酶(DNAse)处理提取的RNA。用所提供的缓冲液洗涤柱子数次，并将RNA最终分散在不含核糖核酸酶(RNAse)的水中。使用(Thermo Scientific)测定浓度，并将mRNA在﹣80℃储存。

使用SuperScript VILO^TMcDNA合成试剂盒(Invitrogen^TM，Life Technologies)制备cDNA。简言之，将100ng RNA与VILO^TMReaction Mix、 Enzyme Mix和无RNA酶的水在25℃下培养10分钟。然后将样品在42℃下培养120分钟，再在85℃培养5分钟。将cDNA保存在﹣20℃。

使用基因表达测定进行定量PCR

获得感兴趣的基因的基因表达测定。在PCR步骤中，将10μL的Universal Master Mix II与1μL的试料混合，约25ng的cDNA和9μL的水组成体积20μL。将管涡旋并短暂离心以旋转下内容物。将每个cDNA样品一式三份制备并移至384孔板中。将每个反应混合物20μL加载到 Optical 384-Well Plate(Applied Biosystems)的每个孔中。然后用 Optical Adhesive Film(Applied Biosystems)覆盖该板，并将该板短暂离心以消除气泡。将该板转移到7900HT快速实时PCR系统中，并使用以下热循环参数，50℃2分钟、95℃10分钟、然后在95℃下15秒、60℃下1分钟，40个循环。分析结果如上节所述。

表4：用于QPCR的基因测定

基因符号	基因名称	测定ID
			Col1a1(大鼠)	胶原蛋白，I型，α1	Rn01463848_m1
Col2a1(大鼠)	胶原蛋白，II型，α1	Rn01637085_m1
			Col2a1(大鼠)	胶原蛋白，II型，α1	Rn01637087_m1
Pop4(大鼠)	核糖核酸酶P蛋白亚基p29(管家基因)	Rn02347225_m1
			COL2A1(人类)	胶原蛋白，II型，α1	Hs00264051_m1
CDKN1A(人类)	细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1(管家基因)	Hs00355782_m1

实施例7：在原位基质ECM蛋白沉积后测试角膜的生物力学和光学性质

检查啮齿动物眼前段(正面结构)

已经显示角膜生物力学在各种角膜疾病的诊断和治疗中是相关的，并提供对角膜结构及其与角膜生理功能的关系的洞察。已经经过治疗以导致ECM蛋白沉积的角膜也需要测试角膜混浊，因为不希望透明度的降低。

Phoenix Micron IV啮齿动物眼睛成像系统(Phoenix Research Labs)用于检查治疗的大鼠的角膜。首先使用腹膜内注射氯胺酮和(3:2)给予大鼠镇静剂。Micron IV成像系统的裂隙灯附件用于详细检查角膜的层次，并检查角膜的完整性和透明度。还进行视网膜成像以检查角膜透明度。在成像之后，对大鼠给药(阿非匹唑)以减弱镇静剂。

体外和体内治疗角膜的纳米压痕测量

纳米压痕通过施加垂直于目标样品平面的超小力并测量所得到的样品压痕(Dias和Ziebarth，2013)来提供目标材料的机械测量。纳米压痕最近已经成为测量组织和其它生物材料中纳米和微观力学性能的强大工具(Ebenstein和Pruitt 2006)。原位扫描探针显微镜(SPM)成像的更新进展，其中，纳米压头同时用作3D成像装置并与纳米压痕结合使得新一轮的新材料研究成为可能(Dickinson和Schirer，2009)。同时记录力、位移和时间，同时在受控负载下将纳米压痕压头推入角膜组织。在纳米压痕过程中施加的力可以小到几纳牛顿，甚至可以达到几牛顿，使得能够研究一系列尺寸范围。纳米压痕测试以负载—位移曲线输出，可以使用明确定义的方程来分析，以计算与角膜刚度、完整性和弹性相关的机械性能。

将人类圆锥形角膜置于对照培养基或含有诱导重编程因子的特异性ECM蛋白的培养基中器官型培养。然后在治疗时间结束时进行纳米压痕测量。对于体内研究，手动约束动物，并且将约15μL含有重编程因子的凝胶滴眼制剂灌注于每只Wistar大鼠的右眼，对侧眼用作对照眼。眼滴剂长达七周每天给药三次。在隔离眼睛的处理期的第1周、第3周或第7周记录纳米压痕测量值。

在奥克兰大学的化学和材料工程实验室进行纳米压痕测试。为了在其自然位置测试角膜，需要模具用于纳米压痕。以前的研究使用聚苯乙烯和万能胶将角膜保持在适当位置。模具在负载下变形的结果是潜在的误差源，因此决定将硬质模具用于测试。用于制造模具的第一种材料是常规的橡皮泥。这形成人类角膜样品的准确的形状和曲率(图6(A))。然后在接下来的两天内让橡皮泥硬化，然后再用于测试。大鼠眼睛的测试与使用的整个眼睛略有不同。为了将眼球保持在适当位置，使用填充有树脂并具有小的凹部以保持球体的陪替氏培养皿(图6(B))，使用PBS将样品保持干燥。

由于样品是非常柔软的生物样品，因此所有的纳米压痕测试均使用均质流体压头。用于人类样品的压痕负载为50μN。对于大鼠球体，使用3μN和5μN之间的负载范围。开启光纤灯，将样品直接放置在显微镜下的光线之下。角膜的中心部分尽可能准确地直接放置在光线中(图6(C))。通过调整Z滑块来聚焦样品，直到可以以良好的分辨率观察到角膜的表面。为了确保焦点位于角膜样品的最高点，在x和y方向上移动视域，以观察焦点如何改变。

一旦数据收集点集中在角膜的中心，就可定义取样边界，并且实施了快速的方法。缩进之前，必须正确设置负载功能。实际的压痕过程由HysitronTriboin 自动操作(图6(D))。将预定义的负载安置在穿过样品的压头上，直到达到所限定的限度。然后将压头保持10秒钟，再将压头从样品中卸载。样品的硬度由压头卸载后的残留压痕面积(Ar)确定。

其中，P_max是最大压痕负载，而面积是平球(conospherical)压头与样品的接触面积。减小的弹性模量表示样品和压头中的弹性模量，如下式所示：

i指的是压痕机，m是指样品材料。减少的弹性模量告诉我们样品的弹性如何。因为每个测试使用相同的压头，所以可以使用减少的弹性模量来比较每个被测样品中的弹性。

实施例8：成人角膜基质细胞在外源性TGFβ3和地塞米松治疗后产生软骨特异性II型胶原蛋白

已知一种生长因子可以作用于具有相似或不同效应的几种类型的细胞，而多种生长因子可以共享类似的生物学功能。当选择可能在角膜基质中造成胶原蛋白沉积的生长因子、细胞因子和化学物质时，重要的是考虑某些外源因子的已知作用。在本实验中，使用了TGFβ3和地塞米松的联合治疗。

通过其对干/祖细胞的影响的研究已经获得了TGFβ3和地塞米松的作用的大部分证据(Schuldiner，Yanuka，Itskovitz-Eldor，Melton和Benvenisty 2000；Worster，Nixon，Brower-Toland和Williams 2000)。以前已经使用TGFβ和地塞米松的组合来诱导祖细胞在体外分化成软骨细胞(Diekman，Rowland，Lennon，Caplan和Guilak 2009；Johnstone等1998；Kolambkar，Peister，Soker，Atala和Guldberg 2007；Winter等2003)。此外，地塞米松是一种合成类固醇药物，用于治疗炎症性眼病。因此，在软骨形成分化培养基中使用TGFβ3和地塞米松的组合来使角膜基质细胞分化为软骨细胞的表型。

在本实验中，特别说明I型和II型胶原蛋白的表达。已知纤维类型的胶原蛋白如I型和II型自组装和交联以形成高度结晶的纤维，从而表现出非常高的刚度、低延展性和显着的弹性储能能力(Wells 2003)。其是有助于纤维的刚度和拉伸强度的交联。

角膜基质细胞外基质(ECM)主要由I型和V型胶原蛋白组成的紧密包装的异型胶蛋白纤维组成。与角膜纤维相似，软骨纤维是异型的(由II型和XI型构成)且具有均匀直径25nm(略小于角膜纤维)(Mendler，Eich-Bender，Vaughan，Winterhalter和Bruckner，1989)。II型胶原蛋白是软骨的主要纤维组分，并且与I型胶原蛋白相似，因为分子基本上由长度为300nm的单个不间断螺旋结构域组成。由于它们的相似性，所以认为II胶原蛋白和XI胶原蛋白是其它组织中I胶原蛋白和V胶原蛋白(角膜基质胶原蛋白)的软骨类似物。

在本实验中，将来自成人角膜的角膜基质细胞接种在含有TGFβ3和地塞米松的软骨形成分化培养基或标准成纤维细胞增殖培养基中。在2～3天内，接种在软骨形成分化培养基中的角膜基质细胞形成直径约50～100μm的细胞聚集体/球体(图7(A))。标记为中心部分的软骨细胞特异性II型胶原蛋白的球体和周围的巢蛋白(图7(B))。此外，一旦将球体置于成纤维细胞增殖培养基中，来自球体的细胞开始向外扩散(图7(C))以填充培养皿，从而形成单层细胞。一旦细胞聚集的区域标记为II型胶原蛋白，则就不会形成单层细胞(图7(D))。

接种在成纤维细胞增殖培养基中的角膜基质细胞形成均匀单层的成纤维细胞样细胞(图8(A))，其未标记为巢蛋白或II型胶原蛋白(图8(B))。当培养基变为软骨形成分化培养基时，培养物的外观没有变化，细胞保留II型胶原蛋白阴性。这些结果表明细胞聚集体似乎对软骨样ECM的产生很重要。接种到成纤维细胞增殖培养基中的角膜基质细胞不能形成必需的细胞聚集体。因此，为了形成成纤维细胞簇，将汇合的成纤维细胞从培养皿中分离，沉淀，并在成软骨形成分化培养基中作为沉淀培养物再生长三周。细胞团块标记为对角膜基质特异性ECM蛋白角膜蛋白呈阳性，而不对软骨特异性ECM II型胶原蛋白呈阳性(图8(F)和(G))。

实施例9：成人角膜和成年大鼠角膜中的角膜基质细胞在用TGFβ3和地塞米松治疗时分泌含II型胶原蛋白的ECM

将成人角膜切片置于对照培养基或软骨形成分化培养基中的器官切片培养2周。然后将组织切片标记为软骨细胞特异性ECM蛋白II型胶原蛋白和I型天然角膜胶原蛋白。仅在TGFβ3和地塞米松治疗的角膜中观察到阳性标记(图9(C)和10(B))。发现两周的处理期导致II型胶原蛋白在经治疗的角膜基质ECM中沉积(图9(C))。处理1周不会在基质ECM中导致II型胶原蛋白的任何可见的沉积(图9(B))。

在经治疗的角膜中，天然I型胶原蛋白的数量和模式似乎会稍微改变。通常，在未经治疗的角膜中，标记的强度相似，但分布更广泛，标记量较高(图9(D))。此外，新产生的II型胶原蛋白均匀地以有序的方式铺在ECM中，而不形成任何大的物质或聚集体。沿着角膜基质的预先存在的胶原蛋白骨架可以清楚地看到标记，并且分布在基质层的整个厚度上。

然后将体外人类角膜组织实验扩展到体内啮齿动物研究，其中将雄性Wistar大鼠的右角膜处理两周，每天三次给药15μl结冷胶基的TGFβ3和地塞米松眼滴剂。两周后，将大鼠进行安乐死，将角膜进行免疫组织化学处理。经治疗的角膜标记为对仅在角膜前部观察到的具有较高程度沉积的II型胶原蛋白呈阳性(图10(D)和(E))。因此，仅在软骨形成分化培养基中培养的角膜切片对于II型胶原蛋白呈阳性。此外，II型胶原蛋白沿着基质预先存在的胶原蛋白骨架均匀覆盖。

实施例10：在圆锥形角膜中诱导II型胶原蛋白沉积

发明人接下来寻求确认在其研究中观察到的体内重编程可用于圆锥形角膜的治疗。进行实验以确认圆锥形角膜中的角膜基质细胞适于诱导II型胶原蛋白沉积。角膜移植手术后获得的圆锥形角膜钮状体一经获得即可进入培养。将每个钮状体的一半放入对照培养基中，另一半置于软骨形成分化培养基中并保持2周。2周后，将组织进行免疫组织化学或mRNA提取处理。只有经治疗的一半角膜的基质ECM对II型胶原蛋白呈阳性(图11(B))。虽然与正常角膜组织相比，在圆锥形角膜组织中标记的强度较低，但标记图案相似，并沿着预先存在的胶原薄片的骨架有序排列。

波形蛋白标记显示未治疗和经治疗的圆锥形角膜角中的角膜基质细胞之间的明显差异。通常在经处理的角膜中角膜基质细胞密度较低，角膜后部缺乏细胞(图11(C))。此外，与未治疗角膜中的角膜基质细胞相比，经治疗的角膜中的角膜基质细胞出现更多的丝状和完整的形态(图11(E)和(F)))。与未治疗角膜中的角膜基质细胞相比，经治疗的角膜中的角质基质细胞更长，并具有更大量的细胞过程，其具有强烈地标记的波形蛋白。

实施例11：TGFβ3和地塞米松治疗不会诱导纤维蛋白沉积或引起角膜混浊

在软骨形成分化培养基中培养长达三周的人类角膜被标记为与纤维化和瘢痕形成相关的III型胶原蛋白和αSMA(Gabbiani 2003；Karamichos等，2012)，没有任何纤维化基质沉积的证据，另一方面，在对照组织中存在较高程度的αSMA标记(图12)。这些结果证实以前的发现，与TGFβ1和TGFβ2不同，TGFβ3不诱导角膜基质细胞分化成肌成纤维细胞。

在整个研究期间对活的大鼠进行狭缝灯检查。经检查，经治疗和未治疗的角膜无差异，无瘢痕形成或混浊。眼睛背部的成像表明血管显示没有阻碍光通过的清晰的角膜(图13(A)和(B))，并且使用Micron IV眼镜的大鼠角膜的体内横截面成像显示光容易通过的透明角膜(图13(C)和(D))。没有任何导致通过角膜的光线障碍的角膜不透明或浑浊的迹象。

实施例12：体内治疗后II型胶原蛋白和I型胶原蛋白mRNA表达的变化

对体内治疗1周、7周和3周，随后4周的非治疗期的大鼠角膜进行定量基因表达分析。目的是确定在停止出生长因子治疗后，II型胶原蛋白表达是否再次下降和/或永久性停止。还研究了治疗对天然角膜II型胶原蛋白的影响。

与治疗7周的角膜相比时，治疗1周的角膜表达非常高水平的II型胶原蛋白。如图35中的第一个图所示的治疗停止后，表达水平显著降低。对于I型胶原蛋白表达，将治疗1周和7周的角膜各自与其未经治疗的角膜进行比较。发现治疗1周后I型胶原蛋白表达存在初始峰值，但处理7周后I型胶原蛋白表达显著降低，与未治疗角膜中的I型胶原蛋白表达相当(图14(B))。

实施例13：体外和体内治疗角膜的生物力学性质的变化

假设II型胶原蛋白的覆盖将影响角膜的刚度和弹性。为了估计这些变化，将体内大鼠角膜和离体治疗的人类角膜及其匹配对照进行纳米压痕测试。

当与未治疗的对照相比时，1周体内治疗的大鼠角膜在硬度或弹性方面没有显著增加(图15)。在3周体内治疗的角膜中，经治疗的眼睛和对照眼睛之间有明显的差异。每个角膜经过高达八次测试，得到的负荷变形曲线图显示出良好的再现性(图16)。在右眼暴露于生长因子的治疗中，硬度和减少的弹性模量均显著提高。将在对照培养基或软骨形成分化培养基中离体培养6周的匹配的一组圆锥形角膜也进行相同的生物力学测试。再次，测试显示经治疗的角膜的硬度和弹性模量显著增加(图17)。

实施例14：生长因子和类固醇的比较组合

进行羊角膜的离体研究，以便研究其他生长因子—类固醇组合在角膜基质细胞的软骨形成分化中的疗效。

从奥克兰肉类加工公司获得新鲜的羊眼。立即切下角膜并用聚维酮碘(PVP-I)和硫代硫酸钠溶液冲洗。然后，使用环锯切割8mm羊角膜组织瓣。将一只羊角膜瓣置于每个培养条件(如表5中概述的)中3周。然后将角膜瓣置于器官型气-液相培养系统中。

简言之，将健康组织的外植体在培养基和富CO₂环境之间的界面上在0.4μm孔径的细胞培养插件(法国Millicell)上培养。放置角膜切片使得在上皮具有3ml培养基的细胞培养板插件向上。培养基每隔一天更换一次。使用的基础培养基是添加1％抗生素-抗真菌溶液(Anti-Anti))和1％GlutaMAX^TM 的Dulbecco的改性Eagle培养基(DMEM)。在3周结束时，将每个角膜瓣固定在4％多聚甲醛(PFA)中1小时，并用蔗糖溶液处理，以在冷冻和切片之前对组织进行冷冻保护。

简言之，将角膜在4℃下浸入20％蔗糖溶液中5小时，然后移至30％蔗糖溶液中并保持在4℃，直到组织下沉(通常为过夜)。然后将角膜包埋OCT化合物(最佳切割温度)中并浸入液氮中以实现快速冷冻。进一步使用前，将冷冻的组织块保存在﹣80℃。将约4～6个40μm厚的冷冻切片装在SuperFrost^TM Plus载玻片上，并在需要前，将该载玻片储存在﹣80℃。然后将角膜切片标记为II型胶原蛋白。

对于免疫组织化学，将切片在室温下保持15～20分钟。使用PBS冲洗掉OCT，并使用蜡笔划定组织周围的区域。首先，将组织切片用10％正常山羊血清的封闭溶液培养1小时，然后在4℃下用小鼠抗胶原II抗体(Millipore/MAB8887)进行过夜培养。然后将切片在PBS中漂洗三次，再用适当稀释的山羊抗小鼠Alexa 488二抗(Molecular /A-11001)进行培养。将二抗在室温下放置2小时。切片用核标记物4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染，并装入Citifluor抗褪色剂(澳大利亚ProSciTech)中。使用奥林巴斯FluoView^TMFV-1000共焦激光扫描显微镜(405nm、473nm和559nm波长激光)和Leica DMRA荧光显微镜进行可视化标记。

表5描述了本研究的发现。图20显示了在每个条件下角膜切片中II型胶原蛋白标记的代表性图像。

表5：生长因子和类固醇的组合测试

结果证实，TGFβ3和地塞米松的组合是引起靶细胞所需反应的唯一测试组合(图20，G-H图)。其他生长因子—类固醇组合不能在角膜基质细胞中产生II型胶原蛋白的所需变化(图20，A-F图)。结果还证实了在羊角膜中的角膜基质细胞的重编程(图20，G-H图)。

以前的研究已经显示出其它生长因子和其它类固醇化合物不适合于角膜治疗和修复。TGFβ1和TGFβ2均产生纤维化瘢痕(Carrington，Albon等，2006；Desmouliere，Chaponnier等，2005；Jester，Huang等，2002；Cowin等，2001；Shah等，1995)。EGF负调节软骨形成(Yoon 2000)。雌激素也负调节软骨形成(Kato和Gospodarowicz 1985)。氢化可的松已显示促进脂肪形成而不是软骨形成分化(Ghoniem等，2015；Lee，Kuo等，2004)。这些早期研究显示本研究结果对TGFβ3和地塞米松的意义，它们共同促进角膜基质细胞的软骨形成分化和无瘢痕角膜愈合。

实施例15：TGFβ3和地塞米松的剂量比较

在体内研究之前，进行实验以确定离体治疗的各种有效剂量。通过在含有不同浓度的这两个因子的培养基中培养绵羊角膜，对TGFβ3和地塞米松进行剂量范围研究。

获得新鲜的羊眼，并按照实施例14所述切除和处理角膜。将一只羊角膜瓣置于16个培养条件(图21)中的每一个中3周。培养角膜瓣，然后进行如实施例14所述的免疫组织化学和显微镜分析。图21显示了在每种条件下角膜切片中II型胶原蛋白标记的代表图。

该研究表明，较低浓度的TGFβ3(2～4ng/mL)和地塞米松(1～10nM)具有较低的离体疗效(图21，第一行和第二行)。较高剂量，即8～10ng/mL的TGFβ3和100～1000nM的地塞米松在诱导II型胶原蛋白沉积中是有效的(图21，第三和第四行)。

这些结果证实使用100nM的地塞米松和10ng/mL的TGFβ3作为有效浓度(图21，第三行)。更高浓度的地塞米松(1000nM，即400ng/mL)也显示有效(图21，第四行)。注意到，本研究中测试的地塞米松浓度显著低于市售眼滴剂中使用的浓度(即1mg/mL的地塞米松)。

实施例16：实验观察和结果的概述

以前已经使用TGFβ1和地塞米松的组合来诱导祖细胞体外分化成软骨形成细胞(Diekman等，2009；Johnstone等，1998；Kolambkar等，2007；Winter等，2003)。在其它研究中，已经显示角膜基质细胞的侧群细胞在相似的软骨形成分化条件下产生由软骨特异性II胶原蛋白构成的基质(Du，Funderburgh，Mann，SundarRaj，和Funderburgh，2005)。同时已报道，在含有TGFβ1和BMP2的软骨形成分化培养基中四周后，巩膜细胞表达包括聚集蛋白聚糖和II型胶原蛋白的软骨特异性标志物。此外，已经显示人类巩膜细胞在移植到大鼠软骨缺陷后在体内保持其软骨形成潜力(Seko等，2008)。已知巩膜和角膜基质的成纤维细胞共享相同的胚胎起源。

如本文所示，接种在含有TGFβ3和地塞米松且不含有血清的培养基中的角膜基质细胞在2～3天内通过细胞聚集自发形成细胞球体，并且三周内，这些细胞簇标记为对软骨特异性II型胶原蛋白阳性。最初在用TGFβ3和地塞米松治疗后，I型胶原蛋白表达也增加。当将培养基更换为含有胎牛血清的对照培养基时，将细胞簇分散成单层细胞。单层生长的细胞不再表达II型胶原蛋白。这些结果表明细胞聚集体或环境在II型胶原蛋白中的诱导可能是重要的。

值得注意的是，当将培养基改变为含有TGFβ3和地塞米松的软骨形成分化培养基时，角膜基质细胞(首先作为含血清培养基中的成纤维细胞增殖)不分泌II型胶原蛋白。这表明，一旦增殖为纤维细胞，细胞就会失去沿着软骨形成途径分化的能力。此外，软骨形成分化培养基中以三维培养生长的团块成纤维细胞也不能表达软骨特异性II型胶原蛋白。这些结果表明静态的角膜基质细胞表型和细胞聚集体对软骨形成分化是重要的。

如本文所示，在软骨形成分化培养基中的正常角膜和圆锥形角膜的离体培养物显示II型胶原蛋白沿着基质薄片均匀沉积。角膜基质中的每个角膜基质细胞与II型胶原蛋白标记相关，再一次表明重编程成软骨形成表型是随机的，并且确认从体外细胞培养物获得的结果不是由于侧群祖细胞的增殖。此外，大鼠角膜的体内治疗以类似于离体培养中观察到的方式引起II型胶原蛋白的沉积。然而，当在体内治疗时，角膜前部分可观察到更强的II型胶原蛋白的免疫标记，最可能反映生长因子更容易从眼表面向基质前层扩散。

观察圆锥形角膜中角膜基质细胞密度差异的研究已经报道了细胞密度的总体降低。本说明书的结果也证实了这一点。然而，与已报道的基质前部细胞密度显着降低的其他研究不同(Hollingsworth,Efron和Tullo，2005；Ku等，2008；Mencucci等，2010；Niederer等，2008)，本说明书的结果表明未治疗的圆锥形角膜的基质后部的角膜基质细胞密度也明显降低。在圆锥形角膜中一般有角膜的变薄。然而，不知道这是不是由于角膜基质细胞的凋亡和随后的ECM产生减少，或者角膜基质细胞凋亡是否继发于角膜变薄的过程。

如本文所示，与对照相比，在含有TGFβ3和地塞米松的软骨形成培养基中培养的圆锥形角膜中治疗的一半具有增加的角膜基质细胞密度。此外，基质的后部区域似乎被角膜基质细胞重新填充。治疗的一半的角膜基质细胞看起来也更健康，具有显著的核和几种细胞代谢过程。这表明用这两个因子治疗可能引起角膜基质细胞增殖并重新填充基质，特别是没有角膜基质细胞的后部。

胶原蛋白交联(当前的圆锥形角膜治疗之一)导致基质前部角膜基质细胞的初期凋亡。然后是角膜基质细胞再次填充基质的时期。通常可见角膜基质细胞死亡响应于损害，而认为交联的情况是UVA诱导的细胞损伤的结果。认为这种凋亡反应是为了保护角膜免受进一步炎症而进化(Wilson，Netto和Ambrosio 2003)。

在交联处理后也可观察到持续长达数月的基质云雾状浑浊。这归因于胶原蛋白纤维间的胶原蛋白直径和间隔的增加，这将导致角膜微观结构的改变。大多数研究报告说治疗后6～12个月的角膜云雾状浑浊减少(Greenstein，Fry，Bhatt和Hersh 2010；Mazzotta等，2008)。虽然在交联治疗后进行了角膜的几个临床观察，但是对于角膜云雾状浑浊的原因和治疗的其他可能的下游治疗作用不明确。角膜需要几个月被重新填充并变得清晰的事实表明交联可能会触发基质内的伤口愈合反应。

在这项研究中，即使长期(长达八周)的体外和体内治疗，也没有证据表明角膜混浊。这可能是由于沿着预先存在的胶原蛋白薄片将II型胶原蛋白沉积在均匀的层中。III型胶原蛋白(与纤维化相关)和α平滑肌肌动蛋白(在肌成纤维细胞形成期间)的沉积导致混浊和瘢痕形成。在角膜受伤期间都可以看到这两种情况。这些蛋白质都没有在经治疗的角膜中表达，表明可能没有触发引起瘢痕形成的伤口愈合的连锁反应。

如本文所述，II型胶原蛋白mRNA表达的定量测量显示，在停止TGFβ3和地塞米松时其表达显着降低。这表明角膜基质细胞的重编程不是不可逆的，并且随后II型胶原蛋白在ECM中的沉积可能受到潜在的控制。这对于治疗方法的开发是很重要的，因为不希望诱导不可抑制的ECM沉积。

已经使用纳米压痕来评估术后治疗方法，例如圆锥形角膜交联(角膜营养不良)和眼的后LASIK扩张。在对人类尸体角膜进行的一项研究中，发现胶原蛋白交联导致前角膜基质的弹性模量增加了两倍，而后基质不受处理的影响(Dias，Diakonis，Kankariya，Yoo和Ziebarth 2013)。在该研究中，测量前角膜的弹性。此外，本研究的结果表明经TGFβ3和地塞米松治疗的角膜中后基质角膜基质细胞密度发生改变。

虽然纳米压痕不测量各个胶原蛋白纤维的性质，但是它可以测量角膜的固有弹性变化，其将随着胶原蛋白交联的随后增加而改变II型胶原蛋白沉积。基质中的结构差异反映在生物力学性质的相应差异中。结果表明，生长因子治疗的大鼠角膜的弹性模量和硬度几乎增加了三倍。这些结果表明，治疗产生更高弹性的较硬的角膜。弹性模量是物质抗弹性变形的量度，因此较高的弹性模量表明材料更难变形。在本研究中，与处理1周的角膜相比，处理3周的角膜中的硬度和弹性模量显著增加，与免疫组织化学标记结果一致，显示对放置II型胶原蛋白的可检测层需要至少2～3周的治疗。

与基因表达研究和生物力学测试相结合的免疫组织化学标记结果表明，完整角膜内的角膜基质细胞适于通过用TGFβ3和地塞米松处理以沿着软骨形成途径重编程。通过组合的TGFβ3和地塞米松处理的重编程是随机的，并且可以通过调节生长因子处理期来控制以产生更硬、更有弹性的角膜。值得注意的是，需要给药两种试剂；当单独测试TGFβ3和地塞米松时，没有观察到角膜基质细胞中II型胶原蛋白的产生。因此，如本文所述，通过TGFβ3和地塞米松给药，使用体内组织工程提出了用于圆锥形角膜和其它眼睛条件的新型治疗。

实施例17：用大型动物模型来研究角膜重塑

重塑角膜，同时在羊模型中提供最佳方案

额外的实验使用大型动物模型来示范角膜的重塑。对于这些实验，使用大型动物模型来放置处方隐形眼镜。将羊用作模型动物，因为羊的眼睛尺寸和生理与人类的眼睛相当。此外，畜舍设施位于基督城林肯大学(Lincoln University,Christchurch)。还要注意的是，羊具有温和的性情，适合处理。

根据畜舍设施中的标准操作程序给羊服用镇静剂。将基于啮齿动物剂量优化研究的具有最佳TGFβ3和地塞米松浓度(体积比例)的眼滴剂制剂滴注在右眼中，随后放置角膜(或类似的巩膜环)以在胶原蛋白沉积期间保持所需的角膜曲率(图18)。每天持续给药眼滴剂一次或两次(如在啮齿动物优化研究中测定的)，持续三周。然后去除继续将动物再饲养三个星期或六个月。

在治疗之前和治疗结束时(当除去时)，进行角膜厚度和曲率测量。便携式角膜测厚仪用于体内检测治疗组与对照对侧角膜的角膜厚度变化。便携式用于测量治疗前后羊眼的角膜曲率以及角膜厚度(图19(E)和(F))。使用最终(最准确的)测量，在取下镜片后三周再次重复角膜测量。这些是在杀死动物之后，但在取下眼睛之前进行的，如上所述用于啮齿动物角膜的免疫组织化学和生物力学分析。不太可能的情况是，羊无法忍受硬式隐形眼镜(感染、炎症或烦躁的迹象)，不使用眼镜继续进行研究，这允许完成关键参数，如II型胶原蛋白沉积和分布，以及生物力学性质。

鉴于该结果，提出使用本文详细描述的体内组织工程，结合刚性透气的OrthoK隐形眼镜(或类似物)以永久地重塑和稳定角膜，而提供常见的角膜缺陷(包括近视)的治疗。

参考文献

Ashwin,P.T.,&McDonnell,P.J.(2010).Collagen cross-linkage:acomprehensive review and directions for future research.British Journal ofOphthalmology,94(8),965-970.

Cosar,C.B.et al.(2002).Indications for penetrating keratoplasty andassociated procedures,1996-2000.Cornea,21(2),148-151.

Cowin,A.J.,Holmes,T.M.,Brosnan,P.,&Ferguson,M.W.(2001).Expression ofTGF-beta and its receptors in murine fetal and adult dermal wounds.EuropeanJournal of Dermatology,11(5),424-31.

Denniston A.K.O.,Murray P.I.(2009)Oxford Handbook of Ophthalmology(OUP).Second edition.Oxford:New York.Oxford University Press.

Desmouliere,A.,et al.(2005).Tissue repair,contraction,and themyofibroblast.Wound Repair and Regeneration,13(1),7-12.

Dias,J.,Diakonis,V.F.,Kankariya,V.P.,Yoo,S.H.,&Ziebarth,N.M.(2013).Anterior and posterior corneal stroma elasticity after corneal collagencrosslinking treatment.Experimental Eye Research,116,58-62.

Dias,J.M.,&Ziebarth,N.M.(2013).Anterior and posterior corneal stromaelasticity assessed using nanoindentation.Experimental Eye Research,115,41-46.

Dickinson,M.E.,&Schirer,J.P.(2009).Probing more than thesurface.Materials Today,12(7),46-50.

Diekman,B.O.,Rowland,C.R.,Lennon,D.P.,Caplan,A.I.,&Guilak,F.(2009).Chondrogenesis of adult stem cells from adipose tissue and bone marrow:induction by growth factors and cartilage-derived matrix.Tissue engineeringPart A,16(2),523-533.

Dobbins,K.R.,F.W.Price Jr.,W.E.Whitson.(2000).Trends in theindications for penetrating keratoplasty in the Midwestern UnitedStates.Cornea,19(6),813-816.

Ebenstein,D.M.,&Pruitt,L.A.(2006).Nanoindentation of biologicalmaterials.Nano Today,1(3),26-33.

Edmund,C.(1988).Corneal elasticity and ocular rigidity in normal andkeratoconic eyes.Acta Ophthalmologica,66(2),134-140.

Edwards,M.et al.(2002).Indications for corneal transplantation in NewZealand:1991-1999.Cornea,21(2),152-155.

Farquharson,C.,Berry,J.L.,Barbara Mawer,E.,Seawright,E.,&Whitehead,C.C.(1998).Ascorbic acid-induced chondrocyte terminal differentiation:therole of the extracellular matrix and 1,25-dihydroxyvitamin D.European Journalof Cell Biology,76(2),110-118.

Fredrick,D.R.(2002).Myopia.BMJ:British Medical Journal,324(7347),1195.

Fukuchi,T.,Yue,B.,Sugar,J.,&Lam,S.(1994).Lysosomal enzyme activitiesin conjunctival tissues of patients with keratoconus.Archives ofOphthalmology,112(10),1368.

Funderburgh,J.L.(2000).Corneal proteoglycans.In:Proteoglycans:Structure,Biology and Molecular Interactions,R.V.Lozzo,Editor.Marcel Dekker.

Funderburgh,J.L.,Mann,M.M.,Funderburgh,M.L.,Corpuz,L.,&Roth,M.R.(2001).Proteoglycan expression during transforming growth factor-inducedkeratocyte-myofibroblast transdifferentiation.Journal of BiologicalChemistry,276(47),44173.

Funderburgh,J.L.,M.M.Mann,and M.L.Funderburgh(2003)Keratocytephenotype mediates proteoglycan structure.Journal of Biological Chemistry,278(46):45629.

Gabbiani,G.(2003).The myofibroblast in wound healing andfibrocontractive diseases.The Journal of Pathology,200(4),500-503.

Ghoniem,A.A.,Y.,Wiltfang,J.,&Gierloff,M.(2015).Improvedadipogenic in vitro differentiation:comparison of different adipogenic cellculture media on human fat and bone stroma cells for fat tissueengineering.Anatomy&Cell Biology,48(2),85-94.

Greene,C.A.et al.(2013).Cells from the adult corneal stroma can bereprogrammed to a neuron-like cell using exogenous growthfactors.Experimental Cell Research,322(1),122-132.

Greenstein,S.A.,Fry,K.L.,Bhatt,J.,&Hersh,P.S.(2010).Natural historyof corneal haze after collagen crosslinking for keratoconus and cornealectasia:Scheimpflug and biomicroscopic analysis.Journal of Cataract&Refractive Surgery,36(12),2105-2114.

Gurdon,J.B.,D.A.Melton.(2008).Nuclear reprogramming in cells.Science,322,1811-1815.

Gordon,M.K.,R.A.Hahn(2010).Collagens.Cell and Tissue Research,339(1),247-257.

A.M.,P.Collas.(2002).Novel approaches totransdifferentiation.Cloning&Stem Cells,4(4),379-387.

Heng,B.C.,Cao,T.,&Lee,E.H.(2004).Directing stem cell differentiationinto the chondrogenic lineage in vitro.Stem Cells,22(7),1152-1167.

Hollingsworth,J.G.,Efron,N.,&Tullo,A.B.(2005).In vivo cornealconfocal microscopy in keratoconus.Ophthalmic and Physiological Optics,25(3),254-260.

Ignotz,R.A.&Massagué,J.(1986).Transforming growth factor-betastimulates the expression of fibronectin and collagen and their incorporationinto the extracellular matrix.Journal of Biological Chemistry,261,4337-4345.

Ignotz,R.A.,Endo,T.,&Massague,J.(1987).Regulation of fibronectin andtype I collagen mRNA levels by transforming growth factor-beta.Journal ofBiological Chemistry,262(14),6443-6446.

Jackson T.L.(2008)Moorfields Manual of Ophthalmology,Mosby,Elsevier.

Jester,J.V.,Rodrigues,M.M.,&Herman,I.M.(1987).Characterization ofavascular corneal wound healing fibroblasts.New insights into themyofibroblast.The American Journal of Pathology,127(1),140.

Jester,J.V.,et al.(2002).TGFβinduced myofibroblast differentiation ofrabbit keratocytes requires synergistic TGFβ,PDGF and integrinsignaling.Experimental Eye Research 75(6),645-657.

Jhanji,V.,Sharma,N.,&Vajpayee,R.B.(2011).Management of keratoconus:current scenario.British Journal of Ophthalmology,95(8),1044-1050.

Jinabhai,A.,H.Radhakrishnan,C.O’Donnell.(2010).Pellucid cornealmarginal degeneration:a review.Contact Lens&Anterior Eye,34(2),56-63.

Johnstone,B.,Hering,T.M.,Caplan,A.I.,Goldberg,V.M.,&Yoo,J.U.(1998).InVitro Chondrogenesis of Bone Marrow-Derived Mesenchymal ProgenitorCells.Experimental Cell Research,238(1),265-272.

Kadler,K.E.,Baldock,C.,Bella,J.,&Boot-Handford,R.P.(2007).Collagensat a glance.Journal of Cell Science,120(12),1955-1958.

Karamichos,D.,Hutcheon,A.,&Zieske,J.(2011).Transforming growthfactor‐β3 regulates assembly of a non‐fibrotic matrix in a 3D cornealmodel.Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine,5(8),e228-e238.

Karamichos,D.,Zareian,R.,Guo,X.,Hutcheon,A.E.K.,Ruberti,J.W.,&Zieske,J.D.(2012).Novel in vitro model for keratoconus disease.Journal of FunctionalBiomaterials,3(4),760-775.

Kato,Y.and D.Gospodarowicz(1985).Stimulation by glucocorticoid of thesynthesis of cartilage-matrix proteoglycans produced by rabbit costalchondrocytes in vitro.Journal of Biological Chemistry,260(4),2364-2373.

C.Kenney,M.,&Brown,D.J.(2003).The cascade hypothesis ofkeratoconus.Contact Lens and Anterior Eye,26(3),139-146.

Klintworth,G.K.(1999).Advances in the molecular genetics of cornealdystrophies.American Journal of Ophthalmology,128(6),747-754.

Klintworth,G.K.,&Damms,T.(1995).Corneal dystrophies andkeratoconus.Current Opinion in Ophthalmology,6(4),44-56.

Kolambkar,Y.M.,Peister,A.,Soker,S.,Atala,A.,&Guldberg,R.E.(2007).Chondrogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells.Journal ofMolecular Histology,38(5),405-413.

Krachmer,J.H.,Feder,R.S.,&Belin,M.W.(1984).Keratoconus and relatednoninflammatory corneal thinning disorders.Survey of Ophthalmology,28(4),293-322.

Ku,J.Y.,Niederer,R.L.,Patel,D.V.,Sherwin,T.,&McGhee,C.N.(2008).Laserscanning in vivo confocal analysis of keratocyte density inkeratoconus.Ophthalmology,115(5),845-850.

Kulyk,W.M.,&Hoffman,L.M.(1996).Ethanol exposure stimulates cartilagedifferentiation by embryonic limb mesenchyme cells.Experimental CellResearch,223(2),290-300.

Lee,K.D.,et al.(2004).In vitro hepatic differentiation of humanmesenchymal cells.Hepatology,40(6),1275-1284.

Legeais,J.-M.,et al.(2001).Nineteen years of penetrating keratoplastyin the Hotel-Dieu Hospital in Paris.Cornea,20(6),603-606.

Linsenmayer,T.F.,Fitch,J.M.,&Birk,D.E.(1990).Heterotypic collagenfibrils and stabilizing collagens.Annals of the New York Academy of Sciences,580(1),143-160.

Ludwig,A.(2005).The use of mucoadhesive polymers in ocular drugdelivery.Advanced Drug Delivery Reviews,57(11),1595-1639.

Marshall,G.E.,Konstas,A.G.,&Lee,W.R.(1993).Collagens in oculartissues.The British Journal of Ophthalmology,77(8),515.

Mazzotta,C.,Traversi,C.,Baiocchi,S.,Caporossi,O.,Bovone,C.,Sparano,M.C.,Caporossi,A.(2008).Corneal healing after riboflavin ultraviolet-Acollagen cross-linking determined by confocal laser scanning microscopy invivo:early and late modifications.American Journal of Ophthalmology,146(4),527-533.e521.

Meek,K.M.,Tuft,S.J.,Huang,Y.,Gill,P.S.,Hayes,S.,Newton,R.H.,&Bron,A.J.(2005).Changes in collagen orientation and distribution in keratoconuscorneas.Investigative Ophthalmology&Visual Science,46(6),1948-1956.

Mencucci,R.,Marini,M.,Paladini,I.,Sarchielli,E.,Sgambati,E.,Menchini,U.,&Vannelli,G.B.(2010).Effects of riboflavin/UVA corneal cross‐linking onkeratocytes and collagen fibres in human cornea.Clinical&ExperimentalOphthalmology,38(1),49-56.

Mendler,M.,Eich-Bender,S.G.,Vaughan,L.,Winterhalter,K.H.,&Bruckner,P.(1989).Cartilage contains mixed fibrils of collagen types II,IX,and XI.TheJournal of Cell Biology,108(1),191-197.

Menetrey,J.,et al.(2000).Growth factors improve muscle healing invivo.Journal of Bone&Joint Surgery,British Volume,82(1),131-137.

Niederer,R.L.,Perumal,D.,Sherwin,T.,&McGhee,C.N.J.(2008).Laserscanning in vivo confocal microscopy reveals reduced innervation andreduction in cell density in all layers of the keratoconiccornea.Investigative Ophthalmology&Visual Science,49(7),2964-2970.

Nirmal,H.B.,S.R.Bakliwal,S.P.Pawar(2010).In-situ gel:New trends incontrolled and sustained drug delivery system.International Journal ofPharmTech Research,2(2),1398-1408.

Patel,H.Y.et al.(2005).The New Zealand National Eye Bank study 1991-2003:a reviewof the source and management of corneal tissue.Cornea,24(5),576-582.

Patel,D.,C.McGhee(2013).Understanding keratoconus:what have welearned from the New Zealand perspective？Clinical and Experimental Optometry,96(2),183-187.

Peran,M.,et al.(2011).Transdifferentiation:why and how？Cell BiologyInternational,35(4),373-379.

Pramanik,S.,Musch,D.C.,Sutphin,J.E.,&Farjo,A.A.(2006).Extended long-term outcomes of penetrating keratoplasty for keratoconus.Ophthalmology,113(9),1633-1638.

Premaraj et al.(2006).Sustained delivery of bioactive cytokine usinga dense collagen gel vehicle collagen gel delivery of bioactive cytokine.ArchOral Biol.51(4),325-33.

Rabinowitz,Y.S.(1998).Keratoconus.Survey of Ophthalmology,42(4),297-319.

Rabonitz,Y.S.(2004).Ectatic Disorders of the Cornea.In:The Cornea,4thedition.Lippincott Williams&Wilkins.

Romero-Jiménez,M.,Santodomingo-Rubido,J.,&Wolffsohn,J.S.(2010).Keratoconus:a review.Contact Lens and Anterior Eye,33(4),157-166.

Rupenthal,I.D.,Green,C.R.,&Alany,R.G.(2011).Comparison of ion-activated in situ gelling systems for ocular drug delivery.Part 2:Precornealretention and in vivo pharmacodynamic study.International Journal ofPharmaceutics.

Schuldiner,M.,Yanuka,O.,Itskovitz-Eldor,J.,Melton,D.A.,&Benvenisty,N.(2000).Effects of eight growth factors on the differentiation of cellsderived from human embryonic stem cells.Proceedings of the National Academyof Sciences,97(21),11307-11312.

Shah,M.,Foreman,D.M.,&Ferguson,M.W.(1995).Neutralisation of TGF-beta1 and TGF-beta 2 or exogenous addition of TGF-beta 3 to cutaneous rat woundsreduces scarring.Journal of Cell Science,108(3),985-1002.

Sherwin,T.,&Brookes,N.H.(2004).Morphological changes in keratoconus:pathology or pathogenesis.Clinical&Experimental Ophthalmology,32(2),211-217.

Spoerl,E.,Huhle,M.,&Seiler,T.(1998).Induction of cross-links incorneal tissue.Experimental Eye Research,66(1),97-103.

Takahashi,K.,S.Yamanaka.(2006).Induction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell,126(4),663-676.

Tsang et al.(1995).Characterization of recombinant soluble humantransforming growth factor-beta receptor type II(rhTGF-beta sRII).Cytokine,7(5),389-97.

Wells,S.M.(2003).Mechanical design of elastic biopolymers.Physics inCanada,59(2),67-74.

Wernig,M.et al.(2007).In vitro reprogramming of fibroblasts into apluripotent ES-cell-like state.Nature,448(7151),318-324.

Willshaw H.et al.(2000).A Handbook of PaediatricOphthalmology.Pensord Press:United Kingdom.

Wilson,S.E.,Netto,M.,&Ambrosio,R.(2003).Corneal cells:chatty indevelopment,homeostasis,wound healing,and disease.American Journal ofOphthalmology,136(3),530-536.

Winter,A.,Breit,S.,Parsch,D.,Benz,K.,Steck,E.,Hauner,H.,Richter,W.(2003).Cartilage‐like gene expression in differentiated human stem cellspheroids:A comparison of bone marrow–derived and adipose tissue–derivedstromal cells.Arthritis&Rheumatism,48(2),418-429.

Wollensak,G.,Spoerl,E.,&Seiler,T.(2003).Riboflavin/ultraviolet-A–induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus.AmericanJournal of Ophthalmology,135(5),620-627.

Wollensak,J.,&Buddecke,E.(1990).Biochemical studies on human cornealproteoglycans—a comparison of normal and keratoconic eyes.Graefe's Archivefor Clinical and Experimental Ophthalmology,228(6),517-523.

Worster,A.A.,Nixon,A.J.,Brower-Toland,B.D.,&Williams,J.(2000).Effectof transforming growth factor β1 on chondrogenic differentiation of culturedequine mesenchymal stem cells.American Journal of Veterinary Research,61(9),1003-1010.

Yamanaka,S.,H.M.Blau.(2010).Nuclear reprogramming to a pluripotentstate by three approaches.Nature,465(7299),704-712.

Yoon Y.M.,Oh C.D.,Kim D.Y.,Lee YS,Park J.W.,Huh T.L.,Kang S.S.,ChunJ.S.(2000).Epidermal growth factor negatively regulates chondrogenesis ofmesenchymal cells by modulating the protein kinase C-alpha,Erk-1,and p38 MAPKsignaling pathways.Biol Chem.275(16):12353-9.

本领域普通技术人员将从本公开很容易理解，根据本发明相关的实施方式或方面可利用与本文所述的实施方式或方面基本相同的功能和实现与其基本相同的结果的后续修改、替换和/或变型。因此，本发明旨在在其范围内包括本文公开的过程、制造、组合物、化合物、手段、方法和/或步骤的修改、替换和变型。

本说明书中引用的所有参考文献，包括专利和专利申请在此引入作为参考。不认为任何参考文献构成现有技术。在新西兰或任何其它国家，任何参考文献的讨论也不构成承认这种参考文献形成本领域公知常识的一部分。

Claims (46)

1.一种(i)治疗或预防与角膜变薄或不规则有关的病症、(ii)治疗或预防角膜的损伤或损害或(iii)治疗或预防眼睛的屈光不正的方法，该方法包括：

将所述角膜或眼睛与含有TGFβ3多肽或其变体或片段、以及地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物接触，从而治疗或预防病症、损伤、损害或屈光不正。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述TGFβ3多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述地塞米松是磷酸地塞米松。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其中，所述组合物包含10～100ng/ml的TGFβ3多肽。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其中，所述组合物包含40～4000ng/ml的地塞米松。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的方法，其中，将所述组合物配制成眼滴剂。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述组合物用结冷胶配制。

8.根据权利要求1～7中任意一项所述的方法，其中，该组合物每天给药一次或每天给药两次。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的方法，其中，将该组合物与一种或多种额外的眼用试剂共同给药。

10.根据权利要求1～9中任意一项所述的方法，其中，所述一种或多种额外的眼用试剂选自由麻醉剂、抗炎剂、抗微生物剂和润滑剂组成的组。

11.根据权利要求1～10中任意一项所述的方法，其中，与隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环的使用相结合给药所述组合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环调试成在用所述组合物治疗期间和/或之后用于塑形或保持角膜形状。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环调试成用作所述组合物的载体或者用作组合物洗脱装置。

14.根据权利要求1～13中任意一项所述的方法，其中，对于(i)或(ii)，该组合物与角膜胶原蛋白交联联合给药。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，在交联之前和/或之后给药该组合物。

16.根据权利要求1～13中任意一项所述的方法，其中，对于(ii)或(iii)，该方法在屈光手术之前或之后实施。

17.根据权利要求1～15中任意一项所述的方法，其中，所述病症选自由圆锥形角膜、近视和散光组成的组。

18.根据权利要求1～16中任意一项所述的方法，其中，所述角膜的损伤或损害与以下中的一种或多种相关：擦伤、撕裂伤、溃疡、烧伤、刺伤或手术。

19.根据权利要求1～16中任意一项所述的方法，其中，所述眼睛的屈光不正与以下中的一种或多种有关：近视、远视、散光和老花眼。

20.一种试剂盒，该试剂盒包含：

(i)包含TGFβ3多肽或其变体或片段、以及地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物；以及

(ii)一个或多个隐形眼镜。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中，所述隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环调试成在用组合物治疗期间和/或之后用于塑形或保持角膜形状。

22.根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中，所述隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环用作组合物的载体或者用作组合物洗脱装置。

23.根据权利要求20～22中任意一项所述的试剂盒，其中，所述TGFβ3多肽由SEQ IDNO：1的氨基酸序列组成。

24.根据权利要求20～23中任意一项所述的试剂盒，其中，所述地塞米松是磷酸地塞米松。

25.根据权利要求20～24中任意一项所述的试剂盒，其中，该组合物包含10～100ng/ml的TGFβ3多肽。

26.根据权利要求20～25中任意一项所述的试剂盒，其中，该组合物包含40～4000ng/ml的地塞米松。

27.根据权利要求20～26中任意一项所述的试剂盒，其中，将该组合物配制成眼滴剂。

28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中，该组合物用结冷胶配制。

29.根据权利要求20～28中任意一项所述的试剂盒，其中，该组合物每天给药一次或每天给药两次。

30.根据权利要求20～29中任意一项所述的试剂盒，其中，将该组合物与一种或多种额外的眼用试剂共同配制。

31.根据权利要求20～30中任意一项所述的试剂盒，其中，该试剂盒包括用于眼睛的一种或多种额外的试剂。

32.根据权利要求30或31所述的试剂盒，其中，所述一种或多种额外的眼用试剂选自由麻醉剂、抗炎剂、抗微生物剂和润滑剂组成的组。

33.根据权利要求20～32中任意一项所述的试剂盒，其中，该试剂盒包括隐形眼镜溶液。

34.根据权利要求20～33中任意一项所述的试剂盒，其中，该试剂盒包括使用说明书。

35.根据权利要求20～34中任意一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于：(i)治疗或预防眼睛的屈光不正；(ii)治疗或预防选自由圆锥形角膜、近视、远视、散光、老花眼和基质营养不良组成的组的角膜病症；或(iii)治疗选自由擦伤、撕裂伤、溃疡、烧伤、刺伤、角膜融解和手术损害的角膜病症。

36.一种在角膜基质细胞中诱导II型胶原蛋白表达的方法，该方法包括：将所述角膜基质细胞与包含TGFβ3多肽或其变体或片段、以及地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物接触，从而在所述角膜基质细胞中诱导II型胶原蛋白表达。

37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述TGFβ3多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

38.根据权利要求36或37所述的方法，其中，所述地塞米松是磷酸地塞米松。

39.根据权利要求36～38中任意一项所述的方法，其中，该组合物包含10～100ng/ml的TGFβ3多肽。

40.根据权利要求36～39中任意一项所述的方法，其中，该组合物包含40～4000ng/ml的地塞米松。

41.根据权利要求36～40中任意一项所述的方法，其中，将该组合物配制成通过隐形眼镜、角膜插入物、角膜植入物或角膜基质环来给药。

42.根据权利要求36～41中任意一项所述的方法，其中，将该组合物配制成以溶液、凝胶、霜剂或乳液给药。

43.根据权利要求36～42中任意一项所述的方法，其中，该方法在体内实施。

44.根据权利要求36～42中任意一项所述的方法，其中，该方法离体实施。

45.一种(i)治疗或预防与角膜变薄或不规则有关的病症；(ii)治疗或预防角膜的损伤或损害；或(iii)治疗或预防眼睛的屈光不正的方法，该方法包括：

对角膜或者眼睛共同给药包含TGFβ3多肽或其变体或片段的组合物、以及包含地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物，从而治疗或预防病症、损伤、损害或屈光不正。

46.一种在角膜基质细胞中诱导II型胶原蛋白表达的方法，该方法包含：对所述角膜基质细胞共同给药包含TGFβ3多肽或其变体或片段的组合物、以及包含地塞米松或其衍生物或相关的甾体试剂的组合物，从而在所述角膜基质细胞中诱导II型胶原蛋白表达。