CN110092816B - 预防和治疗纤维化的小分子多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种预防和治疗纤维化的小分子多肽及其应用。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。

Description

预防和治疗纤维化的小分子多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及预防和治疗纤维化的小分子多肽及其应用。
背景技术
纤维化是人体组织器官受到长期反复刺激损伤后，产生过度修复或修复失调的结果。纤维增生性疾病涉及全身多种组织器官，如肝、肺、眼、肾、血管纤维化及肿瘤。据统计，约40％的致死疾病和组织纤维化关系密切。在眼部，纤维化疾病发生在不同组织部位，其基本病理过程相似，结局是对视功能造成不可逆损伤。
眼部纤维化疾病包括增生性玻璃体视网膜病变(Proliferativevitreoretinopathy，PVR)，青光眼滤过术后疤痕，角膜瘢痕等。上述纤维化眼病具有不可逆、难治疗、易致盲的特点。其中PVR及青光眼滤过术后疤痕常导致手术失败，视功能严重受损，成为眼科棘手问题。而目前尚无有效药物预防或抑制该类疾病。
如PVR疾病，目前手术是治疗PVR的标准方法，目的是解除纤维增殖膜牵拉和关闭视网膜裂孔，尽可能恢复视网膜正常解剖结构。然而在近20年里，国外报道术后PVR的发生率从4％至34％不等，可见虽然玻璃体视网膜手术的技术取得了进步，PVR的发生率却并未明显降低。目前，通过玻璃体视网膜手术可使视网膜解剖复位成功率达到60％-80％，值得注意的是，这其中仅有40％-80％能够达到功能复位，即视力恢复至5/200以上。可见，手术解剖复位成功并不意味着视功能恢复，且手术花费昂贵，一旦发生PVR即面临再次手术风险，视力恢复极为困难。如果能够通过药物有效预防及控制PVR发病过程中的细胞增殖、迁移及损伤修复，则能预防PVR的形成，最大程度提高网脱手术成功率及视力恢复。因此寻找有效安全的抗PVR药物尤为重要。
青光眼滤过术后疤痕是导致青光眼手术失败的主要原因。目前临床上选用抗代谢类药物用于预防术后疤痕以维持滤过泡的时长。常用药物包括丝裂霉素(mitomycin C，MMC)和5-氟尿嘧啶(5-uorouracil，5-Fu)。然而这类药物并非理想选择，其长期效果欠佳。且这类药物具有明显的细胞毒性，常导致眼部毒副反应，损伤视功能，如角膜毒性、低眼压、眼内炎等。因此需积极寻找抗滤过疤痕的替代用药。目前研究的重点在于如何根据发病的关键环节进行靶向干预，如拮抗TGF-β等生长因子，从而寻找到安全而有效的抗疤痕药物。
角膜疤痕是角膜疾病中常见的结局，常因炎症、外伤等因素导致，且难以消退。如果疤痕位于瞳孔区则对视力造成严重影响。目前除激素药物外尚无靶向药物拮抗角膜疤痕。且激素类药物用于眼表时，副作用较多，如升高眼压、延迟愈合、诱发白内障等，且激素类药物对疤痕的抑制效果并非理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全有效的治疗眼部纤维化相关疾病功能的小分子多肽。
本发明第一方面提供了一种式I所示的多肽，或其药学上可接受的盐：
Z0-CHR1-T-CHR2-T-CHR3-T-CHR4-T-CHR5-T-CHR6-T-CHR7-T-CHR8-T-CHR9-T-CHR10-T-CHR11-T-CHR12-T-CHR13-T-CHR14-T-CHR15-T-CHR16-T-CHR17-T-CHR18-T-CHR19-Z1
式I
式中，Z0为-NH2，或-NHY0，其中，Y0为1-2个氨基酸残基；
Z1为-COOH，或-COOY1，其中，Y1为1-2个氨基酸残基；
各T为-CO-NH-，
其中，
R1选自：(a)羟甲基和(b)羟乙基；
R2选自：(a)酰胺亚甲基和(b)酰胺亚乙基；
R3选自：(a)异丙基和(b)异丁基；
R4选自：(a)丁基和(b)异丁基；
R5选自：(a)异丁基和(b)丁基；
R6选自：(a)氨基亚丁基和(b)胍基-亚丙基；
R7选自：(a)氨基亚丁基和(b)胍基-亚丙基；
R8选自：(a)对羟基苯基和(b)苄基；
R9选自：(a)胍基-亚丙基和(b)氨基亚丁基；
R10选自：(a)酰胺亚甲基和(b)酰胺亚乙基；
R11选自：(a)甲硫乙基和(b)异丁基；
R12选自：(a)异丙基和(b)异丁基；
R13选自：(a)异丙基和(b)异丁基；
R14选自：(a)胍基-亚丙基和(b)氨基亚丁基；
R15选自：(a)甲基和(b)异丙基；
R16选自：(a)巯甲基(HSCH2-)和(b)羟甲基；
R17选自：(a)H和(b)甲基；
R18选自：(a)巯甲基和(b)羟甲基；
R19选自：(a)咪唑基亚甲基和(b)胍基-亚丙基；且所述的多肽具有抑制眼部纤维化的活性。
在另一优选例中，R1-R19中，至少16个为(a)类基团，优选至少17个、18个、19个为(a)类基团。
在另一优选例中，所述多肽与式I0所示的结构相比，R1-R19中有0-1个基团基被取代,
NH2-CHR1-T-CHR2-T-CHR3-T-CHR4-T-CHR5-T-CHR6-T-CHR7-T-CHR8-T-CHR9-T-CHR10-T-CHR11-T-CHR12-T-CHR13-T-CHR14-T-CHR15-T-CHR16-T-CHR17-T-CHR18-T-CHR19–COOH
式I0
其中，
R1为羟甲基；
R2为酰胺亚甲基；
R3为异丙基；
R4为丁基；
R5为异丁基；
R6为氨基亚丁基；
R7为氨基亚丁基；
R8为对羟基苯基；
R9为胍基-亚丙基；
R10为酰胺亚甲基；
R11为甲硫乙基；
R12为异丙基；
R13为异丙基；
R14为胍基-亚丙基；
R15为甲基；
R16为巯基亚甲基；
R17为H；
R18为巯基亚甲基；
R19为咪唑基亚甲基。
在另一优选例中，所述多肽序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述SEQ ID NO.:1所示的序列具有式I0所示的结构：
NH2-CHR1-T-CHR2-T-CHR3-T-CHR4-T-CHR5-T-CHR6-T-CHR7-T-CHR8-T-CHR9-T-CHR10-T-CHR11-T-CHR12-T-CHR13-T-CHR14-T-CHR15-T-CHR16-T-CHR17-T-CHR18-T-CHR19–COOH
式I0
其中，
R1为羟甲基；
R2为酰胺亚甲基；
R3为异丙基；
R4为丁基；
R5为异丁基；
R6为氨基亚丁基；
R7为氨基亚丁基；
R8为对羟基苯基；
R9为胍基-亚丙基；
R10为酰胺亚甲基；
R11为甲硫乙基；
R12为异丙基；
R13为异丙基；
R14为胍基-亚丙基；
R15为甲基；
R16为巯基亚甲基；
R17为H；
R18为巯基亚甲基；
R19为咪唑基亚甲基。
在另一优选例中，所述多肽具有SEQ ID NO:1-20、22所示的序列。
在另一优选例中，-T-CHRn-T-为-NH-CHRn-CO-，构成氨基酸残基，其中n为1-19的正整数。
在另一优选例中，-CHRn-与在其位置前端的-NH-以及在其位置后端的-CO-依次相连构成氨基酸残基，其中n为1-19的正整数。
在另一优选例中，所述多肽具有式I0所示的结构。
本发明第二方面，还提供了式II所示的多肽，或其药学上可接受的盐
[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-[Xaa17]-[Xaa18]-[Xaa19]-[Xaa20] (II)
式中，
Xaa0是无，或1-3个氨基酸构成肽段；
Xaa1是选自下组的氨基酸：Ser和Thr；
Xaa2是选自下组的氨基酸：Asn、Gln、His、Lys和Arg；
Xaa3是选自下组的氨基酸：Val、Ile、Leu、Met、Phe和Ala；
Xaa4是选自下组的氨基酸：Ile、Leu、Val、Met、Ala和Phe；
Xaa5是选自下组的氨基酸：Leu、Ile、Val、Met、Ala和Phe；
Xaa6是选自下组的氨基酸：Lys、Arg、Gln和Asn；
Xaa7是选自下组的氨基酸：Lys、Arg、Gln和Asn；
Xaa8是选自下组的氨基酸：Tyr、Trp、Phe、Thr和Ser；
Xaa9是选自下组的氨基酸：Arg、Lys、Gln和Asn；
Xaa10是选自下组的氨基酸：Asn、Gln、His、Lys和Arg；
Xaa11是选自下组的氨基酸：Met、Leu、Phe和Ile；
Xaa12是选自下组的氨基酸：Val、Ile、Leu、Met、Phe和Ala；
Xaa13是选自下组的氨基酸：Val、Ile、Leu、Met、Phe和Ala；
Xaa14是选自下组的氨基酸：Arg、Lys、Gln和Asn；
Xaa15是选自下组的氨基酸：Ala、Val、Leu和Ile；
Xaa16是选自下组的氨基酸：Cys和Ser；
Xaa17是选自下组的氨基酸：Gly、Pro和Ala；
Xaa18是选自下组的氨基酸：Cys和Ser；
Xaa19是选自下组的氨基酸：His、Asn、Gln、Lys和Arg；
Xaa20是无，或1-3个氨基酸构成肽段；
所述多肽与SEQ ID NO.:1相比，其氨基酸序列的同一性(identity)≥85％；并且所述的多肽具有抑制眼部纤维化疾病的活性。
在另一优选例中，所述眼部纤维化疾病选自下组：角膜瘢痕、增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、青光眼滤过术后疤痕、或其组合。
在另一优选例中，
Xaa1是选自下组的氨基酸：Ser和Thr；
Xaa2是选自下组的氨基酸：Asn和Gln；
Xaa3是选自下组的氨基酸：Val和Leu；
Xaa4是选自下组的氨基酸：Ile和Leu；
Xaa5是选自下组的氨基酸：Leu和Ile；
Xaa6是选自下组的氨基酸：Lys和Arg；
Xaa7是选自下组的氨基酸：Lys和Arg；
Xaa8是选自下组的氨基酸：Tyr和Phe；
Xaa9是选自下组的氨基酸：Arg和Lys；
Xaa10是选自下组的氨基酸：Asn和Gln；
Xaa11是选自下组的氨基酸：Met和Leu；
Xaa12是选自下组的氨基酸：Val和Leu；
Xaa13是选自下组的氨基酸：Val和Leu；
Xaa14是选自下组的氨基酸：Arg和Lys；
Xaa15是选自下组的氨基酸：Ala和Val；
Xaa16是选自下组的氨基酸：Cys和Ser；
Xaa17是选自下组的氨基酸：Gly和Ala；
Xaa18是选自下组的氨基酸：Cys和Ser；
Xaa19是选自下组的氨基酸：His和Arg。
在另一优选例中，
Xaa1为Thr；
Xaa2为Gln；
Xaa3为Leu；
Xaa4为Leu；
Xaa5为Ile；
Xaa6为Arg；
Xaa7为Arg；
Xaa8为Phe；
Xaa9为Lys；
Xaa10为Gln；
Xaa11为Leu；
Xaa12为Leu；
Xaa13为Leu；
Xaa14为Lys；
Xaa15为Val；
Xaa16为Ser；
Xaa17为Ala；
Xaa18为Ser；
Xaa19为Arg。
在另一优选例中，所述多肽与SEQ ID NO.:1相比，其氨基酸序列的同一性优选地≥86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。
在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了≥70％的SEQ ID NO:1的所示多肽的抑制眼部纤维化疾病的活性。
在另一优选例中，所述多肽是由SEQ ID NO.:1所示的多肽经过1-2个氨基酸取代；和/或N端或C端分别经过1-2个氨基酸添加形成的。
在另一优选例中，所述多肽是人工合成。
在另一优选例中，所述多肽不是SEQ ID NO.:1所示的多肽。
本发明第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的本发明第一方面或本发明第二方面所述的多肽或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述的多肽保留了≥70％、75％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、或200％的SEQ ID NO:1所示多肽的抑制眼部纤维化疾病活性。
在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液，尤其是玻璃体腔内注射)、眼用凝胶或眼药膏。
在另一优选例中，所述的组合物为缓释剂型。
本发明还提供了式I和/或式II化合物的二聚体和多聚体形式，且所述二聚体和多聚体形式具有抑制眼部纤维化疾病活性。
本发明第四方面提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明第一方面或本发明第二方面所示的多肽或其药学上可接受的盐。
本发明第五方面提供了本发明第一方面或本发明第二方面所述的多肽或其药学上可接受的盐、和/或本发明第三方面所述药物组合物的用途，用于制备治疗眼部纤维化相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述眼部纤维化相关疾病选自下组：角膜瘢痕、增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、青光眼滤过术后疤痕、或其组合。
本发明第六方面，提供了一种治疗眼部纤维化相关疾病的方法，包括步骤：向需要的对象施用治疗有效量的本发明第一方面或本发明第二方面所述的多肽或其药学上可接受的盐、和/或本发明第三方面所述药物组合物。
在另一优选例中，所述眼部纤维化相关疾病选自下组：角膜瘢痕、增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、青光眼滤过术后疤痕、或其组合。
在另一优选例中，所述的施用包括眼表施用或玻璃体腔内注射施用。
在另一优选例中，所述的对象是人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。
在另一优选例中，所述的对象包括人、小鼠、大鼠、兔、或犬，优选为人、小鼠、大鼠、或兔。
本发明第七方面，提供了一种抑制哺乳动物眼部纤维化的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面或本发明第二方面所述的多肽或其药学上可接受的盐、和/或本发明第三方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的施用包括眼表施用或玻璃体腔内注射施用。
在另一优选例中，所述的对象是人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。
在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。
附图说明
图1显示了不同处理组兔眼PVR模型中网脱发生率。
图2显示了BP2及MMC干预兔眼滤过泡生存曲线。
图3显示了BP2及MMC干预兔眼滤过泡模型术后眼压。
图4显示了BP2干预小鼠角膜瘢痕。
图5显示了本发明多肽的HPLC鉴定分析结果。
图6显示了本发明多肽的HPLC鉴定分析结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类具有治疗眼部纤维化相关疾病功能的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，设计了数个候选序列，采用固相法将其合成，分离纯化获得高纯度的小肽，并运用HPLC及MS对之进行鉴定，再经兔眼PVR体内动物模型、兔眼青光眼滤过术的模型、小鼠角膜瘢痕模型的筛选，获得了一类新型的、具有治疗眼部纤维化相关疾病功能的小分子多肽。
本发明的小肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。
兔眼PVR动物模型对应实际增生性玻璃体视网膜病变(Proliferativevitreoretinopathy，PVR)；
兔眼青光眼滤过术的模型对应实际青光眼滤过术后疤痕；
小鼠角膜瘢痕模型对应实际角膜瘢痕；
眼部纤维化性疾病选自下组：增生性玻璃体视网膜病变(Proliferativevitreoretinopathy，PVR)、青光眼滤过术后疤痕、角膜瘢痕、或其组合。
图像处理和统计学分析
显微镜拍照，使用SPSS17.0统计学软件进行分析。不同实验组结果差异性检验使用ANOVA方法，每两组之间比较使用Bonferroni’s post hoc test。P<0.05具有统计学意义。
活性多肽
在本发明中，术语“本发明多肽”、“BP2多肽”、“BP2小肽”、“短肽BP2”或“肽BP2”可互换使用，都指具有血管新生抑制活性的肽BP2氨基酸序列(SNVILKKYRNMVVRACGCH，如SEQID NO:1所示)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有抑制眼部纤维化疾病功能的、SEQID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-5个(通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括BP2多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制纤维化功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)BP2多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
发明还提供BP2多肽的类似物。这些类似物与天然BP2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。
编码序列
本发明还涉及编码BP2多肽的多核苷酸。一种优选的编码序列如SEQ ID NO:21所示，tccaacgtcatcctgaagaaatacagaaacatggtggtccgggcctgtggctgccac，它编码SEQ ID NO:1所示的短肽BP2(SNVILKKYRNMVVRACGCH)。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:21所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，以SEQ ID NO:21为例，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1序列的多肽，但与SEQ ID NO:21中相应编码区序列有差别的核酸序列。
本发明的BP2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或ZY多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
另一方面，本发明还包括对BP2多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。
在两个核酸或多肽的背景下，当进行最大相符性序列比较和比对时，术语“基本相同”是指两个或多个序列或亚序列，其具有至少约80％，例如至少约85％、约90％、约95％、约98％或约99％的核苷酸或氨基酸残基与特定的参考序列具有同一性，如使用以下序列比较方法和/或通过肉眼检查所测定。
小肽制备方法
本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产(如固相合成方法)。
一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛SephadexG10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。
在一优选例中，本发明多肽BP2，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。
另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸可用来表达或生产重组的BP2多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码BP2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。
药物组合物和施用方法
另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼表、眼周、眼内(尤其是玻璃体腔内)、肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有眼药水、针剂(尤其是玻璃体腔内注射剂)、眼用凝胶和眼药膏。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
例如，眼药水的配制可这样进行：将短肽BP2或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，短肽BP2或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。此外，短肽BP2或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的短肽BP2或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。例如，当局部滴眼时，通常其浓度约为0.1-10wt％，较佳地1-5wt％，每日可2-6次给药，每次1-2滴。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明多肽及其衍生肽分子量小；
(b)水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；
(c)安全性高，对生物组织毒副作用小；并且眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用；
(d)可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低；
(e)本发明多肽的稳定性好；
(f)多肽能够有效抑制体内外眼部纤维化性疾病模型，包括增生性玻璃体视网膜病变(Proliferative vitreoretinopathy，PVR)，青光眼滤过术后疤痕，角膜瘢痕。
实施例1多肽的制备和保存
1.1多肽的制备
按固相合成方法制备了以下多肽。
根据目标的氨基酸序列，由合成仪附带软件计算配置合成所需的保护氨基酸溶液、缩合试剂及切割试剂，并依照计算结果在合成仪中加样。编辑合成程序，设置树脂溶胀振荡30分钟；脱保护5分钟及15分钟各一次；洗(DMF–甲醇–DMF各洗2次)；缩合反应30分钟；再洗(DMF 1次–甲醇2次–DMF 2次)；抽干10分钟；环化反应30分钟；切割多肽2小时。多肽合成完成后，用乙醚洗涤挥干，再行高效液相色谱(high performance liquidchromatopraphy,HPLC)纯化，冻干。终产物经氨基酸分析、HPLC及质谱分析鉴定后分装密封，纯度>99％，密封，-20℃以下保存。
鉴定结果：
结果如表1和图5和图6所示，经HPLC鉴定分析，显示多肽SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO.:1)的分子量为2191.68Da，其他多肽的分子量与其相当，经体外固相合成并以高相液相色谱法提纯，得到纯度为99.25％以上的冻干粉，-20℃密封、干燥、避光保存。
表1
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实施例2增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)模型的建立以及多肽的抑制效果测定
通过建立兔眼PVR动物模型，给予BP2多肽眼内注射干预，通过检眼镜，B超观察眼内增殖膜以及网脱发生情况。
建立兔眼PVR体内动物模型
(1)青紫蓝兔2.0～2.5kg在12小时明/12小时暗环境中饲养；
(2)准备RPE19细胞3×107；
(3)戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉麻醉后，前房穿刺抽取房水0.1ml；
(4)玻璃体腔注射100μl含有2.5×105RPE细胞的生理盐水。
多肽BP2眼内注射干预
(1)分别给予D0,D3,D7天玻璃体腔注射50μl不同浓度BP2，浓度分别为1μg/μl，3μg/μl，5μg/μl。
BP2干预后眼内观察，PVR分级
(1)D0起每日眼底镜观察兔眼内情况
(2)参考文献(Fastenberg,D.M.,Diddie,K.R.,Dorey,K.,Ryan,S.J.,1982.Therole of cellular proliferation in an experimental model of massiveperiretinal proliferation.Am.J.Ophthalmol.93,565–572.)按如下进行PVR分级：
0：健康网膜
1：玻璃体内膜性结构
2：局部血管变化，充血膨胀和血管抬高
3：局部网膜脱离
4：大范围网膜脱离，累及视乳头
5：全网脱，网膜折叠
结果见表2。
其中，对照组为注射50ul不含任何溶剂的眼内注射液组，BP2s为随机打乱氨基酸顺序的多肽组。
表2
建模后，观察模型眼内情况，2周时按照上述PVR分级进行评分，
0：健康网膜
1：玻璃体内膜性结构
2：局部血管变化，充血膨胀和血管抬高
3：局部网膜脱离
4：大范围网膜脱离，累及视乳头
5：全网脱，网膜折叠
n＝数量；
结果如图1所示。
在2周时PVR造模组出现严重纤维增殖，牵拉及网脱，通过BP2不同浓度眼内注射的兔眼PVR的分级明显低于造模组。结论：BP2玻璃体注射有效改善兔眼PVR机化程度。
实施例3兔眼青光眼滤过术的模型建立以及多肽干预效果测定
体内建立兔眼青光眼滤过术模型，观测BP2与丝裂霉素(mitomycin，MMC)分别干预后的滤过泡生存时间，眼压改变。
建立兔眼青光眼滤过泡疤痕模型。分别给予术中MMC(术中浸润0.4mg/ml 5分钟)干预或多肽干预。多肽干预组包括BP2(SEQ ID NO.:1)(术中BP2 5mg/ml5分钟)，对照杂肽BP2s(术中BP2s 5mg/ml 5分钟)浸润巩膜瓣区，并于术后即刻，D3，D7分别于结膜下注射20μl 5mg/ml BP2。术后每日监测眼压。
结果如图2和图3所示。
图2：滤过泡生存曲线。裂隙灯下观察眼部表现，MMC组兔眼可见结膜充血、角膜水肿、前房积血、眼内炎出现。BP2组可见结膜充血，3天后消失，无角膜水肿、前房积血及眼内炎发生。滤过泡消失定义为裂隙灯下检查见眼部的前房深，滤过泡区平坦，有血管的疤痕泡形成。在未经任何给药治疗的对照组，滤过泡的寿命为7～15天，MMC处理组16～28天，BP2给药组7～28天。
图3：术后兔眼眼压变化。建立兔眼青光眼滤过泡疤痕模型。分别给予术中MMC(术中浸润0.4mg/ml 5分钟)干预或多肽干预。多肽干预组包括BP2(术中BP2 5mg/ml 5分钟)，对照杂肽BP2s(术中BP2s 5mg/ml 5分钟)浸润巩膜瓣区，并于术后即刻，D3，D7分别于结膜下注射20μl 5mg/ml BP2。术后每日监测眼压。眼压测量显示，术前各组眼压无差异，术后各组眼压有不同程度降低，随术后时间延长，眼压略有缓升。
结论：BP2多肽能够延长滤过泡寿命，控制眼压，有效抑制青光眼术后滤过泡疤痕形成，预防手术失败。
实施例4小鼠角膜瘢痕模型的建立以及多肽干预验证
中央角膜穿透性切除术建立小鼠角膜损伤愈合模型，观察BP2(每天六次点眼，每次5mg/ml 10μl)给药后角膜瘢痕程度。
建立小鼠角膜损伤愈合模型。给予BP2每天六次点眼，每次5mg/ml 10μl。于第7天镜下观察拍照，空白对照组小鼠角膜透明无明显异常，模型组角膜中央可见浑浊水肿，BP2给药组可见浑浊区域局限，程度较模型组减轻。
结果：
图4：建立小鼠角膜损伤愈合模型。给予BP2每天六次点眼，每次5mg/ml10μl。于第7天镜下观察拍照，空白对照组小鼠角膜透明无明显异常，模型组角膜中央可见浑浊水肿，BP2给药组可见浑浊区域局限，程度较模型组减轻。
结论：多肽有效抑制小鼠损伤愈合模型中角膜瘢痕程度。
实施例5多肽效果的验证
实施例2-4中为三种不同眼部纤维化性疾病的经典模型，代表三种不同眼部纤维化疾病。其中，实施例2的模型更有代表性。体内建立经典的兔眼PVR模型后可观察到典型玻璃体视网膜增殖性改变，如纤维膜牵拉，视网膜隆起脱离等，多肽及其衍生物干预后能够有效抑制PVR的纤维化程度，各项评价指标与模型组比较具有显著差异。其中PVR模型组评分为4.6±0.52，当BP2含量为250μg(浓度5μg/μl，体积50μl)时，评分为2.2±1.03。
结果如表3所示。
表3
结果表明，本发明的BP2多肽及其衍生多肽能够有效抑制PVR的纤维化程度。
同样，采用实施例3-4方法和模型，测定本发明的BP2多肽及其衍生多肽对青光眼术后滤过泡疤痕形成以及角膜瘢痕程度的抑制效果。
结果表明，本发明的BP2衍生多肽能够显著延长滤过泡寿命，控制眼压，有效抑制青光眼术后滤过泡疤痕形成，预防手术失败，并有效抑制小鼠损伤愈合模型中角膜瘢痕程度，其效果与本发明的BP2多肽接近。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海市第一人民医院
<120> 预防和治疗纤维化的小分子多肽及其应用
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys
1 5 10 15
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<210> 2
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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1 5 10 15
Gly Cys His
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys
1 5 10 15
Ala Cys His
<210> 19
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys
1 5 10 15
Gly Ser His
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys
1 5 10 15
Gly Cys Arg
<210> 21
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
tccaacgtca tcctgaagaa atacagaaac atggtggtcc gggcctgtgg ctgccac 57
<210> 22
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val
1 5 10 15
Arg Ala Cys Gly Cys His
20

Claims (4)

1.一种多肽，或其药学上可接受的盐，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或赋形剂。
3.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。
4.一种权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐、和/或权利要求2所述药物组合物的用途，其特征在于，用于制备治疗眼部纤维化相关疾病的药物，所述眼部纤维化相关疾病选自下组：角膜瘢痕、增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、青光眼滤过术后疤痕、或其组合。
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