TWI747816B - 眼用組合物用於製備藥物的用途 - Google Patents

Abstract

本發明包括用於眼睛各種病症的眼用組合物，特別是角膜病症；更包 括利用這些組合物的方法與包含這些組合物的試劑盒。

Description

眼用組合物用於製備藥物的用途

本發明有關治療及/或預防眼睛病症很有用的組合物與方法。具體係，本發明有關用來擴增及再生角膜與矯正眼睛的屈光不正的組合物與方法。

本專利申請案主張2015年3月5日申請的第NZ 705727號紐西蘭臨時專利申請案的優先權，其整個內容在此是以引用方式併入本文供參考。

先前認為，分化的細胞會放棄倒退到先前狀態的能力。不過，這個觀點受到誘導多能幹細胞(細胞重新編程)的挑戰，且證據顯示分化的細胞可轉變到另一表現型(2006年，高橋和山中先生；2007年，威尼克先生等人；2010年，山中與布勞先生；2008年，戈登和梅爾頓先生；2011年，柏蘭先生等人)。此外，現在相信，細胞(包括周圍細胞、細胞外基質、與生長和分化因子)的微環境在實現細胞分化重定向扮演重要作用(2002年，哈克連和科拉斯先生)。隨著這個資訊，研究人員已開始開發利用細胞重新編程與幹細胞技術的治療劑。

眼睛的角膜佔眼睛總屈光力(聚焦能力)的三分之二以上。即使角膜形狀的微小變化會明顯影響圖像聚焦在視網膜上的清晰度。角膜的基質層(眼睛的清晰前表面)包含大部分角膜組織，且由構成緊湊膠原纖維的高度組織薄片組成，多半是第I型和第V型膠原質(1993年，馬歇爾先生等 人)。基質層的獨特結構(膠原質纖維均勻排列)形成角膜的韌性與透明性(2000年，方德布魯先生等人)。

當基質細胞(角膜基質細胞(corneal keratocytes))是從角膜移除去，且單層培養，其會顯現纖維細胞的形態特徵，且從一星條細胞轉變成多核、紡錘形狀細胞(2001年，方德布魯等人)。另一通常觀察的角膜細胞表現型是在傷害後出現在角膜的肌成纖維細胞形式(1987年，小丑先生等)。外源性生長因子與細胞因子的變化認為帶來這些表現型變化(2001年，方德布魯等人)。

生長因子的TGFß系列稱為是軟骨(Chondrogenic/Cartilage)分化的最有力的誘發劑(2004年，恆、曹、和李先生；1998年，約翰斯頓先生等人；2000年，梅尼特里先生等人)。TGF-ß1利用雞胚纖維細胞(chick embryo fibroblasts)來刺激膠原質與纖維連接蛋白的合成(1986年，伊格納西和馬薩格先生)。針對角膜細胞，TGFß1和TGFß2已知會導致有關瘢痕的ECM沉積，可能是由於角膜細胞轉化成肌纖維細胞表現型(2001年，方德布魯、曼恩、方德布魯、科爾普斯、和羅斯先生)。對照下，TGFß3已顯示出誘發角膜纖維細胞，以產生由第I型膠原質構成的ECM沉積，而沒有纖維化或瘢痕(2011年，咔辣姆久、胡瓊雍、和吉斯克先生)。某些非蛋白質化合物，諸如地塞米松(1998年，約翰斯通、赫林、卡普蘭、戈德堡、和柳先生)、抗壞血酸(1998年，法夸爾森、貝瑞、芭芭拉、莫爾、西賴特、和懷德海先生)和乙醇(1996年，庫利克和霍夫曼先生)亦已知促進體內軟骨細胞分化。

有許多會影響角膜的病症，包括各種缺陷、傷害、疾病與變性病症。近視是源自於角膜的過度球面變曲度，使得光會進入視網膜前面的眼睛聚焦點。這是全球性最普遍視力障礙，影響某些亞洲國家70%至90%人口歐洲和美國30%至40%人口(2002年，弗雷德里克先生)。在多數情況， 近視首先發生在學齡兒童，進而持續到約20歲。此亦與成年後的黃斑變性、視網膜脫離、與青光眼的患病率增高有關聯(2006年，艾本斯坦和年普魯特先生)。

近視是最常見使用處方眼鏡或隱形眼鏡來矯正。不過，這些裝置沒有針對病症提供永久治療，且都不適合在某些活動期間使用。隱形眼鏡亦可能發生眼部感染與更嚴重疾病，包括角膜擦傷與潰瘍。在某些情況，屈光手術或角膜塑形表示近視徵兆。不過，這些治療只提供輕度到中度近視的暫時矯正；不是永久治療，且沒有針對嚴重病例。

圓錐角膜是有關稱為鮑曼氏(Bowman)層的角膜部分的角膜基質變薄與破壞的角膜營養不良。角膜基質的逐步變薄通常發生數十年，且導致角膜發展成圓錐形。由於不規律散光和近視，使得此會導致視力受傷。圓錐角膜的發病機制尚不清楚，不過已與某些因子有關聯，諸如不斷揉眼睛與隱形眼鏡佩戴(1984年，克拉茲摩、菲德、和貝林先生；2004年，宣威和布魯克斯先生)。此可能早在青春期出現並繼續進行，持續到生命的三十或四十歲。

圓錐角膜的發病率在2000年全球總人口估計約為1，不過沒有偏好性別(1998年，維茨先生)。由於圓錐角膜的發生通常是在早期成年與延續到黃金時期與養育子女年齡、生活品質降低，使得治療圓錐角膜的經濟負擔代表明顯的公共健康問題。圓錐角膜在西方世界是角膜移植的主要指標，研究人員確定28.8%角膜移植是在法國(2001年，李尼艾斯先生等人)，從11.4%到15.4%角膜移植是在美國(2000年，寇薩爾先生等人；2002年，多賓斯先生等人)。在紐西蘭有非常高的圓錐角膜發病率，在太平洋島嶼族裔與毛利人口有不成比例的高發生率(2005年，帕特爾等人；2013年，帕特爾和麥吉先生)。在紐西蘭，所有執行角膜移植的約50%是針對圓錐角膜(2002年，艾德華先生等人)。

儘管在圓錐角膜方面有數項研究，不過底層的生化過程仍然知之甚少。圓錐角膜的家族性發生表明病因因子之一是遺傳(1985年，易哈萊念先生)。病症亦與某些生化和生物力學因子有關連。例如，已確定圓錐角膜的角膜變薄是造成成份的細胞外基質(ECM，Extracellular Matrix)損失。不過，這可能是由於其破壞、其缺陷的形成、或其組合(1995年，克林特沃思和達姆斯先生；1999年，克林特沃思；2011年，伊漢尼等人)。在角膜基質，有關圓錐角膜的變化包括減少薄片與角膜數量(2008年，顧、尼德雷爾、帕特爾、舍溫、和梅巨泰；2004年舍溫和布魯克斯先生)、與薄片組織與膠原纖維質量分佈的變化(2005年，米克等人)。

據認為，基質層的降解可能是由於異常蛋白水解酶活性(1994年，福地、余、蘇格、和雷姆先生)。圓錐角膜的角膜已知具有降低酶抑製劑的位準與增加降解酶的位準(2003年，肯尼和布郎先生)。生物力學因子包括變薄與減少角膜剛性，因為紫外線照射與機械性創傷引起的氧化性損壞(2003年，肯尼和布朗先生)。圓錐角膜的生物力學研究揭示彈性和硬度的下降；不過，這種情況的原因仍然不明(1988年，埃德蒙先生)。建議，減少膠原質交聯可能會是原因(1990年，伍倫莎和布德克先生)。目前還沒有令人滿意圓錐角膜的動物模型，且調查已明顯受限於體外設置。

隨著疾病的嚴重程度，試圖減緩圓錐角膜進展包括使用特定眼鏡與隱形眼鏡。在嚴重情況下，角膜植入件、基質內角膜環、或角膜移植是必要的(2011年，漢尼、夏爾馬、和瓦杰帕伊先生)。穿透性角膜移植術(其整個角膜厚度會被移除且使用捐贈者角膜組織來替代的方法)是最常用的手術過程，其用來治療圓錐角膜更嚴重的情況(1998年，維茨先生)。圓錐角膜是全球角膜移植手術的領先指標，其中約12-20%會受到需要角膜移植的圓錐角膜影響(2006年，帕拉曼尼克、慕裘、蘇芬、和法拉傑先生)。

圓錐角膜的早期治療方案(諸如稱為Rose K眼鏡的自訂氣體通透眼鏡)已著重在改善視力。較新的治療方法是針對減緩疾病的進展。一種稱為角膜膠原交聯(CXL)的治療著眼於增加角膜剛性與生物力學穩定性。在此過程，上皮會被刮除，投予局部核黃素滴，且角膜暴露於370nm(奈米)UV-A(Ultraviolet-A)紫外線光約30分鐘(2010年，阿斯溫和麥當諾；2003年，萬倫莎、施珀爾、和塞勒先生)。據認，UV-A光可激活核黃素，藉此產生活性氧類，誘發在角膜基質的膠原分子間形成共價鍵(1998年，史波利、胡勒、塞勒先生；2003年，萬倫莎等人)。不過，此過程中，不建議治療厚度較小於400μm(微米)的角膜，由於可能內皮細胞受損。雖然此治療會導致較硬的角膜，不過無法解決角膜變薄的問題。

因此，目前需要治療性組合物與用於處理眼睛病症的方法，包括影響角膜的病症。特別需要相對非侵入性且容易投予的治療。

本發明人已開發用於調節角膜細胞以改變角膜組織中膠原質表現與細胞外基質形成的組合物與方法。這些組合物與方法可用於再生及/或擴增角膜，藉此治療及/或預防角膜的各種病症與眼睛的屈光不正。

在一態樣，本發明包括一種治療或預防有關角膜變薄或不規律的病症，包含：使用一組合物接觸角膜，該組合物包含TGFß3多肽或變體或其片段、與地塞米松或其衍生物或相關類固醇製劑，藉此治療或預防病症。

在各種不同態樣：

該TGFß3多肽是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成。

該地塞米松是磷酸鹽地塞米松(dexamethasone phosphate)。

該組合物包含10至100ng/ml(奈克/毫升)TGFß3多肽。

該組合物包含40至4000ng/ml(奈克/毫升)地塞米松。

該組合物配製成滴眼液。

該組合物使用結蘭膠(gellan gum)配製成。

該組合物是配置供每日一次或每日兩次投予。

該組合物同時投予一或多種附加眼用劑。

一或多種附加眼用劑是選自下列組成群組：麻醉劑、抗炎劑、抗微生物劑與潤滑劑。

該組合物是連同使用接觸鏡、角膜插件、角膜植入件或基質內角膜環投予。

隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環是調適成在使用該組合物治療期間及/或其後面用於模塑或保持角膜形狀。

隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環是調適成充當組合物的載體或作為一組合物洗脫裝置。

該組合物是連同角膜膠原質交聯投予。

該組合物的投予是在交聯的前面及/或其後面。

病症是選自由下列組成群組：圓錐角膜、近視、與散光。

在一替代態樣，該方法包括同時投予一含有TGFß3多肽或變體或其片段的組合物、與一含有地塞米松或其衍生物或相關類固醇製劑的組合物。

在一進一步態樣，本發明包括一種治療或預防角膜的損壞或傷害的方法，包含：使用一組合物接觸角膜，該組合物包含TGFß3多肽或變體或其片段、與地塞米松或其衍生物或相關類固醇試劑，藉此治療或預防角膜的損壞或傷害。

在各種不同態樣：

該TGFß3多肽是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成。

該地塞米松是磷酸鹽地塞米松。

該組合物包含10至100ng/ml(奈克/毫升)TGFß3多肽。

該組合物包含40至4000ng/ml(奈克/毫升)地塞米松。

該組合物配製成為滴眼液。

該組合物使用結蘭膠配製成。

該組合物每日一次或每日兩次投予。

該組合物同時投予一或多種附加眼用劑。

一或多種附加眼用劑是選自以下組成群組：麻醉劑、抗炎劑、抗微生物劑、與潤滑劑。

該組合物是連同使用隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環投予。

隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環是調適成在使用組合物治療期間及/或其後面用於模塑或保持角膜形狀。

隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環是調適成充當組合物的載體或作為一組合物洗脫裝置。

角膜的損壞或傷害是有關下列一或多者：擦傷，撕裂傷、潰瘍、灼傷、刺傷、與手術傷害。

在一替代態樣，該方法包括同時投予一含有TGFß3多肽或變體或其片段的組合物、與一含有地塞米松或其衍生物或相關類固醇製劑的組合物。

在仍然進一步態樣，本發明包括一種治療或預防方法，用以治療或預防眼睛的屈光不正，包含：使用一組合物來接觸其眼睛，該組合物包含TGFß3多肽或變體或其片段、與地塞米松或其衍生物或相關類固醇劑，藉此治療或預防眼睛的屈光不正。

在各種不同態樣：

該TGFß3多肽是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成。

該地塞米松是磷酸鹽地塞米松。

該組合物包含10至100ng/ml(奈克/毫升)TGFß3多肽。

該組合物包含40至4000ng/ml(奈克/毫升)地塞米松。

該組合物配製成為滴眼液。

該組合物使用結蘭膠配製成。

該組合物是配置供每日一次或每日兩次投予。

該組合物同時投予一或多種附加眼用劑。

一或多種附加眼用劑是選自以下組成群組：麻醉劑、抗炎劑、抗微生物劑、與潤滑劑。

該組合物是連同隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環投予。

隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環是調適在使用組合物治療期間及/或其後面用於模塑或保持角膜形狀。

隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環是調適成充當組合物的載體或作為一組合物洗脫裝置。

該方法是在屈光手術的前面或其後面進行。

眼睛的屈光不正是有關下列的一或多者：近視、遠視、散光、與老花眼。

在一替代態樣，該方法包括同時投予一含有TGFß3多肽或變體或其片段的組合物、與含有地塞米松或其衍生物或相關類固醇製劑的組合物。

在仍然進一步態樣，本發明包括一種試劑盒，其包括：一組合物，其包含TGFß3多肽或變體或其片段、與地塞米松或其衍生物或相關類固醇製劑；及一或多個隱形眼鏡。

在各種不同態樣：

隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環是調適成在使用該組合物治療期間及/或其後面用於模塑或保持角膜形狀。

隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環是充當組合物的載體或作為組合物洗脫裝置。

該TGFß3多肽是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成。

該地塞米松是磷酸鹽地塞米松。

該組合物包含10至100ng/ml(奈克/毫升)TGFß3多肽。

該組合物包含40至4000ng/ml(奈克/毫升)地塞米松。

該組合物是配製成滴眼液。

該組合物是使用蘭膠配製成。

該組合物是配製成供每日一次或每日兩次投予。

該組合物共同配製為一或多種附加眼用劑。

試劑盒包括一或多種附加眼用劑。

一或多種附加眼用劑是選自以下組成群組：麻醉劑、抗炎劑、抗微生物劑、與潤滑劑。

該試劑盒包括一隱形眼鏡藥水。

該試劑盒包括使用說明書。

該試劑盒用於治療或預防眼睛的屈光不正。

該試劑盒用於治療或預防選自以下組成群組的角膜病症：圓錐角膜、近視、遠視、散光、老花眼、與基質營養不良。

該試劑盒用於治療選自以下組成群組的角膜病症：擦傷、撕裂傷、潰瘍、灼傷、刺傷、角膜溶解、與手術傷害。

在一替代態樣中，試劑盒包括作為分離成份的組合物，該組合物包含TGFß3多肽或變體或其片段、與含有地塞米松或其衍生物或相關類固醇製劑的組合物。

在甚至進一步態樣，本發明包括一誘發方法，用以在角膜細胞中誘發第II型膠原質表現，包含：使用組合物來接觸角膜細胞，該組合物包含TGFß3多肽或變體或其片段、與地塞米松或其衍生物或相關類固醇製劑，藉此在角膜細胞中誘發第II型膠原質表現。

在各種不同態樣：

TGFß3多肽是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成。

該地塞米松是磷酸鹽地塞米松。

該組合物包含10至100ng/ml(奈克/毫升)TGFß3多肽。

該組合物包含40至4000ng/ml(奈克/毫升)地塞米松。

該組合物是配製供經由一隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環投予。

該組合物是配製成溶液、凝膠、乳膏、或乳液投予。

該方法是體內進行。

該方法是體外進行。

在一替代態樣，該方法包括同時投予一含有TGFß3多肽或變體或其片段的組合物；及一含有地塞米松或其衍生物或相關類固醇製劑的組合物。

前述發明內容是概括描述本發明的某些具體實施例的特徵與技術優點。進一步技術優點將在本發明與以下實例的詳細描述中進行說明。

認為是本發明特徵的新特性可從下面連同任何附圖與實例的詳細描述而變得更瞭解。不過，本說明書提供的附圖與實例是要幫助說明本發明或協助對本發明的理解，而不是要限制本發明的範疇。

圖1A為顯示由角膜的增加球面變曲度引起近視的示意圖，使得進入眼睛的光不會聚焦到視網膜。

圖1B為分別正常(A)與圓錐角膜(B)的視圖。(C)：嚴重圓錐角膜的莎姆定律影像(Scheimpflug image)。在角膜中央發現明顯角膜變薄。

圖2為設置的器官切片培養。

圖3為成年雄性Wistar大鼠眼睛滴入生長因子滴眼液。

圖4針對大鼠眼睛成像設置的Phoenix Micron IV小動物視網膜成像系統。

圖5為以下的示意圖(A)：奈米壓痕系統；(B)：在此壓痕試驗期間獲得的典型負載-位移曲線，其用來計算角膜彈性與滯後。P_MAX=施加的最大負載；h_MAX=滲透深度；h_c=接觸深度(針尖與取樣間的接觸高度)；h_f=最終深度；S=卸載剛度。

圖6為奈米壓痕裝置是設計成保持人體角膜扣狀體(A)與大鼠球體(B)。利用顯微鏡找出角膜的中央部分位(C)，且找出後使用壓痕機探針(D)。

圖7為軟骨細胞分化培養基中接種的角膜基質細胞。角膜細胞是在含有球體形成TGFß3和地塞米松的軟骨細胞分化培養基中經過3週培養，其標記：(a)球體週圍附近的巢蛋白；(B)核心內的第II型膠原質。培養基然後將轉換成含有纖維細胞增殖培養基的血清1週，造成細胞從球體擴散出並遷入培養盤(C)。單層細胞為陰性第II型膠原質，然而細胞團仍會保持陽性第II型膠原質(D)。

圖8為含有纖維細胞增殖培養基的血清接種角膜基質細胞。對照纖維細胞增殖培養基中培養3週的角膜細胞會是陰性巢蛋白(A)、與第II型膠原質(B)。融合成纖維細胞然後在含有TGFß3和地塞米松的軟骨細胞分化培養基中培養3週(C)。細胞會保持陰性第II型膠原質(D)。(E)：在軟骨細胞分化培養基中的融合纖維細胞之沉墊培養。經過3週培養後，球狀細胞 會切片且標記陽性角膜細胞特異性標記基質蛋白(F)、與陰性軟骨細胞特異性第Ⅱ型膠原質(G)。

圖9為在對照培養基(A)和(D)經過2週培養的人體角膜切面分別為陰性第II型膠原質與陽性第I型膠原值。在軟骨細胞分化培養基中，經過1週培養的人體角膜切面(B)和(E)與經過2週培養的(C)和(F)，且標示第II型膠原值(B)和(C)、與第I型(E)和(F)。明顯標記第II型膠原質是經過2週角膜切片治療，然而只經過1週治療的切片是陰性第II型膠原質。儘管相較於對照經治療的切片為不強標記，不過對於兩時段的軟骨細胞分化培養基中培養的切片會是陽性第I型天然角膜膠原質。

圖10為以下兩者經過2週培養的人體角膜切面：(A)對照培養基與(B)軟骨細胞分化培養基及標示第II型膠原質。獲得類似結果如，由圖9所示。體內實驗顯示(C)：未治療的角膜；(D)和(E)：經治療的角膜，其在TGFß3和地塞米松經治療的大鼠角膜上普遍標記第II型膠原質。較強標記可在角膜(D)的前(上)部見到。第II型膠原質出現纖維狀且均勻分佈整個ECM。

圖11分別為對照培養基(A)、(C)和(E)、與軟骨細胞分化培養基(B)、(D)和(F)的體內培的養圓錐角膜的角膜扣狀體；2週及標示第II型膠原質(A)和(B)；及波形(C)-(F)。相較於正常人體角膜的標記，治療圓錐角膜的角膜標記(B)的第II型膠原質的標記是較弱。不過，第II型膠原質的沉積亦模式類似於在正常人體與大鼠角膜的體內與體外治療後的先前結果。相較於半數未治療的圓錐角膜(C)和(E)，經過半數經治療的圓錐角膜扣狀體(D)和(F)的纖維細胞群體數量增加、與完整多重長細胞代謝過程(F)。

圖12為對照培養基(A)和(C)、與軟骨細胞分化介質培養基(B)和(D)經過3週培養的體外培養人體圓錐角膜，且標記α-平滑肌肌動蛋白(αSMA)(A)和(B)、與第III型膠原質(C)和(D)。當相較於軟骨細胞分化培養基中培養 的角膜，在對照培養基(A)中培養角膜間質層出現較強αSMA標記。兩培養基中任一者中培養的角膜沒有出現第III型膠原質的陽性標記。

圖13為體內治療角膜的角膜透明度。治療(A)和(C)、與未治療(B)和(D)角膜。3週後的治療與未治療角膜從彼此區分。角膜(A)和(B)的正面圖顯示透明角膜，光很容易通過其而非常清楚顯現眼睛後部的血管。8週後，角膜截面體內成像顯示清晰、透明角膜，光很容易從其通過。沒有角膜混濁或瘢痕跡象。

圖14為體內治療角膜的第II型膠原質(A)與第I型膠原質(B)的定量基因表現。最初在1週治療後增加第II型膠原質表現。經治療停藥後，明顯降低第II型膠原質表現(A)。天然角膜第I型膠原質表現最初亦上調，不過，經過長期治療(最多7週)後的表現與對照未治療的角膜(B)相比較。

圖15為1週體內治療與未治療角膜的比較沒有顯示硬度(H)明顯差異與降低彈性模數(Er)。

圖16為兩隻大鼠3週體內治療與未治療角膜的負載變形曲線。繪製數值的對應曲線圖清楚顯示增加治療角膜的彈性模數(Er)與硬度(H)。

圖17為經過8週治療與對照人體圓錐角膜的彈性模數與硬度比較顯示在治療過角膜的兩參數明顯增加度。

圖18為結合體內細胞重新編程與剛性隱形眼鏡以在治療過程保持想要角膜形狀的羊眼睛角膜重塑。

圖19為(A)Phoenix Micron IV小動物視網膜成像系統。成像系統能夠測量角膜厚度、球面變曲度與透明度。(B)OCT裝置能夠使前眼視覺化及測量角膜厚度與完整性，類似在本說明書顯現的圖像。(C)奈米壓痕測試儀；及(D)設備示意圖，將用來評估羊體外角膜生理特性。輸出如負載位移曲線所示，其可經由分析取得楊氏(Young)彈性模數、與硬度測度。在大型動物，諸如羊，角膜厚度(E)是採用微米表示且角膜散光測量(F)是利 用可攜式Pentacam®取得。對於角膜球面變曲度(F)，廣泛分佈的彩色輪廓表示半徑大的球面變曲度；窄輪廓表示較陡的球面變曲度區域。數字表示在每個點處的球面變曲度半徑。

圖20為只有TGFß3與地塞米松組合產生第Ⅱ型膠原質沉積。羊角膜組織分別採用20X和60X放大率在下列中培養：(A)BMP6、(B)BMP6+氫化可的松(hydrocortisone)、(C)TGFß3+氫化可的松、(D)BMP6+地塞米松、(E)TGFß3+強體松(prednisone)(F)TGFß3+Triesense®、(G)和(H)TGFß3+地塞米松，且標記為軟骨特異性Ⅱ型膠原質。

圖21為TGFß3和地塞米松組合的劑量反應研究。3週進行羊角膜培養，且標示第Ⅱ型膠原質。

下面描述闡述許多示範性配置、參數、等等。不過，應明白，此描述沒有要限制本發明的範疇，而是描述示範性具體實施例。

定義

在本說明書的每個實例，本發明的的描述、態樣、具體實施例、與實例中，用詞「包括」等等是指尚有其他，而沒有限制。因此，除非在實施方式與文後申請專利範圍中明確說明，否則用詞「包括」、「包含」、等等應被解釋為包含的意義，而與排他的意義相反，即是說「包括但沒有侷限於」的意義。

如本說明書使用，「擴增(Augmenting)」是指增加角膜的厚度、硬度、彈性模數、抗張強度、以及規律性之一或多者的方法，包括角膜組織(例如，基質層)。擴增可用來將特定形狀加諸在角膜，即是，角膜球面變曲度。擴增方法可在眼睛、或角膜出現或沒有特定病症下進行。擴增可有關增加角膜細胞外基質的成分(例如，第II型膠原質)。擴增亦可有關增 加角膜的細胞(例如，角膜細胞)的數量。細胞數量可(例如)藉由從靜態到活性的細胞增殖狀態來增加。

「同時投予(Co-administration)」或「共同投予(Co-administering)」是指試劑組合使用，例如眼睛治療劑，且包括投予共配製製劑(即，組合製劑)、以及同時或依續投予個別製劑。同樣係，「連同(In conjunction)」是指組合使用治療組合物與治療裝置/程序。此可包括使用裝置/程序前使用組合物、同時使用裝置/程序、及/或接續裝置/程序後使用。

角膜的「病症(Condition)」是指角膜的疾病、缺陷、損壞、受傷、退化、或功能性障礙。病症可能會影響角膜組織(例如，基質層)或角膜細胞(例如，Corneal cell/Keratocytes)。病症可為急性病症，例如，擦傷或潰瘍；或者，可為慢性疾病，例如，圓錐角膜或近視。

如本說明書使用的「角膜(Cornea)」是指覆蓋虹膜的眼睛透明前部、瞳孔、與眼部的前房。其包括角膜上皮、鮑曼氏(Bowman)膜、角膜基質、德斯密氏(Descemet)膜、與角膜上皮。特別感興趣的是角膜的基質層(亦稱為固有質(Substantia propria))，其包括帶有角膜細胞的規律配置膠原纖維的細胞外基質。

「衍生物(Derivative)」(有關化學衍生物)是指已化學修飾的化合物。本發明包括本說明書描述的化學化合物的每一者、以及其任何衍生物，包含化學修飾形式，諸如鹽、氫化物、酯、與原始化合物的其他修飾物。

如本說明書使用的「分離(Isolated)」(特別是指多肽)是指從其天然環境分離的分子。分離的分子可利用任何方法或已知或技術中使用的方法組合獲得，包含生化、重組、與合成技術。為了獲得分離的成份，多肽可利用至少一純化或富集步驟來製備。特別感興趣的是利用人工手段(即是非天然方式)獲得的多肽與肽。此包括(但沒有侷限於)合成化學、重組技 術、純化方法、等等。包括分離自天然、重組、或合成來源的多肽。此外還包括由化學合成、或由質粒、載體、或可導入細胞或無細胞翻譯系統的其他表現構建產生的多肽。此多肽顯然從多肽區別，因為其可無需人工手段而自然發生。

為了簡化，術語「蛋白質(Protein)」或「多肽(Polypeptide)」(例如，SEQ ID NO：1)、及其他此術語是指本說明書描述的分子。這些術語並不意味著提供這些分子的完整表徵。因此，蛋白或多肽在本說明書的特徵可具有特定胺基酸序列、結構的特定2維表示，不過應明白，主張的實際分子具有其他特性，包括三維結構、有關某些鍵結的遷移率與其他分子整體性質。其整體上是本發明涵蓋的分子本身及其性質。本說明書的術語「蛋白質」與「多肽」可互換使用。

TGFß3「多肽(Polypeptide)」是指從任何來源獲得的多肽，例如，分離出自然發生多肽、重組多肽、與合成多肽、及包括自然發生胺基酸序列的多肽、以及變體胺基酸序列的多肽、與此序列的片段，如在本說明書的詳細描述。TGFß3在技術亦稱為轉化生長因子ß3、TGFB3、ARVD、和FLJ16571。

胺基酸「序列同源性(Sequence identity)」是指兩或多個多肽的胺基酸與胺基酸比較。試驗序列可等同於參考序列(即是，具有100%同源性)，或者可包括一或多個胺基酸取代。在較佳態樣中，相較於參考胺基酸，胺基酸取代可具有類似化學及/或物理性質，諸如電荷或疏水性。序列同源性通常可利用最高同源性區域的序列比來決定。序列比演算法(例如，BLAST®序列比對程序)是眾知且技術廣泛使用。基於序列比，從比較的多肽序列間可決定同源性百分比。

「屈光不正(Refractive error)」(如本說明書的使用)是指眼睛光聚焦錯誤。屈光不正包括球面差(Spherical error)與柱面差(Cylindrical error)。 低階像差與高階像差兩者都包括在內。具體包括屈光不正是眼睛的病症，諸如近視、遠視、散光、屈光參差、與老花。

「再生(Regeneration)」(相對於角膜)是指角膜的形狀、厚度、規律性、硬度、彈性模數、與拉伸強度之一或多者的修復，其包含角膜組織(例如，基質層)。再生的方法可用來將特定形狀加諸在角膜，即是，角膜球面變曲度。再生方法可在眼內、或角膜的特定病症進行治療。再生可包括增加角膜的細胞外基質中成份(例如，第II型膠原質)。再生亦可包括增加角膜的細胞(例如，角膜細胞)的數量。細胞的數量可(例如)藉由改變這些從靜態到活性的細胞增殖狀態來增加。

「重新編程(Reprogramming)」細胞(例如，角膜細胞(Corneal Cell/Keratocytes))是指在分化狀態的變化。重新編程是有關細胞形態、細胞基因表現(例如，膠原質表現，包含第I型及/或第II型膠原質表現)、細胞增殖狀態(例如，靜態或活性)的一或多個變化。

術語「受試者(Subject)」是指人或非人類的動物。

「預防(Preventing)」是指阻止或延緩病症的發作，例如眼睛病症，或特別是角膜病症，諸如角膜的病症或其他缺陷。預防性措施會導致停止或減輕病症的一或多種症狀，或如果採取此措施可減緩症狀。預防角膜病症可增大角膜，如本說明書詳細描述。

「治療(Treating)」是指減少、改善、或解決病症，例如眼睛病症，或特別角膜病症，諸如角膜的病症或其他缺陷。治療會導致減少、改善、或消除病症的一或多種症狀。角膜病症治療有關角膜再生，如本說明書描述。本發明的組合物與方法可用於治療各種病症，防止各種病症、或治療及預防各種病症，如本說明書詳細描述。

細胞與組織再生

細胞與組織再生技術在治療處置方面擁有相當大希望。如本說明書的揭露，本發明人已開發組合物與方法，供使用原位細胞重新編程來調節細胞，以影響角膜組織的第II型膠原質表現與細胞外基質(ECM)沉積。此然後用來加強及/或擴增眼睛的角膜。發明人藉此提供角膜基質的原位/體內再生與擴增的獨特方法。

因此，揭露的方法可使用在角膜各種病症的體內組織工程治療，包含近視與圓錐角膜。如前述，近視的特徵在於角膜過度球面變曲度(圖1A)，同時圓錐角膜為進行性擴張角膜營養不良，導致角膜變薄的特徵模式(圖1B；圖像是在2010年由羅梅歐-門尼斯、聖多明各-魯比多、和沃爾夫佐恩先生改編成)。

當角膜細胞轉變成纖維細胞或肌纖維細胞表現型時，角膜細胞是相當靜態且通常只產生大量細胞外基質(ECM，Extracellular Matrix)。有關這些表現型的ECM沉積通常會導致角膜間質纖維化與透明度損失(2007年，卡德勒、鮑爾多克、貝拉、與漢福德先生)。構成軟骨細胞的軟骨細胞分泌第Ⅱ型膠原質，其為類似在角膜發現第I型的纖維狀膠原質。第II型膠原質在小雞角膜的發育過程亦是由角膜細胞表現，且其以後只會被成熟小雞基質中的第I型所取代(1990年，林森邁耶先生等人)。

本發明人先前表明，當使用指定生長因子的神經系列時，來自成年人與大鼠角膜的基質細胞可重新編程以產生神經元特異性蛋白(2013年，格琳尼先生等)。此數據證明，成年人細胞群可利用體內與體外的生長因子環境調節來進行簡單重新編程。

現在，如本說明書的證實，本發明人表明，利用轉化生長因子ß3(TGFß3)和地塞米松來治療細胞，角膜基質細胞可在體內與體外誘發以產生軟骨特異性纖維狀膠原質(第II型膠原質)(實例8和9)。特別是，發明人已證實，當使用這兩種化合物時，人體圓錐角膜活檢的角膜細胞表現 第II型膠原質(實例8)。此外，隨著動物研究，發明人已證實，TGFß3和地塞米松兩化合物可利用滴眼液進行體內傳遞以刺激第Ⅱ型膠原質沉積(實例9)。值得注意，第II型膠原質的沉積是均勻的，改善角膜的生物力學，且沒有纖維化或瘢痕形成，且對角膜透明度沒有任何影響(實例11和13)。

在不希望受到理論的束縛情況，假設膠原質沉積會由於將基質內的細胞重新編程為軟骨細胞表現型而明顯。已知軟骨細胞分泌第Ⅱ型膠原質不僅纖維狀膠原類似類似於在角膜發現的第I型，且在小雞角膜的發展過程會表現(1990年，林森邁耶先生等人)。其只會被成熟基質中的第I型膠原質取代(1990年，林森邁耶先生等人)。

在本說明書描述的結果，初始增加第I型膠原質表現是使用TGFß3和地塞米松治療角膜細胞的觀察(實例12)。不過，發明人認為所觀測第I型膠原沉積位準將不足以變硬/重塑角膜。此外，第II型膠原質沉積認為作為治療策略是更為可行。值得注意，第II型膠原質不是易受酶降解，例如酶出現在圓錐角膜。

根據本發明人的結果，可使用角膜細胞的重新編程來產生新的ECM分子作為改善角膜生物機械特性的有效治療方法。此方法認為是有利的，因為其藉由角膜酶來減少變性的易感性，如前述。揭露的治療模塊的目的是要穩定角膜，及矯正眼睛病症，包含眼睛的各種角膜病症與屈光不正。因此，可使用本發明的方法，例如，治療外凸的圓錐角膜基質。此外，本發明的方法可用於治療近視與角膜的各種其他病症，如本說明書的詳細描述。

影響眼睛與角膜的病症

本說明書描述的組合物發現特別使用在再生或增加角膜(例如，基質層)、以及角膜細胞(Corneal cell/Keratocytes)。組合物可用來處理角膜變 薄、弱化、細胞損失、組織損失、基質損失、膠原質損失、及/或異常。如此，本說明書描述的組合物可用於影響眼睛的各種病症，包含有關眼睛的角膜缺陷、疾病、傷害、傷害、及/或退化、以及屈光不正的病症。

在特定態樣，本發明包括治療角膜缺陷的方法。在某些情況，本發明的方法亦可用來防止角膜缺陷。缺陷可能有關角膜的特定病症。示範性病症包括圓錐角膜(如本說明書詳細描述)、與相關病症，其包括角膜外凸，諸如球形角膜、清澈性角膜邊緣變性、與後弧圓錐角膜(請參見，例如，1997年，阿爾發先生；1984年，克拉茲帞先生等人；2004年，拉伯尼茨先生；2010年，吉納柏海先生等人)。具體包括的缺陷是近視、老花眼、與散光，其包含規律與不規律散光。角膜的先天性缺陷亦包括。這些是扁平角膜與小角膜，其後者有關胎兒酒精症候群(fetal alcohol syndrome)、透納氏症(Turner syndrome)、艾登二氏症候群(Ehlers-Danlos syndrome)、韋爾-馬切薩尼二氏症候群(Weill-Marchesani syndrome)、瓦登伯格氏症候群(Waardenburg's syndrome)、南斯-霍蘭症候群(Nance-Horan syndrome)、與狄蘭氏症候群(Cornelia de Lange's syndrome)。還包括有關艾登二氏症候群第IV型的球形角膜(前述)。

在進一步態樣，本發明包括治療角膜傷害或退化的方法。在某些情況，可使用本發明的方法來防止角膜傷害。傷害或退化可能有關角膜的特定病症。特別包括角膜熔解，例如，有關發炎病症的角膜溶解，諸如類風濕性關節炎。其他示範性病症包括角膜炎，諸如邊緣性角膜炎(marginal keratitis)、角膜基質炎(stromal keratitis)、暴露性角膜炎、神經營養性角膜炎(neurotrophic keratitis)、絲狀角膜炎(filamentary keratitis)、酒糟鼻性角膜炎(rosacea keratitis)、病毒性角膜炎(包含皰疹性角膜炎、真菌性角膜炎、原蟲性角膜炎)、與其他感染性角膜炎(諸如梅毒性基質性角膜炎(luetic interstitial keratitis)、微孢子蟲角膜炎(microsporidial keratitis)、希傑森氏 (Thygeson)角膜炎)、與感染性結晶狀角膜病變(infectious crystalline keratopathy)。還包括潰瘍性角膜炎，亦稱為週邊性角膜潰瘍(PUK，Peripheral Ulcerative Keratitis)，其包含有關全身性疾病的潰瘍性角膜炎，諸如類風濕性關節炎、韋格納氏肉芽腫症(Wegener's granulomatosis)、全身性紅斑性狼瘡、復發性多發軟骨炎、與結節性多動脈炎。眼內炎亦包括在內。還包括慢性角膜水腫、莫倫氏(Mooren)潰瘍、扁橢圓形角膜、皰性角結膜病(phlyctenulosis)、特芮安氏(Terrien)角膜邊緣變性、薩爾茲曼結節性角膜變性(Salzman's degeneration)、結膜球狀變性(spheroidal degeneration)、富克斯(角膜變性(Fuch’s dystrophy)。此病症在技術是眾所周知與良好特徵化。請參見，例如，2008年傑克遜先生、2009年丹尼斯頓先生、與2000年Willshaw先生等人。另外包括角膜基質營養不良，例如，格子狀角膜營養不良(例如，第1型與第2型)、顆粒狀角膜營養不良(granular corneal dystrophy)(例如，第1型與第2型)、格羅諾斑狀角膜營養不良(macular corneal dystrophy)、施奈德角膜營養不良Schnyder corneal dystrophy)、先天性角膜基質營養不良(congenital stromal corneal dystrophy)、與斑點狀角膜營養不良(fleck corneal dystrophy)。

在仍然進一步態樣，本發明包括治療角膜傷害的方法。包括由於物理受傷、化學受傷、輻射受傷、及/或來自特定藥物受傷的傷害。受傷可能有關角膜擦傷、角膜糜爛、角膜穿破、膜破裂、角膜瘢痕、或角膜潰瘍，包括溶化性角膜瘍、無痛潰瘍、淺表潰瘍。同時還包括受傷與有關眼科手術得其他受傷，包含手術傷口、放射狀角膜切削術角膜傷口、與角膜移植術後的急性問題，其包含持續性上皮缺陷。此外，包括有關角膜熔解的傷害，例如眼睛的手術或其他治療後的角膜溶解傷害(例如，局部NSAID(非固醇類抗發炎藥物)投予)。角膜溶解可歸因於感染、發炎或營養原因。還包括因年老的角膜傷害與傷害。

在甚至進一步態樣，本發明包括治療或預防眼睛的屈光不正的方法。此屈光不正可能與特定病症有關聯，包括近視、遠視、老花眼、屈光參差、高階像差、與各種散光。高階像差包括(但沒有侷限於)昏迷、三叉像差、四叉像差、球面像差、與利用數學式來識別的像差(例如，澤爾尼克(Zernike)多項式)。

角膜的病症可利用各種方法來診斷，包括角膜熒光素染色法(fluorescein staining)(其可包含賽德爾(Seidel)試驗)、鏡射光顯微鏡、角膜斷層掃描、等距斷層掃描、角膜厚度測量法、超聲、細隙燈、角膜刮術、與活組織檢查。診斷還可能有關視力及/或混濁評估。角膜病症可能與以下一或多種症狀有關聯：痛、畏光、異物感、降低視力、水腫、白細胞浸潤、螢光素吸收、血管形成、發紅、與全身症狀，諸如頭痛、噁心、疲勞。同樣地，屈光不正的症狀可包括(但沒有侷限於)：降低視力以及視力模糊、复視、視力混濁、視力疲勞、異物感、有問題的眩光或光暈、星芒圖案、重影、夜視能力衰退、瞇眼、過度凝視、眨眼過度、頭痛、揉眼睛、眼睛疲勞、眼球表面乾燥、眼睛刺痛、發紅、眼睛痙攣。

治療組合物

如前述，本說明書描述的組合物可用於治療及/或預防眼睛的各種病症，包括影響眼睛的角膜與屈光不正。組合物可包括TGFß3多肽、或變體或其片段、連同地塞米松、或其衍生物或相關類固醇試劑。

在各種不同態樣，組合物可配製成包括成份(TGFß3多肽(或變體或其片段)加上地塞米松(或其衍生物或相關類固醇試劑))的組合；或者，可配製成包括一第一成份(TGFß3多肽(或變體或其片段)、或具有投予前添加第二成份的地塞米松(或其衍生物或相關類固醇試劑))。或者，組合物可配製成包括一第一成份(TGFß3多肽(或變體或其片段)；或者，使用包含第二成份的製劑同時或依序投予的地塞米松(或其衍生物或相關類固醇試劑))。

在一態樣，TGFß3多肽可包括至少以下胺基酸序列：ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILY YVGRTPKVEQ LSNMVVKSCK CS(SEQ ID NO：1)(GenBank(基因銀行)參考第CAR70088.1號)。TGFß3多肽可包括如上顯示的至少112個胺基酸，且可具有分子量25.5kDa。或者，TGFß3多肽可從GenBank參考第CAA33024.1號、GenBank編錄第CAA33024號、或NCBI參考序列第NP_003230.1號中確認的前體多肽序列的胺基酸644-850(207個胺基酸)衍生出。

在其他態樣，TGFß3變體或片段亦可使用。例如，變體或片段可表現SEQ ID NO：1的至少75%序列同源性、最好是至少80%一致性、更好是至少85%、最好是至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或SEQ ID NO：1的約100%序列同源性，如本說明書描述。特別感興趣是TGFß3變體出現生物活性，例如，相較於非變體多肽的類似或改善的活性。

在進一步態樣，一特定片段可使用。例如，TGFß3片段可包含至少80個胺基酸、SEQ ID NO：1的至少85個胺基酸、最好是至少90個胺基酸、至少91個胺基酸、至少92個胺基酸、至少93個胺基酸、至少94個胺基酸、至少95個胺基酸、至少96個胺基酸、至少97個胺基酸、至少98個胺基酸、至少99個胺基酸、最好是至少100個胺基酸、至少101個胺基酸、至少102個胺基酸、至少103個胺基酸、至少104個胺基酸、至少105個胺基酸、至少106個胺基酸、107個胺基酸、108個胺基酸、109個胺基酸、110個胺基酸、或SEQ ID NO：1的111個胺基酸。特別感興趣的是TGFß3的功能性片段，例如，表現生物活性的片段，例如，相較於參考多肽的類似或改善的活性。

在一特定態樣，TGFß3多肽或變體或其片段亦可作為重組多肽。例如，多肽可在眾知的細胞或無細胞表現系統、與技術中使用來表達。其間包括細菌、真菌、植物、與哺乳動物表現系統。使用E.coli細胞、CHO細胞、HEK細胞、與圓葉菸草細胞的表現系統係特別包括。TGFß3多肽或變體或其片段可提供作為在人體或非人體表現系統中表達的人體重組多肽。TGFß3多肽或變體或其片段可根據已知方法提供作為二硫鍵連同二硫鍵連接的同源二聚體、非糖基化多肽鏈。

TGFß3多肽或變體或其片段可利用標準方法從重組表現系統分離，包括眾知的色譜技術。TGFß3多肽或變體或其片段可包括序列標記，以促成分裂、分離及/或定位多肽。根據本發明，TGFß3多肽可從各種商業來源獲得。例如，重組人體TGFß3可從R & D Systems(目錄第243-B3-010號、第243-B3-002號)、BioVision,Inc.(目錄第4344-500號；第4344-50號；第4344-5號)、或Prospec Protein Specialists(目錄第CYT-113號；第CYT-319號)獲得。

TGFß3多肽或變體或其片段的生物活性可根據眾知與使用的方法來測定。例如，生物活性可藉由抑制水貂肺上皮(Mv1Lu)細胞生長(參見，例如，2006年普利馬雷先生等人)的多肽能力進行培養測定。此測量的示範性活動顯現ED 50

5ng/ml(奈克/毫升)。或者，生物活性可利用劑量依賴性抑制小鼠HT-2細胞的IL-4誘發生長來測定(由存在IL-2中的羊紅細胞所激活的BALB/c脾)(參見，例如，1995年，曾先生等人)。此測量的示範性活動通常是介於0.1至0.5ng/ml(奈克/毫升)。或者，包括本說明書描述試劑組合中的組合物可利用下述的方法來測定生物活性。例如，在角膜細胞誘發第II型膠原質(例如，第II型膠原質，α1)可利用下列一或多個技術來評估：免疫組織化學分析法(immunohistochemical assays)、蛋白質測 定法(protein assays)、西方墨點分析法(Western blot analysis)、聚合酶鏈反應(PCR，Polymerase Chain Reaction)分析法、與定量PCR技術。

如本說明書描述，組合物還可包括地塞米松、其衍生物、及/或相關類固醇製劑。地塞米松的特徵為具有以下化學結構：

地塞米松的商標名稱包括(例如)Decadron®、Dexasone®、Diodex®、Hexadrol®、Maxidex®、與Minims®。

在各種態樣，可使用地塞米松的衍生物，包括任何酯及其鹽。示範性衍生物包括(但沒有侷限於)：地塞米松-17-乙酸酯(dexamethasone-17-acetate)(CAS RN：1177-87-3)、地塞米松磷酸氫二鈉(dexamethasone disodium phosphate)(CAS RN：2392-39-4)、地塞米松戊酸酯(dexamethasone valerate)(CAS RN：14899-36-6)、地塞米松-21-異菸鹼酸鈉(dexamethasone-21-isonicotinate)(CAS RN：2265-64-7)、地塞米松棕櫚酸酯(dexamethasone palmitate)(CAS RN：33755-46-3)、地塞米松丙酸酯(dexamethasone propionate)(CAS RN：55541-30-5)、乙呋地塞米松(dexamethasone acefurate)(CAS RN：83880-70-0)、地塞米松-21-半乳糖苷(dexamethasone-21-galactoside)(CAS RN：92901-23-0)、地塞米松21-硫代特戊酸酯(dexamethasone 21-thiopivalate)、地塞米松21-硫代戊酸酯(dexamethasone 21-thiopentanoate)、地塞米松21-硫醇-2-甲基丁酸(dexamethasone 21-thiol-2-methyl-butanoate)、地塞米松21-硫醇-3-甲基-丁 酸乙酯(dexamethasone 21-thiol-3-methyl-butanoate)、地塞米松21-己酸甲硫醇酯(dexamethasone 21-thiohexanoate)、地塞米松21-硫醇-4-甲基-戊酸乙酯(dexamethasone 21-thiol-4-methyl-pentanoate)、地塞米松21-硫醇-3,3-二甲基-丁酸乙酯(dexamethasone 21-thiol-3,3-dimethyl-butanoate)、地塞米松21-硫醇-2-乙基丁酸(dexamethasone 21-thiol-2-ethyl-butanoate)、地塞米松21-硫辛酸(dexamethasone 21-thiooctanoate)、地塞米松21-硫醇-2-乙基己酸酯(dexamethasone 21-thiol-2-ethyl-hexanoate)、地塞米松21-硫代壬酸酯(dexamethasone 21-thiononanoate)、地塞米松21-硫代癸酸酯(dexamethasone 21-thiodecanoate)、地塞米松21-p-氟基硫代苯甲酸鹽(dexamethasone 21-p-fluorothiobenzoate)或其組合。特別包括是地塞米松醇(dexamethasone alcohol)與地塞米松磷酸鈉(dexamethasone sodium phosphate)。地塞米松衍生物亦包括在內，如US 4177268的描述。

組合物可包括相關類固醇劑，以取替或添加地塞米松。例如，其他類皮質激素類固醇可替代或連同地塞米松配合使用。最好當作相關類固醇使用是根據庫普曼(Coopman)分類的C群類固醇，包括倍他米松型(betamethasone-type)類固醇，諸如地塞米松、地塞米松磷酸鈉、倍他米松、倍他米松磷酸鈉、與氟可龍(fluocortolone)優選。其他相關類固醇劑包括(但沒有侷限於)：氟米龍(fluoromethalone)、氯替潑諾(lotoprendol)、甲羥松(medrysone)、去氫皮質醇(prednisolone)、強體松(prednisone)、利美索龍(rimexolone)、氫化可的松(hydrocortisone)、洛度沙胺(lodoxamide)、或任何衍生物或其組合。特別包括醋酸氟米(fluoromethalone acetate)、氟米醇(fluoromethalone alcohol)、乙酸培尼皮質醇(prednisolone acetate)、磷酸培尼皮質醇鈉(prednisolone sodium phosphate)、氯替潑諾(lotoprendol etabonate)、醋酸氫化可的松(hydrocortisone acetate)、洛度沙胺(lodoxamide)、與氨丁三醇(tromethamine)。應明白，對於本發明的任何化 學物質，化學物質可為各種修飾形式，諸如乙形式、與磷酸鈉形式，諸如鈉鹽、與類似物。

組合物可包括(例如)0.04ng/ml(奈克/毫升)至4ng/ml(奈克/毫升)；或0.04ng/ml(奈克/毫升)至0.4ng/ml(奈克/毫升)；或0.4ng/ml(奈克/毫升)至4ng/ml(奈克/毫升)；或4至40ng/ml(奈克/毫升)；或40ng/ml(奈克/毫升)至400奈克/毫升、或40ng/ml(奈克/毫升)至4000ng/ml(奈克/毫升)地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑；或約0.04ng/ml(奈克/毫升)、約0.08ng/ml(奈克/毫升)、約0.12ng/ml(奈克/毫升)、約0.4ng/ml(奈克/毫升)、約0.8ng/ml(奈克/毫升)、約1.2ng/ml(奈克/毫升)、約4ng/ml(奈克/毫升)、約12ng/ml(奈克/毫升)、約24ng/ml(奈克/毫升)、約4ng/ml(奈克/毫升)、約80ng/ml(奈克/毫升)、約12ng/ml(奈克/毫升)、約24ng/ml(奈克/毫升)、約40ng/ml(奈克/毫升)、約80ng/ml(奈克/毫升)、約1000ng/ml(奈克/毫升)、約1600ng/ml(奈克/毫升)、約2000ng/ml(奈克/毫升)、約2400ng/ml(奈克/毫升)、約3200ng/ml(奈克/毫升)、或約4000ng/ml(奈克/毫升)地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑。

如進一步實例，組合物可包括0.4μg/ml(微克/毫升)至40μg/ml(微克/毫升)；或0.4μg/ml(微克/毫升)至4μg/ml(微克/毫升)；或4μg/ml(微克/毫升)至40μg/ml(微克/毫升)地塞米松或其衍生物或相關類固醇製劑；或約0.4μg/ml(微克/毫升)、約0.8μg/ml(微克/毫升)、約1μg/ml(微克/毫升)、約1.2μg/ml(微克/毫升)、約2μg/ml(微克/毫升)、約4μg/ml(微克/毫升)、約8μg/ml(微克/毫升)、約12μg/ml(微克/毫升)、約20μg/ml(微克/毫升)、或約40μg/ml(微克/毫升)地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑。

如仍然進一步實例，組合物可包括0.1mg/ml(毫克/毫升)至1mg/ml(毫克/毫升)；或0.5mg/ml(毫克/毫升)至5mg/ml(毫克/毫升)；或1 mg/ml(毫克/毫升)至10mg/ml(毫克/毫升)；地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑；或約0.1mg/ml(毫克/毫升)、約0.5mg/ml(毫克/毫升)、約1mg/ml(毫克/毫升)、約2mg/ml(毫克/毫升)、約5mg/ml(毫克/毫升)、或約10mg/ml(毫克/毫升)地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑。

組合物可包括(例如)1ng/ml(奈克/毫升)至1μg/ml(微克/毫升)；或1ng/ml(奈克/毫升)至10ng/ml(奈克/毫升)；或1ng/ml(奈克/毫升)至100ng/ml(奈克/毫升)；或10ng/ml(奈克/毫升)至1μg/ml(微克/毫升)TGFß3多肽或變體或其片段；或約1ng/ml(奈克/毫升)、約5ng/ml(奈克/毫升)、約10ng/ml(奈克/毫升)、約20ng/ml(奈克/毫升)、約50ng/ml(奈克/毫升)、約100ng/ml(奈克/毫升)、約20ng/ml(奈克/毫升)、約500ng/ml(奈克/毫升)、約800ng/ml(奈克/毫升)、或約1μg/ml(微克/毫升)TGFß3多肽或變體或其片段。在特定態樣，組合物可包括至少40ng/ml(奈克/毫升)地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑、連同至少4ng/ml(奈克/毫升)TGFß3多肽、或變體或其片段。

組合物亦可包括一或多個抗炎劑。示範性抗炎劑包括(至少)富馬酸酮替芬(ketotifen fumarate)、雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、氟白普洛芬鈉(flurbiprofen sodium)、酮咯酸氨丁三醇(ketorlac tromethamine)、舒洛芬(suprofen)、塞來考昔(celecoxib)、萘普生(naproxen)、羅非考昔(rofecoxib)、或任何衍生物或其組合。特別包括非類固醇抗炎藥(NSAID)。組合物可額外包括一或多個麻醉劑。示範性麻醉劑包括(至少)局部麻醉劑，諸如丙美卡因(proparacaine)、利多卡因、與丁卡因、及任何衍生物或其組合。其他眼用試劑可選用包含組合物；熟諳此技者可基於接受治療受試者的病症與需要來選擇。

如本說明書描述的組合物可針對局部投予來配製，如本說明書描述，而且根據熟知的方法。在某些情況，可能想要眼內投予。組合物可採 用適合投予眼睛的任何形式來提供。示範性製劑在合適眼睛載體包括(至少)溶液、懸浮液、乳液(分散體)、凝膠劑、霜劑、或軟膏劑。例如，組合物可採用滴眼液、半固體凝膠、或噴霧劑的形式。在某些態樣，成型隱形眼鏡或其他插件/植入件可沉浸本發明的組合物。如此，當受視者配戴隱形眼鏡時，組合物可連續且以定時釋放方式傳遞到角膜。

針對眼睛的局部投予，組合物可使用pH值5.0至8.0範圍來配製。此pH範圍可利用添加緩衝液到溶液中實現。最好是製劑在緩衝溶液是穩定性。即是，在緩衝液與活性劑間沒有導致組合物不穩定的負作用，例如藉由沉澱或聚合。組合物可為高滲性(5%至40%，最好約10、20、30、或40%)或低滲性(0%至5%，最好約1、2，3、或4%)，此取決於受試者的需求(例如，工作需要、休息時間、睡眠、等斗)。當連同成型隱形眼鏡使用時，可使用高滲性組合物(例如，40%)，如本說明書詳細描述。

組合物可包括作為任選成份的一或多個合適防腐劑。適合的防腐劑可添加以防止污染，例如，細菌污染。此試劑可包括(但沒有侷限於)：苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、硫柳汞(thimerosal)、氯丁醇(chlorobutanol)、對羥基苯甲酸甲酯(methyl paraben)、對羥基苯甲酸丙酯(propyl paraben)、苯乙醇(phenylethyl alcohol)、EDTA、山梨酸(sorbic acid)、Onamer® M、與熟諳此技者熟知的其他試劑、或其任何組合。此防腐劑通常可依組合物重量的0.001%至1.0%位準來使用。

組合物可包含有任選共溶劑。本組合物的成份溶解度可利用在組合物中的表面活性劑或其他合適共溶劑來增強。此共溶劑/表面活性劑包括(例如)聚山梨酸酯(polysorbate)20、60和80；聚氧乙烯(polyoxyethylene)/聚氧丙烯(polyoxypropylene)表面活性劑(例如Pluronic® F-68、F-84和P-103)；環糊精(cyclodextrin)；泰洛沙泊(tyloxapol)；及熟諳此技者熟知的 其他試劑、及其任何組合。此共溶劑典型可依組合物重量的0.01%至2%位準來使用。

增滲劑可用來增加眼睛攝取組合物。示範性試劑包括(至少)氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)、離子載體，諸如拉沙裡菌素(lasalocid)、氯化烷基二甲基苄基銨(benzalkonium chloride)、對羥基苯甲酸酯(Parabens)、吐溫20、皂甙、Brij 35、Brij 78、Brij 98、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)、膽汁鹽(bile salts)、與膽汁酸(bile acids)(諸如膽酸鈉(sodium cholate)、鈉牛磺膽(sodium taurocholate)、甘氨脫氧膽酸鈉(sodium glycodeoxycholate)、牛磺脫氧膽酸鈉(sodium taurodeoxycholate)、牛磺膽酸(taurocholic acid)、鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid)、與熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid))、癸酸(capric acid)、月桂氮酮(azone)、夫西地酸(fusidic acid)、六亞甲基月桂醯胺(hexamethylene lauramide)、皂甙(saponins)、六亞甲基辛醯胺(hexamethylene octanamide)、與癸基甲基亞碸(decylmethyl sulfoxide)。

此外，生物黏附聚合物可用來黏附到覆蓋眼睛的黏蛋白層，以延長組合物接觸眼睛。生物黏附聚合物可為能夠建立靜電相互作用，具眾多親水性官能團的高分子膠體，諸如羧基、羥基、醯胺、與硫酸鹽。示範性試劑包括(至少)聚丙烯酸(polyarylic acid)(例如，卡波姆(carbopol)、卡波糖(carbophil)、與聚卡波非(polycarbophil))與羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)。

控釋系統亦可使用；此系統可包括原位凝膠、膠體顆粒、奈米顆粒、及/或囊泡。其他藥物傳遞系統包括(但沒有侷限於)：非侵蝕眼用插件、可侵蝕眼用插件、水凝膠、膠原膜、脂質體、載藥膜(例如，NOD®)、與離子導入法。

組合物(還)可包括增加黏度的選劑。黏度超過單純水溶液是要用來增加活性化合物的眼部吸收，以降低施配製劑的變化性、降低製劑懸浮液或乳狀液成份的物理分離、及/或改善眼用成份。此增黏劑包括(例如)聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、甲基纖維素(methyl cellulose)、羥基丙基甲基纖維素(hydroxy propyl methylcellulose)、羥乙基纖維素(hydroxyethyl cellulose)、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)、羥基丙基纖維素(hydroxy propyl cellulose)、熟諳此技者熟知的其他試劑、或其組合。此試劑通常可依組合物重量採用0.01%至2%位準。

在特定態樣，組合物包括膠凝劑，例如，高分子量水溶性多醣，諸如結冷膠。結冷膠可從各種商業供應源取得，例如，選用商標名稱Kelcogel®。特別係，Kelcogel® LT100可當作細網、高醯基結蘭使用，其形成軟、彈性、非脆的凝膠。在特定態樣，基於組合物的結冷膠是製劑成0.5%滴眼液。

其他試劑可用來進一步穩定或增強組合物。例如，EDTA、氯化鈉、泰洛沙泊、硫酸鈉、及/或羥乙基纖維素之一或多者可具有進一步穩定組合物的附加效益作用。

治療方法

如前述，本說明書描述的組合物發現是特別用來再生或擴增角膜(例如，基質層)、以及角膜細胞(Corneal Cell/Keratocytes)。特別是，組合物可用來提供增強角膜的整形、厚度、規擇性、硬度、彈性模數、拉伸強度、或功能性(例如，屈光)。因此，本說明書描述的組合物可用來解決角膜的各種病症與矯正眼睛的屈光不正，且可當作使用其他眼睛治療的輔助療法使用。

如前述，組合物能採用投予眼睛的任何適當方式進行製劑。製劑包括眼用溶液、霜劑、乳劑、軟膏、與凝膠。特別注意的製劑是製成滴眼液。在特定態樣，組合物可使用市售多種類型滴眼液點滴器當中任何類型當作滴眼液進行投予。如範例所示，本發明組合物的容器可為透明、半透明、不透明，且可包含其他特性或綜合特性，諸如玻璃襯裡、具保護封套、採用單或數劑量等分試樣(Aliquot)包裝、及其任何組合。

組合物可在實現想要醫療效果的受試者身上投予療效量。更具體係，組合物可投予解決在本說明書所述眼科病症、或至少減輕此病症的一或多種症狀的劑量。組合物的精確劑量(即是，劑量與服用時間)可由臨床醫師根據受試者與出現的病症來決定。示範性製劑(例如，滴眼液)可每日投予1至24次、或每日1至12次、或每日1至6次、或每日1至4次、或每日1至3次、或每日1至2次、或每日1、2、3、4、6、8、12、18、或24次。組合物可如同滴眼液藉由將要治療的每個眼睛注入一滴進行局部性施用。或者，每個眼睛可施加2至3滴。

對於描述的組合物，劑量範圍可一劑量每眼為(例如)0.2pg(皮克)至2.4ng(奈克)；或2pg(皮克)至2.4ng(奈克)地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑；或約0.2pg(皮克)、約0.4pg(皮克)、約0.6pg(皮克)、約0.8pg(皮克)、約1.2pg(皮克)、約2.4pg(皮克)、約2pg(皮克)、約4pg(皮克)、約6pg(皮克)、約8pg(皮克)、約12pg(皮克)、約18pg(皮克)、約24pg(皮克)、約0.2ng(奈克)、約0.26ng(奈克)、約0.4ng(奈克)、約0.6ng(奈克)、約0.8ng(奈克)、約1.2ng(奈克)、約1.8ng(奈克)、或約2.4ng(奈克)地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑。

如其他實例，劑量範圍可一劑量每眼為12ng(奈克)至1.3μg(微克)；或6ng(奈克)至600ng(奈克)地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑；或約6ng(奈克)、約8ng(奈克)、約12ng(奈克)、約16ng(奈克)、約 18ng(奈克)、約24ng(奈克)、約26ng(奈克)、約30ng(奈克)、約36ng(奈克)、約40ng(奈克)、約48ng(奈克)、約52ng(奈克)、約54ng(奈克)、約60ng(奈克)、約72ng(奈克)、約78ng(奈克)、約80ng(奈克)、約90ng(奈克)、約120ng(奈克)、約130ng(奈克)、約160ng(奈克)、約180ng(奈克)、約240ng(奈克)、約260ng(奈克)、約300ng(奈克)、約360ng(奈克)、約400ng(奈克)、約480ng(奈克)、約520ng(奈克)、約540ng(奈克)、約600ng(奈克)、約720ng(奈克)、約780ng(奈克)、約900ng(奈克)、約1.2μg(微克)、約1.3μg(微克)地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑。

如仍然其他實例，劑量範圍可一劑量每眼為1.5μg(微克)至150μg(微克)；2.6μg(微克)至260μg(微克)；或6.5μg(微克)至650μg(微克)地塞米松、或其衍生物或其相關類固醇製劑；或約1.5μg(微克)、約2μg(微克)、約3μg(微克)、約4.5μg(微克)、約6μg(微克)、約6.5μg(微克)、約7.5μg(微克)、約10μg(微克)、約15μg(微克)、約22.5μg(微克)、約32.5μg(微克)、約20μg(微克)、約26μg(微克)、30μg(微克)、約40μg(微克)、約45μg(微克)、約60μg(微克)、約65μg(微克)、約75μg(微克)、約80μg(微克)、約90μg(微克)、約100μg(微克)、約120μg(微克)、約130μg(微克)、約150μg(微克)、約180μg(微克)、約225μg(微克)、約240μg(微克)、約260μg(微克)、約200μg(微克)、約300μg(微克)、約325μg(微克)、約450μg(微克)、約600μg(微克)、或約650μg(微克)地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑。應明白，地塞米松的特定製劑可市售取得，且此可根據公認的劑量與服用時間來使用。

任何前述地塞米松劑量可一劑量每眼使用以下劑量範圍來同時投予，例如，5pg(皮克)至65ng(奈克)；或0.5ng(奈克)至65ng(奈克)TGFß3多肽、或變體或其片段；或約5pg(皮克)、約10pg(皮克)、約15pg(皮克)、約20pg(皮克)、約30pg(皮克)、約45pg(皮克)、約60pg(皮克)、約0.05ng(奈 克)、約0.1ng(奈克)、約0.15ng(奈克)、約0.2ng(奈克)、約0.3ng(奈克)、約0.45ng(奈克)、約0.5ng(奈克)、約0.6ng(奈克)、約0.65ng(奈克)、1ng(奈克)、約1.5ng(奈克)、約2ng(奈克)、約3ng(奈克)、約4ng(奈克)、約4.5ng(奈克)、約6ng(奈克)、約6.5ng(奈克)、約7.5ng(奈克)、約9ng(奈克)、約10ng(奈克)、約12ng(奈克)、約13ng(奈克)、約15ng(奈克)、約16ng(奈克)、約20ng(奈克)、約22.5ng(奈克)、約24ng(奈克)、約30ng(奈克)、約32.5ng(奈克)、約36ng(奈克)、約40ng(奈克)、約45ng(奈克)、約48ng(奈克)、約50ng(奈克)、約52ng(奈克)、約60ng(奈克)、或約65ng(奈克)TGFß3多肽、或變體或其片段。

一眼睛的劑量可為約一滴揭露的組合物。組合物的一滴可為10μl(微升)至200μl(微升)、20μl(微升)和120μl(微升)、或50μl(微升)至80μl(微升)或其間的任何值。例如，點滴器(諸如，移液器)可分配從1μl(微升)至300μl(微升)、與介於其間任何值的液滴。最好是，點滴器可分配每滴揭露組合物約15μl(微升)、約20μl(微升)、約30μl(微升)、約45μl(微升)、約60μl(微升)、或約65μl(微升)。

在組合物經由隱形眼鏡或另一插入/植入件投予的情況，隱形眼鏡或插入/植入件可包括，例如，0.01mg(毫克)至10mg(毫克)地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑；或約0.01mg(毫克)、約0.1mg(毫克)、約0.5mg(毫克)、約0.7mg(毫克)、約1mg(毫克)、約5mg(毫克)、或約10mg(毫克)地塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑。或者，隱形眼鏡或插入/植入件可包括10ng(奈克)至100ng(奈克)地塞米松、或或其衍生類或相關固醇製劑；或約1ng(奈克)、約5ng(奈克)、約10ng(奈克)、約20ng(奈克)、約50ng(奈克)、約80ng(奈克)、或約100ng(奈克)塞米松、或其衍生物或相關類固醇製劑。如進一步實例，隱形眼鏡或插入/植入件可包括約10ng(奈克)至1μg(微克)TGFß3多肽、或變體或其片段；或約10ng(奈克)、 約50ng(奈克)、約100ng(奈克)、約200ng(奈克)、約500ng(奈克)、約800ng(奈克)、或約1μg(微克)TGFß3多肽、或變體或其片段。

本說明書描述的組合物可連同各種外科手術或其他治療使用。例如，組合物可連同眼睛屈光矯正的手術與非手術方法來使用。示範性方法包括(但沒有侷限於)：放射狀角膜切開術(RK，Radial Keratotomy)，其包含迷你不對稱徑向狀角膜切開術(MARK，Mini Asymmetric Radial Keratotomy)、六角型角膜成形術(HK，Hexagonal Keratotomy)、雷射屈光角膜切削術(PRK，Photorefractive Keratectomy)、角膜磨鑲術、雷射原位層狀角膜重塑術(LASIK，Laser in situ Keratomileusis)(例如，intraLASIK®)、雷射上皮原位角膜塑型術(LASEK，Laser epithelial Keratomileusis)(例如，外延LASEK)、自動式層狀角膜切開術(ALK，Automated Lamellar Keratoplasty)、雷射熱角膜整型手術(LTK，Laser Thermal Keratoplasty)、傳導性角膜成形術(CK，Conductive Keratoplasty)、角膜緣鬆弛切開術(LRI，limbal relaxing incisions)、角膜散光切開術(AK，Astigmatic Keratotomy)、表面角膜鏡片術、前鞏膜切開術(ACS，Anterior Ciliary Sclerotomy)、鞏膜加固術、老花眼逆轉術、雷射老花眼逆轉術(LRP，Llaser Reversal of Presbyopia)、角膜內環植入術(ICR，Intracorneal Ring)、角膜基質環植入術(例如，INTACTS®)、植入式隱形眼鏡手術、鞏膜擴張帶術(SEB，Scleral Expansion Band)、與Kamra^TM角膜嵌體術。此外，還包括熱角膜成形術、角膜塑型術、角膜塑形酶、與化學角膜塑形。

組合物可連同非屈光病症的手術矯正配合使用，例如，角膜撕裂傷的手術矯正。在特定態樣，本說明書描述的組合物可連同在角膜進行的特定手術方法配合使用。示範性方法包括(但沒有侷限於)：角膜移植手術、穿透性角膜移植術(PK，Penetrating Keratoplasty)、光性治療性角膜切除術(PTK，Phototherapeutic Keratectomy)、翼狀胬肉(pterygium excision)、角膜 紋身、人工角膜插入術(例如，KPro或Dohlman-Doane)、與人工角膜插入術(OOKP，Oosteo-Odonto-Keratoprosthesis insertion)。

組合物可連同角膜膠原交聯使用。角膜交聯通常涉及使用暴露於UV-A光所激活的核黃素溶液。注意，交聯方法包括(但沒有侷限於)：去除上皮的角膜交聯(德累斯頓方法(Dresden Protocol)，或上皮脫落(epi-off))、跨上皮交聯(外延(epi-on))、與加速交聯。交聯程序通常是可用的，且使用CXL、C3R® CCL®和KXL®角膜交聯、等等進行銷售。組合物的投予可在交聯程序的前面、及/或其後面。建議，揭露的組合物可用來避免或抗拒交聯程序的有害作用，諸如基質混濁與細胞損失(以下將更詳細描述)。此外，使用揭露組合物的角膜再生可允許在先前不適宜此程序的受試者身上進行交聯，例如，具有角膜厚度小於400μm(微米)的受試者。此外，揭露的組合物可用來減緩或停止無法在其自身使用交聯來解決的逐漸角膜變薄現象。

本說明書描述的組合物可連同一或多個眼用試劑投予。在各種不同態樣，同時投予可藉由使用此試劑來同時或依序投予、或藉由使用此試劑形成共配製製劑達成。根據所要治療或預防的病症，在本說明書描述的組合物可使用一或多種試劑同時投予，包括(但沒有侷限於)：抗組胺劑、擬交感神經藥、β受體阻斷劑、擬副交感神經藥、抑副交感神經劑、前列腺素、營養物、血管收縮劑、潤滑劑、抗微生物劑、與麻醉劑。特別係包括各種抗炎劑，其包含非類固醇抗炎藥(NSAID)。組合物亦可使用眼睛潤滑液與人工淚液來同時投予。

麻醉藥的非限制性實例包括：苯佐卡因(benzocaine)、丁胍卡因(bupivacaine)、可卡因(cocaine)、依替卡因(etidocaine)、利多卡因(lidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、普莫卡因(pramoxine)、丙胺卡因(prilocalne)、氯普魯卡因(chloroprocaine)、普魯卡因(procaine)、丙美卡因(proparacaine)、羅 吡卡因(ropicaine)、與丁卡因(tetracaine)。抗炎劑的非限制性實例包括：阿斯匹林、乙醯氨酚(acetaminophen)、吲哚美辛(indomethacin)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、奧沙拉秦(olsalazine)、水楊酸鈉(sodium salicylate)、三水楊酸膽鹼鎂(choline magnesium trisalicylate)、雙水楊酯(salsalate)、二氟尼柳(diflunisal)、水楊醯水楊酸(salicylsalicylic acid)、舒林酸(sulindac)、依托度酸(etodolac)、托美丁(tolmetin)、雙氯芬酸(diclofenac)、酮咯酸(ketorolac)、伊布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、非諾洛芬(fenoprofen)、舒洛芬(suprofen)、奧沙普秦(oxaproxin)、甲滅酸(mefenamic acid)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、昔康類(oxicams)、吡羅昔康(piroxicam)、替諾昔康(tenoxicam)、苯基保泰松(pyrazolidinediones)、保泰松(phenylbutazone)、羥苯噻唑酮(oxyphenthatrazone)、非尼拉敏(pheniramine)、安他唑啉(antazoline)、萘丁美酮(nabumetone)、COX-2抑製劑(Celebrex®)、阿扎丙宗(apazone)、尼美舒利(nimesulide)、與齊留通(zileuton)。糖皮質激素(諸如，氫化可的松、潑尼松龍、氟米、與地塞米松亦可以當作抗炎劑使用。

示範性抗微生物劑包括(但沒有侷限於)：桿菌肽鋅(bacitracin zinc)、氯黴素(chloramphenicol)、金黴素(chlorotetracycline)、環丙沙星(ciprofloxacin)、紅黴素(erythromycin)、慶大霉素(gentamicin)、諾氟沙星(norfloxacin)、乙醯磺胺(sulfacetamide)、磺胺異噁唑(sulfisoxazole)、多黏菌素B(polymyxin B)、四環素(tetracycline)、妥布黴素(tobramycin)、碘苷(idoxuridine)、三氟胸苷(trifluridine)、阿糖腺苷(vidarabine)、阿昔洛韋(acyclovir)、膦甲酸(foscarnet)、更昔洛韋(ganciclovir)、納他黴素(natamycin)、兩性黴素B(amphotericin B)、克黴唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、氟康唑(fluconazole)、酮康唑(ketoconazole)、咪康唑(miconazole)、氟胞嘧啶(flucytosine)、克林黴素(clindamycin)、乙胺嘧啶 (pyrimethamine)、醛葉酸(folinic acid)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)和磺胺(trimethoprim-sulfamethoxazole)。示範性血管收縮劑包括(但沒有侷限於)：地匹福林(Propine®)、腎上腺素、苯福林(phenylephrine)、阿可樂定(apraclonidine)、可卡因、羥化苯丙胺(hydroxyamphetamine)、萘甲唑啉(naphazoline)、四氫唑啉(tetrahydrozoline)、呱吡三唑(Dapiprazole)、倍他洛爾(betaxolol)、卡替洛爾(carteolol)、左布諾洛爾(levobunolol)、美替洛爾(metipranolol)、和噻嗎洛爾(timolol)。營養素包括維生素、礦物質、與其他有益試劑，諸如維生素A、維生素B₁、維生素B₆、維生素B₁₂、維生素C(抗壞血酸)、維生素E、維生素K、和鋅。

在特定態樣，本說明書描述的組合物是破製成滴眼液，此滴眼液是連同其他滴眼液製劑使用。此其他滴眼液可包括(但沒有侷限於)：洗/潤眼滴液、乾眼治療、類固醇與抗生素滴眼液、青光眼滴眼液、過敏/消炎滴眼液、與結膜炎滴眼液。

組合物可連同隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環配合使用，以協助維持或重塑受試者的角膜。角膜插件當中包括是角膜鑲嵌與角膜覆蓋裝置。例如，隱形眼鏡、基質內角膜環、或其他插件/植入件可在使用組合物治療的前面、期間及/或後面供成型或保持角膜形狀。應注意，角膜「插件」通常是指插入角膜的臨時裝置，而角膜「植入件」通常是指一更永久裝置。不過，許多眾知的裝置在技術中是描述成植入件/插件可互換。因此，基於使用時機，如本說明書使用的術語「插件/植入件」不應視為嚴格限制。

隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環可連同用來治療眼睛的角膜缺陷、疾病、傷壞、傷害、及/或退化、以及屈光不正的揭露組合物一起使用。在各種態樣，隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環可充當組合物的載體或一組合物洗脫裝置。在其他態樣，隱 形眼鏡、基質內角膜環、或其他角膜插件/植入件可搭配適合投予眼睛的組合物(例如，滴眼液)使用，如本說明書詳細描述。在某些態樣，電腦軟體可用來決定隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環是否最適合於受試者及/或決定組合物的製劑。在特定態樣，使用隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環連同本說明書揭露組合物的治療是在眼科手術(例如，屈光或移植手術)的前面或後面使用。

治療可能需要評估受試者(例如，年齡、受試者的工作需求、眼睛缺陷或疾病、等等)；依處方使用成型隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環，以協助必要的角膜前表面球面變曲度半徑的變化；及處方使用搭配隱形眼鏡或植入件/插件之本說明書描述的組合物。受試者處方使用的隱形眼鏡或植入件/插件可施加機械力在角膜上，藉此誘發形狀變化，即是，角膜的屈光力。

在某些較佳態樣，可利用角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環連同揭露的組合物來維持或塑形角膜。市售裝置的實例包括INTACS®和KeraRing基質內角膜環。在另一態樣，成塑隱形眼鏡可連同揭露的組合物配合使用。隱形眼鏡可為硬式或剛式、或可為軟式眼鏡。或者，隱形眼鏡可包括硬式與軟式眼鏡兩者。如果使用軟式隱形眼鏡，角膜可誘發更正或負的球面變曲度，且因為他或她都能調適於隱形眼鏡使得可減少受試者眼睛的不適度。如果使用硬式隱形眼鏡，多個機械壓力可能會施加在角膜。隱形眼鏡可為透氣式。成型隱形眼鏡可從商業來源獲得。市售眼鏡的實例包括至少DreamLite、OK Lens、EyeDream、MiracLens、DreamLens、MiracLens、DreamLens、i-GO OVC、GOV、Wake & See、CRT、Fargo/iSee、Emerald和Wave Contact Lens System眼鏡。

一旦隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環放置在受試者眼睛的上面/其內，本說明書描述的組合物(例如，滴眼液)可投予眼 睛。在某些情況，在置入隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環前，可能想要預先投予組合物。最好是，隱形眼鏡、基質內角膜環、或其他插件/植入件與組合物可結合使用以產生形狀變化，藉此角膜的屈光力發生變化。組合物可時常投予，以使角膜採用想要形狀變化。在某些態樣，至少每24、12、或8小時投予組合物。在其他態樣，每6小時投予組合物。在某些其他態樣，約每3小時投予組合物。在仍然其他態樣，約每2小時投予組合物。在其他態樣，每一小時投予組合物。

在沒有想要受到任何特定理論束縛的情況，結合使用本說明書描述的隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環與組合物可誘發角膜的分子結構變化，且可誘發在角膜基質中發現的細胞與蛋白質變化，諸如膠原質(例如，第II型膠原質)。藉此使角膜表面更均勻。藉由減少角膜表面的不規律性，可改善所有圖像(即是，視力)的品質與清晰度。

對於成型隱形眼鏡的計算，採取最小角膜曲率。熟諳此技者亦可使用較陡峭角膜曲率或兩者的平均，且基於角膜球面變曲度，進行角膜前表面最小角或陡峭球面變曲度半徑的必要計算，藉此矯正眼睛的屈光缺陷。成型隱形眼鏡的基弧可基於每個眼睛的屈光力變化來計算。在特定態樣，成型隱形眼鏡的基弧可從1至4個較小角或較陡峭屈光度來開始計算，甚至最好是，1至3個較小角或較陡峭屈光度，甚至更好是1至2個較小角或較陡峭屈光度，此取決於需要的屈光不正。周邊基弧取決於成型隱形眼鏡的調適性，且其半徑計算到較大於中心區域的半徑0.5mm(毫米)，不過可隨著設計而變化。

根據本發明使用的成型隱形眼鏡的直徑可為8.0mm(毫米)至18.0mm(毫米)。市售眼鏡能有此直徑。在某些態樣，成型隱形眼鏡可為8.0mm(毫米)至12.0mm(毫米)直徑範圍的硬式隱形眼鏡。在其他態樣，成型隱形眼鏡可為13.0mm(毫米)至15.0mm(毫米)直徑範圍的軟式隱形眼鏡。 軟式隱形眼鏡可涵蓋整個角膜且擴及不同鞏膜。在仍然其他態樣，成型隱形眼鏡可包含硬性與軟性材料。隱形眼鏡的中心可為硬性，大小約12mm(毫米)、13.0mm(毫米)、14.0mm(毫米)、或15.0mm(毫米)，然後在周邊為軟性，大小約16.0mm(毫米)、17.0mm(毫米)和18.0mm(毫米)。夜間使用較大隱形眼鏡(最好是軟性隱形眼鏡)，當作成塑隱形眼鏡使用。

可決定成型隱形眼鏡的屈光力是否最接近受試者需能夠舒適看見的可能屈光力。在使用成型隱形眼鏡的調適過程中，如果視覺不適合於受試者的需要，當受試者接受治療時，受試者使用處方眼鏡。當角膜重塑或已重塑時，可重複各種視光測量，以確定治療是否按照計劃進行且適當。此測量可包括近視和遠視的視力評估、矯正型、角膜散光測量法、客觀和主觀視網膜檢影法、成型隱形眼鏡適應圖表、成型隱形眼鏡的移動、與成型隱形眼鏡的舒適度。

進行測量後，基於這些測量來改變治療計劃。隨著每個評估，可決定是否繼續使用相同成型隱形眼鏡或是否應使用新的隱形眼鏡。此外，同樣決定要與成型隱形眼鏡使用的組合物。改變成型隱形眼鏡及/或組合物可數個星期誘發想要的角膜整形。在某些態樣，開始治療後的前8週期間進行每週定期性修正。

如本說明書描述的組合物可誘發角膜的膠原成份變化(例如，第II型膠原質)。角膜的解剖學、組織學與生理學的其他態樣亦可能受到組合物的影響。在某些態樣，組合物可為高滲性或低滲性，以誘發角膜水合變化。在其他態樣，組合物可用來改變角膜的分子結構(例如，細胞外基質)，如此，可擴增或修復角膜、或重塑角膜到想要的球面變曲度。

當角膜重塑時，可能想要同時投予一或多種酶以軟化角膜。示範性酶包括(但沒有侷限於)透明質酸酶、軟骨素酶ABC、軟骨素酶AC、角質素酶與基質溶素，其顯現能與角膜的各種蛋白多醣成份發生作用。同時 還包括酵素膠原蛋白酶、基質金屬蛋白酶-1(間質膠原酶)、與基質金屬蛋白酶-2(明膠酶)。在組合物連同任何此類酶同時投予的情況，可能想要包括組合物中的媒介物，諸如聚合物(例如，甲基纖維素、聚乙烯醇、纖維素、等等)，以提高這種酶的作用。其他試劑可包括激活金屬蛋白酶，例如，白介素-1α、腫瘤壞死因子α/ß及其任何子類型、單鈉尿酸單水合物、4-氨基乙酸苯汞、人體血清澱粉樣蛋白A、人體B₂微球蛋白、與氯化銅。還包括可為尿素(Carbamide/Urea)。還可使用這些試劑的任何組合。

組合物亦可連同降解角膜中發現的其他糖類或蛋白質的一或多種酶同時投予。組合物可連同用來降低成型隱形眼鏡或角膜的任何角膜插件/植入件的刺激性的一或多種麻醉劑同時投予。組合物可連同治療期間用來改善受試者舒適性的一或多種潤滑劑同時投予。在其他態樣，組合物可連同一或多種抗微生物劑(諸如抗細菌、抗病毒及/或抗真菌劑)同時投予。組合物亦可連同一或多種血管收縮劑同時投予。熟諳此技者可基於要治療的病症來決定同時投予受試者的適當試劑。

在某些態樣，組合物可使用試劑盒來提供。試劑盒可包括下列一或多者：成型隱形眼鏡、潤滑滴眼液、隱形眼鏡的清洗液或其他溶液、隱形眼鏡攜帶盒、一對額外隱形眼鏡、與佩戴隱形眼鏡及使用該組合物的使用說明。隨試劑盒提供的組合物可配製成包括重要成份(TGFß3多肽(或變體或其片段)以及地塞米松(或其衍生物或相關類固醇劑))的組合；或者，試劑盒可包括投予前混合一起的單獨製劑、或同時投予(即是，同時或依順投予)的組成部分。

實例

本說明書描述的實例是說明本發明的特定具體實施例與態樣，且沒有要以任何方式來限制本發明。熟諳此技者可無需過度實驗，可利用本 說明書的揭露與教示來產生其他具體實施例、態樣與變化。所有此具體實施例、態樣與變化認為是在本發明的範疇內。

實例1：實驗概述

在先前實驗，發明人已表示，可將角膜細胞向下分成神經元譜系。本說明書描述的實驗已針對調查角膜細胞轉變成分泌軟骨特異性第Ⅱ型膠原質的類似軟骨細胞之可能性。這類型軟骨認為是在發展過程顯現(1990年，林森邁耶等人)。進一步目的是要決定第二型膠原質沉積是否可在活大鼠角膜體內誘發，及這種治療是否會明確影響角膜的光學特性。進一步目的是要決定圓錐角膜組織的角膜細胞是否能夠接受細胞重新編程與後續生成含豐富ECM的第II型膠原質的這種方法。最後，實驗的目的是要使用奈米壓痕試驗(允許硬度與彈性模數分析的生物工程方法)來評估第II型膠原質沉積對體內與體外治療角膜的生物力學特性的影響。

實例2：組織取樣

人體組織

屍體整個人眼角膜、移植手術時取得的圓錐角膜、人體角膜緣與外科醫生切除的DSEK囊膜(來自戴氏(Descemet)剝除角膜內皮細胞移植術(DSEK，Descemet's stripping endothelial keratoplasty)的過多基質組織)是透過紐西蘭國家眼科銀行(紐西蘭源供體獲得)出處的捐贈獲得。在從輪部鞏膜留置2mm(毫米)角膜緣的角膜移植手術移除角膜扣狀物後，從而收集人角膜緣。使用組織前，從北X區人類倫理委員會可取得研究倫理批准與同意。使用前，所有組織儲藏在紐西蘭眼庫培養基(在Eagles MEM培養液添加2% FCS、2mM L-谷氨酰胺、1× Anti-Anti)，並在紐西蘭眼庫傳送培養基(眼庫培養基補充5%右旋糖酐)中傳送。

動物組織

倫理委員會批准的動物實驗研究是從奧克蘭大學動物倫理委員會(申請案第R856號)獲得。在利用二氧化碳室安樂死後，可從6-8週齡成年雄性Wistar大鼠獲得眼睛與軟骨。整個眼睛是從動物取出，且在解剖顯微鏡的幫助下，使用手術剪小心解剖角膜。胸骨劍突(Xiphoid process)(其是在末端包含薄、寬軟骨板的部分胸骨)是利用解剖刀進行解剖。動物組織是使用聚維酮碘(PVP-I)與硫代硫酸鈉洗濯。使用刀片刮掉涵蓋軟骨的過度脂肪與組織。使用前，新採集的眼睛與軟骨是短暫儲藏在磷酸鹽緩衝鹽溶液。

實例3：組織學分析

組織製備與冰凍切割

角膜與軟骨片(2mm(毫米)×2mm(毫米))是在液氮冷凍前，嵌入最佳切割溫度化合物(荷蘭櫻花市，OCT，Tissue-Tek)。10-15μm(微米)厚切片是使用Micron HM550 Cryostat(美國，Thermo-Scientific公司)進行切割，並安置在Superfrost^TM Plus靜電切片(德國，Menzel-Glenser公司)。在進一步使用前，冷凍切片儲藏在-20℃。

細胞與組織培養

來自人體與大鼠角膜的組織消化與細胞製劑

角膜緣是經過解剖以從第II級層流氣罩的鞏膜來隔離基質。此後，角膜上皮與內皮使用角膜刀輕輕刮掉並丟棄。DSEK罩亦使用角膜刀輕輕刮除上皮。殘留的基質組織然後在37℃使用迴旋式振盪器輕輕混合在0.4%第II型膠原酶(Sigma-Aldrich公司)、漢克(Hanks)平衡鹽溶液(GIBCO®，Life Technologies公司)進行吸收。不同吸收時間是要5小時，此為最佳組織消化與細胞存活率的所需時間。

在組織消化完成後，細胞然後藉由1200rpm高速離心處理七分鐘沉澱。細胞然後在最小適當細胞培養基量中重新懸浮，並使用Leica DM IL桌上型倒置顯微鏡與紐鮑爾(Neubauer)計數板(Neubauer hemocytometer)來 計數。添加到台盼藍溶液(PBS的0.04%台盼藍(Trypan Blue)儲備溶液)的1：1比細胞懸浮液是在最少每個取樣三個計數且採用平均值來使用。

角膜細胞的細胞培養

所有細胞操作是在使用無菌技術的第II級層流氣罩中進行。隔離的角膜細胞是在2-3ml(毫升)細胞培養基，在塑料或玻璃蓋玻片上面的12或24微孔簇盤(Falcon公司)中培養。細胞在37℃具5% CO₂保持在濕式培養箱。如果需要，24小時後改變培養基，然後隨後每兩天或更頻繁來改變。每日使用Leica DM IL桌上型倒置顯微鏡來觀察培養基。對於細胞沉澱培養，組織後的新取得細胞可藉由在塑料錐形管以300g(公克)在20℃進行7分鐘高速離心處理進行沉澱。適當的培養基添加到試管。在37℃培養24小時後，細胞會收縮且形成不會黏附到試管壁的顆粒。這些顆粒持續三週在37℃含5% CO₂潮濕大氣的2ml(毫升)培養基中培養。培養基是每隔一天更換。

器官切片培養

人體與大鼠角膜和軟骨組織是在前後平面使用刀片進行薄切片(1-2mm(毫米))，且切片是安置在器官氣-液相培養系統(圖2)。簡單的說，健康組織的外植體是在培養基與富含CO₂環境間界面的0.4μm(微米)孔徑細胞培養薄膜(法國，Millicell公司)進行培養。角膜切面是上皮側朝上安置在3ml(毫升)培養基的細胞培養盤薄膜。培養基是每隔一天更換。

實例3：體外重新編程

培養基

如下面所述來使用數種定制培養基。

角膜細胞的軟骨源性重新編程

組織切片是在變化的時間間隔在軟骨源性分化培養基中培養，以決定生長因子處理所需的最佳時間。取樣是在每個時間點收集(參見表2)。為了獲得細胞單層，角質細胞是每平方厘米(cm²)為15×10⁴的密度接種在玻璃蓋玻片上。允許細胞附著在蓋玻片24小時，且培養基是每隔一天更換。培養維持長達3週時間。

實例4：體內重新編程

生長因子傳遞的凝膠滴眼液製劑

滴眼液是使用結蘭膠配製成，其是由細菌(伊樂假單胞菌(Pseudomonas elodea))生成的水溶性多醣。利用凝膠基質製劑允許延長角膜滯留時間與增加治療劑的眼部生物利用度。因為聚合結蘭膠是在單價與 雙價陽離子(諸如，Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺、和Na⁺)狀態經歷原位成膠(2010年，貝克利韋爾與帕瓦爾先生)的陰離子型聚合物。當聚合物滴注眼睛時，出現在淚液的電解質會引起聚合物的凝膠化，這然後會導致較長滯留時間，並增加藥物的生物利用度(2005年，路德維希先生)。根據先前製劑研究，聚合物製劑在體內使用是無刺激性且安全性(2011年，魯彭索爾、格林、及艾拉尼先生)。

透過先加熱蒸餾水至80℃，隨後在不斷攪拌下添加結蘭膠(美國，Kelcogel^TM公司)來備製0.5%溶液。一旦粉末完全溶解後，將溶液冷卻並儲藏在4℃。適當的生長因子量在不斷攪拌下添加到流體凝膠。十倍高於使用在培養基的生長因子濃度是用來透過鼻淚引流與眨眼動作來彌補藥損。滴眼液凝膠包含100ng/ml(奈克/毫升)TGFß3與約4μg/ml(微克/毫升)地塞米松的最終濃度。

神經細胞與軟骨細胞因子治療

動物會受到為人為約束且約15μL(微升)滴眼液會滴入右眼(圖3)。異側眼睛是當作對照試驗眼睛使用。神經特化要持續5天每日3次投予滴眼液；軟骨細胞特化要長達8週投予。

實例5：免疫組織化學(IHC，Immunohistochemical)分析

組織採集與治療

治療結束後，使用二氧化碳室將動物安樂死。可採集眼睛及在磷酸緩衝生理食鹽水洗滌。然後小心解剖角膜並在4%低聚甲醛(PFA)固定1小時，同時使用蔗糖溶液來處理，以在冷凍及切片前，冷凍保護組織。作為冷凍保護的蔗糖是脫水劑，其可防止在冰凍組織切片形成冰晶假象。在緩慢冷凍組織的情況，冷凍保護就顯得特別重要。

簡單的說，角膜在4℃沉浸在20%蔗糖溶液5小時，然後轉移到30%蔗糖溶液，並保持在4℃持續到組織沉澱(通常過夜)。角膜然後包埋在 OCT化合物並浸入液氮中以實現快速冷凍。進一步使用前，冷凍組織塊是儲藏在-80℃。約10-15μm(微米)厚度冰凍切片是安置在Superfrost^TM Plus切片，且在使用前，切片儲藏在-80℃。在細胞培養的情況，在蓋玻片上培養的細胞是使用PBS洗滌，並在4% PFA液中固定15分鐘。進一步使用前，蓋玻片沉浸在PBS。

免疫組織化學

針對組織冷凍切片，進行免疫組織化學前，將切片保持在室溫下15-20分鐘。使用PBS洗掉OCT且使用蠟筆來劃定組織周圍的區域。將組織切片先使用10%正常山羊血清的阻斷液培養1小時，然後在4℃使用一級抗體的適當稀釋劑進行過夜培養。切片然後先在PBS洗滌三次，接著使用二級抗體的適當稀釋劑進行培養。二級抗體會在室溫下維持2小時。切片是使用核蛋白標誌4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)來複染，並染上Citifluor抗螢光衰減劑(澳大利亞，ProSciTech公司)。Olympus FluoView^TMFV-1000共聚焦雷射掃描顯微鏡(405nm(奈米)、473nm(奈米)和559nm(奈米)波長雷射)與Leica DMRA熒光顯微鏡用於成像。

實例6：基因表現分析

RNA分離與cDNA合成

使用PureLink® RNA MicroKit(Invitrogen公司)進行取樣的mRNA萃取。簡單的說，組織取樣是與0.75ml(毫升)TRIzol®和Carrier RNA混合，並使用手持式均質儀(PRO Scientific,Inc.公司)予以勻質化。取樣然後使用0.2ml(毫升)氯仿來培養，然後在4℃進行15分鐘的12000rpm離心處理。上相會被分離並與乙醇混合，然後轉移到收集圓柱試管。

RNA是藉由12000rpm離心處理1分鐘收集在圓柱試管。透流試管會被丟棄且萃取的RNA使用脫氧核糖核酸酶(DNAse)處理。使用提供的緩和劑洗滌圓柱試管數次，且RNA最後散佈在不含核糖核酸酶(RNAse)的水。使用NanoDrop®(Thermo Scientific公司)進行濃度測定，且mRNA儲藏在-80℃。

SuperScript® VILO^TM cDNA合成試劑盒(Invitrogen^TM，Life Technologies公司)用來備製cDNA。簡單的說，100ng(奈克)RNA是與VILO^TM反應混合液、SuperScript®酶混合物、和不含RNAse的水在25℃下培養10分鐘。取樣然後在42℃培養120分鐘，隨後在85℃培養5分鐘。將cDNA儲藏在-20℃。

利用TaqMan®基因表現分析的定量PCR

針對性基因的TaqMan®基因表現分析可取得。在PCR步驟，10μL(微升)TaqMan® Universal Master Mix II混合1μL(微升)試料，約25ng(奈克)cDNA和9μL(微升)水構成20μL(微升)體積。將試管渦旋及短暫離心以降轉成份。每個cDNA取樣都做三次備製並使用移液管將其移到384微孔板。每個20μL(微升)反應混合物載入MicroAmp® Optical 384微孔反應板(美商應用生命系統股份有限公司(Applied Biosystems))的每個微孔。然後使用MicroAmp®光學膠膜(Applied Biosystems公司)來覆蓋微孔板，且使微孔板短暫離心以消除氣泡。微孔板轉移到7900HT快速即時PCR系統(Fast Real-Time PCR System)，並使用以下熱循環參數來運行，50℃下 2分鐘、95℃下10分鐘、接著95℃下40個週期進行15秒、及60℃進行1分鐘。如前述進行結果分析。

實例7：原位間質ECM蛋白沉積後的角膜生物力學與光學性能試驗

大鼠眼睛的前段(正面結構)檢測

角膜生理特性已顯現有關診斷及治療各種角膜疾病且提供洞察角膜及有關角膜生理功能的結構。經治療導致ECM蛋白沉積的角膜亦需要針對角膜渾濁進行試驗，因為降低透明性不是想要的。

Phoenix Micron IV小動物視網膜成像系統(鳳凰城市研究實驗室(Phoenix Research Labs))用來檢測接受治療大鼠的角膜。先使用腹腔注射氯胺酮和Domitor®(3：2)施予大鼠鎮定劑。Micron IV成像系統的裂隙灯裝置可用來詳細檢測角膜層及檢查角膜完整性與透明度。視網膜成像亦用來檢查角膜透明度。成像後，然後將大鼠投予Antisedan®(阿替美唑)以減弱鎮定劑。

體外與體內治療角膜的奈米壓痕測量

奈米壓痕是透過施加垂直於想要取樣平面的超小力進行想要材料的機械測量、與結果取樣壓痕測量(2013年，迪拉兹與辛巴斯先生)。奈米壓痕最近成為測量組織與其他生物材料中奈米與微尺度力學性能的強大工具(2006年，艾本斯坦與普魯特先生)。原位掃描探針顯微鏡(SPM，Scanning Probe Microscopy)成像的最新進展(其中奈米壓痕機探針同時當作結合奈米壓痕的3D成像裝置使用)已促成新材料研究的新風潮(2009年，迪金森與舒曼先生)。力、位移、與時間會被同時記錄，而奈米壓痕探針會在受控負載下推入角膜組織。奈米壓痕期間施加的力可為小到數奈米牛頓或大到數個牛頓，允許大規模範圍研究。奈米壓痕試驗是負載位移曲線的輸出，其可利用明確定義的方程計算有關角膜的剛性、完整性、與彈性的機械特性分析。

人體圓錐角膜是投入對照試驗培養基、或含有誘發重新編程因子的特異性ECM蛋白的培養基中進行組織切片培養。治療結束後然後進行奈米壓痕測量。對於體內研究，動物會被手動限制，且含有重新編程因子的約15μL(微升)凝膠滴眼液製劑滴入每隻Wistar大鼠的右眼。異側眼睛是當作對照試驗眼睛使用。長達七週每日三次投予滴眼液。隔離眼睛治療時間的第1週、第3週、第7週後記錄奈米壓痕測量。

奈米壓痕試驗是在奧克蘭大學化學與材料工程實驗室進行。為了試驗在當前位置的角膜，需要用於奈米壓痕的模具。先前研究已使用聚苯乙烯與萬用黏性物將角膜保持定位。受負載變形的模具作用是潛在性誤差來源，使得決定使用硬模具來試驗。用來建立模具的第一材料是習知的橡皮泥(Play dough)。這可形成人體角膜取樣的準確形狀與球面變曲度(圖6(A))。進行試驗前，先讓橡皮泥保持兩天使其硬化。因為使用整個眼睛球體，使得鼠眼的試驗略不同。為了使整個眼睛球體保持定位，使用能夠以 樹脂填充與具有小凹部以保持眼睛球體的培養盤(圖6(B))。PBS可用來使取樣保持乾燥。

因為取樣是非常柔軟生物取樣，使得球錐流體探針用於所有奈米壓痕試驗。用於人體取樣的壓陷負載為50μN(微牛頓)。針對鼠球體部位，使用介於3和5μN(微牛頓)間負載範圍。啟動纖維光學照明，且取樣直接安置在來自顯微鏡的光流下。角膜的中心部分盡可能準確直接安置在光物下(圖6(C))。先利用調整Z滑件將取樣聚焦，然後利用良好的解析度來觀察角膜的表面。若要確保焦點是在角膜取樣的中央最高點，在x和y方向移動視域來觀察焦點是如何變化。

一旦數據收集點著重在角膜的中心，將可定義取樣邊界，且進行快速方法。壓縮前，必須正確設定負載功能。實際壓縮過程是利用HysitronTriboindenter®儀器進行自動操作(圖6(D))。預先定義的負載是安置在壓痕機探針，壓痕機探針會穿透取樣持續到定義的限制。然後在探針從取樣卸載前，探針會保持10秒鐘。取樣的硬度是在探針卸載後，由殘餘壓痕(Ar)的面積來決定。

其中P_max是最大壓痕負載，且面積是球錐探針與取樣的接觸面積。減小的彈性模數表示取樣與壓痕機探針兩者的彈性模數，如下列方程式所示：

其中i表示壓痕機，m表示取樣材料。減少的彈性模數告訴我們取樣的彈性為何。因為相同壓痕機探針用於每個試驗，使得減小的彈性模數可用來比較每個試驗取樣的彈性。

實例8：使用外源性TGFß3和地塞米松治療後，成年人體角膜基質生成軟骨特異性第Ⅱ型膠原質

已知道，一生長因子可用作為具有類似或不同效果的數種類型細胞，同時一個以上的生長因子可共用類似的生物功能。當選擇在角膜基質中可能帶來膠原沉積的生長因子、細胞因子、與化學物質時，考慮某些外在因子的已知影響是很重要的。這項本實驗中，可使用TGFß3和地塞米松的組合治療。

TGFß3和地塞米松效果的最顯著已經由其在幹細胞/祖細胞作用的研究獲得(2000年，舒爾迪那、雅奴卡、伊特斯科維茨-艾爾多、麥爾登、和班菲尼斯特先生；2000年，沃斯特、尼克松、布勞爾-托蘭、和威廉姆斯)TGFß和地塞米松的組合先前已用來誘發幹細胞分化為體內軟骨(2009年，迪可曼、羅蘭、列儂、卡普蘭、與圭拉克先生；1998年，約翰斯通先生等人；2007年，科蘭柏咯、佩斯特、索克、阿塔拉、與古爾脫伯格先生；2003年，温特先生等人)。此外，地塞米松、合成的類固醇藥劑已用來治療發炎性眼部疾病。因此，TGFß3和地塞米松的組合使用在軟骨細胞分化培養基以使角膜細胞分化成軟骨細胞表現型。

這項本實驗，第I型和第II型膠原質的表現要特別注意。已知道，形成高晶態纖維的諸如第I和II型自組和交聯的纖維類型膠原質顯現非常高剛度、低延伸與明顯彈性能量儲存能力(2003年，韋爾斯先生)。其為有助促成纖維鋼性與張力強度的交聯作用。

角膜基質的細胞外基質(ECM，Extracellular Matrix)主要是由第I和V型膠原質構成的密封異型膠原質組成。類似角膜纖維，軟骨原纖維是 異型(由第II和XI型構成)，具有25nm(奈米)均勻直徑(略小於角膜纖維)(1989年，門德勒、艾希-本德爾、沃恩、溫特、與布魯克納先生)。第II型膠原質是軟骨的主要纖維成分，且類似第I型膠原值，在於該分子本質是由300nm(奈米)長度的單非斷裂螺旋結構域組成。由於其類似，使得在其他組織中，第II和XI型膠原質認為是類似第I和V型膠原質(角膜基質膠原)的軟骨組織。

這項本實驗，來自成年角膜的角膜細胞是接種在含有TGFß3和地塞米松的軟骨細胞分化培養基、或標準纖維細胞增殖培養基。在2-3天內，在軟骨細胞分化培養基接種的角膜細胞形成約50-100μm(微米)直徑的細胞聚合體/球體(圖7(A))。球體在中央部位、與周邊周圍的巢蛋白是標記軟骨細胞特異性第Ⅱ型膠原質(圖7(B))。此外，一旦球體安置在來自球體的纖維細胞增殖培養基細胞(圖7(C))，開始向外擴展植入培養盤，藉此形成細胞單層。細胞曾聚合的區域是標記第II型膠原質，然而單層的細胞沒有標記(圖7(D))。

在纖維細胞增殖培養基接種的角膜細胞會形成均勻單層類纖維細胞(圖8(A))，其沒有標記巢蛋白或第II型膠原質(圖8(B))。當培養基改變為軟骨細胞分化培養基，培養外觀沒有變化，且細胞保持陰性第II型膠原。這些結果表明，細胞聚合對於類似軟骨ECM生成顯現重要性。角膜細胞接種到纖維細胞增殖培養基無法形成必要的細胞聚合。因此，為了形成纖維細胞團，融合成纖維細胞會從培養盤分離、沉澱、與生長，因為在軟骨細胞分化培養基再經三週的沉墊培養(Pellet culture)。沉澱細胞在角膜基質特異性ECM蛋白聚糖是標記陽性，但不是軟骨特異性ECM第II型膠原質(圖8(F)和(G))。

實例9：當使用TGFß3和地塞米松來治療時，成人角膜與成年鼠角膜的角膜細胞會分泌含有ECM的第Ⅱ型膠原質

成年人角膜的切片安置在對照培養基或軟骨細胞分化培養基的器官切片培養兩週。組織切片然後標記軟骨特異性ECM蛋白第II型膠原質與原生第I型角膜膠原。陽性標記只能夠在TGFß3和地塞米松經治療角膜看見(圖9(C)和圖10(B))。發現，兩星期的治療期間會導致治療角膜的基質ECM內沉積第II型膠原質(圖9(C))。一星期治療不會在基質ECM導致任何可見第II型膠原質沉積(圖9(B))。

原生第I型膠原質的含量與模型在經治療角膜會略微變化。通常，標記的強度是類似，不過分佈更加廣泛且標記數量在未治療角膜會較高(圖9(D))。此外，新生成的第II型膠原質是均勻且順序覆蓋在ECM，而不會形成任何大質量或聚合體。沿著角膜基質的預存膠原結構可清楚看見標記且分佈在基質層的整個厚度。

人體體內角膜組織實驗然後推廣到大鼠體內研究，其中雄性Wistar大鼠的右眼角膜使用TGFß3和地塞米松的15μl(微升)結冷膠(Gellan gum)滴眼液，接受每日三次投予連續兩週治療。兩週後，將大鼠安樂死並處理免疫組織化學角膜。只有經治療的角膜是標記陽性第Ⅱ型膠原質，其具有在角膜前部觀察到的較高沉積程度(圖10(D)和(E))。因此，只有在軟骨細胞分化培養基中培養的角膜切面是陽性第II型膠原質。此外，第II型膠原質是沿著預存基質膠原結構覆蓋在均勻層。

實例10：在圓錐角膜誘發第II型膠原質沉積

發明者然後觀察確認在其研究所觀察體內重新編程可用來治療圓錐角膜。實驗進行以確認在圓錐角膜的角膜細胞是適合於誘發第二型膠原質沉積。角膜移植手術後，一旦取得圓錐角膜扣狀體(Keratoconic corneal button)便安置培養。每個扣狀體的半部是安置在對照培養基，另一半部安置在軟骨細胞分化培養基並保持2週。2週後，組織會免疫組織化學或mRNA萃取代謝處理。只有半數經治療角膜的基質ECM是陽性第II型膠 原質(圖11(B))。相較於正常角膜組織，雖然標記強度在圓錐角膜組織是較低，不過標記圖案是類似，且依循沿著預存膠原層骨幹順序配置。

波形蛋白標記在未治療與治療圓錐角膜的角膜細胞間顯示顯著差異。通常，角膜細胞密度在角膜後部的含不足細胞的未治療角膜為較低(圖11(C))。此外，相較於在未治療角膜的角膜細胞，在經治療角膜的角膜細胞出現更多絲狀且形態完整(圖11(E)和(F))。相較於在未治療角膜的角膜細胞，經治療角膜的角膜細胞為較長且具有強烈標記波形蛋白的大量細胞代謝過程。

實例11：TGFß3和地塞米松治療沒有誘發纖維化蛋白的沉積或引起角膜混濁

在長達三週軟骨細胞分化培養基中培養的人體角膜是標記第III型膠原質和αSMA，其係與纖維化與瘢痕有關聯(2003年，加比亞尼先生；2012年，咔辣姆久先生等人)。沒有任何纖維化基質沉積的證據，另一方面在對照組織有較高程度αSMA標記(圖12)。這些結果證實先前的發現，不像TGFß1和TGFß2，TGFß3不會在肌纖維細胞誘發角膜基質分化。

裂隙燈檢查在整個研究期間是在活大鼠進行。經檢測後，治療與未治療角膜是沒有瘢痕或混濁跡象的區分。揭示血管的眼睛成像背部顯示沒有阻礙光線通過的清晰角膜(圖13(A)和(B))，且使用Micron IV眼鏡的大鼠角膜體內橫截面成像顯示光容易通過的透明角膜(圖13(C)和(D))。沒有會導致光通過角膜障礙的任何角膜混濁或透明度降低的跡象。

實例12：體內治療的第II型和第I型膠原質的mRNA表現變化

1週、7週、3週的體內治療然後4週非治療期的大鼠角膜進行定量基因表現分析。此目的是要確定第II型膠原質表現在生長因子治療停藥後是否再次減少及/或永久停止。同時研究第II原生角膜膠原質的療效。

相較於7週治療的角膜，1週治療的角膜表現非常高第II型膠原質位準。如圖35的第一圖所示，在停藥治療時，大幅降低表現位準。對於第I型膠原質表現，1週和7週經治療角膜是個別相較於其未治療的角膜。發現到，1週治療後的第I型膠原表現存在始發脈衝，但在第7週的第I型膠原質表現明顯較低，且相較於其在未治療角膜的表現(圖14(B))。

實例13：體內與體外治療角膜的生物力學特性變化

假設，鋪設第II型膠原質會影響角膜的剛度與彈性。為了評估這些變化，大鼠體內角膜與體外治療人體角膜及其匹配對照組進行奈米壓痕試驗。

相較於未治療的對照組，1週體內治療大鼠角膜沒有明顯增加硬度或彈性(圖15)。在3週體內經治療角膜，治療與對照組眼間具有明顯區別。各角膜經試驗多達八次，且取得的結果負載變形圖顯示有良好的再現性(圖16)。在暴露於生長因子治療的右眼，硬度與降低彈性模數兩者明顯較高。在對照培養基或6週軟骨細胞分化培養基中體外培養的一對匹配球形角膜亦進行同樣的生物力學試驗。再者，試驗顯示明顯增加經治療角膜的硬度與彈性模數(圖17)。

實例14：生長因子與類固醇的比較組合

羊角膜的體外研究是要調查在角膜細胞的軟骨細胞分化中其他生長因子類固醇組合的療效。

新鮮羊眼是從奧克蘭肉類加工(Auckland Meat Processors)公司獲得。角膜立即切下並使用聚維酮碘(PVP-I)和硫代硫酸鈉溶液洗滌。然後，使用環鋸切割羊角膜組織的8mm(微米)瓣。一羊角膜瓣安置在每個培養條件連續3週(表5的描述)。角膜瓣然後安置在器官氣-液相細胞培養系統。

簡單的說，健康組織的外植體是在培養基與富含CO₂環境間界面於0.4μm(微米)孔徑細胞培養插件(法國，Millicell公司)中培養。角膜切面 是上皮面向上安置在具有3ml(毫升)培養基的細胞培養盤插件上面。培養基是每隔一天更換。使用的培養基是DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)基礎培養基，其補充1%抗生物質-抗真菌劑(Anti-Anti，Antibiotic-antimycotic solution)和1% Glutamax^TM(GIBCO®)。3週結束後，每個角膜瓣固定在4%多聚甲醛(PFA)1小時，並使用蔗糖溶液治療以在冷凍切片前先冷凍保護組織。

簡單的說，角膜在4℃沉浸在20%蔗糖溶液5小時，然後轉移到30%蔗糖溶液，並保持在4℃持續到組織下沉(通常過夜)。角膜然後包埋在最佳切削溫度(OCT，Optimal Cutting Temperature)化合物並浸入液氮以實現快速冷凍。進一步使用前，先將組織冷凍塊保存在-80℃。約4-640μm(微米)厚冷凍切片安裝在Superfrost^TM Plus載玻片，且在需要前，先將載玻片儲藏在-80℃。角膜切面然後標記為第II型膠原質。

對於免疫組織化學，切片保持在室溫下15-20分鐘。OCT使用PBS洗掉且組織周圍區域已使用蠟筆劃定。將組織切片先使用10%正常羊血清的阻斷液培養1小時，然後在4℃使用大鼠抗第Ⅱ型膠原質抗體(Millipore/MAB8887)進行隔夜培養(Overnight incubation)。然後先將切片在PBS洗滌三次，再使用羊抗鼠Alexa Fluor®488二級抗體(Molecular Probes®/A-11001)的適當稀釋液進行培養。二級抗體在室溫下留置2小時。切片是使用核蛋白標誌4'，6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進行複染，並安裝在Citifluor抗螢光衰減劑(澳大利亞，ProSciTech公司)。Olympus FluoView^TM FV-1000共聚焦雷射顯微鏡(405nm(奈米)、473nm(奈米)和559nm(奈米)波長雷射)與Leica DMRA熒光顯微鏡是用來可視化標記。

表5描述來自這項研究的結果。圖20顯示在各情況的角膜部分標記第II型膠原質的代表性圖像。

結果證實，TGFß3和地塞米松的組合是唯一的試驗組合，其是從靶細胞引起想要的反應(圖20的長方形照片G-H)。其他生長因子類固醇組合無法在角膜細胞中產生第II型膠原質的想要變化(圖20的長方形照片A-F)。研究結果亦證實羊角膜的角膜細胞重新編程(圖20的長方形照片G-H)。

先前研究已顯示，其他生長因子與其他類固醇化合物不適於角膜治療與修復。TGFß1和TGFß2兩者會生成纖維化瘢痕(2006年，卡林頓、埃爾本先生等人；2005年，戴斯麥利爾、查蓬利爾先生等人；2002年，杰斯特、黃先生等人；2001年，柯玟先生等人；1995年，沙赫先生等人)。EGF消極調節軟骨(2000年，尹先生)。雌激素亦消極調節軟骨(1985年，加藤和戈斯波羅維茲先生)。氫化可的松(Hydrocortisone)已證明促進脂肪形成，而不是軟骨細胞分化(2015年，古奈姆先生等人；2004年，李、郭先生等人)。這些早期研究顯示，在TGFß3和地塞米松的目前發現重要性，其共同促進角膜基質細胞的軟骨細胞分化與無瘢痕角膜癒合。

實例15：TGFß3和地塞米松的劑量比較

在體內研究前，進行實驗以確定用於體外治療的各種有效劑量。藉由在含有不同濃度的這兩因子的培養基中培養羊角膜進行TGFß3和地塞米松的劑量範圍研究。

新鮮羊眼可獲得且角膜是經過切除且如實例14所述進行治療。一羊角膜瓣安置在16個培養條件的每一者持續三週(圖21)。角膜瓣經過 培養，然後進行免疫組織化學與顯微分析，如實例14所示。圖21顯示在各情況的角膜部位標記第二型膠原質的代表性圖像。

這項研究表明，較低濃度TGFß3(2-4ng/mL(奈克/毫升))和地塞米松(1-10nM(奈米))具有較低體外效能(圖21，第一和第二列)。較高劑量(即是，8-1ng/ml(奈克/毫升)TGFß3和100-1000nM(奈米)地塞米松)在誘發第II型膠原質沉積是有效率(圖21，第三和第四列)。

這些結果證實，100nM(奈米)地塞米松和10ng/mL(奈克/毫升)TGFß3是當作有效濃度使用(圖21，第三列)。較高濃度地塞米松(1000nM(奈米，即是，400ng/mL(奈克/毫升))亦證明是有效(圖21，第四列)。注意，在這項研究中試驗的地塞米松濃度認為較低於市售滴眼液使用的濃度(即是，1ng/mL(奈克/毫升)地塞米松)。

實例16：實驗觀察與結果的概述

TGFß1和地塞米松的組合先前已用來誘發祖細胞以分化成體內軟骨細胞(2009年，迪克曼先生等人；1998年，斯通先生等人；2007年，科蘭柏咯先生等人；2003年，温特先生等人)。在其他研究中，角膜基質細胞的側群已顯示產生類似於軟骨細胞分化情況下由軟骨特異性第Ⅱ型膠原質構成的基質(2005年，杜、方德布魯、曼恩、桑達拉吉、和方德布魯先生)。同時已報導，在含有TGFß1和BMP2的軟骨細胞分化培養基中四周後的鞏膜細胞表現含有聚集蛋白聚糖和第II型膠原質的軟骨特異性標記符。此外，在轉植到大鼠軟骨缺損部位後，人體鞏膜細胞已顯現保留其體內軟骨細胞潛力(2008年，塞科等人)。眾所周知，鞏膜與角膜基質的纖維細胞共用一共同胚胎組織起源。

如本說明書所示，在含有TGFß3和地塞米松的培養基與在沒有血漿中接種的角膜細胞藉由細胞聚合會在2-3天內自發形成細胞球，且在三週內，這些細胞團被標記陽性軟骨特異性第II型膠原質。最初，在使用 TGFß3和地塞米松治療時，第I型膠原質表現亦增加。當培養基改變為含有胎牛血清的對照培養基時，細胞團會分散成一細胞單層。在單層生長的細胞不再表現第II型膠原質。這些結果表明細胞聚合或環境在第II型膠原質誘發可能很重要。

注意，當培養基改變為含有軟骨細胞分化培養基的TGFß3和地塞米松時，角膜細胞(其是在含有培養基的首先增殖為纖維細胞)不會分泌第Ⅱ型膠原質。這表明，一旦增殖為纖維細胞，細胞沒有能力沿著軟骨途徑分化。此外，在軟骨細胞分化培養基的三維培養生長為顆粒的纖維細胞亦沒有表現軟骨特異性第Ⅱ型膠原質。這些結果表明，靜態角膜細胞表現型與細胞聚合對於軟骨細胞分化是很重要。

在本說明書顯示，軟骨細胞分化培養基的正常與圓錐角膜的體外培養沿基質片層顯現第II型膠原質的均勻沉積。角膜基質內的每個角膜細胞是與標記第II型膠原質有關聯，再者，表明重新編程成軟骨表現型是隨機的，且確認從體內細胞培養得到的結果不是側群祖細胞增殖的結果。此外，大鼠角膜的體內治療亦會引起第II型膠原質沉積，類似於在體外培養觀察的方式。不過，當在體內治療時，角膜前部可見到第II型膠原質的較強免疫標記，最可能反映生長因子較容易從眼表面擴散到基質的前層。

專注在圓錐角膜的角膜細胞密度差異的研究已報導整體降低細胞密度。本說明書的結果亦證實這一點。不過，不像已報導明顯降低基質前部細胞密度的其他研究(2005年，霍林斯沃思、埃夫隆和托羅先生；2008年，顧先生等人；2010年，曼庫西先生等人；2008年，尼亞德爾先生等人)，本說明書的結果表明亦明顯降低未治療圓錐角膜基質後部的角膜細胞密度。在圓錐角膜，具有一般薄的角膜。不過，不確定這是否由於角膜細胞凋亡及後續降低ECM生成或角膜細胞凋亡是否繼發於角膜變薄過程。

如本說明書所示，相較於對照組，在含有TGFß3和地塞米松的軟骨培養基中培養的經治療半數圓錐角膜會增加角膜細胞密度。此外，基質的後半區域似乎是由角膜再生。經治療半數的角膜細胞亦似乎看似更健康，其具有大明顯細胞核與數個細胞代謝過程。此表示使用兩因子的治療可能造成增殖角膜細胞及再生基質，特別是沒有角膜細胞的後部。

膠原交聯(其為目前圓錐角膜的治療之一)是在角膜細胞凋亡的初始期間發生在基質的前半部。這隨後發生在角膜細胞的基質再生期間。角膜細胞死亡通常隨著傷害看見，且在交聯情況，認為是UVA誘發細胞損壞的結果。此凋亡反應認為是已進化以保護角膜不會進一步發炎(2003年威爾遜、內托、和安布羅西奧先生)。

交聯治療後亦可觀察到持續長達數月的基質混濁。其認為是增加膠原質直徑與膠原纖維間的間距，導致角膜微結構的變形。大多數研究已報導，治療後的6-12個月間會減少角膜混濁(2010年，格林斯坦、弗萊、巴特、和赫什先生；2008年，馬索塔先生等人)。雖然已有交聯治療後進行數個角膜臨床觀察，不過仍有關於角膜混濁的原因與治療方面其他可能下游效應的模糊。需要數個月時間使角膜再生，且清楚意味交聯可能會引發基質內患部修護反應。

在這項研究中，即使長期(多達8週)體內與體內治療，沒有角膜混濁的跡象。這可能是由於沿著預存膠原薄層沉積第Ⅱ型膠原質在均勻層。沉積第III型膠原質(有關纖維化)與α-平滑肌肌動蛋白(在肌纖維細胞形成期間)會導致混濁與瘢痕。這兩者在角膜傷害期間會顯現。這些蛋白質在治療的角膜是不會表現，其意味不會發生可能導致瘢痕的患部修復連鎖反應。

如本說明書描述，第II型膠原質mRNA表現的定量測定顯示，其表現在沒有TGFß3和地塞米松後會明顯降低。此建議角膜系胞的重新編 程是不可逆且可控制在ECM的第II型膠原質後續沉積。這對於發展治療方法是非常重要，因為此將不會誘發無法抑制的ECM沉積。

奈米壓痕已使用在手術後治療方法的評估，諸如眼睛部位的圓錐角膜(角膜營養不良)與LASIK術後擴張的交聯。在對人類屍體角膜進行的一項研究發現，膠原交聯造成兩倍增加前角膜基質的彈性模數，同時後基質不會受到治療的影響(2013年，迪拉兹、戴康尼斯、根格裏亞、俞、和齊巴斯先生)。在這項研究中，前角膜彈性是經過測定。此外，這項研究的結果表示後基質角膜細胞密度會在TGFß3和地塞米松經治遼的角膜中發生改變。

雖然奈米壓痕技術不測量單個膠原纖維的特性，不過可測量在角膜的固有彈性特性變化，其將會隨著膠原交聯的增加而在第Ⅱ型膠原質沉積改變。基質內的結構差異反映在生物力學特性的對應差異。在本明書的結果顯示，幾乎三倍增加治療大鼠角膜的生長因子中的彈性模數與硬度。這些結果表示治療造成具有較高彈性的較硬角膜。彈性模數是防止物質彈性變形的測度，因此較高的彈性模數表示材料更不容易變形。在這項研究中，相較於1週治療的角膜，3週經治療角膜明顯增加硬度與彈性模數係符合免疫組織化學標記結果，其顯示對於置放第II型膠原質檢測層需要至少2-3週治療。

免疫組織化學標記結果結合基因表現研究與生物力學試驗兩者顯示完整角膜內的角膜細胞藉由使用TGFß3和地塞米松的治療而可容易沿著軟骨化途徑重新編程。結合TGFß3和地塞米松治療的重新編程是隨機的，且可經由生長因子治療週期以導致更硬、更彈性角膜的調整來控制。注意，需要投予兩種藥劑；當分別試驗TGFß3和地塞米松時，無法觀察到角膜細胞的第II型膠原質生成。因此，提出一種藉由投予TGFß3和地塞 米松(如本說明書描述)，使用體內組織工程提出有關圓錐角膜與其他眼部病症的新治療。

例17：利用大型動物模型來研究角膜重塑

重塑角膜同時在羊模型提供最佳方案

附加實驗使用大型動物模型來示範說明角膜重塑。對於這些實驗，大型動物模型允許置放醫生處方隱形眼鏡。羊是當作模型動物使用，因為羊眼睛是較類似人類的尺寸與生理機能。此外，畜舍設施位於美國基督城市的林肯大學。同時注意，羊性情很溫和，且適合於處理。

羊是根據畜舍設施的標準作業程序施予鎮定劑。基於大鼠劑量優化研究，具有最佳TGFß3和地塞米松濃度(體積比例)的滴眼液製劑是在置放角膜INTACS®(或類似鞏膜環)後接著滴入右眼，以在膠原質沉積(圖18)期間保持想要的角膜球面變曲度。每日一次或兩次持續三週投予滴眼液(如在鼠類優化研究的決定)。然後移除INTACS®且再三個星期或六個月持續收容動物。

治療前及在治療結束(當移除INTACS®時)，採取角膜厚度與球面變曲度測量。可攜式角膜測厚儀用來檢測治療與對照體內對側角膜比較的角膜厚度變化。可攜式Pentacam®用來測量在治療前及治療後的羊眼角膜球面變曲度以及角膜厚度(圖19(E)和(F))。使用最後(最準確)Pentacam®測量，在取下眼鏡後的三週時間再次重複角膜測量。這些是在殺死動物後但在取下眼睛以前進行，供大鼠角膜的免疫組織化學與生物力學分析(如前述)。不太可能情況是，在羊無法忍受硬性隱形眼鏡(感染、發炎或急躁不安的跡象)，該項研究會在沒有眼鏡時繼續進行，其允許完成關鍵參數，諸如第Ⅱ型膠原沉積與分佈與生物力學特性。

鑑於結果，建議使用如本說明詳細描述的體內組織工程結合硬式透氣OrthoK隱形眼鏡(或類似)，以永久塑形及穩定角膜，藉此提供治療包含近視的一般角膜缺陷。

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本熟諳此技者將容易從本發明的揭示變得更明白，實質執行或實質達成相同於本說明書所述具體實施例或態樣之功能或結果的各種修改、替換、及/或變化都可根據本發明的相關具體實施例或態樣來使用。因此，本發明是要包括修改、替換、與變化以處理、製造、組成本說明書揭示的物件、化合物、構件、方法及/或步驟，且在本發明的範疇內。

本說明書中所引用包含專利與專利申請案的所有參考文獻在此以引用方式併入本文供參考。但任何參考文獻不構成先前技術。任何參考文獻的討論內容不承認這類參考文獻構成紐西蘭或任何其他國家在本領域中的一般常識。

<110> 奧克蘭聯合服務有限公司 格林，卡洛 安 格林，柯林 薛爾溫，崔佛

<120> 眼用組合物使用方法

<130> 901 WO1

<150> NZ 705727

<151> 2015-03-05

<160> 1

<170> 3.5版專利

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> 構建合成多肽

<400> 1

Claims (24)

1. 一種包含TGFβ3多肽與地塞米松或其鹽、酯或氫化物的組合物之用途，其係用於製備(i)治療或預防有關一目標物之角膜變薄或不規律的病症；或(ii)治療或預防一目標物之眼睛的屈光不正的藥物；其中，該TGFβ3多肽包括至少100個SEQ ID NO：1的胺基酸。
2. 如請求項1所述之用途，其中該TGFβ3多肽表現SEQ ID NO：1的至少90%序列同源性。
3. 如請求項1所述之用途，其中該TGFβ3多肽是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成。
4. 如請求項1所述之用途，其中該地塞米松是磷酸地塞米松。
5. 如請求項1所述之用途，其中該組合物包括10至100ng/ml(奈克/毫升)TGFβ3多肽。
6. 如請求項1所述之用途，其中該組合物包括40至4000ng/ml(奈克/毫升)地塞米松。
7. 如請求項1至6任一項所述之用途，其中(a)該組合物是配製供每日一次或每日兩次投予。(b)該組合物是配製以與一或多種附加眼用劑同時投予，且該等一或多種附加眼用劑是選自下列組成群組：麻醉劑、抗炎劑、抗微生物劑、與潤滑劑；(c)該組合物是配製連同使用隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環投予，其係調適成在使用該組合物治療期間及/或其後用於塑形或保持角膜形狀或係調適成充當該組合物的載體或作為一組合物洗脫裝置；及/或(d)該組合物是配製成溶液、凝膠、乳膏、乳液或滴眼液。
8. 如請求項1至6任一項所述之用途，其中 (a)針對(i)，該組合物是配製以在角膜膠原交聯之前及/或之後投予，或(b)針對(ii)，該組合物是配製以在屈光手術之前或其之後投予。
9. 如請求項1至6任一項所述之用途，其中(a)該病症是選自下列組成群組：圓錐角膜、近視、與散光；或(b)該眼睛的屈光不正是有關下列一或多者：近視、遠視、散光、與老花眼。
10. 一種試劑盒之用途，其係用於製備(i)治療或預防有關一目標物之角膜變薄或不規律的病症；或(ii)治療或預防一目標物之眼睛的屈光不正的藥物，該試劑盒包括：(i)一組合物，其包含一TGFβ3多肽與地塞米松或鹽、酯或氫化物；及(ii)一或多個隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環；其中，該TGFβ3多肽包括至少100個SEQ ID NO：1的胺基酸。
11. 如請求項10所述之用途，其中(a)一或多個該隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環是調適成在使用該組合物治療期間及/或其後面用於塑形或保持角膜形狀；及/或(b)一或多個該隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環是充當該組合物的載體或作為一組合物洗脫裝置。
12. 如請求項10所述之用途，其中該TGFβ3多肽表現SEQ ID NO：1的至少90%序列同源性。
13. 如請求項10所述之用途，其中該TGFβ3多肽是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成。
14. 如請求項10所述之用途，其中該地塞米松是磷酸地塞米松。
15. 如請求項10至14任一項所述之用途，其中該組合物包括下列組成群組之一或多種： (a)10至100ng/ml(奈克/毫升)TGFβ3多肽；(b)40至4000ng/ml(奈克/毫升)地塞米松；(c)一用於每日一次或每日兩次投予之製劑；(d)與一或多種附加眼用劑之共同製劑；或(e)一配製成溶液、凝膠、乳膏、乳液或滴眼液之製劑。
16. 如請求項10至14任一項所述之用途，其中(a)該試劑盒包括一或多種附加眼用劑，且其中該等一或多種附加眼用劑是選自下列組成群組：麻醉劑、抗炎劑、抗微生物劑、與潤滑劑；(b)該試劑盒包括一隱形眼鏡藥水；及/或(c)該試劑盒包括使用說明書。
17. 如請求項10至14任一項所述之用途，其係用於製備治療或預防選自下列組成群組的角膜病症：圓錐角膜、近視、遠視、散光、老花眼、與基質營養不良。
18. 一種組合製劑的用途，其係用於製備(i)治療或預防有關一目標物之角膜變薄或不規律的病症；或(ii)治療或預防一目標物之眼睛的屈光不正的藥物，該組合製劑包括(A)一包含TGFβ3多肽的第一組合物，以及(B)一包含地塞米松或其鹽、酯或氫化物的第二組合物；其中，該TGFβ3多肽包括至少100個SEQ ID NO：1的胺基酸。
19. 如請求項18所述之用途，其中該TGFβ3多肽表現SEQ ID NO：1的至少90%序列同源性。
20. 如請求項18所述之用途，其中該TGFβ3多肽是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成。
21. 如請求項18所述之用途，其中該地塞米松是磷酸地塞米松。
22. 如請求項18至21任一項所述之用途，其中，該組合製劑包括一或多種：(a)10至100ng/ml(奈克/毫升)TGFβ3多肽；(b)40至4000ng/ml(奈克/毫升)地塞米松；(c)一用於每日一次或每日兩次投予之製劑；(d)一經由一隱形眼鏡、角膜插件、角膜植入件、或基質內角膜環投予之製劑；(e)一或多種附加眼用劑之共同製劑；或(f)一用為溶液、凝膠、乳膏、乳液、或滴眼液投予之製劑。
23. 如請求項22所述之用途，其中該等一或多種附加眼用劑是選自下列組成群組：麻醉劑、抗炎劑、抗微生物劑、與潤滑劑。
24. 如請求項18至21任一項所述之用途，其中，(a)該病症是選自下列組成群組：圓錐角膜、近視、與散光；或(b)該眼睛的屈光不正是有關下列一或多者：近視、遠視、散光、與老花眼。

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