CN116710474A - 肽制剂及其眼科用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了适于局部眼部递送肽治疗剂的制剂。本公开还提供了用于治疗眼部损伤的组合物和方法。所述组合物和制剂可以包括治疗活性α连接蛋白肽。

Description

肽制剂及其眼科用途
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背景技术
角膜损伤和眼外伤有可能引发眼部发病，其严重程度可能包括视力丧失。对角膜可能的损伤是无限的，但为了解决作战士兵的烧伤和爆炸伤、以及糖尿病等疾病导致的继发性角膜损伤的发生率做出了重大努力，例证了对解决眼睛的多方面和复杂伤口愈合过程的生物治疗剂的需要。为了保持视敏度，角膜损伤治疗必须促进快速的角膜上皮再形成，减轻损伤进展/持续，并且根据受影响的角膜细胞类型/组织层，还促进其它受影响的组织层的再生。值得注意的是，如果角膜基质被穿透和损伤，则眼部治疗必须允许通过角膜细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化而适当愈合，但要防止肌成纤维细胞的过度作用，该过度作用可引起角膜浑浊和瘢痕形成。重要的是，炎性细胞浸润也需要考虑计算，因为不成比例的炎症可能具有有害作用。免疫作用的抑制可导致感染，而过度的炎症破坏正常的伤口愈合和再生。因此，对角膜造成的损伤需要对组织损伤后存在的几种不同细胞类型具有特定生物学效应的生物治疗，其中不同的细胞层和结构均匀性以及细胞外基质的组成对于适当的角膜生物力学和功能是至关重要的。
角膜损伤的当前护理标准(SOC，standard of care)包括眼部冲洗、润滑剂、人工泪液、抗生素、角膜绷带镜、睑缘缝合术或构建结膜瓣。这些治疗方法具有两个显著的局限性。首先，它们没有解决角膜伤口愈合中的基本生物学和分子过程，在角膜伤口愈合中治疗失败与严重的视力损伤或丧失相关。其次，正如战斗环境中由爆炸或燃烧装置引起的角膜损伤和创伤所体现的那样，在医疗设施有限的地方，这些SOC治疗要么不可能，要么很可能及时发生，而眼部伤口的治疗是次要的。
此外，显然需要具有对眼睛敏感组织提供安全有效治疗所需特征的的局部治疗制剂。特别地，开发用于眼部使用的含肽制剂存在独特的挑战；肽在溶液中的差的化学和物理稳定性限制了制剂的选择。用于眼部递送的治疗剂必须符合国际协调委员会(ICH)和美国药典(USP)的指南，该指南管理制剂的异质性、稳定性、黏度和pH，以确保安全性以及活性药物成分向眼部表面的有效递送。此外，当在传统滴眼剂载体中局部递送至眼时，大分子如蛋白质、抗体和小肽显示较差的生物利用度。
因此，非常需要能加速伤口愈合同时减轻导致角膜混浊和视力丧失的失调的生物过程的滴眼剂生物治疗剂。本公开解决了这一需要和其它需要。
发明内容
在一个方面，本公开提供了包含一种或多种肽的制剂，其中该制剂适于局部施用于眼睛。例如，所提供的制剂是滴眼剂制剂。在一个方面，本公开提供了用于治疗角膜损伤的制剂。
在实施例中，本公开提供了包含分子量为约1.0kDa至约10.0kDa的活性肽和羟丙基甲基纤维素(HPMC)的制剂，其中该制剂适于局部眼部递送。在实施例中，HPMC以约0.01％(w/w)至约2.0％(w/w)的浓度，或约0.1％(w/w)至约0.19％(w/w)的浓度存在于制剂中。在实施例中，HPMC以约0.1％、或约0.2％、或约0.3％、或约0.5％或约1.0％(w/w)的浓度存在于制剂中。在实施例中，制剂还包含氯化钠(NaCl)。在实施例中，NaCl以约0.5％至约2.0％、或约0.7％至约1.5％的浓度存在。在实施例中，NaCl以约0.25％至约0.9％的浓度存在。在实施例中，NaCl以约0.9％(w/w)的浓度存在。
在实施例中，制剂还包含张力调节剂。例如，在实施例中，制剂还包含葡萄糖、甘油、甘露醇、氯化钾或氯化镁。
在实施例中，活性肽以约0.005％(w/w)至约5％(w/w)、或约0.035％(w/w)至约3.5％(w/w)的浓度存在于组合物中。在实施例中，活性肽以约0.035％(w/w)至约3.0％(w/w)的浓度存在于组合物中。在实施例中，活性肽以约0.05％(w/w)至约2.5％(w/w)的浓度存在于组合物中。在实施例中，活性肽以约0.1％(w/w)至约2.0％(w/w)的浓度存在于组合物中。在实施例中，活性肽以约0.5％(w/w)至约1.5％(w/w)的浓度存在于组合物中。在实施例中，制剂的黏度为约18mPaS至约28mPaS。在实施例中，制剂的黏度为约18mPaS、约19mPaS、约20mPaS、约21mPaS、约22mPaS、约23mPaS、约24mPaS、约25mPaS、约26mPaS、约27mPaS或约28mPaS。在实施例中，制剂的pH为约5至约8、或约5至约7，或约5、约6、约7或约8。在实施例中，制剂的pH为约6.5。在实施例中，制剂的pH为约6.5至约7.5。在实施例中，制剂的pH为约6.5至约7.0。在实施例中，制剂具有约200至约350mOsm/kg的渗透浓度，例如约280至约350mOsm/kg，例如约288mOsm/kg。在实施例中，制剂的密度为约0.5g/mL至约2.0g/mL。在实施例中，制剂的密度为约0.5g/mL、约0.6g/mL、约0.7g/mL、约0.8g/mL、约0.9g/mL、约1.0g/mL、约1.1g/mL、约1.2g/mL、约1.3g/mL、约1.4g/mL、约1.5g/mL、约1.6g/mL、约1.7g/mL、约1.8g/mL、约1.9g/mL或约2.0g/mL。例如，在实施例中，制剂的密度为约0.99g/mL。
在实施例中，本文提供的制剂中的活性剂是α连接蛋白肽或其活性片段。例如，在实施例中，多肽包含α连接蛋白的羧基最末端(carboxy terminal-most)的4-30个连续氨基酸。在实施例中，多肽由α连接蛋白的羧基最末端的4-30个连续氨基酸组成。在实施例中，α连接蛋白为Connexin 37、Connexin 40、Connexin 43或Connexin 45。在实施例中，多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自以下构成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。在实施例中，多肽包含SEQ ID NO:2的氨基序列。在实施例中，多肽还包含细胞内化序列。在实施例中，细胞内化序列包含蛋白质的氨基酸序列，该蛋白质选自以下构成的组：触角蛋白、TAT、HIV-TAT、Pentratin、Antp-3A(Antp突变体)、Buforin II、Transportan、MAP(模型两亲性肽)、K-FGF、Ku70、朊病毒蛋白、pVEC、Pep-1、SynB 1、Pep-7、HN-1、BGSC(双胍-亚精胺-胆固醇)和BGTC(双胍-Tren-胆固醇)。在实施例中，细胞内化序列为触角蛋白，并且其中该序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在实施例中，多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自以下构成的组：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。在某些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:9的氨基序列。
在实施例中，本文提供的制剂适于局部眼部施用。在实施例中，施用是通过滴眼剂施用。
在实施例中，本公开提供了治疗或预防有需要的受试者的眼部损伤的方法，包括局部施用本文提供的制剂。在实施例中，本公开提供了用于在受试者的眼部损伤后加速角膜再上皮化的制剂和方法，该方法包括向受试者的眼睛局部施用本文提供的制剂。在实施例中，在引起眼部损伤的事件之后立即将制剂施用至眼睛。在实施例中，在引起眼部损伤的事件的约1小时内、约2小时内、约5小时内或约12小时内将多肽施用于受试者。在实施例中，在引起眼部损伤的事件后至少约2小时将多肽施用于受试者。在实施例中，将多肽每天两次、或约每8小时、或约每12小时施用至受试者的眼睛，直至观察到眼睛愈合。在实施例中，眼部损伤是角膜损伤。在实施例中，眼部损伤是视网膜损伤。在实施例中，眼部损伤由烧伤、爆炸或裂伤引起。在实施例中，眼部损伤是化学或热烧伤。在实施例中，眼部损伤是由眼睛与发疱剂(如芥子气等)接触引起的。在实施例中，眼部损伤由慢性疾病引起。在实施例中，慢性疾病是糖尿病或糖尿病性角膜病变。在实施例中，慢性疾病是视网膜疾病。在实施例中，受试者患有干眼症。在实施例中，受试者具有持续性角膜上皮缺陷，例如可由干眼症引起。在实施例中，损伤继发于眼外科手术、化学或热烧伤损伤或角膜裂伤。
在实施例中，本公开提供了用于治疗或预防有需要的受试者的眼部损伤的制剂，和/或用于在受试者的眼部损伤后加速角膜再上皮化的制剂。
附图说明
图1显示了角膜化学烧伤后10、24、36、48、72、96或120小时使用1％荧光素的角膜染色，以及化学损伤后两天每天两次施用aCT1(200μM或5mM)滴眼剂或载体对照的角膜染色。
图2A是显示图1的定量荧光染色的棒线图(每个治疗组n＝6；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；SEM)。
图2B显示了前剂量和角膜化学烧伤后第1天、第2天和第3天，施用aCT1肽滴眼剂(200μM或5mM)或载体对照的兔眼的角膜中心厚度(μm)。
图3显示了双侧中央经上皮光疗角膜切除术(PTK)手术和用aCT1肽(150μM)或载体对照治疗后的兔眼的1％荧光素染色。
图4A-4B显示了用aCT1肽治疗减少角膜暴露于氮芥(NM)后发生的角膜增厚。图4A显示了角膜厚度，且图4B提供了在所示组中角膜厚度的定量。每个治疗组n＝3。
图5A-5D显示了用aCT1肽治疗降低暴露于氮芥(NM)的角膜的炎症反应。图5A显示了H&E染色，且图5B显示了aCT1治疗组中炎性细胞浸润显著减少。图5C显示了促炎酶COX2染色，且图5D提供了角膜组织中COX2的定量。(每个治疗组n＝3；单因素方差分析，**p<0.01；***p<0.001；SD)。
图6A-6D显示了暴露于NM的角膜的aCT1治疗可保护角膜成纤维细胞和角膜细胞。图6A提供了H&E染色，且图6B显示了在所示组中治疗的角膜中的角膜成纤维细胞计数。图6C显示了基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的IHC染色，其导致角膜基质的降解。图5D提供了角膜基质中MMP-9阳性的定量。每个治疗组n＝3。
图7A-7D显示了用aCT1肽治疗减少了暴露于NM的角膜中的角膜新生血管。图7A显示了通过H&E染色的每组角膜中的血管，且图7B提供了每组中血管计数的定量。血管内皮生长因子(VEGF)是刺激新血管形成的信号蛋白。图7C显示了VEGF的染色，且图7D提供了VEGF阳性评分的定量。每个治疗组n＝3。
具体实施方式
本文提供了用于将肽组合物局部递送至眼睛的制剂，以及用于治疗或预防眼睛病症和病况(例如角膜损伤)的方法。
用于眼部递送的治疗剂必须满足ICH和USP的指南，该指南管理制剂的异质性、稳定性、黏度和pH，以确保安全性以及活性药物成分向眼部相关组织的有效递送。开发用于眼部使用的含肽制剂存在独特的挑战，包括肽在溶液中的化学和物理稳定性差，特别是在提供足够的稳定性和黏度以局部施用于眼睛的溶液类型中。未能开发对于治疗眼部病症表现出足够的生物利用度的含肽制剂，这可能是缺乏获得FDA批准的基于肽的眼部治疗剂的原因。含肽的眼用制剂很少被FDA批准。对于那些批准的制剂，这些含肽制剂的施用途径是玻璃体内注射(Mandal等人，2018)，而不是更安全和侵入性更小的局部施用途径。
黏弹性聚合物例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)还没有与肽组合用于适于滴眼剂递送的制剂中。具有适当黏度、表面张力和其它物理特性的制剂对于滴眼剂来说是必需的，以实现与眼部表面足够的接触时间，这是确保肽递送所必需的。预期小肽在用于改变滴眼剂黏度的常规赋形剂例如HPMC、羧甲基纤维素(CMC)、羟乙基纤维素(HEC)和PF-127中表现出差的溶解度。与这些成分组合的肽聚集导致沉淀物形成，这使得制剂不适合眼部递送。因此，本领域的常规教导远离利用黏弹性聚合物例如HPMC与小肽活性药物成分组合的制剂。相反，目前用于递送小肽治疗剂的制剂涉及将非还原糖、氨基酸和表面活性剂与肽或其它大分子混合以获得适于眼递送的制剂(Giannos等人，2018，Kamerzell等人，2011)。
本发明人出乎意料地发现，黏弹性聚合物与小肽活性成分的组合产生了一种制剂，该制剂保持肽溶解度并且具有适于将肽局部递送至眼表面的运动黏度。该制剂令人惊讶地实现了肽在用于滴眼剂递送的制剂中的稳定溶液状态。肽在溶液中的稳定性是区别本发明与常规肽递送系统的重要性能特征。由于溶解度差，已知肽在常规滴眼剂递送系统中沉淀出来。众所周知，高黏度的溶液不能过滤灭菌；用于眼部递送大分子的常规制剂使用不包括黏弹性聚合物的水性赋形剂来获得具有低黏度的溶液，该溶液可以通过穿过无菌过滤器来灭菌。因此，没有HPMC与治疗肽混合以获得适于局部递送至眼的制剂的实例。
然而，本发明人惊奇地获得了包含aCT1肽和HPMC的稳定制剂，其适于局部递送至眼睛并有效治疗眼部病症。该制剂不可预见地优于包含CMC、HEC或普朗尼克凝胶(PF-127)而非HPMC的制剂。出乎意料的是，使用黏弹性聚合物HPMC与肽得到了一种制剂，其黏度足以使肽递送至眼部表面所需的接触时间，并且可以通过使溶液通过0.22μMPVDF或PES膜过滤器而灭菌。无菌制剂对于将治疗性肽递送至敏感组织例如眼睛是必需的。制剂通过0.22μMPVDF或PES膜过滤器，产生无菌的制剂，其适于将药物递送至敏感眼部组织。
在实施例中，制剂还包含氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、碘化钠(NaI)、氯化镁(MgCl2)、氟化钾(KF)、氯化钙(CaCl2)、四氟硼酸钠(NaBF4)和/或溴化钠(NaBr)。在实施例中，制剂包含NaCl。在实施例中，相对于不包含NaCl的制剂，NaCl令人惊讶地提供了更大的稳定性。在实施例中，NaCl以约0.5％至约2.0％、或约0.7％至约1.5％的浓度存在。在实施例中，NaCl以约0.25％至约0.9％的浓度存在。在实施例中，NaCl以约0.9％(w/w)的浓度存在。
在实施例中，本文提供的制剂在一定温度范围内随时间表现出稳定性。例如，制剂提供肽稳定性持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少两个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少8个月、至少12个月、至少18个月、至少2年、至少3年或至少6年。在实施例中，制剂在约-20℃、约5℃、约25℃和其间的任何温度下提供肽稳定性。在某些实施例中，制剂在约-20℃下提供肽稳定性持续至少6个月、至少8个月、至少12个月、至少18个月、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年或至少6年。在实施例中，本文提供的制剂包含肽(例如，α连接蛋白肽)，其中肽在至少约1个月内保持至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％或至少约95％的稳定性。在实施例中，本文提供的制剂包含肽(例如，α连接蛋白肽)，其中肽在至少约3个月内保持至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％或至少约95％的稳定性。在实施例中，本文提供的制剂包含肽(例如，α连接蛋白肽)，其中肽在至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年或至少约6年内保持至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％或至少约95％的稳定性。当使用本文提供的制剂时，在约-20℃、约5℃、约25℃和其间的任何温度下实现此类稳定性。
在实施例中，本文提供的制剂在一定范围的储存温度下随时间推移不显示杂质、或显示可忽略的杂质或可接受的杂质水平。例如，制剂在至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少两个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年或至少6年内不显示杂质、或显示可忽略的杂质或可接受的杂质水平。在实施例中，制剂在约-20℃、约5℃、约25℃和其间的任何温度下不显示杂质、或显示可忽略的杂质或可接受水平的杂质。在实施例中，制剂中的杂质的可忽略水平可以小于0.1％。在实施例中，制剂中可接受的杂质水平可以小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％。
在实施例中，本文提供的制剂是容易过滤的(例如，可通过0.2μm PES过滤器过滤)。在实施例中，与先前用于肽的眼部施用的制剂相比，本文提供的制剂更可过滤。在实施例中，本文提供的制剂包含HPLC、肽(例如，α连接蛋白肽)、NaCl，并且不需要另外的载体、缓冲液或赋形剂，以具有适于眼部递送的制剂特性(例如黏度、渗透浓度、密度、pH、可过滤性)以及纯度和稳定性分布。
在实施例中，本公开提供了一种滴眼剂载体，其含有无刺激性、稳定且具有适合在眼中局部使用的特征的治疗肽(例如aCT1肽)。因此，在实施例中，本发明提供了用于治疗眼部损伤或疾病的包含α连接蛋白多肽的治疗性滴眼剂组合物。在实施例中，滴眼剂制剂进一步包含HPMC。在实施例中，制剂还包含在储存期间稳定α连接蛋白多肽的缓冲液和/或赋形剂。在实施例中，α连接蛋白多肽包含α连接蛋白的羧基末端氨基酸序列。本发明的α连接蛋白多肽可包含、由其组成或包括α连接蛋白或其保守变体的羧基最末端4-30个连续氨基酸。在实施例中，所述至少一种α连接蛋白多肽在其氨基末端与细胞内化转运蛋白连接。
在实施例中，本公开提供了用于眼科适应症的治疗性应用的含有aCT1的稳定滴眼剂载体制剂及其制备方法。在实施例中，眼科适应症包括伤口愈合、炎症和免疫调节、组织再生、生物力学恢复或影响角膜或其他眼部组织的任何部分的其它生理状况的治疗。本文提供的制剂可以被施用以治疗急性和慢性损伤和创伤，包括军事或民用化学损伤或角膜撕裂、手术相关病况、以及任何原发性眼部病症或引起继发性眼部病况表现或需要医疗护理的其他病况的急性和慢性表现。该制剂具有物理化学、生物化学和流变学特性，当应用于损伤、创伤和影响正常眼功能的病况时，使其能够提供治疗有效量的aCT1肽。
在实施例中，可以使用以任何形式加入到无菌水中的一种或多种缓冲剂来保持生理相关的pH或保持pH，其中pH调节剂的加入将导致生理相关的pH。在一些实施例中，可以加入一种或多种pH调节剂，例如硼酸钠、柠檬酸、硝酸钠、组氨酸、盐酸或氢氧化钠，以在pH 5-8的期望治疗范围内调节。优选地，缓冲剂是无刺激性的、不染色的和无免疫原性的。在实施例中，优选的缓冲液是组氨酸。在实施例中，组氨酸以约20mM到约80mM的浓度存在。在实施例中，组氨酸以约40mM的浓度存在。
在实施例中，制剂还包含张力调节剂。例如，在实施例中，制剂还包含葡萄糖、甘油、甘露醇、氯化钾或氯化镁。在实施例中，制剂还包含抗氧化剂，例如甲硫氨酸。
在实施例中，本文提供的制剂不包括缓冲剂。在实施例中，制剂中不包括另外的赋形剂，使得制剂不包含赋形剂。在实施例中，制剂包含活性剂肽、HPMC，并且不加入赋形剂。在实施例中，本文提供的制剂不包括任何添加的糖、氨基酸和/或表面活性剂。在实施例中，制剂包含活性剂(例如连接蛋白肽)、HPMC、NaCl和水，基本上由或由活性剂(例如连接蛋白肽)、HPMC、NaCl和水组成。在实施例中，HPMC以约0.2％w/w至约1.0％w/w的浓度存在于制剂中。在实施例中，HPMC以约0.5％w/w的浓度存在于制剂中。在实施例中，HPMC以约1.0％w/w的浓度存在于制剂中。
在实施例中，制剂中包括一种或多种聚合物例如HPMC，以稳定分离的多肽。优选地，制剂包含无刺激性、不染色且无免疫原性的稳定剂。稳定剂的加入使得药物产品能够在各种温度条件下(例如，在约5℃、在约10℃、在约15℃、在约20℃、在约25℃、在约30℃、在约35℃、或在约40℃)和在一定范围的相对湿度下(例如，在约0％相对湿度、在约10％相对湿度、在约20％相对湿度、在约30％相对湿度、在约40％相对湿度、在约50％相对湿度、在约60％相对湿度、在约70％相对湿度、在约80％相对湿度、在约90％相对湿度、或在约100％相对湿度)长期(即3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、或24个月)储存。在实施例中，本发明还可以包括防腐剂，以进一步在所述各种温度和相对湿度下保持所述长期储存。
示例性的制剂提供在下表1中。
在实施例中，本文提供的制剂可包含在塑料滴眼管或玻璃小瓶中，该塑料滴眼管或玻璃小瓶含有单剂量或多剂量，用于对有需要的受试者治疗性施用包含至少一种aCT多肽的局部眼用制剂。在实施例中，制剂可以包含在玻璃容器中，并且与由其它材料(例如塑料)制成的容器相比，该制剂在玻璃容器内可以更稳定。在实施例中，制剂可以包含在塑料容器中，例如塑料滴眼管。在实施例中，局部眼用制剂包含HPMC。在实施例中，本文提供的制剂是在施用适当和设计的滴眼管瓶或小瓶中的无菌、即用型滴眼剂制剂。
在实施例中，本公开提供了用于治疗和预防角膜损伤和眼部外伤的方法。在实施例中，该方法包括向眼睛局部施用本文提供的包含α连接蛋白多肽的制剂。在实施例中，损伤或创伤是闭合眼球眼损伤或角膜已经发生损伤的创伤。角膜损伤或创伤的原因不限于并且可以包括冲击损伤、化学和热烧伤、以及引起急性或慢性损伤的其他损伤或病况，作为病症或疾病的原发性和继发性表现。在实施例中，角膜损伤的原因是暴露于发疱剂或起疱剂，例如氮芥或硫芥(例如芥子气)。在实施例中，病症或疾病是糖尿病。在实施例中，病症或疾病是糖尿病性角膜病变。在实施例中，慢性疾病是视网膜疾病。在实施例中，本公开提供了用于治疗和预防视网膜疾病的方法。例如，在实施例中，视网膜疾病选自黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性(AMD)、新生血管性年龄相关性黄斑变性(nAMD))、色素性视网膜炎(RP)、视网膜脱离、糖尿病性视网膜病、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)和视网膜静脉闭塞(RVO)后发生的黄斑水肿。在实施例中，当眼部疾病或病症(例如视网膜病症)的治疗涉及玻璃体切除术和/或一次或多次玻璃体内注射时，疾病或病症涉及在受试者中发生的角膜缺陷。
在实施例中，本文提供的方法包括治疗和/或预防导致角膜瘢痕形成或过度和失调的炎症或免疫应答的任何疾病或病症。在实施例中，受试者是具有持续性角膜上皮缺陷(PED或PCED)的人类受试者，该缺陷是由角膜损伤后(例如在约2周内)快速再上皮化和闭合失败导致的，即使使用标准的护理支持性治疗。PED可导致严重的并发症，包括感染和视力丧失。在实施例中，PED是由干眼症引起的。因此，在实施例中，本文提供的制剂和方法通过提高角膜损伤后的再上皮化的速率来治疗患有PED或以其他方式患有角膜损伤的受试者。在实施例中，施用所提供的制剂使再上皮化的速率提高约10％、约25％、约50％、约75％、约100％或更多。在实施例中，与其中将标准护理或无治疗施用于受试者的眼的对照中的再上皮化的速率相比，所提供的制剂的施用增强再上皮化的速率。再上皮化的速率可以被增强，使得角膜愈合发生在损伤后约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13或约14天内。本文提供的制剂和方法不限于单独的专门治疗，并且可以与其它标准的护理治疗联合使用。
用于本文提供的制剂和方法的多肽可以是具有例如伤口愈合特性、抗炎特性、涉及角膜基质的保护或再生的特性和/或抗新生血管特性的任何多肽。在实施例中，多肽可以是具有约1.0kDa至约10.0kDa分子量的任何合适的多肽。在实施例中，多肽可以是具有约1.0kDa、约2.0kDa、约3.0kDa、约4.0kDa、约5.0kDa、约6.0kDa、约7.0kDa、约8.0kDa、约9.0kDa或约10.0kDa的分子量的任何合适的多肽。
在实施例中，多肽可以是包含α连接蛋白的羧基最末端氨基酸的任何多肽，其中多肽不包含全长α连接蛋白。因此，在实施例中，所提供的多肽不包含α连接蛋白的N端胞质结构域。在实施例中，所提供的多肽不包含α连接蛋白的两个胞外结构域。在实施例中，所提供的多肽不包含α连接蛋白的四个跨膜结构域。在实施例中，所提供的多肽不包含α连接蛋白的胞质环结构域。在实施例中，所提供的多肽不包含邻近第四跨膜结构域的α连接蛋白的胞质羧基末端结构域的序列的那部分。在α连接蛋白中存在保守的脯氨酸或甘氨酸残基，其始终位于距离羧基最末端氨基酸约17-30个氨基酸的位置，例如，对于人Cx43，在氨基酸363处的脯氨酸残基位于从羧基最末端异亮氨酸后19个氨基酸的位置。在另一个实例中，对于鸡Cx43a，在氨基酸362处的脯氨酸残基位于从羧基最末端异亮氨酸后18个氨基酸的位置。在另一个实例中，对于人Cx45，在氨基酸377处的甘氨酸残基位于从羧基最末端异亮氨酸后19个氨基酸的位置。在大鼠Cx33的另一实例中，在氨基酸258处的脯氨酸残基位于从羧基最末端甲硫氨酸向后28个氨基酸的位置。因此，在实施例中，所提供的多肽不包含邻近α连接蛋白的所述保守脯氨酸或甘氨酸残基的氨基酸。因此，所提供的多肽可包含α连接蛋白的最c端4-30个氨基酸，包括α连接蛋白的最c端4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个氨基酸。示例性的α连接蛋白多肽公开于美国专利Nos.7,786,074；7,888,319；8,357,668；8,809,257；8,916,515；8,859,733；8,846,605；9,161,984；9,394,351；9,408,381；9,844,214；9,855,313；10,398,140；和10,398,757，和/国际专利申请No.PCT/US2018/000035，其全部内容通过引用并入本文。
连接蛋白是负责细胞间通讯的间隙连接通道的亚单位蛋白(Goodenough和Paul，2003)。基于核苷酸序列的保守模式，编码连接蛋白的基因被分成两个家族，称为α和β连接蛋白基因。α连接蛋白的羧基最末端的氨基酸序列的特征在于多种独特和保守的特征。这种组织保守性与ACT肽的以下能力一致：形成独特的3D结构、与多个配对蛋白相互作用、介导与脂质和膜相互作用、与核酸(包括DNA)相互作用、转运和/或阻断膜通道、以及为蛋白水解切割、蛋白交联、ADP-核糖基化、糖基化和磷酸化提供共有基序。因此，所提供的多肽与蛋白质的结构域相互作用，该结构域通常介导所述蛋白与α连接蛋白的羧基末端的结合。例如，肾母细胞瘤过表达蛋白(NOV)与Cx43 c端结构域相互作用(Fu等人，J Biol.Chem.2004 279(35):36943-50)。据认为，这种蛋白质和其他蛋白质与α连接蛋白的羧基末端相互作用，并进一步与其它蛋白质相互作用，形成大分子复合物。因此，所提供的多肽可抑制分子机器的操作，例如，涉及调节Cx43间隙连接通道聚集的分子机器。
本文提供的多肽包含α连接蛋白或其保守变体的羧基端氨基酸序列。在实施例中，多肽包含或由氨基酸序列RPRPDDLEI(SEQ ID NO:2)组成。在实施例中，如本文描述，多肽是aCT1。术语“aCT1”在本文中可与“αCT1”、“aCT”、“aCT-1”、“ACT”和“ACT-1”互换使用。aCT1为分子量为3597.33Da的25aa肽，其具有基于触角蛋白细胞内化结构域(1-16aa；RQPKIWFPNRRKPWKK；SEQ ID NO:7)与跨膜间隙连接蛋白Cx43(17-25aa；RPRPDDLEI；SEQ IDNO:2)10的C端PDZ结合结构域的连接的紧凑2-结构域设计。因此，完整aCT1序列是RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDLEI(SEQ ID NO:9)。aCT1和相关肽通过调节Cx43和其C端融合配偶体(包括紧密连接蛋白闭锁小带蛋白-1(ZO-1))之间的分子相互作用，增加间隙连接的大小和稳定性。这导致Cx43上的丝氨酸368(S368)氨基酸的磷酸化，并有利于细胞表面Cx43从半通道向间隙连接细胞内通道的转变。在aCT1降解后，S368的磷酸化长时间阻止ZO-1与Cx43的c端结合，从而允许治疗的长效性。同时，aCT1稳定了细胞膜上的ZO-1，防止了响应损伤的连接降解，并保持了上皮细胞的屏障功能。结果是间隙连接(细胞间通讯)以及紧密连接(细胞间连接)的稳定，导致多种有益效果，包括增加细胞通讯、抑制炎症反应和减少促纤维化细胞的浸润和增殖。总之，aCT1促进的分子和细胞性活动保持了组织完整性，减少了损伤扩散，抑制了病理性炎症，并加速愈合和组织再生。
在实施例中，本文提供的组合物和方法涉及预防、治疗和/或减轻角膜损伤的进展。在实施例中，本文提供的组合物和方法涉及预防、治疗和/或减轻角膜损伤的进展。在实施例中，本文提供的制剂用于预防、治疗和/或减轻角膜损伤的进展。在实施例中，本文提供aCT1在制备用于预防或治疗角膜损伤的药物中的用途。
所提供的多肽的ACT序列可以来自任何α连接蛋白。因此，所提供多肽的α连接蛋白组分可来自人、鼠、牛、单孔类动物、有袋类动物、灵长类动物、啮齿类动物、鲸类动物、哺乳动物、禽类、爬行类动物、两栖类动物、鱼类、脊索动物、原脊索动物或其它α连接蛋白。因此，所提供的多肽可以包含连接蛋白的ACT，该连接蛋白选自以下构成的组：小鼠连接蛋白47、人连接蛋白46.6、牛连接蛋白46.6、小鼠连接蛋白30.2、大鼠连接蛋白30.2、人连接蛋白31.9、狗连接蛋白31.9、绵羊连接蛋白44、牛连接蛋白44、大鼠连接蛋白33、小鼠连接蛋白33、人连接蛋白36、小鼠连接蛋白36、大鼠连接蛋白36、狗连接蛋白36、鸡连接蛋白36、斑马鱼连接蛋白36、狼鲈(morone)连接蛋白35、狼鲈连接蛋白35、蝾螈(Cynops)连接蛋白35、河豚(Tetraodon)连接蛋白36、人连接蛋白37、黑猩猩连接蛋白37、狗连接蛋白37、田鼠(Cricetulus)连接蛋白37、小鼠连接蛋白37、金仓鼠(Mesocricetus)连接蛋白37、大鼠连接蛋白37、小鼠连接蛋白39、大鼠连接蛋白39、人连接蛋白40.1、非洲爪蟾(Xenopus)连接蛋白38、斑马鱼连接蛋白39.9、人连接蛋白40、黑猩猩连接蛋白40、狗连接蛋白40、牛连接蛋白40、小鼠连接蛋白40、大鼠连接蛋白40、田鼠连接蛋白40、鸡连接蛋白40、人连接蛋白43、长尾猴(Cercopithecus)连接蛋白43、穴兔(Oryctolagus)连接蛋白43、黄鼠(Spermophilus)连接蛋白43、田鼠连接蛋白43、毛足鼠(Phodopus)连接蛋白43、大鼠连接蛋白43、Sus连接蛋白43、金仓鼠连接蛋白43、小鼠连接蛋白43，豚鼠(Cavia)连接蛋白43、牛连接蛋白43、刺猬(Erinaceus)连接蛋白43、鸡连接蛋白43、非洲爪蟾连接蛋白43、穴兔连接蛋白43、鲤鱼连接蛋白43、斑马鱼连接蛋白43、大鲖(Danio aequinnamus)连接蛋白43、斑马鱼连接蛋白43.4、斑马鱼连接蛋白44.2、斑马鱼连接蛋白44.1、人连接蛋白45、黑猩猩连接蛋白45、狗连接蛋白45、小鼠连接蛋白45、牛连接蛋白45、大鼠连接蛋白45、鸡连接蛋白45、河豚连接蛋白45、鸡连接蛋白45、人连接蛋白46、黑猩猩连接蛋白46、小鼠连接蛋白46、狗连接蛋白46、大鼠连接蛋白46、金仓鼠连接蛋白46、田鼠连接蛋白46、鸡连接蛋白56、斑马鱼连接蛋白39.9、牛连接蛋白49、人连接蛋白50、黑猩猩连接蛋白50、大鼠连接蛋白50、小鼠连接蛋白50、狗连接蛋白50、绵羊连接蛋白49、金仓鼠连接蛋白50、田鼠连接蛋白50、鸡连接蛋白50、人连接蛋白59、或其它α连接蛋白。
α连接蛋白的20-30个羧基最末端的氨基酸序列的特征在于独特且保守的组织。这种独特和保守的组织包括II型PDZ结合基序(Φ-x-Φ；其中x＝任何氨基酸，Φ＝疏水氨基酸)和邻近该基序的脯氨酸(P)和/或甘氨(G)铰链残基；高频磷酸-丝氨酸(S)和/或磷酸-苏氨酸(T)残基；以及高频的带正电荷的精氨酸(R)、赖氨酸(K)和带负电荷的天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)氨基酸。对于许多α连接蛋白，P和G残基存在于邻近羧基末端II型PDZ结合基序的簇状基序中。大多数α连接蛋白的S和T磷-氨基酸通常也被组织成簇状的重复样基序。这种组织尤其适用于Cx43，其中20个最末端羧基的氨基酸中90％由后七个氨基酸组成。在序列高度保守的另一个实例中，Cx43的ACT肽组织从人类到鱼类是高度保守的。
因此，在一个方面，所提供的多肽包含一个、两个、三个或全部氨基酸基序，该氨基酸基序选自以下构成的组：1)II型PDZ结合基序，2)脯氨酸(P)和/或甘氨酸(G)铰链残基；3)磷酸-丝氨酸(S)和/或磷酸-苏氨酸(T)残基的簇；和4)高频率带正电荷的精氨酸(R)和赖氨酸(K)以及带负电荷的天冬氨酸(D)和/或谷氨酸(E)氨基酸。在另一个方面，所提供的多肽包括在羧基端的II型PDZ结合基序、邻近PDZ结合基序的脯氨酸(P)和/或甘氨酸(G)铰链残基、以及邻近铰链残基的带正电荷的残基(K、R、D、E)。
PDZ结构域最初被鉴定为突触后密度蛋白PSD95/SAP90、果蝇肿瘤抑制因子dLG-A和紧密连接蛋白ZO-1中的保守序列元件。尽管最初被称为GLGF或DHR基序，但它们现在被称为是代表这前三个含PDZ的蛋白(PSD95/DLG/ZO-1)的首字母缩写。这些80-90个氨基酸的序列现在已经在超过75种蛋白质中被鉴定，并且特征性地在单一蛋白质中以多拷贝表达。因此，在一个方面，所提供的多肽可抑制α连接蛋白与包含PDZ结构域的蛋白质的结合。PDZ结构域是一种特定类型的蛋白质相互作用模块，其具有结构上明确定义的相互作用“口袋”，该口袋可以被PDZ结合基序填充，本文中称为“PDZ基序”。PDZ基序是共有序列，通常但不总是位于细胞内最末端的羧基末端。已将四种类型的PDZ基序分类：I型(S/T-x-Φ)、II型(Φ-x-Φ)、III型和IV型(D-x-V)，其中x为任何氨基酸，Φ为疏水性残基(V、I、L、A、G、W、C、M、F)，Ψ为碱性亲水性残基(H、R、K)。(Songyang，Z.等人，1997.Science275,73-77)。因此，在一个方面，提供的多肽包含II型PDZ结合基序。
当本文提及特定蛋白质时，考虑变体、衍生物和片段。蛋白质变体和衍生物是本领域技术人员熟知的，并且可以涉及氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常属于三类中的一类或多类：取代型、插入型或缺失型变体。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常是比氨基或羧基末端融合更小的插入，例如，在1至4个残基的数量级上。缺失的特征在于从蛋白质序列中去除一个或多个氨基酸残基。这些变体通常通过在编码蛋白质的DNA中进行核苷酸的位点特异性诱变，从而产生编码变体的DNA，然后在重组细胞培养物中表达DNA来制备。在具有已知序列的DNA中预定位点进行取代突变的技术是公知的，包括例如M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但可以同时发生在许多不同的位置；插入通常在约1至10个氨基酸残基的数量级上。可以组合取代、缺失、插入或其任何组合以获得最终的构建体。取代变体是其中至少一个残基被除去并且在其位置插入不同的残基的那些变体。
例如，本领域技术人员已知一个氨基酸残基被另一个生物学和/或化学相似的氨基酸残基替换是保守取代。例如，保守取代可以是一个疏水残基被另一个疏水残基取代，或一个极性残基被另一个极性残基取代。每个明确公开的序列的保守取代的变体都包括在本文提供的多肽内。
通常，保守取代对所得多肽的生物活性几乎没有影响。在一个具体的实例中，保守取代是肽中的氨基酸取代，其基本上不影响肽的生物学功能。肽可以包括一个或多个氨基酸取代，例如2-10个保守取代、2-5个保守取代、4-9个保守取代，例如2个、5个或10个保守取代。
通过使用例如标准程序(例如定点诱变或PCR)操作编码多肽的核苷酸序列，可以产生含有一个或多个保守取代的多肽。或者，通过使用标准肽合成方法，可以产生含有一个或多个保守取代的多肽。丙氨酸扫描可用于识别蛋白质中哪些氨基酸残基可耐受氨基酸取代。在一个实例中，当丙氨酸或其它保守氨基酸(例如下文列出的那些)取代一个或多个天然氨基酸时，蛋白质的生物活性降低不超过25％，例如不超过20％，例如不超过10％。
应当理解，有许多氨基酸和肽类似物可以掺入所公开的组合物中。例如，有许多D氨基酸。公开了天然存在的肽的相反立体异构体，以及肽类似物的立体异构体。通过将选择的氨基酸加载到tRNA分子上，并改造利用例如琥珀密码子的遗传构建体，以位点特异性方式将类似物氨基酸插入肽链中，可容易地将这些氨基酸掺入到多肽链中(Thorson等人，Methods in Molec Biol.77:43-73(1991)，Zoller，Current Opinion in Biotechnology，3:348.(354)(1992)；Ibba，Biotechnology&Genetic Engineering Reviews 13:197-216(1995)，Cahill等人，TIBS,14(10):400-403(1989)；Benner，TIB Tech，12:158-163(1994)；Ibba和Hennecke，Bio/Technology，12:678-682(1994)，所有这些文献都通过引用并入本文，至少对于与氨基酸类似物相关的材料)。
D-氨基酸可用于产生更稳定的肽，因为D-氨基酸不被肽酶等识别。用相同类型的D-氨基酸(例如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸)系统取代共有序列的一个或多个氨基酸可用于产生更稳定的肽。半胱氨酸残基可用于将两个或多个肽环化或连接在一起。这对于将肽限制为特定构象是有益的。(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61:387(1992)，通过引用并入本文)。
因此，所提供的多肽可包含α连接蛋白(ACT)c端的保守变体。应理解，定义本文所公开的基因和蛋白质的任何变体、修饰或衍生物的一种方式是通过定义变体、修饰和衍生物在与特定已知序列的序列同一性(本文也称为同源性)方面。具体公开的是本文公开的核酸和多肽的变体，其与所述或已知序列具有至少65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的序列同一性。本领域技术人员容易理解如何确定两种蛋白质或核酸的序列同一性。例如，可以在比对两个序列之后计算序列同一性，使得序列同一性处于其最高水平。计算序列同一性的另一种方法可以通过公开的算法来进行。
因此，所提供的多肽可包含与α连接蛋白(ACT)的c端具有至少65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％序列同一性的氨基酸序列。因此，在一个方面，所提供的多肽包含与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或本文提供的任何序列具有至少65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％序列同一性的氨基酸序列。
在实施例中，多肽包含细胞内化转运蛋白或序列。细胞内化序列可以是本领域已知的或新发现的任何内化序列，或其保守变体。细胞内化转运蛋白和序列的非限制性例子包括触角蛋白序列、TAT、HIV-Tat、Pentratin、Antp-3A(Antp突变体)、Buforin II、Transporta、MAP(模型两亲性肽)、K-FGF、Ku70、朊病毒蛋白、pVEC、pep-1、SynB1、pep-7、HN-1、BGSC(双胍-亚精胺-胆固醇)和BGTC(双胍-Tren-胆固醇)。示例性细胞内化转运蛋白在表2A中提供。
表2A.示例性细胞内化序列
现在已知的或以后识别的任何其它内化序列可以与本发明的肽组合。
所提供的多肽可以包含任何ACT序列(例如，本文公开的任何ACT肽)与本文所提供的任何细胞内化序列的组合。所述组合的实例在表2B中提供。因此，所提供的多肽可包含触角蛋白序列，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7。因此，所提供的多肽可包含氨基酸序列SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。
表2B.具有细胞内化序列的ACT多肽(CIS)具有细胞内化序列的ACT多肽(CIS)
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还提供了编码本文提供的多肽的分离的核酸。所公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物组成。本文讨论了这些和其它分子的非限制性例子。应理解，例如，当载体在细胞中表达时，所表达的mRNA通常由A、C、G和U组成。因此，提供了一种分离的核酸，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12的多肽。
在实施例中，本文提供了一种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的一种或多种本文提供的多肽、核酸或载体。例如，提供了一种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9。在实施例中，组合物包含一种或多种包封在微载体中的本文提供的多肽。例如，在实施例中，组合物包含一种或多种本文提供的多肽，其中多肽在纳米颗粒或外泌体中。
在实施例中，本文提供的组合物包含载药微载体制剂，其包括纳米颗粒或外泌体。在实施例中，纳米颗粒的尺寸为约100nm至约1000nm，或约100nm至约500nm，或约200nm至约250nm，或约100nm至约200nm。
在实施例中，制剂包含约0.01％w/w至约3.5％w/w、或约0.05％w/w至约3.0％w/w、或约0.07％w/w至约2.0％w/w、或约0.1％w/w至约1.0％w/w、或约0.1％w/w至约0.5％w/w、或约0.2％w/w至约0.8％w/w、或约0.03％w/w至约0.07％w/w、或约0.05％w/w的多肽。在实施例中，制剂包含约0.035％w/w的多肽、或约0.07％w/w的多肽、或约0.1％w/w的多肽、或约1.0％w/w的肽、或约3.5％w/w的多肽。
在实施例中，制剂包含约0.00035mg/mL至约35mg/mL、或约0.001mg/mL至约20mg/mL、或约0.01mg/mL至约3.5mg/mL、或约0.1mg/mL至约1.0mg/mL、或约0.2mg/mL至约0.8mg/mL、或约0.3mg/mL至约0.7mg/mL的多肽。在实施例中，制剂包含约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.35mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL或约1.0mg/mL的多肽。在实施例中，制剂包含约0.35mg/mL或约0.7mg/mL的多肽。在实施例中，制剂包含约1mg/mL、或约10mg/mL或约20mg/mL的多肽。
在实施例中，组合物以制剂形式施用于受试者，该制剂包含约1μM至约100,000μM、或约10μM至约50,000μM、或约100μM至约10,000μM、或约10μM至约9,000μM、或约50μM至约5,000μM、或约100μM至约2,000μM、或约200μM至约2,000μM、或约200μM至约1,000μM、或约50μM至约1,500μM的多肽，或约100μM至约1,000μM的多肽，或约500至约1,500μM的多肽。在实施例中，将组合物以制剂形式施用于受试者，该制剂包含约1μM、约5μM、约50μM、约100μM、约150μM、约200μM、约300μM、约400μM、约500μM、约600μM、约700μM、约800μM、约900μM、约1,000μM、约1,500μM、约2,000μM、约3,000μM、约4,000μM、约5,000μM、约6,000μM、约7,000μM、约8,000μM、约9,000μM、约10,000μM、约20,000μM、约25,000μM、约50,000μM、约75,000μM、约100,000μM或更多的多肽。
在实施例中，在引起眼部损伤的事件之后立即将制剂施用至眼睛。在实施例中，在引起眼部损伤的事件的约1小时内、约2小时内、约3小时内、约4小时内、约5小时内、约6小时内、约8小时内、约12小时内、约18小时内或约24小时内将制剂施用于受试者。在实施例中，在引起眼部损伤的事件后至少约2小时向受试者施用制剂。在实施例中，将制剂每天施用至受试者的眼睛，例如每天一次，或每天两次，和/或约每8小时或约每12小时施用。在实施例中，施用制剂直至观察到眼部愈合。在实施例中，施用制剂至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天或更长时间。在实施例中，制剂长期施用。如本文所用，术语“长期施用”是指制剂以开放式给药方案施用，即开始治疗并旨在持续无限期的时间和/或直至症状消退等。在实施例中，对于慢性疾病病况，在检测到慢性疾病病况时将制剂施用于眼睛，并且长期施用。在实施例中，将制剂长期施用至患有由慢性病症如干眼症(DED)引起的角膜损伤的受试者。
如本文所用，“受试者”包括脊椎动物，更具体地为哺乳动物(例如，人、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟或爬行动物或两栖动物。在实施例中，受试者为人受试者。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，旨在涵盖成年和新生儿受试者以及胎儿，无论是男性还是女性。在实施例中，患者是指患有疾病或病症的受试者。在实施例中，患者群体是指具有疾病或病症或处于发展特定疾病或病症的风险的特定的、限定的受试者组。
如本文所用，“抑制(inhibit/inhibiting/inhibition)”是指降低活性、反应、病况、疾病或其它生物参数。这可以包括但不限于完全丧失活性、反应、病况或疾病。因此，与天然或对照水平相比，降低可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何降低量。
范围和值在本文中可表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，除非上下文另有明确指示，否则也特别预期和考虑公开的是从一个特定值和/或到另一个特定值的范围。明确公开的范围内含有的所有单独值和值的子范围也是特别预期的，并且应当被认为是公开的，除非上下文另有明确指示。无论在特定情况下是否明确公开了这些实施例中的一些或全部，前述内容都适用。如本文所用，术语“约”等，当用于值的上下文时，通常是指所述值的正10％或负10％。例如，约0.5将包括0.45和0.55，约10将包括9至11，约1000将包括900至1100。
“治疗(treat/treatment)”是指减少疾病或病症的影响的方法。治疗还可以指减少疾病或病症本身的根本原因而不仅仅是症状的方法。治疗可以是从天然水平的任何降低和/或疾病临床体征的任何改善和/或存活或功能的任何增加；并且可以是但不限于完全消除疾病、病症或疾病或病症的症状。例如，如果与相同受试者或对照受试者的天然水平相比，损伤的一种或多种症状减轻或者如果受试者的病况改善，则认为所公开的治疗角膜损伤的方法是一种治疗。因此，与天然或对照水平相比，降低或改善可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何降低量。“预防(prevent/prevention)”等是指预防角膜损伤的发作或降低其发病率或严重性的方法。
本文引用的出版物、专利和专利申请的全部内容通过引用具体地并入。虽然已经参照本发明的具体实施例描述了所描述的发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等同物进行替换。此外，可以进行许多修改以采用特定的情况、材料、物质组成、工艺步骤或多个步骤，以实现所述发明的客观精神和范围。所有这些修改都在所附权利要求的范围内。
通过参考以下实例进一步阐述本公开。然而，应当注意，与上述实施例一样，这些实例是说明性的，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
实例
实例1.测试缓冲制剂的比较研究
对包含柠檬酸盐缓冲液和羟乙基纤维素(HEC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)的制剂进行过滤可行性、肽稳定性和机械黏度研究。使用高效液相色谱(HPLC)用经验证的分析方法对最终aCT1滴眼剂制剂进行稳定性和杂质分析。还进行了研究以比较包含不同缓冲液和赋形剂组合的制剂的肽过滤可行性和肽稳定性。
首先，制备含有柠檬酸盐缓冲液的HEC和HPMC溶液，并测试其过滤可行性。测试的HEC溶液在pH 6.0的10mM柠檬酸盐缓冲液中含有0.2％w/w、0.15％w/w或0.125％w/w的HEC。测试的HPMC溶液在pH 6.0的10mM柠檬酸盐缓冲液中含有0.5％w/w的HPMC。两种溶液都含有0.07％ACT肽，3.6kDa肽。
通过0.2μm PES过滤器测试溶液的过滤性。研究结果表明，HPMC溶液在0.5％(w/w)浓度下易于通过0.2μm PES膜25mm注射过滤器过滤。相反，当用低剪切混合器(磁力搅拌棒)制备时，最高HEC溶液(0.2％(w/w))难以通过PES注射器过滤器过滤，以及难以使用具有真空泵的单元通过0.2μm PES过滤器过滤。当用较高剪切的匀浆器制备时，较高浓度的HEC溶液更容易过滤。两种较低浓度的HEC溶液都可以通过0.2μm PES过滤器过滤。
使用TA AR1000流变仪进行机械黏度研究。在25℃下，在500μM的样品间隙和2分钟的平衡时间下，测定在0.01-1,000Pa的剪切应力下的黏度。0.5％w/w HPMC溶液的黏度为57.3mPaS；0.15％w/v HEC溶液的黏度为3.7mPaS。
评估了包含0.07％aCT1肽、10mM柠檬酸、0.9％ NaCl和0.2％ HEC或0.2％ HPMC(pH 6.0)的类似制剂的肽稳定性。在0个月和3个月的时间点检测到杂质。
总之，尽管制剂可以被无菌过滤，但不认为黏度在适于保留在眼部表面的范围内。对于人眼滞留，10.2mPaS的最小剪切黏度是必需的(Zaki等人，1986)。美国药典(USP)指南指出，18-28mPaS是滴眼剂制剂的最佳黏度范围。此外，在0个月和3个月的稳定时间点检测到杂质。因此，这些制剂不适合眼部递送。总之，研究表明，包含柠檬酸盐缓冲液令人惊讶地产生了具有不利特征的制剂。
将包含柠檬酸盐缓冲液的制剂与包含磷酸盐缓冲液的制剂进行比较。制备下表3所示的溶液。制备pH为4、5或6的100mM柠檬酸盐缓冲液和pH为6、7或8的100mM磷酸盐缓冲液。使用每种单独的缓冲液制备0.5％w/V HPMC的HPMC溶液。HPMC溶液用0.2M PES过滤器过滤。将3.5mg/mL aCT1肽加入过滤的HPMC溶液中，在搅拌板上混合直至得到均匀、澄清的溶液。然后将溶液过滤到10mL带有波纹封口的透明小瓶中。
表3.柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液制剂
制剂编号 说明
5776 3.5mg/mL aCT1、0.5％w/w HPMC在pH 4.0的100mM柠檬酸盐缓冲液中
5777 3.5mg/mL aCT1、0.5％w/w HPMC在pH 5.0的100mM柠檬酸盐缓冲液中
5778 3.5mg/mL aCT1、0.5％w/w HPMC在pH 6.0的100mM柠檬酸盐缓冲液中
5779 3.5mg/mL aCT1、0.5％w/w HPMC在pH 6.0的100mM磷酸盐缓冲液中
5780 3.5mg/mL aCT1、0.5％w/w HPMC在pH 7.0的100mM磷酸盐缓冲液中
5781 3.5mg/mL aCT1、0.5％w/w HPMC在pH 8.0的100mM磷酸盐缓冲液中
在柠檬酸盐缓冲液中过滤较低pH(4和5)的溶液是非常困难的。与0.5％ HPMC在pH6.0的10mM柠檬酸盐缓冲液中的溶液(用于过滤可行性研究)相比，过滤0.5％w/v HPMC在pH6.0的100mM柠檬酸盐缓冲液和pH 6.0的100mM磷酸盐缓冲液中的溶液有点困难。在所有溶液中，FID 5780(0.5％ HPMC在pH 7.0的100mM磷酸盐缓冲液中)易于过滤。每种制剂(制剂ID或FID如上表3所示)的过滤容易程度：FID 5780>5781>5779>5778。aCT1肽在所有溶液中都迅速溶解。
然而，在2周和4周的稳定时间点，在每种制剂中都检测到杂质(表4)。因此，包含磷酸盐缓冲液，如柠檬酸盐缓冲液，不能产生具有良好肽稳定性的制剂。
表4.在2和4周稳定时间点的杂质
为了研究pH稳定性研究中的低含量T0测试，并评价含有和不含有HPMC的制剂的过滤器适用性，制备了表5中所示的下列制剂。
表5.另外的柠檬酸盐缓冲液和HPMC制剂
使用0.2M PES过滤器或0.2M PVDF过滤器过滤每种溶液。结果提供在下表6中。
表6.在制剂中使用或不使用HPMC的过滤器适用性评价和测定结果
含有柠檬酸盐缓冲液的制剂在pH 4或5下非常难以过滤。含有柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液的制剂在pH 6下非常难以过滤。因此，尽管过滤后确定在制剂中的肽的量相对于预期量(标示值％；表6)通常在合适的范围内(通常认为97％-115％的范围是合适的)，但使用PES或PVDF过滤器不能适当过滤制剂。
下表7-10提供了柠檬酸盐缓冲液与磷酸盐缓冲液制剂(含有或不含甘油作为增黏剂)的3个月稳定性研究数据。虽然aCT1肽的稳定性在其中几种制剂中是有利的，但在5℃和25℃下储存的制剂中测试的杂质分布(表9-10)超出了可接受的范围。
表7.5℃测定结果
1％LC＝标示值的百分比
2T0＝时间零点
3T3M＝储存时间3个月
4T6M＝储存时间6个月
表8.25℃/40％相对湿度(RH)测定结果
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1％LC＝标示值的百分比
2T0＝时间零点
3T3M＝储存时间3个月
4T6M＝储存时间6个月5未测试。
表9.5℃杂质结果
表10.25℃/40％ RH杂质结果
/>
总之，研究表明，令人惊奇的是，仅包含HPMC(而不是HEC、CMC或甘油)并且排除任何缓冲液的制剂对局部眼部施用表现出有利特性。实例2.测试含有或不含添加剂的HPMC制剂的对比研究
表11中提供的制剂分别测试了添加剂甘露醇、依地酸二钠、偏亚硫酸氢钠和维生素E TPGS。这些是FDA批准的眼用赋形剂。
表11.用于测试添加剂的制剂
表12.5℃测定结果-塑料容器
表13.5℃测定结果-玻璃容器
杂质结果表明玻璃容器样品中制备与制备之间的不一致性，以及这些测试制剂中存在杂质。测试的添加剂都没有改善制剂中的肽稳定性。因此，选择不包括所有这些添加剂的制剂进行进一步测试，包括下文实例4-6中描述的体内测试。
实例3.用于滴眼剂施用的包含肽的制剂的体内比较研究
下表14所示的赋形剂用于制备含有浓度为100μM至10,000μM的aCT1肽的制剂，并测试溶解度和有效递送至眼睛的潜力。具体而言，比较了含有NaCl、聚合物羟丙基甲基纤维素(HPMC)、F-127(PF-127)、羟乙基纤维素(HEC)和羧甲基纤维素(CMC)的制剂。测试的制剂不包括任何添加剂或缓冲液。
表14.用于比较分析的载体
载体 浓度(w/v)
羟丙基甲基纤维素(HPMC) 0.5-1％
PF-127 20-25％
羟乙基纤维素(HEC) 0.5-1％
羧甲基纤维素(CMC) 0.5％
NaCl 0.9％
将制剂局部施用于荷兰带兔的眼睛。aCT1肽在所有浓度的盐水中都是可溶的，然而制剂在足以获得药物向角膜递送的时间内不与眼部表面接触。向剂量制剂中加入黏度调节剂羧甲基纤维素(CMC)引起聚集。相反，向制剂中加入黏弹性聚合物羟丙基甲基纤维素(HPMC)不会引起aCT1肽聚集或沉淀。
实例4：每日两次使用的耐受性和分布研究
进行了一项研究，以确定aCT1肽在HPMC制剂中连续7天每天两次眼部施用的安全性、耐受性和生物学分布。
通过在载体(1％HPMC)中混合适量的供试品以达到目标浓度(参见下表15中的剂量浓度)来制备剂量制剂。制剂包含1％w/w HPMC和0.9％w/w NaCl，并且不包括缓冲液、防腐剂、其它载体和其它赋形剂。过滤后记录制剂pH，并且取决于制剂的浓度，pH在5.9至7.6之间。每天每次给药间隔8小时，每只眼给药体积为0.1mL。
表15.实验设计
连续七天每天两次局部眼部施用aCT1耐受性良好，并且在笼侧或临床观察、体重、临床病理学、器官重量或尸体剖检中没有任何不良结果。对包括对照组在内的所有组中的一些动物，眼睛检查显示眼睑和结膜的刺激以及角膜的点画和眼睑的剥落；表明这些发现归因于载体的黏度而不是aCT1处理。在暴露于aCT1的眼组织中也没有显微镜发现。
aCT1的组织分布在施用0.1μmol/眼/剂量的兔子中测定。aCT1的全血浓度低，但在所有三只雄性兔中在第1天0.25小时可测得浓度为3.26±5.28ng/ml。第1天的所有其它血液样品和第7天的所有血液样品都低于定量下限(LLOQ)。在雄性和雌性的眼睑结膜中观察到在眼部组织中最高浓度的aCT1。在第1天和第7天给药后，所有取样的动物在该组织中具有aCT1的可定量浓度。最高平均浓度出现在第1天0.25小时，为939±228ng/g(雄性)和2730±697ng/g(雌性)。角膜和房水具的aCT1平均水平次高，为181±50.0ng/g(角膜，第1天，雌性0.25小时)和115±76.3ng/g(房水，第1天，雄性0.25小时)。在第1天和第7天施用剂量后的每个时间点，至少一只动物的玻璃体液包含aCT1的可定量水平。在第1天的0.25小时，所有兔子的视网膜组织中都可测量到aCT1，浓度范围为1.91ng/g(雌性040)至24.2ng/g(雌性24.2ng/g)。
aCT1在所有组织中的浓度倾向于随时间的推移而降低。在雄性和雌性兔中观察到aCT1分布没有一致的差异。在施用剂量前收集的所有血液和组织样品都低于aCT1定量下限。如第1天眼部施用后0.25小时血液中供试品的低水平所示，aCT1的全身暴露是轻微的。一只雄性在第7天4小时也具有aCT1的可定量水平。aCT1被快速吸收到眼组织中，对于所有眼组织，在第1天Tmax为0.25小时。
总之，在眼睑结膜、即与剂量制剂直接接触的组织中观察到最高浓度的aCT1。角膜和房水也高度暴露于aCT1。该溶液还实现了ACT向包括视网膜在内的眼睛最内组织的递送，考虑到如本文所述的向眼睛递送多肽相关的挑战，这是一个令人惊讶的结果。
尽管眼组织和血液暴露于aCT1，没有可归因于aCT1治疗的副作用，暴露于aCT1的眼的组织病理学没有显示任何异常发现。因此，本研究中没有鉴定出最大耐受剂量(MTD)。当连续7天每天两次施用时，未观察到的副作用水平(NOAEL)估计为1.0μmol/眼。
总之，研究结果表明，HPMC可用于aCT1肽的眼科递送系统，并在包括视网膜的目标组织中安全地达到aCT1的治疗水平。
实例5.角膜损伤后的角膜再生和再上皮化以及用HPMC中的aCT1肽治疗
还没有FDA批准的有效加速角膜再上皮化的治疗剂。进行研究以确定aCT1肽是否可在眼损伤后诱导和/或加速角膜愈合。
在一项研究中，在庚醇诱导的兔眼角膜糜烂(化学烧伤)后，测试了在1％ HPMC中的200μM和5mM aCT1制剂促进角膜再生的能力。制剂包含1％w/w HPMC和0.9％w/w NaCl，并且不包括缓冲液、防腐剂、其它载体和其它赋形剂。aCT1滴眼剂在受伤后立即施用，然后每天两次，持续2天。aCT1加速了化学烧伤后的角膜愈合，如通过荧光素染色测量的(图1和2A)以及通过角膜中央厚度测量的(图2B)。
在另一项研究中，将兔子麻醉，角膜(双侧)受到中心6.0mm直径×150μm深的损伤(经上皮PTK损伤)。在损伤后，立即用荧光素对角膜进行染色，并对其成像以监测损伤的大小。用150μM aCT1 0.5％HPMC或一种载体对照治疗眼睛。结果示于图3。用aCT1肽治疗的眼睛显示加速的角膜愈合。考虑到及时的上皮表面重建对于预防功能丧失、眼部发病和视力丧失是至关重要的，因此aCT1治疗眼和对照眼之间的早期(3天内)差异具有高度临床意义。
实例6.硫芥诱导的眼损伤的aCT1肽治疗
硫芥(SM)和氮芥(NM)是影响眼睛、皮肤和呼吸系统的强效发疱化学战剂。在发疱剂中，SM已最广泛地用于战争中，导致受伤和战场伤亡。眼睛是对发疱剂暴露最敏感的组织，暴露2-6小时后出现症状，几周后愈合。眼部暴露与延迟的损伤症状有关：干燥、结膜瘢痕、视敏度降低、持续性角膜缺陷、炎症和导致进行性视力退化的新血管形成。目前，还没有批准用于眼部暴露于眼部发疱剂(包括SM和NM)的疗法。
因此，进行了一项研究，以评估aCT1滴眼剂在治疗这种发疱战剂中的治疗潜力。将新西兰白兔(每个治疗组n＝3)暴露于25μL 1％氮芥(NM)的盐水溶液。用载体对照(0.5％HPMC)或用200μM aCT1的0.5％ HPMC溶液或用5mM aCT1的0.5％HPMC溶液治疗角膜。制剂包含0.5％w/wHPMC和0.9％w/w NaCl，并且不包括缓冲剂、防腐剂、其它载体和其它赋形剂。在暴露后2小时进行治疗，然后每12小时进行一次持续7天。健康(未损伤)角膜也未治疗，或仅用载体治疗。在暴露后7天对动物实施安乐死。收集角膜并进行组织学(H&E染色)或免疫组织化学处理。
研究结果提供于图4-7中。ACT治疗限制了NM暴露后的角膜水肿。图4A和4B显示，与未治疗和载体治疗的NM暴露的角膜相比，aCT1肽限制了角膜水肿损伤。aCT1治疗也降低了NM暴露后角膜中的促炎反应(图5A-5D)。促炎反应和炎性细胞的募集可加剧组织损伤，导致角膜混浊和瘢痕形成。H&E染色显示，与未治疗和载体治疗的暴露于NM的角膜相比，aCT1显著降低了暴露于NM的角膜的角膜基质中的炎性细胞浸润(图5A和5B)。aCT1治疗组中促炎酶COX-2的表达也减少(图5C和5D)，这可能部分介导炎性细胞浸润的减少。
角膜成纤维细胞(也称为角膜角质细胞)合成胶原对于基质维持和再生至关重要，并且基质金属肽酶-9(MMP-9)在角膜基质中的表达和活性增加导致其降解。aCT1处理防止了NM暴露后角膜基质的降解并促进了角膜基质的再生，这通过aCT1治疗的角膜中角膜成纤维细胞/角膜细胞的保护(图6A和6B)以及aCT1治疗的角膜中基质中MMP-9表达的减少(图6C和6D)得到证实。
眼部暴露于发疱剂也诱导角膜新生血管形成，这导致角膜混浊和功能障碍。研究显示aCT1阻止角膜新血管形成。图7A和7B显示aCT1治疗限制了角膜基质中新血管的形成。治疗组中新血管的缺乏对应于血管内皮生长因子(VEGF，一种刺激新血管形成的信号因子)表达减少的模式(图7C和7D)。
总之，研究结果表明，施用aCT1制剂在保护免受硫芥诱导的眼损伤和加速这种损伤后角膜基质的再生方面具有惊人的效力。aCT1肽对角膜愈合所需的几种细胞类型和活性具有积极作用，因此独特地能够有效治疗和预防角膜损伤。
实例7.用于治疗用途的最佳aCT1制剂的评价。
进行了研究，以评价由aCT1肽、氯化钠和HPMC(4000mPaS；表16)组成的新型aCT1滴眼剂制剂的特征。令人惊讶的是，这种不含防腐剂、赋形剂或缓冲溶液的制剂提供了一种具有推荐范围内的黏度的制剂，用于局部递送至眼睛并在储存期间表现出肽稳定性。此外，该制剂的回收测试证明了无菌过滤的可行性以及该制剂与验证的HPLC测试方法的相容性，以证实滴眼剂规格(表17和表18)。进行测定以评价该制剂与无菌过滤和用于测定肽浓度的分析方法的相容性。与分析方法的相容性是确保产物保持在规格内所必需的。在玻璃或塑料中储存后，在该最佳制剂的无菌过滤后，证明aCT1肽完全回收(表17)。对于包含0.7％w/w或1.8％w/w aCT1肽的制剂，在-20℃、5℃和25℃储存0、1和3个月时肽的稳定性示于表19。
因此，本文提供了稳定的滴眼剂制剂，其具有用于将肽递送至眼的优异的制剂特性，包括相对于测试的各种其它载体和与包含防腐剂、赋形剂或缓冲溶液的制剂(参见实例1-3)相比的优异特性。本文提供的制剂可用于将肽治疗剂例如aCT1肽最佳地递送至眼睛用于治疗用途。
表16.最佳滴眼剂制剂
表17.制剂测定结果
表18.最佳制剂特性
特性 滴眼剂制剂
密度 0.99g/mL
pH 5.3
黏度 20.4mPa.s
渗透浓度 288mOsm/kg
表19.最佳滴眼剂制剂的肽稳定性测试。
实例8.赋形剂效果
评估了各种制剂组分的效果。结果提供于表20和21中。与山梨糖醇相比，NaCl提供了更好的稳定性，特别是在高于50mM的浓度下。此外，在较高的肽浓度下观察到较高的稳定性。
表20.NaCl相对于山梨糖醇(20mg/mL肽，pH 6.5)的效果
纯度损失(％) [NaCl](mM) 山梨糖醇(mM)
0.67 0.67 0.67
0.24 0.24 0.24
0.03 0.03 0.03
0.76 0.76 0.76
1.05 1.05 1.05
表21.[肽]/pH的影响
纯度损失(％) [肽](mg/mL) pH
0.44 0.8 6.5
0.39 5 6.5
0.30 10 6.5
0.19 15 6.5
0.06 20 6.5
0.33 20 7.0
0.50 20 7.5
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 1
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20
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<223> 合成结构
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Pro Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp
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Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Val
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Arg Pro Arg Pro Asp Asp Val Pro Val
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Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
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Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
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Leu Ala
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Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
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Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp
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Ser Lys
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Lys Lys Arg Lys Val
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<223> 合成结构
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Pro Ser Cys Val Ser Ser Ser Ala Val Leu Thr Thr Ile Cys Ser Ser
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Val
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<223> 合成结构
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<223> 合成结构
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<220>
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<220>
<223> 合成结构
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 51
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 52
Gly Asp Gly Lys Asn Ser Val Trp Val
1 5
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 53
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Gly Lys Asn Ser Val Trp Val
20
<210> 54
<211> 18
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 54
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Tyr Val
<210> 55
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 55
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1 5 10 15
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20
<210> 56
<211> 20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 56
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Pro Pro Gln Arg Pro Arg Pro Asp
1 5 10 15
Asp Leu Glu Ile
20
<210> 57
<211> 25
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<220>
<223> 合成结构
<400> 57
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
20 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 58
Arg Gln Ile Ala Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Ala Ala
1 5 10 15
Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
20 25
<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 59
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu
1 5 10 15
Glu Ile
<210> 60
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 60
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
1 5 10 15
Arg Leu Leu Arg Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
20 25 30
<210> 61
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 61
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu Arg Pro Arg Pro Asp Asp
20 25 30
Leu Glu Ile
35
<210> 62
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 62
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ala Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
20 25
<210> 63
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 63
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
20 25
<210> 64
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 64
Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu Arg Pro Arg Pro Asp Asp
1 5 10 15
Leu Glu Ile
<210> 65
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 65
Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp
1 5 10 15
Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Arg Pro Arg Pro
20 25 30
Asp Asp Leu Glu Ile
35
<210> 66
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 66
Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His
1 5 10 15
Ser Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
20 25
<210> 67
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 67
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
20 25 30
<210> 68
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 68
Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Gly Arg Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
20 25
<210> 69
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 69
Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr Arg
1 5 10 15
Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
20
<210> 70
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 70
Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu Arg Pro Arg Pro
1 5 10 15
Asp Asp Leu Glu Ile
20
<210> 71
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 71
Lys Gly Lys Ser Asp Pro Tyr His Ala Thr Ser Gly Ala Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ala Lys Asp Cys Gly Ser Gln Lys Tyr Ala Tyr Phe Asn Gly Cys Ser
20 25 30
Ser Pro Thr Ala Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro Pro Gly Tyr Lys Leu
35 40 45
Val Thr Gly Asp Arg Asn Asn Ser Ser Cys Arg Asn Tyr Asn Lys Gln
50 55 60
Ala Ser Glu Gln Asn Trp Ala Asn Tyr Ser Ala Glu Gln Asn Arg Met
65 70 75 80
Gly Gln Ala Gly Ser Thr Ile Ser Asn Ser His Ala Gln Pro Phe Asp
85 90 95
Phe Pro Asp Asp Asn Gln Asn Ser Lys Lys Leu Ala Ala Gly His Glu
100 105 110
Leu Gln Pro Leu Ala Ile Val Asp
115 120
<210> 72
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 72
Lys Thr Asp Pro Tyr Ser His Ser Gly Thr Met Ser Pro Ser Lys Asp
1 5 10 15
Cys Gly Ser Pro Lys Tyr Ala Tyr Tyr Asn Gly Cys Ser Ser Pro Thr
20 25 30
Ala Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro Pro Gly Tyr Lys Leu Val Thr Gly
35 40 45
Asp Arg Asn Asn Ser Ser Cys Arg Asn Tyr Asn Lys Gln Ala Ser Glu
50 55 60
Gln Asn Trp Ala Asn Tyr Ser Ala Glu Gln Asn Arg Met Gly Gln Ala
65 70 75 80
Gly Ser Thr Ile Ser Asn Ser His Ala Gln Pro Phe Asp Phe Ala Asp
85 90 95
Glu His Gln Asn Thr Lys Lys Leu Ala Ser Gly His Glu Leu Gln Pro
100 105 110
Leu Thr Ile Val Asp Gln Arg Pro
115 120
<210> 73
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 73
Leu Gly Phe Gly Thr Ile Arg Asp Ser Leu Asn Ser Lys Arg Arg Glu
1 5 10 15
Leu Glu Asp Pro Gly Ala Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Trp Asn Thr Pro
20 25 30
Ser Ala Pro Pro Gly Tyr Asn Ile Ala Val Lys Pro Asp Gln Ile Gln
35 40 45
Tyr Thr Glu Leu Ser Asn Ala Lys Ile Ala Tyr Lys Gln Asn Lys Ala
50 55 60
Asn Thr Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Gly Ser His Glu Glu Asn Leu Pro
65 70 75 80
Ala Asp Leu Glu Ala Leu Gln Arg Glu Ile Arg Met Ala Gln Glu Arg
85 90 95
Leu Asp Leu Ala Val Gln Ala Tyr Ser His Gln Asn Asn Pro His Gly
100 105 110
Pro Arg Glu Lys Lys Ala Lys Val
115 120
<210> 74
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 74
Gly Phe Gly Thr Ile Arg Asp Thr Leu Asn Asn Lys Arg Lys Glu Leu
1 5 10 15
Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Trp Asn Thr Pro Ser
20 25 30
Ala Pro Pro Gly Tyr Asn Ile Ala Val Lys Pro Asp Gln Met Gln Tyr
35 40 45
Thr Glu Leu Ser Asn Ala Lys Met Ala Tyr Lys Gln Asn Lys Ala Asn
50 55 60
Ile Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Gly Ser Asn Glu Glu Asn Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asp Leu Glu Asn Leu Gln Arg Glu Ile Lys Val Ala Gln Glu Arg Leu
85 90 95
Asp Met Ala Ile Gln Ala Tyr Asn Asn Gln Asn Asn Pro Gly Ser Ser
100 105 110
Ser Arg Glu Lys Lys Ser Lys Ala
115 120
<210> 75
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 75
Pro Tyr Leu Val Asp Cys Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile
1 5 10 15
Phe Ile Ile Phe Met Leu Val Val Gly Leu Ile Ser Leu Val Leu Asn
20 25 30
Leu Leu Glu Leu Val His Leu Leu Cys Arg Cys Leu Ser Arg Gly Met
35 40 45
Arg Ala Arg Gln Gly Gln Asp Ala Pro Pro Thr Gln Gly Thr Ser Ser
50 55 60
Asp Pro Tyr Thr Asp Gln Val Phe Phe Tyr Leu Pro Val Gly Gln Gly
65 70 75 80
Pro Ser Ser Pro Pro Cys Pro Thr Tyr Asn Gly Leu Ser Ser Ser Glu
85 90 95
Gln Asn Trp Ala Asn Leu Thr Thr Glu Glu Arg Leu Ala Ser Ser Arg
100 105 110
Pro Pro Leu Phe Leu Asp Pro Pro
115 120
<210> 76
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 76
Cys Gly Ser Lys Glu His Gly Asn Arg Lys Met Arg Gly Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Thr Tyr Met Ala Ser Ile Phe Phe Lys Ser Val Phe Glu Val Ala
20 25 30
Phe Leu Leu Ile Gln Trp Tyr Leu Tyr Gly Phe Thr Leu Ser Ala Val
35 40 45
Tyr Ile Cys Glu Gln Ser Pro Cys Pro His Arg Val Asp Cys Phe Leu
50 55 60
Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ile Leu Phe Met Leu Val Val
65 70 75 80
Ser Met Val Ser Phe Val Leu Asn Val Ile Glu Leu Phe Tyr Val Leu
85 90 95
Phe Lys Ala Ile Lys Asn His Leu Gly Asn Glu Lys Glu Glu Val Tyr
100 105 110
Cys Asn Pro Val Glu Leu Gln Lys
115 120
<210> 77
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 77
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 78
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 78
ccctcctccc gggcctcctc ccgggcctcc tcccggcccc ggcccgacga cctggagatc 60
<210> 79
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 79
cggccccggc ccgacgacct ggagatc 27
<210> 80
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 80
cggccccggc ccgacgacct ggaggtg 27
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 81
cggccccggc ccgacgacgt gcccgtg 27
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 82
aaggcccggt ccgacgacct gtccgtg 27
<210> 83
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 83
cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaag 48
<210> 84
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 84
cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcc ctcctcccgg 60
gcctcctccc gggcctcctc ccggccccgg cccgacgacc tggagatc 108
<210> 85
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 85
cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60
gacgacctgg agatc 75
<210> 86
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 86
cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60
gacgacctgg aggtg 75
<210> 87
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 87
cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60
gacgacgtgc ccgtg 75
<210> 88
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 88
cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagaa ggcccggtcc 60
gacgacctgt ccgtg 75
<210> 89
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 89
Pro Cys Ser Arg Ala Ser Ser Arg Met Ser Ser Arg Ala Arg Pro Asp
1 5 10 15
Asp Leu Asp Val
20
<210> 90
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 90
Pro Arg Val Ser Val Pro Asn Phe Gly Arg Thr Gln Ser Ser Asp Ser
1 5 10 15
Ala Tyr Val
<210> 91
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is biotinylated L-2-aminohexanoic acid
<400> 91
Xaa Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys
1 5 10 15
Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
20 25

Claims (38)

1.一种制剂，其包含分子量为约1.0kDa至约10.0kDa的活性肽和羟丙基甲基纤维素(HPMC)，其中所述制剂适于局部眼部递送。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述HPMC以约0.01％(w/w)至约2.0％(w/w)的浓度存在于所述制剂中。
3.根据权利要求2所述的制剂，其中所述HPMC以约0.05％(w/w)至约0.5％(w/w)的浓度存在于所述制剂中。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制剂，其中所述制剂还包含氯化钠(NaCl)。
5.根据权利要求4所述的制剂，其中所述NaCl以约0.7％至约1.5％(w/w)的浓度存在。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制剂，其中所述活性肽以约0.05％(w/w)至约0.1％(w/w)的浓度存在于所述组合物中。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制剂，其中所述制剂的黏度为约18至约28mPaS。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制剂，其中所述活性肽是α连接蛋白肽。
9.根据权利要求8所述的制剂，其中所述α连接蛋白肽包含α连接蛋白的羧基最末端的4-30个连续氨基酸。
10.根据权利要求9所述的制剂，其中所述α连接蛋白肽由α连接蛋白的羧基最末端的4-30个连续氨基酸组成。
11.根据权利要求9的制剂，其中所述肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自以下构成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
12.根据权利要求11所述的制剂，其中所述肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的制剂，其中所述肽包含细胞内化序列。
14.根据权利要求13所述的制剂，其中所述细胞内化序列包含蛋白质的氨基酸序列，所述蛋白质选自以下构成的组：触角蛋白、TAT、HIV-Tat、Pentratin、Antp-3A(Antp突变体)、Buforin II、Transportan、MAP(模型两亲性肽)、K-FGF、Ku70、朊病毒蛋白、pVEC、Pep-1、SynB 1、Pep-7、HN-1、BGSC(双胍-亚精胺-胆固醇)和BGTC(双胍-Tren-胆固醇)。
15.根据权利要求14所述的制剂，其中所述细胞内化序列是触角蛋白，并且其中所述序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
16.根据权利要求15所述的制剂，其中所述肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自以下构成的组：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。
17.根据权利要求16所述的制剂，其中所述肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的制剂，其中所述制剂适于通过滴眼剂施用。
19.一种治疗或预防有需要的受试者的眼部损伤的方法，其包括向所述受试者的眼睛局部施用根据权利要求8-18中任一项所述的制剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中在引起眼部损伤的事件之后立即施用所述制剂。
21.根据权利要求19所述的方法，其中在引起眼部损伤的事件后至少约2小时向受试者施用多肽。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述眼部损伤是角膜损伤。
23.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述眼部损伤由烧伤或爆炸引起。
24.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述眼部损伤是化学或热烧伤损伤。
25.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述眼部损伤由慢性疾病引起。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述慢性疾病是糖尿病。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述慢性疾病是糖尿病性角膜病变。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述慢性疾病是视网膜疾病。
29.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述损伤继发于眼外科手术。
30.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述受试者患有持续性角膜上皮缺陷。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述持续性角膜上皮缺陷由干眼症引起。
32.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述眼部损伤是视网膜损伤。
33.一种用于加速受试者眼部损伤后角膜再上皮化的方法，所述方法包括向所述受试者的眼睛局部施用根据权利要求7-17中任一项所述的制剂。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述眼部损伤由手术、化学损伤、角膜裂伤或慢性疾病引起。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述受试者患有持续性角膜上皮缺陷。
36.一种根据权利要求8-18中任一项所述的制剂，其用于治疗或预防有需要的受试者的眼部损伤。
37.一种根据权利要求8-18中任一项所述的制剂，其用于加速受试者眼部损伤后角膜再上皮化。
38.根据权利要求36或37所述的制剂，其中所述受试者患有持续性角膜上皮缺陷。
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