CN104548210A - 含地塞米松转化生长因子的可控缓释plga微球及制备 - Google Patents
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Abstract
发明提供一种含地塞米松转化生长因子的可控缓释聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，通过水-油-水乳胶法制备DEX/PLGA复合微球，并通过表面覆盖带正电荷的聚乙烯亚胺将包埋DEX的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球带正电荷，将TGF-β3与肝素/多聚L-赖氨酸溶液混合，形成摩尔电荷比在0-3.15范围的混合物，再将TGF-β3嵌合的肝素/多聚L-赖氨酸纳米粒与包埋DEX的PLGA微球混合覆盖，获得目的微球。本发明复合了生长因子的促生长增殖分化作用及DEX的抗炎作用，减少细胞贴附载体后出现的炎症效应，更适应细胞贴附，且对生物体无毒无害，并使细胞支架在治疗完成后被生物体降解成为可能，可作为制备生物支架的载体。
Description
技术领域
本发明属于生物组织工程细胞支架材料，涉及生物材料表面修饰方法，尤其涉及一种含地塞米松（DEX）、转化生长因子（TGF-β3）的可控缓释聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球及制备方法。
背景技术
已有许多研究组利用髓核细胞或间充质干细胞复合细胞支架用于椎间盘组织工程的研究。在生物支架材料的评估中，主要使用固态和预成型的细胞支架包括网状支架和纤维网格。但这些细胞支架，用于移植细胞的载体时，需要开放性切口植入到椎间盘内，破坏了椎间盘天然密闭微环境，故缺陷明显。同时此类细胞支架多采用琼脂，透明质酸等为原料，虽对生物无害，但因体积较大，已破坏椎间盘原有微生物环境，生物组织相容性不佳，且无法保证能在治疗完成后被生物体降解。许多研究已经发现细胞中添加特定的药物和生长因子，如转化生长因子（TGF-β3），有利于培养细胞合成椎间盘髓核的基质蛋白。地塞米松（DEX）等抗炎因子可以最大限度降低移植伴随的炎症，并促进细胞分化。两种药剂在避免互相干扰下共同发挥药效，因此，局限环境下抗炎皮质类固醇和生长因子的小剂量缓释给药控制是必要的。而目前网状支架和纤维网格细胞支架材料无法实现这一要求。
发明内容
发明的目的是提供一种含地塞米松（DEX）、的转化生长因子（TGF-β3）的可控缓释聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球，具体制备步骤如下：
（1）DEX/PLGA微球制备
DEX/PLGA微球由水-油-水（w/o/w）乳胶法制备：取PLGA和DEX溶于二氯甲烷溶液，将混合溶液注入300ml含有2% (w/v) 聚乙烯醇（poly(vinyl alcohol，PVA)的水溶液中，用磁力搅拌器以600rpm搅拌2-3小时（35°C），脱去二氯甲烷，以1500rpm速度离心2min后收集微球，用蒸馏水洗涤6次后冻干备用；其中地塞米松（DEX）与聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）质量比是1:0.01。二氯甲烷的用量是DEX的0.5倍。聚乙烯醇用量是二氯甲烷的10倍。
（2）肝素-TGF-β3纳米粒制作
取肝素溶液（0.5 mg/ml）和多聚L-赖氨酸（0.5 mg/ml），1:1溶于蒸馏水（PH 7.4）形成0.5 mg/ml溶液，取100 ng/ml TGF-β3加入到0.5 mg/ml肝素/多聚L-赖氨酸溶液，不停搅拌15s，放入室温中孵育30min，形成摩尔电荷比在0-3.15范围的混合物，肝素溶液和混合溶液在实验前都经过了0.22 μm尼龙过滤器；
（3）TGF-β3/DEX/PLGA微球制作
首先，将DEX/PLGA微球涂上带正电荷的PEI，PEI侧链上的胺类被广泛质子化，即将1g微球放置于1 mg/ml, 0.1w/v%的PEI溶液12小时，不停搅拌，之后用1500rpm速度离心2min，收集后用蒸馏水洗涤3次，再浸于嵌合了TGF-β3的肝素/多聚L-赖氨酸溶液24小时并不断温和搅拌，得到涂有TGF-β3嵌合的肝素/多聚L-赖氨酸纳米粒的PLGA微球，经过1000rpm离心2min，蒸馏水漂洗3次后收集。最终，经过6次蒸馏水洗涤及冻干后，嵌合TGF-β3并涂有DEX的双重PLGA微球（TGF-β3/DEX/PLGA微球）制备完成。
本发明的另一个目的是提供所述微球在制备生物支架材料中的应用。本发明微球良好的组织相容性和较低的免疫原性，以及PLGA自身的优良降解特性，为细胞附着，生长，分化等提供了优良的载体。
本发明微球首先通过水-油-水（w/o/w）乳胶法制备DEX/PLGA复合微球，并通过表面覆盖带正电荷的聚乙烯亚胺（PEI: Mw，1800）将包埋DEX的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球带正电荷。将TGF-β3与肝素/多聚L-赖氨酸溶液混合，形成摩尔电荷比在0-3.15范围的混合物。再通过正负电荷互相吸引的原理，将TGF-β3嵌合的肝素/多聚L-赖氨酸纳米粒与包埋DEX的PLGA微球混合覆盖，从而形成TGF-β3/DEX/PLGA微球。
本发明与空白PLGA相比，复合了生长因子的促生长增殖分化作用以及DEX的抗炎作用，减少了细胞贴附载体后出现的炎症效应，二者协同作用使新型TGF-β3/DEX/PLGA微球为细胞附着，生长，分化等提供了优良的载体，更适应细胞贴附，且对生物体无毒无害，并使细胞支架在治疗完成后被生物体降解成为可能。
本发明制备方法基于以下考虑设计：（1）为了得到能被注射入生物体内并能被细胞附着的载体；（2）为了得到生物组织相容性良好对机体无毒无害的支架模型；（3）实现细胞支架在一定时间后被生物体降解的可能；（4）为了解决荷载生长因子及药物的缓释控制。
本发明制备的TGF-β3/DEX/PLGA微球，通过对该微球的表征观察及粒径测定，DEX，TGF-β3释放曲线测定，得知该生物支架材料的直径大小，表面征象，及局部释放DEX和TGF-β3情况均达到发明目的，通过CCK-8测定和乳酸脱氢酶（LDH）测定得知，该微球支架不但对附着的间充质干细胞没有毒性，而且可促进间充质干细胞生长，分化成髓核相似细胞，降低局部炎症反应。良好的组织相容性和较低的免疫原性，以及PLGA自身的优良降解特性。本发明提供的新型TGF-β3/DEX/PLGA微球为细胞附着，生长，分化等提供了优良的载体，且对生物体无毒无害，并使细胞支架在治疗完成后被生物体降解成为可能。对于椎间盘微创组织工程研究及治疗相当有必要。
附图说明
图1 嵌合TGF-β3的肝素纳米粒层层组装到包埋DEX的PLGA微球的示意图（注：DEX-MS=DEX包埋的PLGA微球）。
图2是TGF-β3/DEX/PLGA微球在SEM不同倍数下形态（A1低倍，A2中倍，A3高倍）。
图3是TGF-β3/DEX/PLGA微球在30天内DEX和TGF-β3的释放率。
图4是通过CCK-8值测定TGF-β3/DEX/PLGA微球对细胞增殖的影响。
图5是通过LDH释放测定TGF-β3/DEX/PLGA微球对细胞凋亡的影响。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作出进一步的具体说明，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1: 以6gPLGA制作TGF-β3/DEX/PLGA微球
（1）DEX/PLGA微球制备，由水-油-水（w/o/w）乳胶法制备：取PLGA(6g)，DEX（60mg）溶于30ml二氯甲烷，利用玻璃注射器（规格，20G）将混合溶液注入300ml含有2% (w/v) 聚乙烯醇（poly(vinyl alcohol，PVA)的水溶液中，用磁力搅拌器以600rpm搅拌2-3小时（35°C），脱去二氯甲烷，以1500rpm速度离心2min后收集微球，用蒸馏水洗涤6次后冻干备用；
（2）肝素-TGF-β3纳米粒制作
取肝素溶液（0.5 mg/ml）和多聚L-赖氨酸（0.5 mg/ml），1:1溶于蒸馏水（PH 7.4）形成0.5 mg/ml溶液，取100 ng/ml TGF-β3加入到0.5 mg/ml肝素/多聚L-赖氨酸溶液，不停搅拌15s，放入室温中孵育30min，形成摩尔电荷比在0-3.15范围的混合物，肝素溶液和混合溶液在实验前都经过了0.22 μm尼龙过滤器；
（3）TGF-β3/DEX/PLGA微球制作
首先，将DEX/PLGA微球涂上带正电荷的PEI，PEI侧链上的胺类被广泛质子化，即将1g微球放置于1 mg/ml, 0.1w/v%的PEI溶液12小时，不停搅拌，之后用1500rpm速度离心2min，收集后用蒸馏水洗涤3次，再浸于嵌合了TGF-β3的肝素/多聚L-赖氨酸溶液24小时并不断温和搅拌，得到涂有TGF-β3嵌合的肝素/多聚L-赖氨酸纳米粒的PLGA微球，经过1000rpm离心2min，蒸馏水漂洗3次后收集。最终，经过6次蒸馏水洗涤及冻干后，嵌合TGF-β3并涂有DEX的双重PLGA微球（TGF-β3/DEX/PLGA微球）制作完成（参见图1）。
实施例2：以12gPLGA制作TGF-β3/DEX/PLGA微球。
（1）DEX/PLGA微球制备
取PLGA(12g)，DEX（120mg）溶于60ml二氯甲烷，利用玻璃注射器（规格，20G）将混合溶液注入600ml含有2% (w/v) PVA的水溶液中，用磁力搅拌器以600rpm搅拌2-3小时（35°C），脱去二氯甲烷，以1500rpm速度离心2min后收集微球，用蒸馏水洗涤6次后冻干备用；
（2）肝素-TGF-β3纳米粒制作
取肝素溶液（0.5 mg/ml）和多聚L-赖氨酸（0.5 mg/ml），1:1溶于蒸馏水（PH 7.4）形成0.5 mg/ml溶液，取100 ng/ml TGF-β3加入到0.5 mg/ml肝素/多聚L-赖氨酸溶液，不停搅拌15s，放入室温中孵育30min；形成摩尔电荷比在0-3.15范围的混合物，肝素溶液和混合溶液在实验前都经过了0.22 μm尼龙过滤器；
（3）TGF-β3/DEX/PLGA微球制作
将上述DEX/PLGA微球放置于1 mg/ml, 0.1w/v%的PEI溶液12小时，不停搅拌，之后用1500rpm速度离心2min，收集后用蒸馏水洗涤3次，再浸于嵌合了TGF-β3的肝素/多聚L-赖氨酸溶液24小时并不断温和搅拌，得到涂有TGF-β3嵌合的肝素/多聚L-赖氨酸纳米粒的PLGA微球，经过1000rpm离心2min，蒸馏水漂洗3次后收集。最终，经过6次蒸馏水洗涤及冻干后，嵌合TGF-β3并涂有DEX的双重PLGA微球（TGF-β3/DEX/PLGA微球）,整个制备过程参见图1。
实施例3：以24gPLGA制作TGF-β3/DEX/PLGA微球。
（1）DEX/PLGA微球制备
取PLGA(24g)，DEX（240mg）溶于240ml二氯甲烷，利用玻璃注射器（规格，20G）将混合溶液注入1200ml含有2% (w/v) PVA的水溶液中，用磁力搅拌器以600rpm搅拌2-3小时（35°C），脱去二氯甲烷，以1500rpm速度离心2min后收集微球，用蒸馏水洗涤6次后冻干备用；
（2）肝素-TGF-β3纳米粒制作
取肝素溶液（0.5 mg/ml）和多聚L-赖氨酸（0.5 mg/ml），1:1溶于蒸馏水（PH 7.4）形成0.5 mg/ml溶液，取100 ng/ml TGF-β3加入到0.5 mg/ml肝素/多聚L-赖氨酸溶液，不停搅拌15s，放入室温中孵育30min；
（3）TGF-β3/DEX/PLGA微球制作
将上述DEX/PLGA微球放置于1 mg/ml, 0.1w/v%的PEI溶液12小时，不停搅拌，之后用1500rpm速度离心2min，收集后用蒸馏水洗涤3次，再浸于嵌合了TGF-β3的肝素/多聚L-赖氨酸溶液24小时并不断温和搅拌，得到涂有TGF-β3嵌合的肝素/多聚L-赖氨酸纳米粒的PLGA微球，经过1000rpm离心2min，蒸馏水漂洗3次后收集。最终，经过6次蒸馏水洗涤及冻干后，嵌合TGF-β3并涂有DEX的双重PLGA微球（TGF-β3/DEX/PLGA微球）。整个制备过程参见图1。
实施例4
目前此项研究发明已被成功用于椎间盘退变大鼠尾部以修复退变椎间盘，实验通过构建大鼠退变椎间盘模型，并将单独间充质干细胞，间充质干细胞合并PLGA微球，以及间充质干细胞合并TGF-β3/DEX/PLGA微球注射入退变椎间盘，以研究搭载支架的干细胞对退变椎间盘的修复作用。实验结果显示DEX/PLGA微球在SEM各倍数下形状规则，大小较为一致，具有良好的均一性（见图2）。TGF-β3/DEX/PLGA微球中TGF-β3与DEX释放在前3天迅速上升，3天之后基本上呈零点释放曲线，提示TGF-β3与DEX从TGF-β3/DEX/PLGA微球体中持续释放（见图3）。注射TGF-β3/DEX/PLGA微球后大鼠椎间盘内间充质干细胞增殖率上升，与正常对照组和空白PLGA组相比有显著性差异（见图4）。大鼠尾部注射TGF-β3/DEX/PLGA微球后细胞LDH释放与正常对照组和空白PLGA组无明显差异，提示TGF-β3/DEX/PLGA微球对间充质干细胞无毒性作用（见图5）。此项实验证明了本发明微球的可靠性与有效性。TGF-β3/DEX/PLGA微球能降低局部炎症反应，加之良好的组织相容性和较低的免疫原性，以及PLGA自身的优良降解特性。
Claims (6)
1.一种含地塞米松转化生长因子的可控缓释聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，其特征在于，所述微球通过以下制备方法获得：
（1）地塞米松/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球制备：取PLGA和DEX溶于二氯甲烷，将混合溶液注入含有w/v为 2%的聚乙烯醇的水溶液中，搅拌，脱去二氯甲烷，离心后收集微球，用蒸馏水洗涤后冻干备用；
（2）肝素-TGF-β3纳米粒制备：取肝素溶液和多聚L-赖氨酸，1:1溶于蒸馏水形成0.5 mg/ml溶液，取100 ng/ml TGF-β3加入到0.5 mg/ml肝素/多聚L-赖氨酸溶液，搅拌15s后室温中孵育30min，形成摩尔电荷比在0-3.15范围的混合物；
（3）TGF-β3/DEX/PLGA微球制备：将地塞米松/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球放置于1 mg/ml, 0.1w/v%的PEI溶液12小时，搅拌后离心，收集后用蒸馏水洗涤，再浸于嵌合了TGF-β3的肝素/多聚L-赖氨酸溶液并不断搅拌，得到涂有TGF-β3嵌合的肝素/多聚L-赖氨酸纳米粒的PLGA微球，经过1000rpm离心2min，蒸馏水漂洗后收集，最终，经过蒸馏水洗涤及冻干后，得到嵌合TGF-β3并涂有DEX的双重PLGA微球。
2.根据权利要求1所述的一种含地塞米松转化生长因子的可控缓释聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，其特征在于，制备（1）中地塞米松与聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量比是1:0.01，二氯甲烷的用量是地塞米松的0.5倍，聚乙烯醇用量是二氯甲烷的10倍。
3.根据权利要求1所述的一种含地塞米松转化生长因子的可控缓释聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，其特征在于，制备（1）中在35℃，用磁力搅拌器以600rpm搅拌2-3小时，脱去二氯甲烷。
4.根据权利要求1所述的一种含地塞米松转化生长因子的可控缓释聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，其特征在于，制备（2）中肝素溶液和混合溶液在实验前都经过了0.22 μm尼龙过滤器。
5.根据权利要求1所述的一种含地塞米松转化生长因子的可控缓释聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，其特征在于，制备（3）中，浸于嵌合了TGF-β3的肝素/多聚L-赖氨酸溶液24小时并不断温和搅拌。
6.根据权利要求1所述的一种含地塞米松转化生长因子的可控缓释聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球在制备生物支架材料中的应用。
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