KR20230117342A - 펩타이드 제제 및 이의 안과적 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩타이드 치료제의 국소 안과 전달에 적합한 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 안구 손상을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 조성물 및 제제는 치료적으로 활성인 알파 코넥신 펩타이드를 포함할 수 있다.

Description

펩타이드 제제 및 이의 안과적 용도

본 발명은 펩타이드 제제 및 이의 안과적 용도에 관한 것이다.

각막 손상 및 안구 외상은 시력 상실을 포함하는 중증도에 이를 수 있는 안구 이환율을 유발할 가능성이 있다. 각막 손상 가능성은 무한하지만 당뇨병과 같은 질환으로 인한 2차 각막 손상 발생률과 함께 전투 군인의 화상 및 폭발 부상을 해결하기 위한 상당한 노력은 눈의 다면적이고 복잡한 상처 치유 과정을 다루는 바이오 치료제의 필요성을 보여준다. 시력을 유지하기 위해, 각막 손상 치료는 빠른 각막 재상피화를 촉진하고, 손상 진행/지속성을 완화하며, 영향을 받는 각막 세포 유형/조직층에 따라, 영향을 받는 다른 조직층의 재생도 촉진한다. 중요한 것은, 각막 기질이 침투되어 손상된 경우, 안구 치료는 각막 세포의 섬유아세포 및 근섬유아세포로의 전환을 통한 적절한 치료를 가능하게 해야 하지만 각막 혼탁 및 반흔을 유발할 수 있는 근섬유아세포의 과도한 작용을 배제해야 한다. 중요한 것은, 염증 세포 침윤도 불균형한 염증이 해로운 영향을 미칠 수 있기 때문에 계산된 고려가 필요하다. 억제된 면역 작용은 감염으로 이어질 수 있으며 과도한 염증은 정상적인 상처 치유 및 재생을 방해할 수 있다. 따라서, 세포외 기질의 뚜렷한 세포층과 구조적 균일성 및 조성물이 적절한 각막 생체역학 및 기능에 필수적인 각막 손상은 조직 손상 후 존재하는 여러 다른 세포 유형에 특정한 생물학적 효과를 갖는 생물 치료제를 필요로 한다.

각막 손상에 대한 현재 치료 표준(SOC)은 안구 세척, 윤활제, 인공 눈물, 항생제, 붕대 콘택트 렌즈, 안검봉합술 또는 결막 피복의 구축을 포함한다. 이러한 치료적 접근은 두 가지 중요한 한계가 있다. 첫째, 이들은 치료 실패가 심각한 장애 또는 시력 상실과 관련된 각막 상처 치유의 근본적인 생물학적 및 분자 과정을 다루지 않다. 둘째, 전투 상황에서 폭발물 또는 방화 장치로 인한 각막 손상 및 외상으로 나타나는 것처럼, 이러한 SOC 치료는 의료 시설이 제한적이고 안구 상처가 이차적으로 치료되는 경우 적시에 발생할 수 있거나 발생할 가능성이 없다.

또한, 눈의 민감한 조직의 안전하고 효과적인 치료를 제공하는 데 필요한 특징을 갖는 국소 치료 제제에 대한 분명한 요구가 있다. 특히, 안구 사용을 위한 제제를 함유하는 펩타이드의 개발은 독특한 도전을 제시한다; 용액에서 펩타이드의 열악한 화학적 및 물리적 안정성은 제제 옵션을 제한한다. 안구 전달에 사용되는 치료제는 눈의 표면에 대한 안전성과 활성 약학적 성분의 효과적인 전달을 보장하기 위해 제제 이질성, 안정성, 점도 및 pH를 관리하는 국제의약품규제조화위원회(ICH) 및 미국 약전(USP) 지침을 충족해야 한다. 더욱이, 단백질, 항체 및 소형 펩타이드와 같은 거대분자는 전통적인 점안액 비히클로 눈에 국소적으로 전달될 때 불량한 생체이용률을 나타낸다.

따라서, 각막 혼탁 및 시력 상실을 유발하는 조절 장애가 있는 생물학적 과정을 완화시키면서 상처 치유를 촉진하는 점안액 바이오치료제에 대한 상당한 요구가 있다. 본 발명은 이런 요구 및 다른 요구를 해결한다.

한 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 제제를 제공하며, 여기서 제제는 눈에 대한 국소 투여에 적합하다. 예를 들어, 제공된 제제는 점안액 제제이다. 한 양태에서, 본 발명은 각막 손상을 치료하는 데 사용하기 위한 제제를 제공한다.

실시태양에서, 본 발명은 약 1.0 kDa 내지 약 10.0 kDa의 분자량을 갖는 활성 펩타이드 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC)를 포함하는 제제를 제공하며, 여기서 제제는 국소 안구 전달에 적합하다. 실시태양에서, HPMC는 약 0.01%(w/w) 내지 약 2.0%(w/w)의 농도, 또는 약 0.1%(w/w) 내지 약 0.19%(w/w)의 농도로 제제에 존재한다. 실시태양에서, HPMC는 약 0.1% 또는 약 0.2% 또는 약 0.3% 또는 약 0.5% 또는 약 1.0%(w/w)의 농도로 제제에 존재한다. 실시태양에서, 제제는 염화나트륨(NaCl)을 더 포함한다. 실시태양에서, NaCl은 약 0.5% 내지 약 2.0%, 또는 약 0.7% 내지 약 1.5%의 농도로 존재한다. 실시태양에서, NaCl은 약 0.25% 내지 약 0.9%의 농도로 존재한다. 실시태양에서, NaCl은 약 0.9%(w/w)의 농도로 존재한다.

실시태양에서, 제제는 장성 변형제를 더 포함한다. 예를 들어, 실시태양에서, 제제는 덱스트로스, 글리세린, 만니톨, 염화칼륨 또는 염화마그네슘을 더 포함한다.

실시태양에서, 활성 펩타이드는 약 0.005%(w/w) 내지 약 5%(w/w), 또는 약 0.035%(w/w) 내지 약 3.5%(w/w)의 농도로 조성물에 존재한다. 실시태양에서, 활성 펩타이드는 약 0.035%(w/w) 내지 약 3.0%(w/w)의 농도로 조성물에 존재한다. 실시태양에서, 활성 펩타이드는 약 0.05%(w/w) 내지 약 2.5%(w/w)의 농도로 조성물에 존재한다. 실시태양에서, 활성 펩타이드는 약 0.1%(w/w) 내지 약 2.0%(w/w)의 농도로 조성물에 존재한다. 실시태양에서, 활성 펩타이드는 약 0.5%(w/w) 내지 약 1.5%(w/w)의 농도로 조성물에 존재한다. 실시태양에서, 제제는 약 18mPaS 내지 약 28mPaS의 점도를 갖는다. 실시태양에서, 제제는 약 18mPaS, 약 19mPaS, 약 20mPaS, 약 21mPaS, 약 22mPaS, 약 23mPaS, 약 24mPaS, 약 25mPaS, 약 26mPaS, 약 27mPaS 또는 약 28mPaS의 점도를 갖는다. 실시태양에서, 제제는 약 5 내지 약 8, 또는 약 5 내지 약 7, 또는 약 5, 약 6, 약 7, 또는 약 8의 pH를 갖는다. 실시태양에서, 제제는 약 6.5의 pH를 갖는다. 실시태양에서, 제제는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다. 실시태양에서, 제제는 약 6.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 실시태양에서, 제제는 약 200 내지 약 350mOsm/kg, 예를 들어, 약 280 내지 약 350mOsm/kg, 예를 들어, 약 288mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 실시태양에서, 제제는 약 0.5g/mL 내지 약 2.0g/mL의 밀도를 갖는다. 실시태양에서, 제제는 약 0.5g/mL, 약 0.6g/mL, 약 0.7g/mL, 약 0.8g/mL, 약 0.9g/mL, 약 1.0g/mL, 약 1.1g/mL, 약 1.2g/mL, 약 1.3g/mL, 약 1.4g/mL, 약 1.5g/mL, 약 1.6g/mL, 약 1.7g/mL, 약 1.8g/mL, 약 1.9g/mL, 또는 약 2.0g/mL의 밀도를 갖는다. 예를 들어, 실시태양에서, 제제는 약 0.99g/mL의 밀도를 갖는다.

실시태양에서, 본 명세서에 제공된 제제의 활성제는 알파 코넥신 펩타이드 또는 이의 활성 단편이다. 예를 들어, 실시태양에서, 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 카복시 최말단 4 내지 30개의 인접 아미노산을 포함한다. 실시태양에서, 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 카복시 최말단 4 내지 30개의 인접 아미노산으로 이루어진다. 실시태양에서, 알파 코넥신은 코넥신 37, 코넥신 40, 코넥신 43, 또는 코넥신 45이다. 실시태양에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 및 SEQ ID NO: 5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 실시태양에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 아미노 서열을 포함한다. 실시태양에서, 폴리펩타이드는 세포 내재화 서열을 더 포함한다. 실시태양에서, 세포 내재화 서열은 안테나페디아, TAT, HIV-Tat, 페네트라틴, Antp-3A(Antp 돌연변이체), 부포린 II, 트랜스포탄, MAP(모델 양친매성 펩타이드), K-FGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB 1, Pep-7, HN-1, BGSC(비스-구아니디늄-스페르미딘-콜레스테롤) 및 BGTC(비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 실시태양에서, 세포 내재화 서열은 안테나페디아이고, 여기서 서열은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함한다. 실시태양에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함한다.

실시태양에서, 본 명세서에 제공된 제제는 국소 안구 투여에 적합하다. 실시태양에서, 투여는 점안액 투여를 통해 이루어진다.

실시태양에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 제제를 국소적으로 투여하는 단계를 포함하여 이를 필요로 하는 대상에서 안구 손상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 실시태양에서, 본 발명은 대상의 안구 손상 후 각막 재상피화를 가속화하기 위한 제제 및 방법을 제공하며, 이 방법은 본 명세서에서 제공되는 제제를 대상의 눈에 국소적으로 투여하는 단계를 포함한다. 실시태양에서, 제제는 안구 손상을 야기한 사건 직후에 눈에 투여된다. 실시태양에서, 폴리펩타이드는 안구 손상을 야기한 사건의 약 1시간 이내, 약 2시간 이내, 약 5시간 이내, 또는 약 12시간 이내에 대상에게 투여된다. 실시태양에서, 폴리펩타이드는 안구 손상을 야기한 사건 후 적어도 약 2시간 후에 대상에게 투여된다. 실시태양에서, 폴리펩타이드는 안구 치유가 관찰될 때까지 하루에 두 번, 또는 약 8시간마다, 또는 약 12시간마다 대상의 눈에 투여된다. 실시태양에서, 안구 손상은 각막 손상이다. 실시태양에서, 안구 손상은 망막 손상이다. 실시태양에서, 안구 손상은 화상, 폭발 또는 열상에 의해 유발된다. 실시태양에서, 안구 손상은 화학적 또는 열 화상 손상이다. 실시태양에서, 안구 손상은 머스타드 가스 등과 같은 점포제와 눈의 접촉에 의해 유발된다. 실시태양에서, 안구 손상은 만성 질환에 의해 야기된다. 실시태양에서, 만성 질환은 당뇨병 또는 당뇨병성 각막병증이다. 실시태양에서, 만성 질환은 망막 질환이다. 실시태양에서, 대상은 안구 건조증을 갖는다. 실시태양에서, 대상은 안구 건조증에 의해 유발될 수 있는 것과 같은 지속적인 각막 상피 결함을 가지고 있다. 실시태양에서, 손상은 안구 수술, 화학적 화상 또는 열 화상 손상 또는 각막 열상 손상에 이차적이다.

실시태양에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상에서 안구 손상을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 제제, 및/또는 대상에서 안구 손상 후 각막 재상피화를 가속화하는 데 사용하기 위한 제제를 제공한다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

도 1은 각막 화학적 화상 후 10, 24, 36, 48, 72, 96 또는 120시간에 1% 플루오레세인을 사용하고 화학적 손상 후 2일 동안 1일 2회 aCT1(200μM 또는 5mM) 또는 비히클 대조군의 안약 투여에 의한 각막 염색을 나타낸다.
도 2a는 도 1의 정량화된 형광 염색을 보여주는 막대 그래프이다. (치료 그룹당 n=6; *p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001; SEM).
도 2b는 사전 투여 및 각막 화학적 화상 후 1일, 2일 및 3일에, aCT1 펩타이드(200μM 또는 5mM) 또는 비히클 대조군의 안약 투여에 의한 토끼 눈의 중심 각막 두께(μm)를 나타낸다.
도 3은 양측 중앙 경상피 광치료 각막절제술(PTK) 수술 및 aCT1 펩타이드(150μM) 또는 비히클 대조군에 의한 치료 후 토끼 눈의 1% 플루오레세인 염색을 나타낸다.
도 4a-4b는 aCT1 펩타이드에 의한 치료가 질소 머스타드(NM)에 대한 각막 노출 후에 발생하는 각막 비후를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 4a는 각막 두께를 나타내고 도 4b는 표시된 그룹에서 각막 두께의 정량화를 제공한다. 치료 그룹당 n=3.
도 5a-5d는 aCT1 펩타이드에 의한 치료가 질소 머스타드(NM)-노출된 각막에서 염증 반응을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 5a는 H&E 염색을 나타내고 도 5b는 염증 세포 침윤이 aCT1 치료된 그룹에서 상당히 감소되었음을 나타낸다. 도 5c는 전염증성 효소 COX2 염색을 나타내고 도 5d는 각막 조직에서 COX2의 정량화를 제공한다. (치료 그룹당 n=3; 일원 ANOVA, **p<0.01; ***p<0.001; SD).
도 6a-6d는 NM-노출된 각막의 aCT1 치료가 각막 섬유아세포 및 각막세포를 보호할 수 있음을 나타낸다. 도 6a는 H&E 염색을 제공하고 도 6b는 지시된 그룹에서 치료된 각막의 각막 섬유아세포 세포 수를 나타낸다. 도 6c는 각막 기질의 분해를 유도하는 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9)에 대한 IHC 염색을 나타낸다. 도 5d는 각막 기질에서 MMP-9 양성의 정량화를 제공한다. 치료 그룹당 n=3.
도 7a-7d는 aCT1 펩타이드에 의한 치료가 NM-노출된 각막에서 각막 혈관신생을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 7a는 H&E 염색에 의한 각 그룹의 각막 혈관을 나타내고 도 7b는 각 그룹에서 혈관 수의 정량화를 제공한다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 혈관신생을 자극하는 신호 단백질이다. 도 7c는 VEGF에 대한 염색을 나타내고 도 7d는 VEGF 양성 점수의 정량화를 제공한다. 치료 그룹당 n=3.

펩타이드 조성물을 눈에 국소 전달하기 위한 제제, 및 각막 손상과 같은 눈 장애 및 상태를 치료 또는 예방하는 방법이 본 명세서에 제공된다.

안과용 전달에 사용되는 치료제는 눈의 관련 조직으로 활성 약학적 성분의 효과적으로 전달뿐만 아니라 안전성을 보장하기 위해 제제 이질성, 안정성, 점도 및 pH를 관리하는 ICH 및 USP 가이드라인을 충족해야 한다. 안구 사용을 위한 펩타이드 함유 제제의 개발은 용액, 특히 눈에 국소 투여하기에 충분한 안정성과 점도를 제공하는 용액 유형에서 펩타이드의 열악한 화학적 및 물리적 안정성을 포함하는 독특한 문제를 제시한다. 안구 질환의 치료를 위한 충분한 생체이용률을 나타내는 펩타이드 함유 제제를 개발하지 못하는 것은 FDA 승인을 얻은 펩타이드 기반 안구 치료제의 부족에 대한 가능성 있는 이유이다. FDA 승인을 받은 펩타이드 함유 안구 제제는 거의 없다. 승인된 제제의 경우, 이러한 펩타이드 함유 제제의 투여 경로는 더 안전하고 덜 침습적인 국소 투여 경로 대신 유리체강내 주사이다(Mandal et al. 2018).

하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC)와 같은 점탄성 폴리머는 점안액 전달에 적합한 제제에서 펩타이드와 조합하여 사용된 적이 없다. 적절한 점도, 표면 장력 및 기타 물리적 특성을 가진 제제는 점안액이 펩타이드 전달을 보장하는 데 필요한 안구 표면과의 충분한 접촉 시간을 달성하는 데 필요하다. 소형 펩타이드는 HPMC, 카복시메틸셀룰로오스(CMC), 하이드록시에틸 셀룰로오스(HEC) 및 PF-127과 같은 점안액 점도를 수정하기 위해 사용되는 종래의 부형제에서 낮은 용해도를 나타낼 것으로 예상된다. 이러한 성분과 함께 펩타이드 응집은 제제를 안구 전달에 부적합하게 만드는 침전물 형성을 초래한다. 따라서, 당업계의 통상적인 교시는 소형 펩타이드 활성 약학적 성분과 함께 HPMC와 같은 점탄성 폴리머를 이용하는 제제와는 거리가 멀다. 대신, 소형 펩타이드 치료제의 전달을 위한 현재 제제는 안구 전달에 적합한 제제를 얻기 위해 비환원당, 아미노산 및 계면활성제를 펩타이드 또는 다른 거대분자와 혼합하는 것을 포함한다(Giannos et al. 2018, Kamerzell et al. 2011).

본 발명자들은 점탄성 폴리머와 소형 펩타이드 활성 성분의 조합이 펩타이드 용해도를 유지하고 펩타이드를 안구 표면에 국소 전달하기에 적합한 동점도를 갖는 제제를 생성한다는 것을 예상치 못하게 발견하였다. 제제는 놀랍게도 점안액 전달을 위한 제제에서 펩타이드의 안정한 용액 상태를 달성한다. 용액에서 펩타이드 안정성은 본 발명을 종래의 펩타이드 전달 시스템과 차별화시키는 중요한 성능 특징이다. 낮은 용해도 때문에, 펩타이드는 종래의 점안액 전달 시스템에서 침전되는 것으로 알려져 있다. 고점도 용액은 필터 멸균할 수 없다는 것은 잘 알려져 있고; 거대분자의 안구 전달을 위한 종래의 제제는 점탄성 폴리머를 포함하지 않는 수성 부형제를 사용하여 멸균 필터를 통과함으로써 멸균될 수 있는 저점도 용액을 얻었다. 따라서, 눈으로의 국소 전달에 적합한 제제를 얻기 위해 치료 펩타이드와 혼합된 HPMC의 예는 없다.

그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 눈으로의 국소 전달에 적합하고 안구 질환의 치료에 효과적인 aCT1 펩타이드 및 HPMC를 포함하는 안정한 제제를 얻었다. 이 제제는 HPMC 대신에 CMC, HEC 또는 플루로닉 겔(PF-127)을 포함하는 제제보다 예측할 수 없을 정도로 우수하였다. 예상외로, 펩타이드와 함께 점탄성 폴리머 HPMC를 사용하여 펩타이드를 안구 표면으로 전달하는 데 필요한 접촉 시간을 가능하게 하기에 충분한 점도를 지니면서도 0.22μM PVDF 또는 PES 막 필터를 통한 용액의 통과를 통해 멸균될 수 있는 제제를 생성하였다. 제제 멸균은 눈과 같은 민감한 조직에 치료용 펩타이드를 전달하는 데 필요하다. 0.22μM PVDF 또는 PES 막 필터를 통한 제제의 통과는 민감한 안구 조직으로의 약물 전달에 적합한 무균성 제제를 생성한다.

실시태양에서, 제제는 염화나트륨(NaCl), 염화칼륨(KCl), 요오드화나트륨(NaI), 염화마그네슘(MgCl₂), 불화칼륨(KF), 염화칼슘(CaCl₂), 사불화붕산나트륨(NaBF₄) 및/또는 브롬화나트륨(NaBr)을 더 포함한다. 실시태양에서, 제제는 NaCl을 포함한다. 실시태양에서, NaCl은 놀랍게도 NaCl을 포함하지 않는 제제에 비해 더 큰 안정성을 제공한다. 실시태양에서, NaCl은 약 0.5% 내지 약 2.0%, 또는 약 0.7% 내지 약 1.5%의 농도로 존재한다. 실시태양에서, NaCl은 약 0.25% 내지 약 0.9%의 농도로 존재한다. 실시태양에서, NaCl은 약 0.9%(w/w)의 농도로 존재한다.

실시태양에서, 본 명세서에 제공된 제제는 온도 범위에서 시간 경과에 따라 안정성을 나타낸다. 예를 들어, 제제는 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 8개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 2년, 적어도 3년 또는 적어도 6년 동안 펩타이드 안정성을 제공한다. 실시태양에서, 제제는 약 -20°, 약 5℃, 약 25℃ 및 이들 사이의 임의의 온도에서 펩타이드 안정성을 제공한다. 특정 실시태양에서, 제제는 약 -20°에서 적어도 6개월, 적어도 8개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년, 적어도 5년 또는 적어도 6년 동안 펩타이드 안정성을 제공한다. 실시태양에서, 본 명세서에서 제공되는 제제는 펩타이드(예를 들어, 알파 코넥신 펩타이드)를 포함하고, 여기서 펩타이드는 적어도 약 1개월에 걸쳐 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92% , 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95% 안정하다. 실시태양에서, 본 명세서에서 제공되는 제제는 펩타이드(예를 들어, 알파 코넥신 펩타이드)를 포함하고, 여기서 펩타이드는 적어도 약 3개월에 걸쳐 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92% , 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95% 안정하다. 실시태양에서, 본 명세서에서 제공되는 제제는 펩타이드(예를 들어, 알파 코넥신 펩타이드)를 포함하고, 여기서 펩타이드는 적어도 약 1년, 적어도 약 2년, 적어도 약 3년, 적어도 약 4년, 적어도 약 5년 또는 적어도 6년에 걸쳐 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95% 안정하다. 이러한 안정성은 본 명세서에서 제공되는 제제가 사용될 때 약 -20°, 약 5℃, 약 25℃ 및 이들 사이의 임의의 온도에서 달성된다.

실시태양에서, 본 명세서에서 제공되는 제제는 일정 범위의 보관 온도에서 시간 경과에 따라 불순물이 없거나 무시할 수 있는 불순물을 나타내거나 허용 가능한 수준의 불순물을 나타낸다. 예를 들어, 제제는 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년, 적어도 5년 또는 적어도 6년 동안 불순물이 없거나 무시할 수 있는 불순물을 나타내거나 허용 가능한 수준의 불순물을 나타낸다. 실시태양에서, 제제는 약 -20°, 약 5℃, 약 25℃ 및 이들 사이의 임의의 온도에서 불순물이 없거나 무시할 수 있는 불순물을 나타내거나 허용 가능한 수준의 불순물을 나타낸다. 실시태양에서, 제제 내 불순물의 무시할 수 있는 수준은 0.1% 미만일 수 있다. 실시태양에서, 제제 내 불순물의 허용 가능한 수준은 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만일 수 있다.

실시태양에서, 본 명세서에 제공된 제제는 쉽게 여과가능하다(예를 들어, 0.2㎛ PES 필터를 통해 여과가능). 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 제제는 펩타이드의 안구 투여에 이전에 사용된 제제와 비교하여 더 여과가능하다. 실시태양에서, 본 명세서에서 제공되는 제제는 HPLC, 펩타이드(예를 들어, 알파 코넥신 펩타이드), NaCl을 포함하고 제제 특성(예를 들어, 점도, 삼투압, 밀도, pH, 여과성)뿐만 아니라 안구 전달에 적합한 순도 및 안정성 프로파일을 갖기 위해 추가 비히클, 완충액 또는 부형제를 필요로 하지 않는다.

실시태양에서, 본 발명은 자극적이지 않고 안정하며 눈의 국소 사용에 적절한 특징을 갖는 치료 펩타이드(예를 들어, aCT1 펩타이드)를 함유하는 점안액 담체를 제공한다. 따라서, 실시태양에서, 본 발명은 안구 손상 또는 질환의 치료를 위한 알파 코넥신 폴리펩타이드를 포함하는 치료 점안액 조성물을 제공한다. 실시태양에서, 점안액 제제는 HPMC를 더 포함한다. 실시태양에서, 제제는 보관 동안 알파 코넥신 폴리펩타이드를 안정화시키는 완충제 및/또는 부형제를 더 포함한다. 실시태양에서, 알파 코넥신 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 카복실 말단 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 알파 코넥신 폴리펩타이드는 알파 코넥신 단백질 또는 이의 보존적 변이체의 카복시 최말단 4 내지 30개의 인접 아미노산을 포함, 구성 또는 포함할 수 있다. 실시태양에서, 상기 적어도 하나의 알파 코넥신 폴리펩타이드는 이의 아미노 말단에서 세포 내재화 수송체에 연결된다.

실시태양에서, 본 발명은 안과 적응증에서 치료적 응용을 위한 aCT1을 함유하는 안정한 점안액 담체의 제제 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 실시태양에서, 안과 적응증은 상처 치유, 염증 및 면역 조절, 조직 재생, 생체역학적 복원, 또는 각막 또는 다른 안구 조직의 임의의 부분에 영향을 미치는 다른 생리학적 상태의 치료를 포함한다. 본 명세서에서 제공되는 제제는 군인 또는 민간인 화학 상해 또는 각막 열상, 수술 관련 상태, 및 임의의 1차 안구 장애 또는 의학적 돌봄을 나타내거나 필요로 하는 2차 안구 상태를 나타내는 다른 상태의 급성 및 만성 징후를 포함하는 급성 및 만성 상해 및 상처를 치료하기 위해 투여될 수 있다. 이 제제는 적절한 눈 기능에 영향을 미치는 상해, 상처 및 상태에 적용할 때 aCT1 펩타이드의 치료량 및 유효량을 제공할 수 있는 물리화학적, 생화학적 및 유변학적 특성을 가진다.

실시태양에서, 멸균수에 첨가되는 임의의 형태의 하나 이상의 완충제는 생리학적으로 관련된 pH를 유지하기 위해 또는 pH 조절제의 첨가가 생리학적 관련 pH를 초래할 pH를 유지하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 붕산나트륨, 구연산, 질산나트륨, 히스티딘, 염산 또는 수산화나트륨과 같은 하나 이상의 pH 조절제가 pH 5 내지 8의 원하는 치료 범위 내에서 조절하기 위해 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 완충제는 비자극성, 비염색성, 비면역성이다. 실시태양에서, 바람직한 완충액은 히스티딘이다. 실시태양에서, 히스티딘은 약 20mM 내지 약 80mM의 농도로 존재한다. 실시태양에서, 히스티딘은 약 40mM의 농도로 존재한다.

실시태양에서, 제제는 장성 개질제를 더 포함한다. 예를 들어, 실시태양에서, 제제는 덱스트로스, 글리세린, 만니톨, 염화칼륨 또는 염화마그네슘을 더 포함한다. 실시태양에서, 제제는 메티오닌과 같은 항산화제를 더 포함한다.

실시태양에서, 본 명세서에 제공된 제제는 완충제를 포함하지 않는다. 실시태양에서, 추가 부형제가 제제로부터 제외되어, 제제는 부형제를 포함하지 않는다. 실시태양에서, 제제는 활성제 펩타이드, HPMC를 포함하고, 첨가된 부형제를 포함하지 않는다. 실시태양에서, 본 명세서에서 제공된 제제는 임의의 첨가된 당, 아미노산 및/또는 계면활성제를 포함하지 않는다. 실시태양에서, 제제는 활성제(예를 들어, 코넥신 펩타이드), HPMC, NaCl 및 물을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이루어진다. 실시태양에서, HPMC는 약 0.2% w/w 내지 약 1.0% w/w의 농도로 제제에 존재한다. 실시태양에서, HPMC는 약 0.5% w/w의 농도로 제제에 존재한다. 실시태양에서, HPMC는 약 1.0% w/w의 농도로 제제에 존재한다.

실시태양에서, HPMC와 같은 하나 이상의 폴리머가 분리된 폴리펩타이드를 안정화하기 위해 제제에 포함된다. 바람직하게는, 제제는 비자극성, 비착색성 및 비면역원성인 안정화제를 포함한다. 안정제의 첨가가 다양한 온도 조건하에서(예를 들어, 약 5℃에서, 약 10℃에서, 약 15℃에서, 약 20℃에서, 약 25℃에서, 약 30℃에서, 약 35℃에서, 또는 약 40℃에서) 및 상대 습도 범위하에서(예를 들어, 약 0% 상대 습도, 약 10% 상대 습도, 약 20% 상대 습도, 약 30% 상대 습도, 약 40% 상대 습도, 약 50% 상대 습도, 약 60% 상대 습도, 약 70% 상대 습도, 약 80% 상대 습도, 약 90% 상대 습도, 또는 약 100% 상대 습도에서) 의약품의 장기간(즉, 3개월 동안, 6개월 동안, 9개월 동안, 12개월 동안, 18개월 동안 또는 24개월 동안) 보관을 가능하게 한다. 실시태양에서, 본 발명은 또한 언급된 다양한 온도 및 상대 습도하에서 기술된 장기간 보관을 추가로 유지하기 위한 방부제를 포함할 수 있다.

예시적인 제제는 하기 표 1에 제공된다.

제제 No	펩타이드	pH	His (mM)	NaCl (mM)	MgCl2 (mM)	만니톨 (mM)	Met (mM)	HPMC (%)
1	20	6.5	30	130	0	0	0	0.19
2	20	6.0	20	65	50	0	10	0.15
3	20	5.5	10	65	0	150	0	0.11
4	20	6.0	40	100	25	0	0	0
5	10	6.5	40	65	50	0	5	0.19
6	10	6.0	30	130	0	0	0	0.15
7	10	6.0	20	100	25	0	0	0.11
8	10	7.0	10	65	0	150	20	0
9	20	7.0	30	130	0	0	0	0.19
10	20	6.5	20	65	0	150	0	0.15
11	20	7.0	20	0	0	270	10	0.11
12	20	6.0	20	130	0	0	0	0
13	5	5.5	20	0	0	270	0	0.15
14	5	6.0	10	130	0	0	10	0
15	20	6.6	0	150	0	0	0	0.5
16	20	5.0	0	150	0	0	0	0.5

실시태양에서, 본 명세서에서 제공되는 제제는 적어도 하나의 aCT 폴리펩타이드를 포함하는 국소 안과 제제를 이를 필요로 하는 대상에게 치료 투여하기 위한 단일 용량 또는 다중 용량을 함유하는 플라스틱 점안기 또는 유리 바이알에 포함될 수 있다. 실시태양에서, 제제는 유리 용기에 포함될 수 있으며, 다른 재료(예를 들어, 플라스틱)로 제조된 용기에 비해 유리 용기에서 더 안정적일 수 있다. 실시태양에서, 제제는 플라스틱 용기, 예를 들어, 플라스틱 점안기에 포함될 수 있다. 실시태양에서, 국소 안과 제제는 HPMC를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서에서 제공되는 제제는 투여에 적합하고 설계된 점안기 병 또는 바이알에 멸균되고 바로 사용할 수 있는 점안액 제제로 존재한다.

실시태양에서, 본 발명은 각막 손상 및 안구 외상을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다. 실시태양에서, 이 방법은 알파 코넥신 폴리펩타이드를 포함하는 본 명세서에서 제공되는 제제의 눈으로의 국소 투여를 포함한다. 실시태양에서, 손상 또는 외상은 각막 손상이 발생한 폐쇄 안구 손상 또는 상처이다. 각막 손상 또는 상처의 원인은 장애 또는 질환의 1차 및 2차 징후로서 급성 또는 만성 손상을 유발하는 폭발 손상, 화학적 및 열적 화상 및 기타 손상 또는 상태를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 실시태양에서, 각막 손상의 원인은 질소 머스타드 또는 황 머스타드(예를 들어, 머스타드 가스)와 같은 발포제 또는 수포제에 대한 노출이다. 실시태양에서, 장애 또는 질환은 당뇨병이다. 실시태양에서, 장애 또는 질환은 당뇨병성 각막병증이다. 실시태양에서, 만성 질환은 망막 질환이다. 실시태양에서, 본 발명은 망막 질환을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 실시태양에서, 망막 질환은 황반 변성(예를 들어, 연령 관련 황반 변성(AMD), 신생혈관성 연령 관련 황반 변성(nAMD)), 색소성 망막염(RP), 망막 박리, 당뇨병성 망막병증, 황반 부종, 당뇨병성 황반부종(DME), 및 망막정맥폐쇄(RVO) 후 발생하는 황반부종으로부터 선택된다. 실시태양에서, 질환 또는 장애는 안구 질환 또는 장애(예를 들어, 망막 장애)에 대한 치료가 유리체 절제술 및/또는 1회 이상의 유리체내 주사를 수반할 때 대상에서 발생하는 각막 결함을 수반한다.

실시태양에서, 본 명세서에 제공된 방법은 각막 흉터 또는 과도하고 조절되지 않는 염증 또는 면역 반응을 유발하는 임의의 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방을 포함한다. 실시태양에서, 대상은 표준 관리(standard of care) 지원 치료에도 불구하고 각막 손상 후(예를 들어, 약 2주 이내) 빠른 재상피화 및 폐쇄의 실패로 인해 발생하는 지속적인 각막 상피 결손(PED 또는 PCED)을 가진 인간 대상이다. PED는 감염 및 시력 상실을 포함한 심각한 합병증을 유발할 수 있다. 실시태양에서, PED는 안구 건조증에 의해 야기된다. 따라서, 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 제제 및 방법은 각막 손상 후 재상피화 속도를 향상시킴으로써 PED를 앓고 있거나 그렇지 않으면 각막 손상을 앓고 있는 대상을 치료한다. 실시태양에서, 제공된 제제의 투여는 재상피화 속도를 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 약 100%, 또는 그 이상 향상시킨다. 실시태양에서, 제공된 제제의 투여는 대상의 눈에 표준 치료 또는 무치료가 처리된 대조군에서의 재상피화 속도와 비교하여 재상피화 속도를 향상시킨다. 재상피화 속도는 각막 치유가 손상 후 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 또는 약 14일 내에 일어나도록 향상될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 제제 및 방법은 배타적 치료만으로 제한되지 않으며 다른 표준 관리 치료(들)과 함께 사용될 수 있다.

본 명세서에 제공된 제제 및 방법에 유용한 폴리펩타이드는 상처 치유 특성, 항염증 특성, 각막 기질의 보호 또는 재생과 관련된 특성 및/또는 항신생혈관 특성과 같은 특성을 갖는 임의의 폴리펩타이드일 수 있다. 실시태양에서, 폴리펩타이드는 약 1.0kDa 내지 약 10.0kDa의 분자량을 갖는 임의의 적합한 폴리펩타이드일 수 있다. 실시태양에서, 폴리펩타이드는 약 1.0kDa, 약 2.0kDa, 약 3.0kDa, 약 4.0kDa, 약 5.0kDa, 약 6.0kDa, 약 7.0kDa, 약 8.0kDa, 약 9.0kDa, 또는 약 10.0kDa의 분자량을 갖는 임의의 적합한 폴리펩타이드일 수 있다.

실시태양에서, 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 카복시 최말단 아미노산을 포함하는 임의의 폴리펩타이드일 수 있으며, 여기서 폴리펩타이드는 전장 알파 코넥신 단백질을 포함하지 않는다. 따라서, 실시태양에서, 제공된 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 세포질 N-말단 도메인을 포함하지 않는다. 실시태양에서, 제공된 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 2개의 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 실시태양에서, 제공된 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 4개의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 실시태양에서, 제공된 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 세포질 루프 도메인을 포함하지 않는다. 실시태양에서, 제공된 폴리펩타이드는 제 4 막횡단 도메인에 근접한 알파 코넥신의 세포질 카복실 말단 도메인의 서열 부분을 포함하지 않는다. 카복실 최말단 아미노산에서 약 17 내지 30개 아미노산에 일관되게 위치된 알파 코넥신에 보존된 프롤린 또는 글리신 잔기가 존재한다. 예를 들어, 인간 Cx43의 경우 아미노산 363의 프롤린 잔기는 카복실 최말단 아이소류신에서 뒤쪽으로 19개 아미노산에 위치한다. 다른 예에서, 병아리 Cx43의 경우 아미노산 362의 프롤린 잔기는 카복실 최말단 아이소류신에서 뒤쪽으로 18개 아미노산에 위치한다. 다른 예에서, 인간 Cx45의 경우 아미노산 377의 글리신 잔기는 카복실 최말단 아이소류신으로부터 뒤쪽으로 19개 아미노산에 위치한다. 다른 예에서, 쥐 Cx33의 경우 아미노산 258의 프롤린 잔기는 카복실 최말단 메티오닌에서 뒤쪽으로 28개 아미노산에 위치한다. 따라서, 실시태양에서, 제공된 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 상기 보존된 프롤린 또는 글리신 잔기에 근접한 아미노산을 포함하지 않는다. 따라서, 제공된 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 c-최말단 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 아미노산을 포함하는 알파 코넥신의 c-최말단 4 내지 30개 아미노산을 포함할 수 있다. 예시적인 알파 코넥신 폴리펩타이드는 미국 특허 번호 7,786,074; 7,888,319; 8,357,668; 8,809,257; 8,916,515; 8,859,733; 8,846,605; 9,161,984; 9,394,351; 9,408,381; 9,844,214; 9,855,313; 10,398,140; 및 10,398,757, 및/또는 국제 특허 출원 번호 PCT/US2018/000035에 개시되며, 이들 각각의 전체 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.

코넥신은 세포간 통신을 담당하는 간극 연접 채널의 서브유닛 단백질이다(Goodenough and Paul, 2003). 뉴클레오타이드 서열의 보존 패턴에 기초하여, 코넥신 단백질을 암호화하는 유전자는 알파 및 베타 코넥신 유전자라고 하는 두 가지 계열로 나뉜다. 알파 코넥신의 카복시 최말단 아미노산 서열은 여러 가지 독특하고 보존된 특징을 특징으로 한다. 조직의 이러한 보존은 독특한 3D 구조를 형성하고, 여러 파트너 단백질과 상호 작용하고, 지질 및 막과의 상호 작용을 중재하고, DNA를 포함하는 핵산과 상호 작용하고, 막 채널을 통과 및/또는 차단하고 단백질 분해 절단, 단백질 가교, ADP-리보실화, 글리코실화 및 인산화에 대한 합의 모티프를 제공하는 aCT 펩타이드의 능력과 일치한다. 따라서, 제공된 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 카복시-말단에 대한 상기 단백질의 결합을 정상적으로 매개하는 단백질의 도메인과 상호작용한다. 예를 들어, 신장모세포종 과발현 단백질(NOV)은 Cx43 c-말단 도메인과 상호작용한다(Fu et al., J Biol. Chem. 2004 279(35):36943-50). 이 단백질과 다른 단백질은 알파 코넥신의 카복시-말단과 상호작용하고 거대분자 복합체를 형성하는 다른 단백질과 추가로 상호작용하는 것으로 여겨진다. 따라서, 제공된 폴리펩타이드는 예를 들어 Cx43 간극 연접 채널의 응집 조절에 관여하는 것과 같은 분자 기계의 작동을 억제할 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 폴리펩타이드는 알파 코넥신 또는 이의 보존적 변이체의 카복시-말단 아미노산 서열을 포함한다. 실시태양에서, 폴리펩타이드는 아미노산 서열 RPRPDDLEI(SEQ ID NO: 2)를 포함하거나 이로 이루어진다. 실시태양에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기술된 바와 같이 aCT1이다. 용어 "aCT1"은 본 명세서에서 "αCT1", "aCT", "aCT-1", "ACT" 및 "ACT-1"과 상호교환적으로 사용된다. aCT1은 막관통 간극 연접 단백질 Cx43(17-25aa; RPRPDDLEI; SEQ ID NO:2)의 C-말단 PDZ 결합 도메인에 대한 안테나페디아 세포 내재화 도메인(1-16aa; RQPKIWFPNRRKPWKK; SEQ ID NO: 7)의 연결을 기반으로 하는 컴팩트한 2-도메인 디자인을 갖는 분자량 3597.33 Da의 25 aa 펩타이드이다. 따라서, 전체 aCT1 서열은 RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDLEI(SEQ ID NO: 9)이다. aCT1 및 관련 펩타이드는 Cx43과 단단한 연접 단백질 폐색대-1(ZO-1)을 포함하는 C-말단 결합 파트너 사이의 분자 상호 작용을 조절하여 간극 연접의 크기와 안정성을 증가시킨다. 이것은 Cx43에서 세린 368(S368) 아미노산의 인산화로 이어지고 반채널에서 간극 연접 세포간 채널로의 세포 표면 Cx43의 전환에 유리하다. S368의 인산화는 aCT1이 분해된 후 오랫동안 ZO-1이 Cx43의 C-말단에 결합하는 것을 방지하여, 치료 지속을 허용한다. 동시에, aCT1은 세포막에서 ZO-1을 안정화시켜, 부상에 대한 반응으로 연접 분해를 방지하고 상피 세포의 장벽 기능을 보존한다. 결과는 세포 통신 증가, 염증 반응 약화, 전섬유화 세포의 침윤 및 증식 감소를 포함하는 다양한 유익한 효과를 가져오는 간극 연접(세포간 통신)와 밀착 연접(세포간 연접)의 안정화이다. 총체적으로, aCT1에 의해 촉진되는 분자 및 세포 이벤트는 조직 무결성을 보존하고 손상 확산을 줄이며 병적 염증을 완화하고 치유 및 조직 재생을 가속화한다.

실시태양에서, 본 명세서에 제공된 조성물 및 방법은 각막 손상의 진행을 예방, 치료 및/또는 완화하는 것과 관련이 있다. 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 조성물 및 방법은 각막 손상의 진행을 예방, 치료 및/또는 완화하는 것과 관련이 있다. 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 제제는 각막 손상의 진행을 예방, 치료 및/또는 완화하는 데 사용하기 위한 것이다. 실시태양에서, 각막 손상을 예방하거나 치료하기 위한 의약의 제조에서 aCT1의 용도가 본 명세서에 제공된다.

제공된 폴리펩타이드의 aCT 서열은 임의의 알파 코넥신으로부터 유래될 수 있다. 따라서, 제공된 폴리펩타이드의 알파 코넥신 성분은 인간, 뮤린, 소, 모노트렌, 유대류, 영장류, 설치류, 고래류, 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 척색동물, 원척색동물 또는 다른 알파 코넥신으로부터 유래될 수 있다. 따라서, 제공된 폴리펩타이드는 마우스 코넥신 47, 인간 코넥신 47, 인간 코넥신 46.6, 소 코넥신 46.6, 마우스 코넥신 30.2, 래트 코넥신 30.2, 인간 코넥신 31.9, 개 코넥신 31.9, 양 코넥신 44, 소 코넥신 44, 래트 코넥신 33, 마우스 코넥신 33, 인간 코넥신 36, 마우스 코넥신 36, 래트 코넥신 36, 개 코넥신 36, 병아리 코넥신 36, 지브라피쉬 코넥신 36, 바스 코넥신 35, 바스 코넥신 35, 도룡뇽 코넥신 35, 복어 코넥신 36, 인간 코넥신 37, 침팬지 코넥신 37, 개 코넥신 37, 비단털등줄쥐 코넥신 37, 마우스 코넥신 37, 설치류 코넥신 37, 래트 코넥신 37, 마우스 코넥신 39, 래트 코넥신 39, 인간 코넥신 40.1, 발톱개구리 코넥신 38, 제브라피쉬 코넥신 39.9, 인간 코넥신 40, 침팬지 코넥신 40, 개 코넥신 40, 소 코넥신 40, 마우스 코넥신 40, 래트 코넥신 40, 비단털등줄쥐 코넥신 40, 병아리 코넥신 40, 인간 코넥신 43, 긴꼬리원숭이 코넥신 43, 굴토끼 코넥신 43, 땅다람쥐 코넥신 43, 비단털등줄쥐 코넥신 43, 난쟁이햄스터 코넥신 43, 래트 코넥신 43, 서스 코넥신 43, 황금비단털쥐 코넥신 43, 마우스 코넥신 43, 기니피그 코넥신 43, 소 코넥신 43, 노루궁뎅이 코넥신 43, 병아리 코넥신 43, 발톱개구리 코넥신 43, 굴토끼 코넥신 43, 잉어 코넥신 43, 제브라피쉬 코넥신 43, 자이언트 다니오 코넥신 43, 제브라피쉬 코넥신 43.4, 제브라피쉬 코넥신 44.2, 제브라피쉬 코넥신 44.1, 인간 코넥신 45, 침팬지 코넥신 45, 개 코넥신 45, 마우스 코넥신 45, 소 코넥신 45, 래트 코넥신 45, 병아리 코넥신 45, 복어 코넥신 45, 병아리 코넥신 45, 인간 코넥신 46, 침팬지 코넥신 46, 마우스 코넥신 46, 개 코넥신 46, 래트 코넥신 46, 황금비단털쥐 코넥신 46, 비단털등줄쥐 코넥신 46, 병아리 코넥신 56, 제브라피쉬 코넥신 39.9, 소 코넥신 49, 인간 코넥신 50, 침팬지 코넥신 50, 래트 코넥신 50, 마우스 코넥신 50, 개 코넥신 50, 양 코넥신 49, 황금비단털쥐 코넥신 50, 비단털등줄쥐 코넥신 50, 병아리 코넥신 50, 인간 코넥신 59, 또는 다른 알파 코넥신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 코넥신의 ACT를 포함할 수 있다.

알파 코넥신의 20-30 카복시 최말단 아미노산 서열은 독특하고 보존된 조직을 특징으로 한다. 이 독특하고 보존된 조직은 유형 II PDZ 결합 모티프(Φ-x-Φ; 여기서 x = 임의의 아미노산 및 Φ = 소수성 아미노산) 및 이 모티프에 근접한 프롤린(P) 및/또는 글리신(G) 힌지 잔기; 고주파수 포스포-세린(S) 및/또는 포스포-트레오닌(T) 잔기; 및 높은 빈도의 양전하 아르기닌(R), 리신(K) 및 음전하 아스파르트산(D) 또는 글루탐산(E) 아미노산을 포함한다. 많은 알파 코넥신의 경우, P 및 G 잔기는 카복시 말단 유형 II PDZ 결합 모티프에 근접한 클러스터 모티프에서 발생한다. 대부분의 알파 코넥신의 S 및 T 인-아미노산은 또한 일반적으로 군집된 반복체 유사 모티프로 조직된다. 이 조직은 특히 Cx43의 경우이며, 여기서 20개의 카복실 최대 아미노산의 90%가 후자의 7개 아미노산으로 구성된다. 서열의 높은 보존의 추가 예에서, Cx43의 ACT 펩타이드 조직은 인간에서 어류까지 고도로 보존되어 있다.

따라서, 한 양태에서, 제공된 폴리펩타이드는 1) 유형 II PDZ 결합 모티프, 2) 프롤린(P) 및/또는 글리신(G) 힌지 잔기; 3) 포스포-세린(S) 및/또는 포스포-트레오닌(T) 잔기의 클러스터; 및 4) 높은 빈도의 양전하 아르기닌(R) 및 라이신(K) 및 음전하 아스파르트산(D) 및/또는 글루탐산(E) 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 모티프 중 1개, 2개, 3개 또는 모두를 포함한다. 다른 양태에서, 제공된 폴리펩타이드는 카복시 말단에 유형 II PDZ 결합 모티프, PDZ 결합 모티프에 근접한 프롤린(P) 및/또는 글리신(G) 힌지 잔기, 및 힌지 잔기에 근접한 양전하 잔기(K, R, D, E)를 포함한다.

PDZ 도메인은 원래 시냅스후 밀도 단백질 PSD95/SAP90, 초파리 종양 억제 인자 dlg-A 및 밀착 연접 단백질 ZO-1 내의 보존된 서열 요소로 확인되었다. 원래 GLGF 또는 DHR 모티프로 언급되었지만, 현재는 PDZ를 포함하는 처음 세 단백질(PSD95/DLG/ZO-1)을 나타내는 약어로 알려져 있다. 이러한 80-90개의 아미노산 서열은 현재 75개 이상의 단백질에서 확인되었으며 특징적으로 단일 단백질 내에서 여러 복제본으로 발현된다. 따라서, 한 양태에서, 제공된 폴리펩타이드는 PDZ 도메인을 포함하는 단백질에 대한 알파 코넥신의 결합을 억제할 수 있다. PDZ 도메인은 본 명세서에서 "PDZ 모티프"라고 하는 PDZ-결합 모티프에 의해 채워질 수 있는 구조적으로 잘 정의된 상호작용 '포켓'을 갖는 특정 유형의 단백질-상호작용 모듈이다. PDZ 모티프는 항상 그런 것은 아니지만 일반적으로 선단 세포내 카복실 말단에 위치하는 일치 서열이다. 4가지 유형의 PDZ 모티프가 분류되었다: 유형 I(S/T-x-Φ), 유형 II(Φ-x-Φ), 유형 III(Ψ-x-Φ) 및 유형 IV(D-x-V), 여기서 x는 임의의 아미노 산이고, Φ는 소수성 잔기(V, I, L, A, G, W, C, M, F)이고 Ψ는 염기성 친수성 잔기(H, R, K)이다. (Songyang, Z., et al. 1997. Science 275, 73-77). 따라서, 한 양태에서, 제공된 폴리펩타이드는 유형 II PDZ 결합 모티프를 포함한다.

특정 단백질이 본 명세서에서 언급될 때, 변이체, 유도체 및 단편이 고려된다. 단백질 변이체 및 유도체는 당업자에게 잘 알려져 있으며 아미노산 서열 변형을 수반할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 변형은 일반적으로 치환, 삽입 또는 결실 변이의 세 부류 중 하나 이상에 속한다. 삽입은 아미노 및/또는 카복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 삽입은 일반적으로 아미노 또는 카복실 말단 융합의 것보다 더 작은 삽입, 예를 들어 1 내지 4개의 잔기 정도일 것이다. 결실은 단백질 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 특징으로 한다. 이러한 변이체는 일반적으로 단백질을 암호화하는 DNA에서 뉴클레오타이드의 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 제조되어, 변이체를 암호화하는 DNA를 생성한 다음 재조합 세포 배양에서 DNA를 발현한다. 공지된 서열을 갖는 DNA의 소정 부위에 치환 돌연변이를 만드는 기술은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 M13 프라이머 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발을 포함한다. 아미노산 치환은 일반적으로 단일 잔기이지만 한 번에 여러 위치에서 발생할 수 있다; 삽입은 일반적으로 약 1 내지 10개의 아미노산 잔기 정도일 것이다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합은 결합되어 최종 구조체에 도달할 수 있다. 치환 변이체는 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입된 변이체이다.

예를 들어, 하나의 아미노산 잔기를 생물학적으로 및/또는 화학적으로 유사한 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것은 보존적 치환으로서 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 하나의 소수성 잔기를 다른 것으로, 또는 하나의 극성 잔기를 다른 것으로 대체하는 것이다. 각각의 명시적으로 개시된 서열의 보존적으로 치환된 변형은 본 명세서에 제공된 폴리펩타이드 내에 포함된다.

전형적으로, 보존적 치환은 생성된 폴리펩타이드의 생물학적 활성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다. 특정 예에서, 보존적 치환은 펩타이드의 생물학적 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 펩타이드 내의 아미노산 치환이다. 펩타이드는 2, 5 또는 10개의 보존적 치환과 같은 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 2-10개의 보존적 치환, 2-5개의 보존적 치환, 4-9개의 보존적 치환을 포함할 수 있다.

예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 PCR과 같은 표준 절차를 사용하여 해당 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 조작함으로써 하나 이상의 보존적 치환을 함유하도록 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 대안적으로, 표준 펩타이드 합성 방법을 사용하여 하나 이상의 보존적 치환을 함유하도록 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 알라닌 스캔은 아미노산 치환을 허용할 수 있는 단백질의 아미노산 잔기를 식별하는 데 사용될 수 있다. 한 예에서, 단백질의 생물학적 활성은 알라닌 또는 다른 보존적 아미노산(예를 들어, 아래에 열거된 것들)이 하나 이상의 천연 아미노산으로 대체되는 경우, 단백질의 생물학적 활성이 25% 이상, 예를 들어 20% 이하, 예를 들어 10% 이하로 감소되지 않는다.

개시된 조성물에 통합될 수 있는 수많은 아미노산 및 펩타이드 유사체가 존재하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 수많은 D 아미노산이 있다. 천연 발생 펩타이드의 반대 입체이성질체 뿐만 아니라 펩타이드 유사체의 입체이성질체가 개시되어 있다. 이러한 아미노산은 선택한 아미노산으로 tRNA 분자를 충전하고 예를 들어 앰버 코돈을 활용하여 특정 부위에 특정 방식으로 유사 아미노산을 펩타이드 사슬에 삽입하는 유전자 구조체를 조작함으로써 폴리펩타이드 사슬에 쉽게 통합될 수 있다(Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994), 이들 모두는 적어도 아미노산 유사체와 관련된 물질에 대해 본 명세서에 참조로 포함된다).

D-아미노산은 펩티다아제 등에 의해 인식되지 않기 때문에 보다 안정한 펩타이드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 동일한 유형의 D-아미노산(예를 들어, L-라이신 대신에 D-라이신)에 의한 공통 서열의 하나 이상의 아미노산의 체계적 치환은 보다 안정한 펩타이드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 잔기는 2개 이상의 펩타이드를 함께 고리화하거나 부착시키는 데 사용될 수 있다. 이것은 펩타이드를 특정 형태로 제한하는 데 도움이 될 수 있다. (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), 참조로 본 명세서에 포함된다).

따라서, 제공된 폴리펩타이드는 알파 코넥신(ACT)의 c-말단의 보존적 변이체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 유전자 및 단백질의 임의의 변이체, 변형 또는 유도체를 정의하는 한 가지 방법은 특정 공지된 서열에 대한 서열 동일성(또한 본 명세서에서 상동성이라고도 함) 측면에서 변이체, 변형 및 유도체를 정의하는 것으로 이해된다. 명시된 또는 알려진 서열과 적어도 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 퍼센트 서열 동일성을 갖는 본 명세서에 개시된 핵산 및 폴리펩타이드의 변이체가 구체적으로 개시된다. 당업자는 2개의 단백질 또는 핵산의 서열 동일성을 결정하는 방법을 쉽게 이해한다. 예를 들어, 서열 동일성이 가장 높은 수준이 되도록 2개의 서열을 정렬한 후에 서열 동일성이 계산될 수 있다. 서열 동일성을 계산하는 또 다른 방법은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다.

따라서, 제공된 폴리펩타이드는 알파 코넥신(ACT)의 c-말단과 적어도 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 퍼센트 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 제공된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, 또는 본 명세서에 제공된 임의의 서열과 적어도 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 퍼센트 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시태양에서, 폴리펩타이드는 세포 내재화 수송체 또는 서열을 포함한다. 세포 내재화 서열은 당업계에 공지되거나 새롭게 발견된 임의의 내재화 서열 또는 이의 보존적 변이체일 수 있다. 세포 내재화 수송체 및 서열의 비제한적 예는 안테나페디아 서열, TAT, HIV-Tat, 페네트라틴, Antp-3A(Antp 돌연변이체), 부포린 II, 트랜스포탄, MAP(모델 양친매성 펩타이드), K-FGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, HN-1, BGSC(비스-구아니디늄-스페르미딘-콜레스테롤) 및 BGTC(비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤)를 포함한다. 예시적인 세포 내재화 수송체는 표 2A에 제공된다.

표 2A. 예시적인 세포 내재화 서열

현재 알려져 있거나 나중에 확인되는 임의의 다른 내재화 서열은 본 발명의 펩타이드와 조합될 수 있다.

제공된 폴리펩타이드는 임의의 본 명세서에 제공된 세포 내재화 서열과 조합된 임의의 aCT 서열(예를 들어, 본 명세서에 개시된 임의의 aCT 펩타이드)을 포함할 수 있다. 상기 조합의 예는 표 2B에 제공되어 있다. 따라서, 제공된 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:7을 포함하는 안테나페디아 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 제공된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, 또는 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

표 2B. 세포 내재화 서열(CIS)을 갖는 ACT 폴리펩타이드 세포 내재화 서열(CIS)을 갖는 aCT 폴리펩타이드

또한 본 명세서에 제공된 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 개시된 핵산은 예를 들어 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체 또는 뉴클레오타이드 대체물로 구성된다. 이들 및 다른 분자의 비제한적 예가 본 명세서에서 논의된다. 예를 들어, 벡터가 세포에서 발현될 때, 발현된 mRNA는 전형적으로 A, C, G 및 U로 구성될 것이라는 것이 이해된다. 따라서, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, 또는 SEQ ID NO:12를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다.

실시태양에서, 약학적으로 허용 가능한 담체에 본 명세서에 제공된 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터 중 하나 이상을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다. 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 담체에 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:9를 포함하는 조성물이 제공된다. 실시태양에서, 조성물은 미세담체에 캡슐화된 본 명세서에 제공된 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 실시태양에서, 조성물은 본 명세서에 제공된 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 폴리펩타이드는 나노입자 또는 엑소좀에 있다.

실시태양에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 나노입자 또는 엑소좀을 포함하는 약물 로딩된 미세담체 제제를 포함한다. 실시태양에서, 나노입자의 크기는 약 100nm 내지 약 1000nm, 또는 약 100nm 내지 약 500nm, 또는 약 200nm 내지 약 250nm, 또는 약 100nm 내지 약 200nm이다.

실시태양에서, 제제는 약 0.01% w/w 내지 약 3.5% w/w, 또는 약 0.05% w/w 내지 약 3.0% w/w, 또는 약 0.07% w/w 내지 약 2.0% w/w, 또는 약 0.1% w/w 내지 약 1.0% w/w, 또는 약 0.1% w/w 내지 약 0.5% w/w, 또는 약 0.2% w/w 내지 약 0.8% w/w, 또는 약 0.03% w/w 내지 약 0.07% w/w, 또는 약 0.05% w/w의 폴리펩타이드를 포함한다. 실시태양에서, 제제는 약 0.035% w/w의 폴리펩타이드 또는 약 0.07% w/w의 폴리펩타이드 또는 약 0.1% w/w의 폴리펩타이드, 또는 약 1.0% w/w의 펩타이드, 또는 약 3.5% w/w의 폴리펩타이드를 포함한다.

실시태양에서, 제제는 약 0.00035mg/mL 내지 약 35mg/mL, 또는 약 0.001mg/mL 내지 약 20mg/mL, 또는 약 0.01mg/mL 내지 약 3.5mg/mL, 또는 약 0.1mg/mL 내지 약 1.0mg/mL, 또는 약 0.2mg/mL 내지 약 0.8mg/mL, 또는 약 0.3mg/mL 내지 약 0.7mg/mL의 폴리펩타이드를 포함한다. 실시태양에서, 제제는 약 0.1mg/mL, 약 0.2mg/mL, 약 0.3mg/mL, 약 0.35mg/mL, 약 0.4mg/mL, 약 0.5mg/mL, 약 0.6mg/mL, 약 0.7mg/mL, 약 0.8mg/mL, 약 0.9mg/mL, 또는 약 1.0mg/mL의 폴리펩타이드를 포함한다. 실시태양에서, 제제는 약 0.35mg/mL 또는 약 0.7mg/mL의 폴리펩타이드를 포함한다. 실시태양에서, 제제는 약 1mg/mL 또는 약 10mg/mL 또는 약 20mg/mL의 폴리펩타이드를 포함한다.

실시태양에서, 조성물은 약 1μM 내지 약 100,000μM, 또는 약 10μM 내지 약 50,000μM, 또는 약 100μM 내지 약 10,000μM, 또는 약 10μM 내지 약 9,000μM, 또는 약 50μM 내지 약 5,000μM, 또는 약 100μM 내지 약 2,000μM, 또는 약 200μM 내지 약 2,000μM, 또는 약 200μM 내지 약 1,000μM, 또는 약 50μM 내지 약 1,500μM의 폴리펩타이드, 또는 약 100μM 내지 약 1,000μM의 폴리펩타이드, 또는 약 500 내지 약 1,500μM의 폴리펩타이드를 포함하는 제제로 대상에게 투여된다. 실시태양에서, 조성물은 약 1μM, 약 5μM, 약 50μM, 약 100μM, 약 150μM, 약 200μM, 약 300μM, 약 400μM, 약 500μM, 약 600μM, 약 700μM, 약 800μM, 약 900μM, 약 1,000μM, 약 1,500μM, 약 2,000μM, 약 3,000μM, 약 4,000μM, 약 5,000μM, 약 6,000μM, 약 7,000μM, 약 8,000μM, 약 9,000μM, 약 10,000μM, 약 20,000μM, 약 25,000μM, 약 50,000μM, 약 75,000μM, 약 100,000μM, 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 제제로 대상에게 투여된다.

실시태양에서, 제제는 안구 손상을 야기한 사건 직후에 눈에 투여된다. 실시태양에서, 제제는 안구 손상을 야기한 사건의 약 1시간 이내, 약 2시간 이내, 약 3시간 이내, 약 4시간 이내, 약 5시간 이내, 약 6시간 이내, 약 8시간 이내, 약 12시간 이내, 약 18시간 이내, 또는 약 24시간 이내에 대상에게 투여된다. 실시태양에서, 제제는 안구 손상을 야기한 사건 후 적어도 약 2시간 후에 대상에게 투여된다. 실시태양에서, 제제는 매일, 예를 들어, 하루에 한 번, 또는 하루에 두 번, 및/또는 약 8시간마다 또는 약 12시간마다 대상의 눈에 투여된다. 실시태양에서, 제제는 안구 치유가 관찰될 때까지 투여된다. 실시태양에서, 제제는 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일 또는 그 이상 동안 투여된다. 실시태양에서, 제제는 만성적으로 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "만성적으로 투여되는"이라는 용어는 제제가 개방형 투여 요법을 위해 투여됨을 의미하며, 즉, 치료가 시작되고 무기한 기간 동안 및/또는 증상이 해소될 때까지 계속되도록 의도되는 등을 의미한다. 실시태양에서, 만성 질환 상태의 경우, 제제는 만성 질환 상태의 검출 시 눈에 투여되고 만성적으로 투여된다. 실시태양에서, 제제는 안구 건조증(DED)과 같은 만성 상태로부터 발생하는 각막 손상을 가진 대상에게 만성적으로 투여된다.

본 명세서에서 사용되는 "대상"은 척추동물, 보다 구체적으로 포유동물(예를 들어, 인간, 말, 돼지, 토끼, 개, 양, 염소, 비인간 영장류, 소, 고양이, 기니피그 또는 설치류), 물고기, 새, 파충류, 또는 양서류를 포함한다. 실시태양에서, 대상은 인간 대상이다. 이 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서 남성이든 여성이든 성인 및 신생아 대상뿐만 아니라 태아가 포함된다. 실시태양에서, 환자는 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상을 의미한다. 실시태양에서, 환자 모집단은 질환 또는 장애를 갖거나 특정 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있는 대상의 특정 정의된 집합을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "억제하다", "억제하는" 및 "억제"는 활성, 반응, 상태, 질환 또는 다른 생물학적 매개변수를 감소시키는 것을 의미한다. 이것은 활동, 반응, 상태 또는 질환의 완전한 손실을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 감소는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 그 사이의 임의의 감소량일 수 있다.

범위 및 값은 본 명세서에서 "약" 하나의 특정 값 및/또는 "약" 또 다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 그러한 범위가 표현될 때, 문맥이 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지의 범위가 또한 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주된다. 명시적으로 개시된 범위 내에 포함된 모든 개별 값 및 값의 하위 범위도 구체적으로 고려되며 문맥에서 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 개시된 것으로 간주되어야 한다. 전술한 내용은 특정한 경우에 이들 실시태양의 일부 또는 전부가 명시적으로 개시되는지 여부에 관계없이 적용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 등은 값의 맥락에서 사용될 때 일반적으로 명시된 값의 ±10%를 의미한다. 예를 들어, 약 0.5는 0.45와 0.55를 포함하고, 약 10은 9에서 11까지를 포함하고, 약 1000은 900에서 1100을 포함한다.

"치료하다" 또는 "치료"는 질환 또는 상태의 영향을 감소시키는 방법을 의미한다. 치료는 또한 단순히 증상보다는 질환 또는 상태 자체의 근본 원인을 줄이는 방법을 의미할 수 있다. 치료는 천연 수준으로부터의 임의의 감소 및/또는 질환의 임상 징후의 임의의 개선 및/또는 생존 또는 기능의 임의의 증가일 수 있다; 질환, 상태 또는 질환 또는 상태의 증상의 완전한 제거일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 각막 손상을 치료하기 위한 개시된 방법은 손상의 하나 이상의 증상의 감소가 있는 경우 또는 동일한 대상 또는 대조군 대상의 기본 수준과 비교할 때 대상의 상태가 개선되는 경우 치료인 것으로 간주된다. 따라서, 감소 또는 개선은 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 그 사이의 임의의 감소량일 수 있다. "예방하다" 또는 "예방" 등은 각막 손상의 발병을 예방하거나 발병률 또는 중증도를 감소시키는 방법을 의미한다.

본 명세서에 인용된 간행물, 특허 및 특허 출원은 구체적으로 그 전체가 참조로 포함된다. 기술된 발명이 이의 특정 실시태양을 참조하여 기술되었지만, 본 발명의 진정한 취지 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있고 등가물이 대체될 수 있음을 당업자는 이해해야 한다. 또한, 기술된 발명의 목적 취지 및 범위에 대해 특정 상황, 재료, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 채택하기 위해 많은 수정이 이루어질 수 있다. 그러한 모든 수정은 본 명세서에 첨부된 청구 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 설명된다. 그러나, 이들 실시예는 전술한 실시태양과 같이 예시적인 것이며 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 점에 유의해야 한다.

실시예

실시예 1. 완충 제제를 테스트하는 비교 연구

구연산염 완충액과 하이드록시에틸셀룰로오스(HEC) 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC)를 포함하는 제제에 대해 여과 가능성, 펩타이드 안정성 및 기계적 점도 연구를 수행하였다. 검증된 분석 방법으로 최종 aCT1 점안액 제제의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 안정성 및 불순물 분석을 수행하였다. 상이한 완충제 및 부형제의 조합을 포함하는 제제의 펩타이드 여과 가능성 및 펩타이드 안정성을 비교하기 위한 연구도 수행되었다.

먼저, 구연산염 완충액을 함유하는 HEC 및 HPMC 용액을 제조하고 여과 가능성을 테스트하였다. 테스트된 HEC 용액은 pH 6.0에서 10mM 구연산염 완충액에 0.2% w/w, 0.15% w/w 또는 0.125% w/w HEC를 함유하였다. 테스트된 HPMC 용액은 pH 6.0에서 10mM 구연산염 완충액에 0.5% w/w HPMC를 함유하였다. 두 용액 모두 0.07% ACT 펩타이드, 3.6kDa 펩타이드를 함유하였다.

0.2㎛ PES 필터를 통한 여과성에 대해 용액을 테스트하였다. 연구 결과는 HPMC 용액은 0.2μm PES 멤브레인 25mm 주사기 필터를 통해 0.5%(w/w) 농도에서 여과하기 쉬운 것으로 나타났다. 반면에, 가장 높은 HEC 용액(0.2%(w/w))은 PES 실린지 필터로 여과하기 어려웠을 뿐만 아니라 낮은 전단 혼합기(자기 교반 막대)로 제조할 때 진공 펌프가 있는 장치를 사용하여 0.2μm PES 필터로 여과하기 어려웠다. 더 높은 전단 균질기로 제조할 때, 고 농도의 HEC 용액이 여과하기 더 쉬웠다. 저농도 HEC 용액은 모두 0.2μm PES 필터를 통해 여과될 수 있다.

기계적 점도 연구는 TA AR1000 유량계를 사용하여 수행하였다. 0.01 내지 1,000 Pa의 전단 응력에서의 점도는 샘플 간격 500μM, 25℃, 평형화 시간 2분으로 결정하였다. 0.5% w/w HPMC 용액의 점도는 57.3mPaS이었고; 0.15% w/v HEC 용액의 점도는 3.7mPaS이었다.

0.07% aCT1 펩타이드, 10mM 구연산, 0.9% NaCl 및 0.2% HEC 또는 0.2% HPMC(pH 6.0)를 포함하는 유사한 제제를 펩타이드 안정성에 대해 평가하였다. 불순물은 0개월 및 3개월 시점에서 검출하였다.

요약하면, 제제는 멸균 여과될 수 있지만, 점도는 안구 표면 상의 유지에 적절한 범위 내에 있는 것으로 간주되지 않았다. 10.2 mPaS의 최소 전단 점도는 인간의 안구 유지에 필요하다(Zaki et al., 1986). 미국 약전(USP) 가이드라인은 18-28mPaS가 점안액 제제의 최적 점도 범위라고 명시한다. 또한, 0개월 및 3개월 안정성 시점에서 불순물이 검출되었다. 따라서, 이들 제제는 안구 전달에 적합하지 않았다. 종합하면, 연구는 구연산염 완충액의 포함이 놀랍게도 바람직하지 않은 특징을 가진 제제를 생산했음을 나타내었다.

구연산염 완충제를 포함하는 제제를 인산염 완충제를 포함하는 제제와 비교하였다. 하기 표 3에 나타낸 용액을 제조하였다. pH 4, 5 또는 6의 100mM 구연산염 완충액 및 6, 7 또는 8의 100mM 인산염 완충액을 제조하였다. 각각의 개별 완충액을 사용하여 0.5% w/V HPMC의 HPMC 용액을 제조하였다. HPMC 용액은 0.2μM PES 필터를 사용하여 여과하였다. 3.5mg/mL aCT1 펩타이드를 여과된 HPMC 용액에 첨가하고 균일하고 투명한 용액이 얻어질 때까지 교반 플레이트에서 혼합하였다. 그런 다음 용액을 크림프 밀봉이 있는 10mL 투명한 바이알로 여과하였다.

구연산염 및 인산염 완충제 제제

제제 ID	설명
5776	100mM 구연산염 완충액 pH 4.0 속 3.5mg/mL aCT1, 0.5% w/w HPMC
5777	100mM 구연산염 완충액 pH 5.0 속 3.5mg/mL aCT1, 0.5% w/w HPMC
5778	100mM 구연산염 완충액 pH 6.0 속 3.5mg/mL aCT1, 0.5% w/w HPMC
5779	100mM 인산염 완충액 pH 6.0 속 3.5mg/mL aCT1, 0.5% w/w HPMC
5780	100mM 인산염 완충액 pH 7.0 속 3.5mg/mL aCT1, 0.5% w/w HPMC
5781	100mM 인산염 완충액 pH 8.0 속 3.5mg/mL aCT1, 0.5% w/w HPMC

구연산염 완충액에서 더 낮은 pH(4 및 5)에서 용액을 여과하는 것은 매우 어려웠다. 100mM 구연산염 완충액 pH 6.0 및 100mM 인산염 완충액 pH 6.0에서 0.5% w/v HPMC 용액의 여과는 10mM 구연산염 완충액 pH 6.0에서 0.5% HPMC 용액(여과 가능성 연구에 사용됨)과 비교할 때 여과하기 약간 어려웠다. 모든 용액 중에서, FID5780(100mM 인산염 완충액 pH 7.0의 0.5% HPMC)은 여과하기 쉬웠다. 각 제제(상기 표 3에 나타낸 바와 같은 제제 ID 또는 FID)의 여과 용이성: FID 5780>5781>5779>5778. aCT1 펩타이드는 모든 용액에 빠르게 용해되었다.

그러나, 2주 및 4주 안정성 시점에서 각각의 제제에서 불순물이 검출되었다(표 4). 따라서, 구연산염 완충액과 같은 인산염 완충액의 포함은 양호한 펩타이드 안정성을 갖는 제제를 생산하지 못했다.

2주 및 4주 안정성 시점의 불순물

샘플 설명	온도	T0 전체 불순물/최대 불순물	T2W 전체 불순물/최대 불순물	T4W 전체 불순물/최대 불순물
10mM 구연산염 완충액 pH 4.0 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC	25℃	0.75%/0.37%	11.14%/6.39%	17.03%/8.48%
10mM 구연산염 완충액 pH 4.0 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC	40℃		30.38%/11.46%	84.56%/40.97%
10mM 구연산염 완충액 pH 5.0 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC	25℃	0.49%/0.22%	8.74%/1.72%	11.47%/3.10%
10mM 구연산염 완충액 pH 5.0 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC	40℃		14.90%/2.69%	19.13%/4.67%
10mM 구연산염 완충액 pH 6.0 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC	25℃	1.55%/0.41%	28.79%/11.57%	38.92%/15.92%
10mM 구연산염 완충액 pH 6.0 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC	40℃		27.72%/8.97%	31.03%/8.68%
10mM 인산염 완충액 pH 6.0 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC	25℃	1.05%/0.24%	24.37%/9.34%	34.80%/13.59%
10mM 인산염 완충액 pH 6.0 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC	40℃		27.8%/5.92%	37.31%/15.77%
10mM 인산염 완충액 pH 7.0 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC	25℃	0.49%/0.20%	13.44%/7.62%	21.91%/13.55%
10mM 인산염 완충액 pH 7.0 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC	40℃		53.82%/35.64%	71.95%/49.63%
10mM 인산염 완충액 pH 8.0 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC	25℃	1.06%/0.51%	37.92%/24.69%	56.67%/ 37.74%
10mM 인산염 완충액 pH 8.0 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC	40℃		96.29%/61.37%	72.82%/63.04%

pH 안정성 연구에서 낮은 검정 T0 테스트를 조사하고 HPMC를 포함하거나 포함하지 않는 제제의 필터 적합성을 평가하기 위해, 표 5에 나타낸 다음 제제를 제조하였다.

추가 구연산염 완충액 및 HPMC 제제

샘플 ID	설명
LBR1421-001-13A	10mM 구연산염 완충액 pH 5.0 속 aCT10.35mg/mL, 염화나트륨 0.8% w/v, HPMC 0.5% w/v
LBR1421-001-13B	10mM 구연산염 완충액 pH 5.0 속 aCT10.35mg/mL, 염화나트륨 0.8% w/v
LBR1421-001-13C	10mM 구연산염 완충액 pH 5.0 속 aCT13.5mg/mL, 염화나트륨 0.8% w/v, HPMC 0.5%w/v
LBR1421-001-13D	10mM 구연산염 완충액 pH 5.0 속 aCT1 3.5mg/mL, 염화나트륨 0.8% w/v

각 용액을 0.2μM PES 필터 또는 0.2μM PVDF 필터를 사용하여 여과하였다. 결과는 하기 표 6에 제공된다.

제제에 HPMC를 포함하거나 포함하지 않는 필터 적합성 및 분석 결과 평가

샘플 설명	Lot	필터	펩타이드 328967 분석법(% 레이블 클레임)
0.35 mg/mL aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13A1	사전-필터	118.5%
0.35mg/mL aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13A2	PES	116.4%
0.35mg/mL aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13A3	PVDF	113.9%
0.35mg/mL aCT1, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13B1	사전-필터	107.3%
0.35mg/mL aCT1, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13B2	PES	107.8%
0.35mg/mL aCT1, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13B3	PVDF	105.8%
3.5mg/mL aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13C1	사전-필터	113.2%
3.5mg/mL aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13C4	사전-필터 (플라스틱 용기)	106.7%
3.5mg/mL aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13C2	PES	109.4%
3.5mg/mL aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13C3	PVDF	109.1%
3.5mg/mL aCT1, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13D1	사전-필터	103.9%
3.5mg/mL aCT1, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13D4	사전-필터 (플라스틱 용기)	103.0%
3.5mg/mL aCT1, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13D2	PES	103.2%
3.5mg/mL aCT1, 0.8% NaCl pH 5.0 (구연산염)	LBR1421-001-13D3	PVDF	103.1%

구연산염 완충제를 함유하는 제제는 pH 4 또는 5에서 여과하기가 매우 어려웠다. pH 6에서 구연산염 및 인산염 완충제를 함유하는 제제는 여과하기가 매우 어려웠다. 따라서 예상량(% 레이블 클레임; 표 6)에 비해 여과 후 제제에 있는 것으로 결정된 펩타이드의 양은 일반적으로 적합한 범위(일반적으로 97%-115% 범위가 적합한 것으로 간주된다) 내에 있었지만, 제제는 PES 또는 PVDF 필터를 사용하여 적절하게 여과할 수 없었다.

점도 향상제로서 글리세린을 포함하거나 포함하지 않는 구연산염 완충액 대 인산염 완충액 제제의 3개월 안정성 연구의 데이터가 하기 표 7-10에 제공된다. aCT1 펩타이드 안정성은 이들 제제 중 몇몇에서 유리했지만, 5℃ 및 25℃에서 보관된 제제에 대해 테스트된 불순물 프로파일(표 9-10)은 허용 범위를 벗어났다.

5℃ 분석 결과

제제 ID (FID)	샘플 설명	T0 2 분석 (% LC 1 )	T3M 3 분석 (% LC)	T6M 4 분석 (% LC)
5903	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% 염화나트륨	96.5%	102.3% (플라스틱) 102.1% (유리)	100.7% (플라스틱) 102.2% (유리)
5905	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC, 2.25% 글리세린	95.6%	101.8% (플라스틱) 101.9% (유리)	100.7% (플라스틱) 101.7% (유리)
5904	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.035% aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% 염화나트륨	97.9%	93.5% (플라스틱) 92.0% (유리)	88.0% (플라스틱) 88.1% (유리)
5906	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.035% aCT1, 0.5% HPMC, 2.25% 글리세린	99.7%	91.0% (플라스틱) 95.6% (유리)	91.1% (플라스틱) 94.2% (유리)

¹ % LC = 레이블 클레임의 백분율

² T0 = 시간 제로

³ T3M = 시간 보관 3개월

⁴ T6M = 시간 보관 6개월

25℃/40% RH 분석 결과

표 6 - 가속 조건(25℃/40% RH)에서 보관된 구연산염 또는 인산염 완충액 제제의 aCT1 안정성
제제 ID (FID)	샘플 설명	T0 2 분석 (% LC 1 )	T3M 3 분석 (% LC)	T6M 4 분석 (% LC)
5903	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% 염화나트륨	96.5%	94.7% (플라스틱) 95.0% (유리)	88.4% (플라스틱) 95.0% (유리)
5905	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC, 2.25% 글리세린	95.6%	84.2% (플라스틱) 90.8% (유리)	NT5 (플라스틱) 80.9% (유리)
5908	10mM 인산염 완충액 pH 5 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC, 2.25% 글리세린	96.6%	84.0% (플라스틱) 91.4% (유리)	NT5 (플라스틱) NT5 (유리)
5904	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.035% aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% 염화나트륨	97.9%	73.5% (플라스틱) 78.6% (유리)	47.2% (플라스틱) 65.4% (유리)
5906	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.035% aCT1, 0.5% HPMC, 2.25% 글리세린	99.7%	35.8% (플라스틱) 81.6% (유리)	NT6 (플라스틱) NT6 (유리)
5909	10mM 인산염 완충액 pH 5 속 0.035% aCT1, 0.5% HPMC, 2.25% 글리세린	101.0%	42.8% (플라스틱) 80.8% (유리)	9.7% (플라스틱) 59.2% (유리)

¹ % LC = 레이블 클레임의 백분율

² T0 = 시간 제로

³ T3M = 시간 보관 3개월

⁴ T6M = 시간 보관 6개월

⁵ 테스트 되지 않음

5℃ 불순물 결과

제제 ID (FID)	샘플 설명	T0 1 전체 불순물/최대 불순물	T3M 2 전체 불순물/최대 불순물	T6M 3 전체 불순물/최대 불순물
5903	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% 염화나트륨	2.11%/0.69%	3.80%/1.59% (플라스틱) 3.90%/1.62% (유리)	4.81%/1.80% (플라스틱) 4.41%/1.80% (유리)
5905	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC, 2.25% 글리세린	2.15%/0.73%	4.20%/1.52% (플라스틱) 3.80%/1.46% (유리)	5.52%/2.20% (플라스틱) 4.73%/1.91% (유리)
5904	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.035% aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% 염화나트륨	3.35%/2.02%	6.01%/3.93% (플라스틱) 7.03%/4.13% (유리)	11.70%/5.61% (플라스틱) 11.61%/5.53% (유리)
5906	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.035% aCT1, 0.5% HPMC, 2.25% 글리세린	3.94%/2.46%	8.63%/6.91% (플라스틱) 5.75%/3.02% (유리)	12.24%/6.82% (플라스틱) 9.61%/3.60% (유리)

25℃/40% RH 불순물 결과

제제 ID (FID)	샘플 설명	T0 1 전체 불순물/최대 불순물	T3M 2 전체 불순물/최대 불순물	T6M 3 전체 불순물/최대 불순물
5903	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% 염화나트륨	2.11%/0.69%	13.64%/3.36% (플라스틱) 9.50%/3.04% (유리)	22.69%/9.11% (플라스틱) 13.28%/3.67% (유리)
5905	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC, 2.25% 글리세린	2.15%/0.73%	18.24%/5.90% (플라스틱) 11.80%/3.08% (유리)	NT4 (플라스틱) 25.44%/4.71% (유리)
5908	10mM 인산염 완충액 pH 5 속 0.35% aCT1, 0.5% HPMC, 2.25% 글리세린	2.07%/0.69%	22.72%/8.06% (플라스틱) 11.10%/2.82% (유리)	NT4 (플라스틱) NT4 (유리)
5904	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.035% aCT1, 0.5% HPMC, 0.8% 염화나트륨	3.35%/2.02%	18.70%/13.34% (플라스틱) 8.36%/3.90% (유리)	57.81%/25.91% (플라스틱) 31.14%/10.60% (유리)
5906	10mM 구연산염 완충액 pH 5 속 0.035% aCT1, 0.5% HPMC, 2.25% 글리세린	3.94%/2.46%	41.44%/36.45% (플라스틱) 17.61%/4.15% (유리)	NT4 (플라스틱) NT4 (유리)
5909	10mM 인산염 완충액 pH 5 속 0.035% aCT1, 0.5% HPMC, 2.25% 글리세린	3.25%/1.86%	45.53%/32.92% (플라스틱) 18.53%/6.72% (유리)	86.10%/44.39% (플라스틱) 40.49%/10.47% (유리)

종합하면, 연구는 놀랍게도 HPMC(및 HEC, CMC 또는 글리세린이 아님)를 포함하고 임의의 완충액을 포함하지 않는 제제만이 국소 안구 투여에 유리한 특성을 나타낸다는 것을 제안하였다.

실시예 2. 첨가제가 있거나 없는 HPMC 제제를 테스트하는 비교 연구

첨가제 만니톨, 에데트산이나트륨, 메타중아황산나트륨 및 비타민 E TPGS를 표 11에 제공된 제제에서 개별적으로 테스트하였다. 이들은 안구용으로 FDA 승인된 부형제이다.

첨가제 테스트에 사용되는 제제

구성요소	농도
aCT1 펩타이드	0.035% (w/w)
NaCl	0.9% (w/w)
HPMC	0.5% (w/w)
첨가제(1.0% 만니톨, 0.2% 에데트산이나트륨, 0.2% 메타중아황산나트륨 또는 0.25% 비타민 E TPGS)	(왼쪽에 표시된 w/w)
정제수	q.s.
pH	4.0 - 8.0

5℃ 분석 결과 - 플라스틱 용기

샘플 설명	T0 분석 (%LC)	T1M 분석 (%LC)	T3M 분석 (%LC)	T6M 분석 (%LC)
0.7 mg/mL aCT1 펩타이드 (Vit. E, 만니톨, EDTA)	100.4	102.2	99.3	103.0
0.7 mg/mL aCT1 펩타이드 (Vit E, TPGS, EDTA)	101.0	103.0	99.5	102.8
0.7 mg/mL aCT1 펩타이드 (Vit E, TPGS)	100.3	102.3	100.0	103.9
0.7 mg/mL aCT1 펩타이드 (EDTA)	101.5	102.8	99.2	100.2
0.7 mg/mL aCT1 펩타이드 (대조군 - 첨가제 없음)	100.7	102.3	99.1	100.7

5℃ 분석 결과 - 유리 용기

샘플 설명	T0 분석 (%LC)	T1M 분석 (%LC)	T3M 분석 (%LC)	T6M 분석 (%LC) Prep1 / Prep 2
0.7 mg/mL aCT1 펩타이드 (Vit. E, 만니톨, EDTA)	101.4	103.3	100.2	123.8/104.1
0.7 mg/mL aCT1 펩타이드 (Vit E, TPGS, EDTA)	101.2	103.2	102.0	107.4/112.1
0.7 mg/mL aCT1 펩타이드 (Vit E, TPGS)	100.5	102.6	100.8	110.9/105.3
0.7 mg/mL aCT1 펩타이드 (EDTA)	100.7	103.4	100.2	117.4/105.3
0.7 mg/mL aCT1 펩타이드 (대조군 - 첨가제 없음)	100.6	102.7	99.5	103.8/103.5

불순물 결과는 유리 용기 샘플에서 프렙 간(prep-to-prep) 불일치 및 이러한 테스트된 제제의 불순물 존재를 보여주었다. 테스트한 첨가제 중 어느 것도 제제에서 개선된 펩타이드 안정성을 나타내지 않았다. 따라서, 하기 실시예 4-6에 기술된 생체내 시험을 포함하는 추가 시험을 위해 이들 첨가제 모두를 포함하지 않는 제제를 선택하였다.

실시예 3. 점안액 투여를 위한 펩타이드를 포함하는 제제의 비교 생체내 연구

하기 표 14에 나타낸 부형제를 사용하여 100μM 내지 10,000μM 범위의 농도에서 aCT1 펩타이드를 함유하는 제제를 제조하고, 용해도 및 안구에 대한 효과적인 전달 가능성을 테스트하였다. 구체적으로, NaCl, 폴리머 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC), Pluronic® F-127(PF-127), 하이드록시에틸셀룰로오스(HEC) 및 카복시메틸셀룰로오스(CMC)를 함유하는 제제를 비교하였다. 테스트된 제제는 첨가제 또는 완충제를 포함하지 않았다.

비교 분석을 위한 비히클

비히클	농도 (w/v)
하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC)	0.5-1%
PF-127	20-25%
하이드록시에틸셀룰로오스(HEC)	0.5-1%
카복시메틸셀룰로오스(CMC)	0.5%
NaCl	0.9%

제제를 네덜란드 벨티드(Dutch Belted) 토끼의 눈에 국소적으로 투여하였다. aCT1 펩타이드는 모든 농도에서 식염수에 가용성이었지만, 제제는 약물을 각막으로 전달하기에 충분한 시간 동안 안구 표면과 접촉한 상태로 남아 있지 않았다. 점성 개질제 카복시메틸셀룰로오스(CMC)를 투여 제제에 첨가하면 응집이 발생하였다. 대조적으로, 제제에 점탄성 폴리머 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC)를 첨가하면 aCT1 펩타이드 응집 또는 침전이 발생하지 않았다.

실시예 4 1일 2회 투여의 내약성 및 분포 연구

연속 7일 동안 HPMC 제제에서 aCT1 펩타이드의 1일 2회 안구 투여의 안전성, 내약성 및 생체분포를 결정하기 위한 연구가 수행되었다.

표적 농도(하기 표 15의 투여 농도 참조)를 달성하기 위해 비히클(1% HPMC)에 적절한 양의 시험 물품을 혼합하여 투여 제제를 제조하였다. 제제는 1% w/w HPMC 및 0.9% w/w NaCl, 및 완충액, 방부제, 기타 비히클 및 기타 부형제를 포함하지 않았다. 제제 pH는 여과 후 기록되었고 제제의 농도에 따라 5.9 내지 7.6이었다. 각 눈에 0.1mL의 투여 부피로 8시간 간격으로 하루의 각 투여량을 제공하였다.

실험 디자인

그룹	치료	투여량 수준 (μmol/눈/투여량)	투여량 농도 (μM)	pH
1	비히클 대조군	0	0	7.2-7.6
2	aCT1	0.01	100	5.9
3	aCT1	0.1	1,000	6.3
4	aCT1	1.0	10,000	5.9-6.0

연속 7일 동안 1일 2회 aCT1의 국소 안구 투여는 내약성이 양호했고 케이지 측 또는 임상 관찰, 체중, 임상 병리, 장기 중량 또는 부검에서 어떠한 부작용 결과를 초래하지 않았다. 눈 검사는 대조군을 포함한 모든 그룹의 일부 동물에서 눈꺼풀과 결막의 자극, 각막 점상 및 눈꺼풀의 벗겨짐을 나타내었고; 이는 이러한 결과가 비히클의 점도 때문이지 aCT1 치료 때문이 아님을 나타낸다. aCT1에 노출된 안구 조직에서도 현미경적 소견은 없었다.

aCT1의 조직 분포는 0.1μmol/눈/투여량을 투여한 토끼에서 결정하였다. aCT1의 전혈 농도는 낮았지만 3마리의 수컷 토끼 모두에서 1일째 0.25시간에 측정 가능했으며 3.26±5.28ng/ml이었다. 1일째의 다른 모든 혈액 샘플과 7일째의 모든 혈액 샘플은 정량 하한(LLOQ) 미만이었다. 안구 조직에서 가장 높은 농도의 aCT1은 수컷과 암컷 모두의 눈꺼풀 결막에서 관찰되었다. 샘플링된 모든 동물은 1일과 7일째 투여 후 이 조직에서 정량화 가능한 농도의 aCT1을 가졌다. 가장 높은 평균 농도는 1일째 0.25시간에서, 939±228ng/g(수컷) 및 2730±697ng/g(암컷)이었다. 각막과 방수는 181±50.0ng/g(각막, 1일째, 암컷의 경우 0.25시간) 및 115±76.3ng/g(수양액, 1일째, 수컷의 경우 0.25시간)의 다음 최고 aCT1의 평균 수준을 가졌다. 유리체액은 1일과 7일째 용량 투여 후 각 시점에서 적어도 한 마리의 동물에서 정량화 가능한 수준의 aCT1을 포함하였다. aCT1은 1일째 0.25시간에 모든 토끼의 망막 조직에서 측정 가능했으며 농도 범위는 1.91ng/g(암컷 040) 내지 24.2 ng/g(암컷 24.2ng/g)이었다.

모든 조직에서 aCT1의 농도는 시간이 지남에 따라 감소하는 경향이 있었다. 수컷과 암컷 토끼에서 관찰된 aCT1 분포에는 일관된 차이가 없었다. 투여량 투여 전에 수집된 모든 혈액 및 조직 샘플은 aCT1에 대한 정량 하한치 미만이었다. aCT1에 대한 전신 노출은 1일째 눈에 안구 투여 후 0.25시간에 혈중 테스트 항목의 낮은 수준으로 나타난 바와 같이 경미하였다. 한 수컷도 7일째 4시간에 정량화할 수 있는 수준의 aCT1을 가졌다. aCT1은 모든 안구 조직에서 Tmax가 1일째 0.25시간이었기 때문에 안구 조직으로 빠르게 흡수되었다.

결론적으로, aCT1의 가장 높은 농도는 투여 제제와 직접 접촉하는 조직인 안검 결막에서 관찰되었다. 각막과 방수도 aCT1에 많이 노출되었다. 용액은 또한 망막을 포함하는 눈의 가장 안쪽 조직으로의 ACT의 전달을 달성했는데, 본 명세서에 기술된 바와 같이 눈으로의 펩타이드 전달과 관련된 문제를 고려할 때 놀라운 결과였다.

aCT1에 대한 안구 조직 및 혈액의 노출에도 불구하고, aCT1 치료에 기인할 수 있는 부작용은 없었고, aCT1에 노출된 안구의 조직병리학은 어떠한 비정상적인 소견도 나타내지 않았다. 따라서, 연구에서 최대 허용 용량(MTD)이 확인되지 않았다. 7일 동안 1일 2회 투여 시 무관찰 부작용 수준(NOAEL)은 1.0μmol/눈인 것으로 추정된다.

종합하면, 연구 결과는 HPMC가 aCT1 펩타이드에 대한 안과 전달 시스템에 사용될 수 있고 망막을 포함하는 관심 조직에서 aCT1의 치료 수준을 안전하게 달성할 수 있음을 나타내었다.

실시예 5. 각막 손상 및 HPMC 중 aCT1 펩타이드 치료 후 각막 재생 및 재상피화

각막 재상피화를 효과적으로 가속화하는 FDA 승인 치료제는 없다. aCT1 펩타이드가 안구 손상 후 각막 치유를 유도 및/또는 가속화할 수 있는 지를 결정하기 위한 연구가 수행되었다.

한 연구에서, 1% HPMC 속 200μM 및 5mM aCT1 제제가 토끼 눈에서 헵탄올-유도된 각막 침식(화학적 화상 손상) 후 각막 재생을 촉진하는 능력에 대해 테스트되었다. 제제는 1% w/w HPMC 및 0.9% w/w NaCl를 포함하고 완충액, 방부제, 기타 비히클 및 기타 부형제를 포함하지 않았다. aCT1 점안액은 손상 직후 투여한 다음 2일 동안 하루에 두 번 투여하였다. aCT1은 플루오레세인 염색(도 1 및 2a) 및 중앙 각막 두께(도 2b)로 측정한 바와 같이 화학적 화상 손상 후 각막 치유를 가속화하였다.

다른 연구에서, 토끼를 마취시키고 각막(양측)에 중심 직경 6.0mm x 150μm 깊이 손상(경상피 PTK 손상)을 입혔다. 손상 직후, 각막을 플루오레세인으로 염색하였고 손상의 크기를 모니터링하기 위해 이미지화하였다. 눈을 150μM aCT1 0.5% HPMC 또는 비히클 대조군으로 치료하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. aCT1 펩타이드로 치료한 눈은 각막 치유가 빨라졌다. 시기 적절한 상피 재포장이 기능 손실, 안구 이환율 및 시력 손실을 예방하는 데 중요하다는 점을 감안할 때, aCT1 치료된 눈과 대조군 눈 사이의 초기(3일 이내) 차이는 임상적으로 매우 중요하다.

실시예 6. 황 머스타드 유발 안구 손상의 aCT1 펩타이드 치료

황 머스타드(SM) 및 질소 머스타드(NM)는 눈, 피부 및 호흡계에 영향을 미치는 강력한 수포성 화학전 제제이다. 수포제 중에서 SM은 전쟁에서 가장 널리 사용되어 손상 및 전장 인과 관계를 초래하였다. 눈은 수포제 노출에 가장 민감한 조직으로 노출 후 2-6시간 후에 증상이 나타나고 몇 주 후에 치유된다. 안구 노출은 건조, 결막 반흔, 시력 감소, 지속적인 각막 결함, 염증 및 진행성 시력 저하로 이어지는 신혈관 형성과 같은 지연된 손상 증상과 관련이 있다. 현재 SM 및 NM을 포함한 안구 수포제에 대한 안구 노출을 위한 승인된 치료법은 없다.

따라서, 이러한 수포성 전쟁 제제의 치료에서 aCT1 점안액의 치료 가능성을 평가하기 위한 연구가 수행되었다. 뉴질랜드 백색 토끼(치료군당 n=3)를 식염수 중 1% 질소 머스타드(NM) 25μL에 노출시켰다. 각막은 비히클 대조군(0.5% HPMC) 또는 0.5% HPMC 속 200μM aCT1로, 또는 0.5% HPMC 속 5mM aCT1로 치료되었다. 제제는 0.5% w/w HPMC 및 0.9% w/w NaCl를 포함하였고 완충액, 방부제, 기타 비히클 및 기타 부형제를 포함하지 않았다. 노출 후 2시간에 치료를 적용한 다음 7일 동안 12시간마다 치료를 적용하였다. 건강한(손상되지 않은) 각막도 치료되지 않았거나 비히클로만 치료되었다. 노출 후 7일째에 동물을 안락사시켰다. 각막을 수집하여 조직학(H&E 염색) 또는 면역조직화학을 위해 처리하였다.

연구 결과는 도 4-7에 제공된다. ACT 치료는 NM 노출 후 각막 부종을 제한하였다. 도 4a 및 4b는 aCT1 펩타이드가 비치료 및 비히클 치료된 NM-노출된 각막과 비교하여 각막 부종 손상을 제한하였다는 것을 보여준다. aCT1 치료는 또한 NM 노출 후 각막에서 염증 유발 반응을 감소시켰다(도 5a-5d). 전염증 반응과 염증 세포의 모집은 각막 혼탁 및 흉터로 이어지는 조직 손상을 악화시킬 수 있다. H&E 염색은 aCT1이 비치료 및 비히클 치료된 NM-노출된 각막과 비교하여 NM-노출된 각막에서 각막 간질의 염증 세포 침윤을 상당히 감소시킨다는 것을 보여주었다(도 5a 및 5b). 전염증성 효소 COX-2의 발현은 또한 aCT1 치료된 그룹에서 감소되었으며(도 5c 및 5d), 이는 부분적으로 염증 세포 침윤의 감소를 매개할 수 있다.

각막 섬유아세포(각막 각질 세포라고도 함)에 의한 콜라겐 합성은 기질 유지 및 재생에 필수적이며, 각막 기질에서 매트릭스 메탈로펩티다아제-9(MMP-9)의 발현 및 활성 증가는 이의 분해를 유도한다. aCT1 치료는 aCT1 치료된 각막에서 각막 섬유아세포/각막 세포의 보호(도 6a 및 6b)뿐만 아니라 aCT1 치료된 각막에서 기질에서 MMP-9 발현의 감소(도 6c 및 6d)에 의해 입증된 바와 같이, NM 노출 후 각막 기질의 분해를 예방하고 재생을 촉진하였다.

수포제에 대한 안구 노출은 또한 각막 혈관신생을 유도하여 각막 혼탁 및 기능 장애를 초래한다. 이 연구는 aCT1이 각막 신생혈관 형성을 예방한다는 것을 보여주었다. 도 7a 및 7b는 aCT1 치료가 각막 기질에서 새로운 혈관의 형성을 제한함을 보여준다. 치료군에서 새로운 혈관의 부족은 혈관 내피 성장 인자(VEGF, 신생혈관 형성을 자극하는 신호 인자) 발현의 감소 패턴과 상응하였다(도 7c 및 7d).

종합하면, 연구 결과는 aCT1 제제의 투여가 황 머스타드-유도 안구 손상에 대해 보호하고 이러한 손상 후 각막 기질의 재생을 가속화하는 데 놀랍도록 강력하다는 것을 보여주었다. aCT1 펩타이드는 각막 치유에 필요한 여러 세포 유형과 활동에 긍정적인 영향을 미치므로 각막 손상을 효과적으로 치료하고 예방할 수 있다.

실시예 7. 치료 용도를 위한 최적의 aCT1 제제의 평가.

aCT1 펩타이드, 염화나트륨 및 HPMC(4000mPaS; 표 16)로 구성된 신규한 aCT1 점안액 제제의 특징을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 놀랍게도, 방부제, 부형제 또는 완충 용액이 없는 이 제제는 눈에 국소 전달하기 위한 권장 범위 내의 점도를 갖는 제제를 제공하고 보관 동안 펩타이드 안정성을 입증하였다. 또한, 이 제제의 회수 테스팅은 점안액 사양을 확인하기 위해 검증된 HPLC 테스트 방법과 제제의 호환성뿐만 아니라 멸균 여과의 실행 가능성을 입증하였다(표 17 및 18). 이 제제와 멸균 여과의 적합성 및 펩타이드 농도를 결정하기 위한 분석 방법을 평가하기 위해 검정을 수행하였다. 제품이 사양 내에서 유지되도록 하려면 분석 방법과의 호환성이 필요하다. aCT1 펩타이드의 완전한 회수는 유리 또는 플라스틱에 보관한 후 이 최적 제제의 멸균 여과 후에 입증되었다(표 17). 0.7% w/w 또는 1.8% w/w aCT1 펩타이드를 포함하는 제제에 대한 -20℃, 5℃ 및 25℃에서 0, 1 및 3개월 보관 시 펩타이드 안정성이 표 19에 도시되어 있다.

따라서, 테스트된 다양한 다른 비히클에 비해 그리고 방부제, 부형제 또는 완충액을 포함하는 제제와 비교하여 우수한 특성을 포함하여 눈에 펩타이드를 전달하기 위한 우수한 제제 특성을 갖는 안정한 점안액 제제가 본 명세서에 제공된다(실시예 1-3 참조). 본 명세서에서 제공되는 제제는 aCT1 펩타이드와 같은 펩타이드 치료제를 치료 용도로 눈에 최적으로 전달하기 위해 사용될 수 있다.

최적 점안액 제제

구성요소	농도(%w/w)
aCT1 펩타이드	0.08; 0.4; 및 2.0
염화나트륨(NaCl)	0.9
하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC), 4000 mPa.s	0.5
정제수	Q.S.

제제 분석 결과

샘플	보간	펩타이드 농도 (mg/mL)	% 레이블 클레임
0.8mg/mL (튜빙/필터 연구)	2-8℃에서 플라스틱 팔콘 튜브에 밤새 보관	0.81	101.29
0.8mg/mL (튜빙/필터 연구)	2-8℃에서 유리병에 밤새 보관	0.82	101.97
펌프가 있는 호박색 바이알의 0.8mg/mL 용액	동결(-20℃)	0.82	102.51

최적 제제 특성

특성	점안액 제제
밀도	0.99g/mL
pH	5.3
점도	20.4mPa.s
삼투압	288mOsm/kg

최적 점안액 제제의 펩타이드 안정성 테스팅

	0.07% w/w (0.7 mg/ml) aCT1 펩타이드			1.8% w/w (18 mg/ml) aCT1 펩타이드
온도	0개월	1개월	3개월	0개월	1개월	3개월
-20℃	88.2	84.8	84.2	90.5	87.4	87.5
5℃	88.2	85.2	83.2	90.5	87.7	86.0
25℃	88.2	84.5	81.2	90.5	87.2	85.3

실시예 8. 부형제 효과

다양한 제제 성분의 효과를 평가하였다. 결과는 표 20 및 21에 제공된다. NaCl은 특히 50mM 이상의 농도에서 소르비톨에 비해 더 나은 안정화를 제공하였다. 또한, 더 높은 펩타이드 농도에서 더 큰 안정성이 관찰되었다.

NaCl 대 소르비톨의 효과(pH 6.5에서 20mg/mL 펩타이드)

순도 상실 (%)	[NaCl] (mM)	소르비톨 (mM)
0.67	0.67	0.67
0.24	0.24	0.24
0.03	0.03	0.03
0.76	0.76	0.76
1.05	1.05	1.05

[펩타이드]/pH의 효과

순도 상실 (%)	[펩타이드] (mg/mL)	pH
0.44	0.8	6.5
0.39	5	6.5
0.30	10	6.5
0.19	15	6.5
0.06	20	6.5
0.33	20	7.0
0.50	20	7.5

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Claims (38)

1. 약 1.0 kDa 내지 약 10.0 kDa의 분자량을 갖는 활성 펩타이드 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC)를 포함하는 제제로서, 여기서 제제는 국소 안구 전달에 적합한 것인 제제.
2. 제 1 항에 있어서,
   HPMC는 약 0.01%(w/w) 내지 약 2.0%(w/w)의 농도로 제제에 존재하는 것인 제제.
3. 제 2 항에 있어서,
   HPMC는 약 0.05%(w/w) 내지 약 0.5%(w/w)의 농도로 제제에 존재하는 것인 제제.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   제제는 염화나트륨(NaCl)을 더 포함하는 것인 제제.
5. 제 4 항에 있어서,
   NaCl은 약 0.7% 내지 약 1.5%(w/w)의 농도로 존재하는 것인 제제.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   활성 펩타이드는 약 0.05%(w/w) 내지 약 0.1%(w/w)의 농도로 조성물에 존재하는 것인 제제.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
   제제는 약 18 내지 약 28 mPaS의 점도를 갖는 것인 제제.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
   활성 펩타이드는 알파 코넥신 펩타이드인 제제.
9. 제 8 항에 있어서,
   알파 코넥신 펩타이드는 알파 코넥신의 카복시 최말단 4 내지 30개의 인접 아미노산을 포함하는 것인 제제.
10. 제 9 항에 있어서,
    알파 코넥신 펩타이드는 알파 코넥신의 카복시 최말단 4 내지 30개의 인접 아미노산으로 이루어진 것인 제제.
11. 제 9 항에 있어서,
    펩타이드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 제제.
12. 제 11 항에 있어서,
    펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 아미노 서열을 포함하는 것인 제제.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩타이드는 세포 내재화 서열을 포함하는 것인 제제.
14. 제 13 항에 있어서,
    세포 내재화 서열은 안테나페디아, TAT, HIV-Tat, 페네트라틴, Antp-3A(Antp 돌연변이체), 부포린 II, 트랜스포탄, MAP(모델 양친매성 펩타이드), K-FGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB 1, Pep-7, HN-1, BGSC(비스-구아니디늄-스페르미딘-콜레스테롤) 및 BGTC(비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제제.
15. 제 14 항에 있어서,
    세포 내재화 서열은 안테나페디아이고, 서열은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제제.
16. 제 15 항에 있어서,
    펩타이드는 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 제제.
17. 제 16 항에 있어서,
    펩타이드는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제제.
18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제제는 점안액에 의한 투여에 적합한 제제.
19. 대상의 눈에 제 8 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 제제를 국소적으로 투여하는 단계를 포함하여, 필요로 하는 대상에서 안구 손상을 치료 또는 예방하는 방법.
20. 제 19 항에 있어서,
    제제는 안구 손상을 야기한 사건 직후에 투여되는 것인 방법.
21. 제 19 항에 있어서,
    폴리펩타이드는 안구 손상을 야기한 사건 후 적어도 약 2시간 후에 대상에게 투여되는 것인 방법.
22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안구 손상은 각막 손상인 방법.
23. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안구 손상은 화상 또는 폭발에 의해 유발되는 것인 방법.
24. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안구 손상은 화학적 또는 열 화상 손상인 방법.
25. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안구 손상은 만성 질환에 의해 유발되는 것인 방법.
26. 제 25 항에 있어서,
    만성 질환은 당뇨병인 방법.
27. 제 26 항에 있어서,
    만성 질환은 당뇨병성 각막병증인 방법.
28. 제 25 항에 있어서,
    만성 질환은 망막 질환인 방법.
29. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    손상은 안구 수술에 이차적인 것인 방법.
30. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 지속성 각막 상피 결함을 앓고 있는 방법.
31. 제 30 항에 있어서,
    지속성 각막 상피 결함은 안구 건조증으로부터 발생하는 것인 방법.
32. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안구 손상은 망막 손상인 방법.
33. 제 7 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 제제를 대상의 눈에 국소적으로 투여하는 단계를 포함하여, 대상에서 안구 손상 후 각막 재상피화를 촉진하는 방법.
34. 제 33 항에 있어서,
    안구 손상은 수술, 화학적 손상, 각막 열상 손상 또는 만성 질환으로 인한 것인 방법.
35. 제 33 항에 있어서,
    대상은 지속성 각막 상피 결함을 앓고 있는 방법.
36. 필요로 하는 대상에서 안구 손상을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 제 8 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 제제.
37. 대상에서 안구 손상 후 각막 재상피화를 촉진하는데 사용하기 위한 제 8 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 제제.
38. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서,
    대상은 지속성 각막 상피 결함을 앓고 있는 제제.