KR20210057072A - 알파 코넥신 c-말단 펩타이드에 대한 나노 입자 제제 및 사용 방법 - Google Patents

알파 코넥신 c-말단 펩타이드에 대한 나노 입자 제제 및 사용 방법 Download PDF

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KR20210057072A
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seq
cancer
connexin
peptide
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KR1020217009738A
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크리스티나 엘. 그렉
가우탐 에스. 가트너카르
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퍼스트스트링 리서치 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 나노 입자 제제 및 알파 코넥신 c-말단 펩타이드에 대한 사용 방법에 관한 것이다. 제조 방법 및 예를 들어, 암 치료에서 사용 방법도 제공된다.

Description

알파 코넥신 C-말단 펩타이드에 대한 나노 입자 제제 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018 년 9월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 62/730,116에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이는 전문이 본 발명에 참조로 포함된다.
연방 기금 연구에 관한 성명
본 발명은 국립 보건원이 수여하는 보조금 번호 R43 CA195937과 국립 보건원이 수여하는 보조금 번호 R43 CA195937에 의해 수여된 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일에 대한 설명
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 참조로 본 발명에 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형식 사본(파일 이름: FIRS_008_01WO_SeqList_ST25.txt, 기록 날짜: 2019년 2월 12일, 파일 크기 34 킬로바이트)).
본 발명은 αCT1 펩타이드 함유 나노 입자 제제, 및 αCT1 함유 나노 입자 제제에 의한 암 및 기타 징후의 치료에 관한 것이다.
물리적 및 화학적 변경(즉, 변성, 응집, 산화, 가수 분해 등)에 대한 생체 내 감수성은 펩타이드 및 단백질의 치료적 발달을 방해하였다. 생분해성 나노 입자는 약물 표적화 및 감소된 표적 외 부작용을 제공하는 것 외에도 지속적인 치료 약물 전달을 달성할 수있는 기회를 제공한다.1-3 생적합성 및 생분해성으로 인해, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 나노 입자와 같은 폴리머 나노 입자는 다양한 저분자 약물의 제어 방출에 사용되어 왔다.4,5 지속적인 약물 방출은 치유되지 않는 궤양과 같은 만성 질환 및 치유하거나 소산하는 데 몇 주 이상 걸릴 수 있고 반복적인 치료 개입을 필요로 할 수 있는 암과 같은 기타 질환에 특히 유용하다.5
αCT1(aCT1 또는 ACT1이라고도 함)은 만성 상처의 치료를 위해 현재 임상 시험 중6-8이고 교모세포종(뇌암)의 치료를 위한 동물 시험 중9인 합성 C-말단 코넥신43 모방 펩타이드 약물이다. 현재 치료 패러다임은 여러 응용 프로그램 또는 관리를 필요로 한다.
생적합성, 서방성 펩타이드 나노 입자 제제 및 이를 용이하게 제조하기 위한 새로운 방법에 대한 당업계의 요구가 있다. 또한, 정맥 내 투여될 수 있는 생적합성 지속 방출 펩타이드 나노 입자 제제에 대한 당업계의 요구가 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 나노 입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 나노 입자는 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머 및 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 치료적 유효량을 포함한다. 일부 실시태양에서, 펩타이드는 세포 내재화 서열(예를 들어, 안테나피디아(Antennapedia), TAT, HIV-Tat, 페네트라틴(Penetratin), Antp-3A(Antp 돌연변이), 부포린(Buforin) II, 트랜스포탄(Transportan), MAP(model amphipathic peptide), K-FGF, Ku70, Prion, pVEC, Pep-1, SynB 1, Pep-7, HN-1, BGSC(Bis-Guanidinium-Spermidine-Cholesterol) 및 BGTC(Bis-Guanidinium-Tren-Cholesterol)로 이루어진 그룹에서 선택된 단백질의 아미노산 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 펩타이드는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLGA이다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLGA 및 PVA이다. 일부 실시태양에서, PLGA는 약 4,000 내지 약 240,000Da, 예를 들어 약 7,000 내지 약 17,000Da의 MW를 갖는다. 일부 실시태양에서, PVA는 약 8,000 내지 약 186,000Da, 예를 들어 약 13,000 내지 약 23,000Da의 MW를 갖는다. 일부 실시태양에서, PVA의 양은 약 0.05%(w/v) 내지 약 5%(w/v)이다. 일부 실시태양에서, PLGA의 양은 약 2%(w/v) 내지 약 10%(w/v)이다. 일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 10nm 내지 약 1000nm(예를 들어, 약 100nm 내지 약 200nm)이다. 일부 실시태양에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 평균 양은 나노 입자 조성물의 mg 당 적어도 약 500ng이다. 일부 실시태양에서, 나노 입자는 약 0mV 내지 약 -30mV의 제타 전위를 특징으로 하는 표면 전하를 갖는다. 일부 실시태양에서, 나노 입자는 약 0.120 내지 약 0.350의 다분산 지수(PDI)를 갖는다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 나노 입자 조성물 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 제제를 제공한다. 일부 실시태양에서, 제제는 주사용으로 제제화된 액체일 수 있다. 일부 실시태양에서, 제제는 에어로졸, 크림, 폼, 에멀젼, 겔, 액체, 로션, 패치, 분말, 고체, 스프레이, 또는 이들의 임의의 조합의 형태이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 나노 입자 조성물을 포함하는 국소 제제를 제공한다. 일부 실시태양에서, 국소 제제는 하이드록시에틸셀룰로스 겔을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 본 발명의 나노 입자 조성물의 제조 방법을 제공한다:
(a) 유기 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 포함하는 제 1 용액을 제 1 수성 용매에 용해된 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 제 2 용액과 조합하는 단계;
(b) 단계(a)의 혼합물을 유화하는 단계;
(c) 단계(b)의 에멀젼을 제 2 수성 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 포함하는 제 2 용액에 첨가하는 단계;
(d) 유기 용매를 제거하는 단계; 및
(e) 선택적으로 (d)의 생성물을 정제하는 단계.
일부 실시태양에서, 이 방법은 (d) 또는 (e)의 생성물을 동결 및/또는 동결 건조하는 단계(f)를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 단계(a)의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLGA이다. 일부 실시태양에서, 단계(c)의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PVA를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 본 발명의 나노 입자 조성물의 제조 방법을 제공한다:
(a) 다음을 제공하는 단계;
i. SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열 및 수혼화성 유기 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머;
ii. 반 용매;
(b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열 및 수혼화성 유기 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 반 용매와 혼합하여 나노 입자 조성물이 형성되도록 하는 단계; 및
(c) 선택적으로 (b)의 생성물을 정제하는 단계.
일부 실시태양에서, 이 방법은 (b) 또는 (c)의 생성물을 동결 및/또는 동결 건조하는 단계(d)를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 단계(a)의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLGA이다. 일부 실시태양에서, 단계(a)의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PVA를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 국소 제제의 제조 방법을 제공한다:
a) 프로필렌 글리콜, 글리세린, 메틸 파라벤 및 프로필 파라벤을 파라벤이 완전히 용해될 때까지 혼합하는 단계;
b) 맑은 용액이 얻어질 때까지 정제수, EDTA, 일 염기성 인산 나트륨, 이 염기성 인산 나트륨 및 D-만니톨을 별도로 혼합하는 단계;
c) a)의 용액을 b)의 용액에 첨가하고, a)의 용액 용기를 정제수로 헹구고, 린스를 결합된 용액에 첨가하고, 결합된 용액이 시각적으로 균질해질 때까지 혼합하는 단계;
d) 균질화 혼합하면서, c)의 결합된 용액에 하이드록시에틸 셀룰로스를 첨가하고 중합체가 완전히 분산될 때까지 혼합하는 단계;
e) 펩타이드가 완전히 용해될 때까지 정제수를 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 별도로 혼합하는 단계;
f) e)의 용액을 d)의 용액에 첨가하고, e)의 용액 용기를 정제수로 헹구고, 린스를 결합된 용액에 첨가하고, 결합된 용액이 균질해질 때까지 혼합하는 단계.
일부 실시태양에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 이 방법은 발명의 약학적 제제의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 암은 신경아교종(예를 들어, 교모세포종)이다. 일부 실시태양에서, 약학적 제제는 종양 내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시태양에서, 이 방법은 화학 요법제(예를 들어, TMZ)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 화학 요법제는 약학적 제제와 동시에 투여되지 않는다(예를 들어, 화학 요법제는 약학적 제제와 다른 날에 투여된다). 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 펩타이드-나노 입자 조성물은 나노 입자와 연관되지 않은 동일한 펩타이드에 비해 암 치료에서 예상치 못한 우수한 임상 효과를 제공한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 펩타이드-나노 입자 조성물은 네이키드 펩타이드에 비해 신경아교종에서 예상치 못한 우수한 임상 이점을 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 펩타이드-나노 입자 조성물은 암 환자에서 현저하게 개선된 결과를 초래하는 우수한 약물 방출 프로파일 및/또는 입자 특성을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 이 방법은 균일한 입자 크기를 갖고 나노 입자 응집이 거의 또는 전혀 없는 펩타이드-나노 입자를 생성한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 피험자에게 본 발명의 국소 제제를 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 만성 상처를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 제제는 만성 상처의 치료에 효과적인 투여 요법으로 투여된다(예를 들어, 매일 또는 매주). 일부 실시태양에서, 만성 상처는 궤양(예를 들어, 하지 궤양)이다. 일부 실시태양에서, 만성 상처는 정맥 하지 궤양, 당뇨병성 족부 궤양 및 욕창으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 펩타이드-나노 입자 조성물은 만성 상처 치료에 예상치 못한 우수한 임상 효과를 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 펩타이드-나노 입자 조성물은 이전에 공지된 상처 치료 요법에 비해 우수한 임상 효과를 초래하는 상처 치료에서 우수한 약물 방출 프로파일을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 펩타이드-나노 입자 조성물은 상처 치료에서 현저하게 개선된 결과를 초래하는 입자 특징을 나타낸다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는 바람직한 실시예를 나타내지만 단지 예시로서 제공된다는 것을 이해해야 하며, 이는 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 당업자에게 명백할 것이기 때문이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 BSA를 모델 약물로 사용한 입자 크기 최적화를 위한 동적 광산란 피크 그래프를 도시한다.
도 2는 시간 경과에 따른 PLGA-NP로부터 로다민 B의 방출 백분율을 도시한다.
도 3은 A) 동결 방지제를 사용하지 않을 때 동결 유무에 따른 입자 직경의 변화. B) 사용된 동결 방지제의 양과 관련하여 동결 후 입자 직경을 도시한다. 1% 수크로스(빠른 또는 느린 동결) 또는 1% 트레할로스(느린 동결)가 첨가되면, 달성되는 입자 크기는 동결되지 않은 NP의 크기에 가깝다. 15% 농도로 첨가된 트레할로스와 수크로스가 동결 방지제 없이 천천히 입자를 동결하는 것보다 더 크게 입자 크기를 증가시켰다. 오차 막대는 적어도 3개의 표본의 표준 편차이다.
도 4는 A) 샌드위치 ELISA 분석을 통해 측정된 캡슐화된 전체 약물의 백분율 함수로서 시간에 따른 나노 입자로부터 αCT1의 누적 방출 그래프. B) αCT1 나노 입자의 분해 동안 DLS에 의해 측정된 입자 직경(Z-평균) 및 입자 크기의 균질성을 나타내는 나노 입자의 다분산 지수. (C 및 D) 1일, (E 및 F) 7일 및 (G 및 H) 21일에 αCT1-NP의 SEM 이미지를 도시한다. 스케일 막대는 1μm(C, E 및 F) 및 100nm(D , F 및 H)이다.
도 5는 A) 나머지 세포 연구에 대한 최적 농도를 결정하기 위한 다양한 농도의 RhB-NP의 세포 흡수를 보여준다. 세포는 이미징 전에 밤새 배양되었다. B) 3주에 걸쳐 VTC-037 GSC에 통합된 NP에서 RhB의 방출. BF: 밝은 시야, Fluo: 형광. 스케일 바: 200μm.
도 6은 1시간 동안 배양 후 37℃ 및 4℃에서 RhB-NP를 GSC에 통합하는 것을 도시한다. BF: 밝은 시야, Fluo: 형광. 스케일 바: 200μm.
도 7은 RhB-NP의 세포 흡수를 도시한다. 스케일 바: 20μm.
도 8은 RhB- 및 αCT1-NP의 세포 흡수를 도시한다. 스케일 바: 20μm.
도 9는 그래픽 표현을 도시한다.
도 10은 Gindy, M., et al., Langmuir 2008, 24 (1), 83-90., 24 (1), 83-90에서 수정된 αCT1-NP 플래시 나노 침전화 프로토콜을 도시한다.
도 11은 A) 이중 에멀젼 및 B) 4-제트 혼합기를 사용하는 플래시 나노 침전화로 합성된 αCT1-PLGA-NP의 SEM 분석을 도시한다. 입자 크기와 형태는 기술간에 비슷하다.
도 12는 A) RhodB-NP는 방출 동역학에 대해 평가되었다. 시간이 지남에 따라 NP 형태의 변화가 감지되지 않았고 로다민 B가 36일 동안 감지되었다. B) 이중 에멀젼 또는 플래시 나노 침전화로 합성된 나노 입자는 PBS 용액에 1mg/mL 농도로 재분산되고 37℃에서 분해되어 αCT1 방출을 분석하였다. 플래시 나노 침전화는 αCT1의 조기 파열 방출이 적음을 도시하였다.
도 13은 LnN229/GSC가 RhodB-NP(적색)를 효율적으로 흡수하고 세포질에 첨가한 지 24시간 후에 검출될 수 있음을 도시한다.
도 14는 VTC-037(교모세포종 환자로부터 분리된 1차 세포)이 RhodB-NP(적색)를 효율적으로 흡수하고 >21일 동안 시험관 내에서 검출될 수 있음을 도시한다. BF = 밝은 시야. Fluo = 형광 현미경.
도 15는 인간 GBM 세포가 αCT1-NP에 의해 방출된 αCT1을 효율적으로 흡수 함을 도시한다. αCT1은 >4일 동안 시험관 내에서 검출될 수 있다. 세포는 배지를 제거하기 전에 24시간 동안 αCT1-NP에 노출되었다. 스트렙타비딘 알렉사 플루오(Streptavidin Alexa Fluor) 647 접합체를 사용하여 염색하기 전에 PBS/BSA 3%/ Triton 0.1%로 세포를 차단하고 투과화하여 Biot-αCT1, Cx43의 CT에 대한 항체(Sigma #6219) 및 핵을 염색하는 알렉사 플루오 488 및 DaPI에 접합된 2차 염소 항 토끼 항체를 검출하였다.
도 16은 GBM 이종 이식 마우스 모델에서 TMZ와 조합하여 사용될 때 αCT1-NP 치료가 종양 부피를 현저히 감소시켰음을 도시한다. TMZ 단독 치료는 효과가 없으며 종양이 계속 성장한다.
αCT1은 만성 상처의 치료를 위해 현재 임상 시험 중6-8이고 교모세포종(뇌암)의 치료를 위한 동물 시험 중9인 합성 C-말단 코넥신43 모방 펩타이드 약물이다. 만성 상처 치료에서, 현재 치료법 패러다임은 치유 과정에서 여러 가지 국소 적용을 포함한다. 서방형 알파 코넥신 펩타이드 제제의 개발은 전체 치료 비용을 줄이고 환자의 순응도를 높이는 것을 도울 수 있다. 또한, 종양 내 또는 정맥 내 투여될 수 있는 서방형 알파 코넥신 펩타이드 제제의 개발은 다양한 암 치료에 대한 알파 코넥신 펩타이드 특성의 적용성을 향상시킬 것이다. 펩타이드는 전기 분무 방법을 통해 알기네이트 마이크로입자를 사용하여 이전 작업에서 성공적으로 캡슐화되어, 약 24시간의 적당한 약물 방출 프로파일을 생성한다.10,11 αCT1의 치료 적용이 뇌 조직(교모세포종 치료의 경우)9 또는 정맥 내 전달의 좁은 세포 외 공간 내의 전달이 포함될 수 있다는 점을 감안할 때, 나노 입자 방출 시스템은 마이크로입자 또는 다른 부피가 큰 방출 방법에 비해 선호되는 약물 전달 방식일 수 있다. 본 발명은 생적합성, 서방성 αCT1 나노 입자 제제 및 이런 제제의 제조 방법을 제공한다.
상기 및 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 달리 표시되지 않는 한, 다음 용어는 다음 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 용어가 누락된 경우, 당업자에게 알려진 통상적인 용어가 지배한다.
본 발명에 사용된 용어 "포함하는", "함유하는" 및 "포함하는" 은 개방적이고 비 제한적인 의미로 사용된다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 객체 중 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본 발명에서 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
용어 "및/또는"은 달리 지시되지 않는 한 "및" 또는 "또는"을 의미하기 위해 본 발명에서 사용된다.
보다 간결한 설명을 제공하기 위해, 본 발명에 제공된 정량적 표현 중 일부는 용어 "약"으로 한정되지 않는다. 용어 "약"이 명시적으로 사용되었는지 여부에 관계없이, 본 발명에 제공된 모든 양은 실제 제공된 값을 의미하는 것으로 이해되며, 또한 이러한 주어진 값에 대한 실험 및/또는 측정 조건으로 인한 등가물 및 근사치를 포함하는 당업자에 기초하여 합리적으로 추론되는 이러한 주어진 값에 대한 근사값을 의미하는 것으로 이해된다. 수율이 백분율로 주어질 때마다, 이런 수율은 특정 화학양론적 조건에서 얻을 수 있는 동일한 개체의 최대량에 대해 수율이 주어진 개체의 질량을 의미한다. 백분율로 표시된 농도는 다르게 표시되지 않는 한 질량 비율을 나타낸다.
"환자"는 포유 동물, 예를 들어, 인간, 마우스, 쥐, 기니피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 또는 원숭이, 침팬지, 개코 원숭이 또는 히말라야와 같은 비인간 영장류이다. "환자"는 인간과 동물을 모두 포함한다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 폴리머를 지칭하기 위해 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비 아미노산에 의해 중단될 수 있다. 이 용어는 또한, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 다른 조작에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다. 본 발명에 사용된 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 다를 포함하는 천연 및/또는 비 천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱을 포함한다.
화합물과 관련하여 사용될 때 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 원하는 생물학적 결과를 제공하기에 충분한 양의 화합물을 지칭한다. 그 결과는 질환의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화 또는 생물학적 시스템의 기타 원하는 변경일 수 있다. 예를 들어, 치료 용도를 위한 "유효량"은 질환의 임상적으로 유의 한 감소를 제공하는 데 필요한 본 발명에 개시된 화합물을 포함하는 조성물의 양이다. 임의의 개별 사례에서 적절한 "유효량"은 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 표현 "유효량"은 일반적으로 활성 물질이 치료 효과를 갖는 양을 지칭한다.
본 발명에 사용된 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 용어 "예방하다"와 동의어이며 질환 발생 연기, 질환 발생 예방 및/또는 발생할 것으로 예상될 또는 예상된 이런 증상의 심각성을 감소시키는 것을 의미한다. 따라서, 이런 용어는 기존의 질병 증상 개선, 추가 증상 예방, 증상의 근본적인 원인 개선 또는 예방, 장애 또는 질환 억제, 예를 들어, 장애 또는 질환의 발생 억제, 장애 또는 질환 완화, 장애 또는 질환의 경감 유발, 질환 또는 장애로 인한 상태 완화 또는 질환 또는 장애의 증상 중지 또는 완화를 포함한다.
용어 "장애"는 본 발명에서 달리 명시되지 않는 한, 용어 질환, 상태 또는 질병을 의미하고 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "약학적으로 허용 가능한" 또는 "약리학적으로 허용 가능한"을 사용함으로써 이는 생물학적으로 또는 그렇지 않으면 바람직하지 않은 물질을 의미하는 것으로 의도된다 - 물질은 실질적으로 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 그것이 포함된 조성물의 성분들과 함께 유해한 방식으로 상호 작용하지 않고 개인에게 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "담체"는 담체, 부형제 및 희석제를 포함하고 한 기관 또는 신체의 일부에서 다른 기관 또는 피험자의 신체 일부로 약제를 운반하거나 수송하는 것에 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 부형제는 원하는 제형의 호환성 및 방출 프로파일 특성을 기준으로 선택해야 한다. 예시적인 담체 물질은, 예를 들어, 결합제, 현탁제, 붕해제, 충전제, 계면 활성제, 가용화제, 안정화제, 윤활제, 습윤제, 희석제, 분무 건조 분산액 등을 포함한다.
용어 "약학적으로 적합한 담체 물질"은, 예를 들어, 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화 규소, 글리세로인산 칼슘, 락트산 칼슘, 말토덱스트린, 글리세린, 규산 마그네슘, 카제인산 나트륨, 대두 레시틴, 염화 나트륨, 인산 삼칼슘, 인산 이칼륨, 스테아로일 락틸산 나트륨, 카라기난, 모노글리세라이드, 다이글리세라이드, 사전젤라틴화 전분 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1975 참조.
본 발명에 사용된 용어 "피험자"는 포유 동물 및 비 포유 동물을 포함한다. 포유 동물의 예는, 포유류 부류: 인간, 침팬지와 같은 비인간 영장류, 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 소, 말, 양, 염소, 돼지와 같은 농장 동물; 토끼, 개, 및 고양이와 같은 가축; 쥐, 생쥐 및 기니피그 등과 같은 설치류를 포함하는 실험실 동물 등의 임의의 구성원을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비 포유 동물의 예는 새, 물고기 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 한 실시태양에서, 포유 동물은 인간이다.
본 발명에서 사용된 용어 "투여된", "투여" 또는 "투여하는"은 개시된 화합물 또는 개시된 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 조성물을 피험자에게 직접 투여하거나 개체를 화합물과 접촉시키거나 화합물에 노출시킴으로써 치료가 필요한 동물을 포함하는 피험자의 몸에 유효량의 화합물을 형성할 수 있는 화합물의 프로드럭 유도체 또는 유사체 또는 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 조성물을 피험자에게 투여하는 것을 지칭한다.
본 발명에서 사용된 용어 "전달하는"는 개체를 목적지에 제공하는 것을 의미한다. 예를 들어, 치료제 및/또는 예방제를 피험자에게 전달하는 것은 (예를 들어, 국소, 정맥 내, 근육 내, 피내 또는 피하 경로에 의해) 본 발명의 나노 입자를 피험자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 포유 동물 또는 포유 동물 세포에 나노 입자를 투여하는 것은 하나 이상의 세포를 나노 입자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
캡슐화는 나노 입자에 적재, 결합, 결합 또는 기타 부착된 약물의 양(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 같은 알파 코넥신 폴리펩타이드의 치료적 유효량)을 의미한다. 일반적으로, 나노 입자가 약물을 캡슐화하는 능력은 약물 초기 양의%로 표현된다. 따라서, 모든 약물이 나노 입자로 캡슐화되는 경우 최적의 캡슐화 비율 100%가 달성된다.
본 발명에 사용된 "캡슐화 효율"은 나노 입자의 제조에 사용된 치료제의 초기 총량에 비해 나노 입자의 일부가 되는 치료제의 양을 의미한다. 예를 들어, 처음에 조성물에 제공된 총 100mg의 치료제 중 97mg의 치료제가 NP에 캡슐화되면 캡슐화 효율은 97%로 주어질 수 있다. 본 발명에서 사용된, "캡슐화"는 완전한, 실질적인 또는 부분적 포위, 한정, 둘러싸기 또는 용기에 포함을 지칭할 수 있다.
용어%(w/v)는 단위 부피당 중량 백분율을 의미하므로, 2% PLGA(w/v)는 본 발명의 나노 입자를 형성하기 위해 용매에 첨가된 PLGA의 초기 양을 의미한다(즉, 2g의 PLGA가 100mL의 용매에 첨가된다).
본 연구에서는, 합성 펩타이드 약물 αCT1의 캡슐화 및 제어 방출을 위한 다양한 방법을 사용하여 나노 입자를 제조하였다.
알파 코넥신 폴리펩타이드
코넥신은 세포 간 통신을 담당하는 갭 접합부 채널의 서브 유닛 단백질이다(Goodenough and Paul, 2003). 뉴클레오타이드 서열의 보존 패턴에 따라, 코넥신 단백질을 암호화하는 유전자는 알파 및 베타 코넥신 유전자라고 지칭되는 두 가지 패밀리로 나뉜다.
알파 코넥신의 카르복시-말단 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 본 발명에 개시된다. 알파 코넥신의 C-말단 아미노산 서열은 본 발명에서 알파 코넥신 카르복시-말단 또는 ACT 폴리펩타이드로 지칭될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명에 개시된 조성물은 알파 코넥신의 C-말단으로부터 4 내지 30개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 C-말단의 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 전장 알파 코넥신 단백질을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 세포질 N-말단 도메인을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 2개의 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 4개의 막 횡단 도메인을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 알파 코넥신의 세포질 루프 도메인을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 제 4 막 횡단 도메인에 근접한 알파 코넥신의 세포질 카복실 말단 도메인의 서열의 일부를 포함하지 않는다.
제공된 폴리펩타이드의 ACT 서열은 임의의 알파 코넥신으로부터 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드의 알파 코넥신 성분은 인간, 설치류, 소, 단공류, 유대류, 영장류, 설치류, 고래류, 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 척색 동물, 원핵 생물 또는 다른 알파 코넥신으로부터 유래될 수 있다.
일부 양태에서, 폴리펩타이드는 마우스 코넥신 47, 인간 코넥신 47, 인간 코넥신 46.6, 소 코넥신 46.6, 마우스 코넥신 30.2, 랫트 코넥신 30.2, 인간 코넥신 31.9, 개 코넥신 31.9, 양 코넥신 44, 소 코넥신 44, 랫트 코넥신 33, 마우스 코넥신 33, 인간 코넥신 36, 마우스 코넥신 36, 랫트 코넥신 36, 개 코넥신 36, 병아리 코넥신 36, 지브라피쉬 코넥신 36, 모론 코넥신 35, 모론 코넥신 35, 사이놉스 코넥신 35, 테트라오돈 코넥신 36, 인간 코넥신 37, 침팬지 코넥신 37, 개 코넥신 37, 크리세툴루스 코넥신 37, 마우스 코넥신 37, 메소크리세투스 코넥신 37, 랫트 코넥신 37, 마우스 코넥신 39, 랫트 코넥신 39, 인간 코넥신 40.1, 제노퍼스 코넥신 38, 지브라피쉬 코넥신 39.9, 인간 코넥신 40, 챔팬지 코넥신 40, 개 코넥신 40, 소 코넥신 40, 마우스 코넥신 40, 랫트 코넥신 40, 크리세툴로스 코넥신 40, 병아리 코넥신 40, 인간 코넥신 43, 세르코피테쿠스 코넥신 43, 오릭토라구스 코넥신 43, 스퍼모필루스 코넥신 43, 크리세툴로스 코넥신 43, 포도푸스 코넥신 43, 랫트 코넥신 43, 서스 코넥신 43, 메소크리세투스 코넥신 43, 마우스 코넥신 43, 카비아 코넥신 43, 소 코넥신 43, 에리나세우스 코넥신 43, 병아리 코넥신 43, 제노퍼스 코넥신 43, 오릭토라구스 코넥신 43, 사이프리누스 코넥신 43, 지브라피쉬 코넥신 43, 다니오 에퀴핀나투스 코넥신 43, 지브라피쉬 코넥신 43.4, 지브라피쉬 코넥신 44.2, 지브라피쉬 코넥신 44.1, 인간 코넥신 45, 침팬지 코넥신 45, 개 코넥신 45, 마우스 코넥신 45, 소 코넥신 45, 랫트 코넥신 45, 병아리 코넥신 45, 테트라오돈 코넥신 45, 병아리 코넥신 45, 인간 코넥신 46, 침팬지 코넥신 46, 마우스 코넥신 46, 개 코넥신 46, 랫트 코넥신 46, 메소크리세투스 코넥신 46, 크리세툴로스 코넥신 46, 병아리 코넥신 56, 지브라피쉬 코넥신 39.9, 소 코 넥신 49, 인간 코넥신 50, 침팬지 코넥신 50, 랫트 코넥신 50, 마우스 코넥신 50, 개 코넥신 50, 양 코넥신 49, 메소크리세투스 코넥신 50, 크리세툴루스 코넥신 50, 병아리 코넥신 50, 인간 코넥신 59, 또는 다른 알파 코넥신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 코넥신의 ACT를 포함할 수 있다. 알파 코넥신에 대한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 등록 번호에 의해 표 1에서 확인된 아미노산 서열을 포함한다.
알파 코넥신
단백질 등록 번호 단백질 등록 번호
마우스 코넥신 47 NP_536702 포도푸스 코넥신 43 AAR33085
인간 코넥신 47 AAH89439 랫트 코넥신 43 AAH81842
인간 코넥신46.6 AAB94511 서스 코넥신 43 AAR33087
소 코넥신 46.6 XP_582393 메소크리세투스 코넥신 43 AAO61857
마우스 코넥신 30.2 NP_848711 마우스 코넥신 43 AAH55375
랫트 코넥신 30.2 XP_343966 카비아 코넥신 43 AAU06305
인간 코넥신 31.9 AAM18801 소 코넥신 43 NP_776493
개 코넥신 31.9 XP_548134 에리나세우스 코넥신 43 AAR33083
양 코넥신 44 AAD56220 병아리 코넥신 43 AAA53027
소 코넥신 44 I46053 제노퍼스 코넥신 43 NP_988856
랫트 코넥신 33 P28233 오릭토라구스 코넥신 43 AAS89649
마우스 코넥신 33 AAR28037 사이프리누스 코넥신 43 AAG17938
인간 코넥신 36 Q9UKL4 지브라피쉬 코넥신 43 CAH69066
마우스 코넥신 36 NP_034420 다니오 에퀴핀나투스 코넥신 43 AAC19098
랫트 코넥신 36 NP_062154 지브라피쉬 코넥신 43.4 NP_571144
개 코넥신 36 XP_544602 지브라피쉬 코넥신 44.2 AAH45279
병아리 코넥신 36 NP_989913 지브라피쉬 코넥신 44.1 NP_571884
지브라피쉬 코넥신 36 NP_919401 인간 코넥신 45 I38430
모론 코넥신 35 AAC31884 침팬지 코넥신 45 XP_511557
모론 코넥신 35 AAC31885 개 코넥신 45 XP_548059
사이놉스 코넥신 35 BAC22077 마우스 코넥신 45 AAH71230
테트라오돈 코넥신 36 CAG06428 소 코넥신 45 XP_588395
인간 코넥신 37 I55593 랫트 코넥신 45 AAN17802
침팬지 코넥신 37 XP_524658 병아리 코넥신 45 NP_990834
개 코넥신 37 XP_539602 테트라오돈 코넥신 45 CAF93782
크리세툴로스 코넥신 37 AAR98615 병아리 코넥신 45.6 I50219
마우스 코넥신 37 AAH56613 인간 코넥신 46 NP_068773
메소크리세투스 코넥신37 AAS83433 침팬지 코넥신 46 XP_522616
랫트 코넥신37 AAH86576 마우스 코넥신 46 NP_058671
마우스 코넥신 39 NP_694726 개 코넥신 46 XP_543178
랫트 코넥신 39 AAN17801 랫트 코넥신 46 NP_077352
인간 코넥신 40.1 NP_699199 메소크리세투스 코넥신 46 AAS83437
제노퍼스 코넥신38 AAH73347 크리세툴로스 코넥신 46 AAS77618
지브라피쉬 코넥신 39.9 NP_997991 병아리 코넥신 56 A45338
인간 코넥신 40 NP_859054 지브라피쉬 코넥신 39.9 NP_997991
침팬지 코넥신 40 XP_513754 소 코넥신 49 XP_602360
개 코넥신 40 XP_540273 인간 코넥신 50 P48165
소 코넥신 40 XP_587676 침팬지 코넥신 50 XP_524857
마우스 코넥신 40 AAH53054 랫트 코넥신 50 NP_703195
랫트 코넥신 40 AAH70935 마우스 코넥신 50 AAG59880
크리세툴로스 코넥신 40 AAP37454 개 코넥신 50 XP_540274
병아리 코넥신 40 NP_990835 양 코넥신 49 AAF01367
인간 코넥신 43 P17302 메소크리세투스 코넥신 50 AAS83438
세르코피테쿠스 코넥신 43 AAR33082 크리세툴로스 코넥신 50 AAR98618
오릭토라구스 코넥신 43 AAR33084 병아리 코넥신 50 BAA05381
스퍼모필루스 코넥신 43 AAR33086 인간 코넥신 59 AAG09406
크리세툴로스 코넥신 43 AAO61858
일부 양태에서, 본 발명에 개시된 조성물은 알파 코넥신의 카복시-말단에 대한 상기 단백질의 결합을 정상적으로 매개하는 단백질의 도메인과 상호 작용하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명에 개시된 조성물은 단백질에 경쟁적으로 결합함으로써 알파 코넥신에 정상적으로 결합하는 단백질의 기능을 억제하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 신모세포종 과발현 단백질(NOV)은 Cx43 c-말단 도메인과 상호 작용한다(Fu et al., J Biol Chem. 2004 279 (35):36943-50). NOV는 알파 코넥신의 카복시 말단과 상호 작용하고 거대 분자 복합체를 형성하는 다른 단백질과 더 상호 작용한다. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명에 개시된 조성물의 폴리펩타이드는, 예를 들어, NOV와 상호 작용함으로써 Cx43 갭 접합부 채널의 응집을 조절하는 것과 관련된 분자 기계의 작동을 억제할 수 있다고 생각된다.
일부 양태에서, 폴리펩타이드는 비-알파 코넥신 또는 비-ACT 펩타이드 코넥신 아미노산에 의해 플랭킹될 수 있다. 비-알파 코넥신의 예는 강화된 녹색 형광 단백질의 239 아미노산 서열이다. 비-ACT 펩타이드 코넥신 아미노산의 예는 인간 Cx43의 카복시-말단 20 내지 120개 아미노산(SEQ ID NO: 72); 병아리 Cx43의 카복시-말단 20 내지 120개 아미노산(SEQ ID NO: 73); 인간 Cx45의 카복시-말단 20 내지 120개 아미노산(SEQ ID NO: 74); 병아리 Cx45의 카복시-말단 20 내지 120개 아미노산(SEQ ID NO: 75); 인간 Cx37의 카복시-말단 20 내지 120개 아미노산(SEQ ID NO: 76); 및 랫트 Cx33의 카복시-말단 20 내지 120개 아미노산(SEQ ID NO: 77)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
알파 코넥신의 카복시-말단-가장 아미노산 서열은 다수의 독특하고 보존된 특징을 특징으로 한다(표 2 참조). 이러한 조직 보존은 독특한 3D 구조를 형성하고, 여러 파트너 단백질과 상호 작용하고, 지질 및 막과의 상호 작용을 매개하고, DNA를 포함한 핵산과 상호 작용하고, 막 채널을 통과 및/또는 차단하고 단백질 분해 절단, 단백질 가교, ADP-리보실화, 글리코실화 및 인산화에 대한 합의 모티프를 제공하는 ACT 펩타이드의 능력과 일치한다.
일부 양태에서, 본 발명에 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 유형 II PDZ 결합 모티프(Ф-x-Ф; 여기서 x는 임의의 아미노산이고 Ф=는 소수성 아미노산; 예를 들어, 표 2, 볼드체)를 포함한다. PDZ 모티프는 일반적으로 항상 그런 것은 아니지만 극단적인 세포 내 카복실 말단에 위치한 공통 서열이다. 4 가지 유형의 PDZ 모티프가 분류되었다 : 유형 I(S/T-x-Ф), 유형 II(Ф-x-Ф), 유형 III(Ψ-x-Ф) 및 유형 IV(D-x-V), 여기서 x는 아미노산이고, Ф는 소수성 잔기(V, I, L, A, G, W, C, M, F)이고 Ψ는 염기성 친수성 잔기(H, R, K)이다.(Songyang, Z., et al. 1997. Science 275, 73-77).
일부 양태에서, 본 발명에 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 PDZ 도메인을 포함하는 단백질에 대한 알파 코넥신의 결합을 억제할 수 있다. PDZ 도메인은 원래 시냅스 후 밀도 단백질 PSD95/SAP90, 초파리 종양 억제자 dlg-A 및 밀착 접합부 단백질 ZO-1 내에서 보존된 서열 요소로 확인되었다. 원래는 GLGF 또는 DHR 모티프라고 했지만 이제는 이러한 처음 세 개의 PDZ 함유 단백질(PSD95/DLG/ZO-1)을 나타내는 약어로 알려져 있다. 이러한 80-90 아미노산 서열은 현재 75개 이상의 단백질에서 확인되었으며 단일 단백질 내에서 여러 사본으로 특징적으로 발현된다. PDZ 도메인은 PDZ 결합 모티프로 채워질 수 있는 구조적으로 잘 정의된 상호 작용 '포켓'을 갖는 특정 유형의 단백질 상호 작용 모듈이다.
일부 양태에서, 본 발명에 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 PDZ 결합 모티프 근방인 - 프롤린(P) 및/또는 글리신(G) 힌지 잔기; 고주파 포스포-세린(S) 및/또는 포스포-트레오닌(T) 잔기; 및 고주파의 양으로 하전된 아르기닌(R), 리신(K) 및 음으로 하전된 아스파라긴산(D) 또는 글루탐산(E) 아미노산을 포함할 것이다. 일부 양태에서, P 및 G 잔기는 카복시-말단 II 형 PDZ 결합 모티프에 근접한 클러스터 모티프(예를 들어, 표 2, 이탤릭체)에서 발생한다. 일부 양태에서, S 및 T 인산염-아미노산은 전형적으로 군집된 반복적인 모티프(예를 들어, 표 2, 밑줄)로 구성된다. Cx43의 ACT 펩타이드 구성은 인간으로부터 물고기까지 매우 보존되어 있다(예를 들어, 표 2에서 인간 및 지브라피쉬에 대한 Cx43 ACT 서열을 비교). 추가로, Cx45의 ACT 펩타이드 구성은 인간으로부터 새까지 매우 보존되어 있다(예를 들어, 표 2의 인간 및 병아리에 대한 Cx45 ACT 서열 비교). Cx36의 ACT 펩타이드 구성은 또한 영장류로부터 물고기까지 매우 보존되어 있다(예를 들어, 표 2의 침팬지 및 제브라 피쉬에 대한 Cx36 ACT 서열을 비교).
알파 코넥신 카복시-말단(ACT) 아미노산 서열
유전자 서열 SEQ ID NO
인간 알파 Cx43 P SSRA SSR PRP D DLEI (SEQ ID NO:9)
병아리 알파 Cx43 P S RA SSRA SSR PRP D DLEI (SEQ ID NO:29)
지브라피쉬 알파 Cx43 P CSRA SSRM SSRA R P D DLDV (SEQ ID NO:90)
인간 알파 Cx45 G SNKS TA SSKS GDG KN SVWI (SEQ ID NO:30)
병아리 알파 Cx45 G SNKSS A SSKS GDG KN SVWI (SEQ ID NO:31)
인간 알파 Cx46 G RA SKAS RASS G RAR P E DLAI (SEQ ID NO:32)
인간 알파 Cx46.6 G SASS RD G K TVWI (SEQ ID NO:33)
침팬지 알파 Cx36 P RVSV PNFG R TQ SSD SAYV (SEQ ID NO:34)
병아리 알파 Cx36 P RMSM PNFG R TQ SSD S AYV (SEQ ID NO:35)
지브라피쉬 알파 Cx36 P RMSM PNFG R TQ SSD S AYV (SEQ ID NO:91)
인간 알파 Cx47 P RAGSEK G SASS R DG KT TVWI (SEQ ID NO:36)
인간 알파 Cx40 G HRL P H G YHSDKRRL SKASS KARSD DLSV (SEQ ID NO:37)
인간 알파 Cx50 P ELTTDDAR P LSRL SKASS RARSD DLTV (SEQ ID NO:38)
인간 알파 Cx59 P NHVV SLTN NLI GRRVP T DLQI (SEQ ID NO:39)
랫트 알파 Cx33 P S CV SSS A VLTTIC SS DQVV PVG L SS FYM (SEQ ID NO:40)
양 알파 Cx44 G R SSKA SKSS GG RARAA DLAI (SEQ ID NO:41)
인간 베타 Cx26 LC YLLIR YCSGK SKKPV (SEQ ID NO:42)
일부 양태에서, 폴리펩타이드의 카복실 말단으로부터 약 17 내지 30개의 아미노산에 위치하는 보존된 프롤린 또는 글리신 잔기가 있다(표 2). 비 제한적인 예는 다음과 같다. 인간 Cx43에서 아미노산 363의 프롤린 잔기는 카복실 말단으로부터 19개의 아미노산에 위치한다. 병아리 Cx43에서 아미노산 362의 프롤린 잔기는 카복실 말단으로부터 18개의 아미노산에 위치한다. 인간 Cx45에서 아미노산 377의 글리신 잔기는 카복실 말단으로부터 19개의 아미노산에 위치한다. 랫트 Cx33에서 아미노산 258의 프롤린 잔기는 카복실 말단에서 뒤로 28개 아미노산에 위치한다. 일부 양태에서, 본 발명에 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 카복실 말단으로부터 약 17 내지 30개의 아미노산에 위치하는 이 보존된 프롤린 또는 글리신 잔기에 근접한 아미노산을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 본 발명에 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 1) II 형 PDZ 결합 모티프, 2) 프롤린(P) 및/또는 글리신(G) 힌지 잔기; 3) 포스포-세린(S) 및/또는 포스포-트레오닌(T) 잔기의 클러스터; 및 4) 고주파수 양으로 하전된 아르기닌 (R) 및 리신(K) 및 음으로 하전된 아스파르트 산(D) 및/또는 글루탐산(E) 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1, 2, 3 또는 모든 아미노산 모티프를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 PDZ 결합 모티프에 근접한 카복시-말단, 프롤린(P) 및/또는 글리신(G) 힌지 잔기 및 힌지 잔기에 근접한 양으로 하전된 잔기(K, R, D E)에서 II 형 PDZ 결합 모티프를 포함한다.
일부 양태에서, 폴리펩타이드의 아미노산의 약 50% 초과, 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과 또는 약 90% 초과는 프롤린(P), 글리신(G), 포스포-세린(S), 포스포-트레오닌(T), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D) 또는 글루탐산(E) 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산으로 구성된다. 아미노산 프롤린(P), 글리신(G), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)은 단백질 구조와 기능을 결정하는 데 중요할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 프롤린 및 글리신 잔기는 단백질의 3D 구조에서 단단한 회전을 제공하여 기능에 필요한 폴리펩타이드의 접힌 형태의 생성을 가능하게 하는 것으로 생각된다. 하전된 아미노산 서열은 종종 접힌 단백질의 표면에 위치하며 단백질-단백질 상호 작용, 단백질-지질 상호 작용, 효소-기질 상호 작용 및 단백질-핵산 상호 작용을 포함하여 폴리펩타이드에 의해 매개되는 화학적 상호 작용에 중요할 수 있다. 일부 양태에서, 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 유형 II PDZ 결합 모티프에 근접한 프롤린(P) 및 글리신(G), 라이신(K), 아스파르트산(D) 및/또는 글루탐산(E) 풍부 영역을 포함한다.
알파 Cx37의 18개의 카복시-말단-대부분 아미노산 서열은 ACT 펩타이드 테마에 대한 예외적인 변이를 나타낸다. Cx37 ACT 유사 서열은 GQKPPSRPSSSASKKQ*YV(SEQ ID NO: 43)이다. 따라서, Cx37의 카복시 말단 4 아미노산은 부분적으로 II 형 PDZ 결합 도메인과 일치한다. 고전적인 II 형 PDZ 결합 도메인 대신에, Cx37은 소수성 아미노산이 예상되는 위치 2에서 중성 Q*를 갖는다. 이러한 Cx37은 II 형 PDZ 결합 도메인 유사 서열로 지칭될 수 있는 것을 포함한다. 그럼에도 불구하고, Cx37은 클러스터된 세린 잔기, 빈번한 R 및 K 잔기 및 PDZ 결합 도메인-유사 서열에 근접한 P-풍부 서열을 포함하는 ACT 펩타이드 조직의 모든 다른 양태를 엄격하게 유지하며; 따라서, 위에 나열된 다른 >70 알파 코넥신과 ACT와 유사한 조직의 전체적인 보존 수준을 공유한다. 또한, Cx37 ACT와 유사한 카복시 말단의 기능적 특성은 다른 알파 코넥신과도 공유된다.
비교를 위해, 베타 코넥신 Cx26이 표 2에 도시된다. Cx26은 카복실 말단 II 형 PDZ 결합 모티프를 갖지 않으며; 카복실 말단 대부분의 아미노산의 30% 미만이 S, T, R, D 또는 E 잔기를 포함하고; P 및 G 힌지 잔기의 클러스터를 함유하는 II 형 PDZ 결합 모티프 또는 PDZ 결합 유사 모티프에 근접한 모티프의 증거가 없으며; 및 세린 및 트레오닌 포스포-아미노산의 클러스터된 반복 유사 모티프의 증거는 없다. Cx26은 서열의 카복시 말단 근처에 하나씩 클러스터된 3개의 라이신(K) 잔기를 가진다. 그러나, 상기 열거된 >70 알파 코넥신에서 조사된 알파 코넥신은 카복시 말단에서 3개의 반복된 K 잔기 도메인의 이러한 특징을 나타내는 것으로 밝혀지지 않았다(Cx26은 베타 코넥신이므로, 정의상 ACT 도메인을 갖지 않는다).
일부 양태에서, 본 발명에 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 변이체, 유도체 및 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드의 변이체는 아미노산 변형을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열 변형은 아미노산 치환, 아미노산 삽입 및 아미노산 결실을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드는 하나의 아미노산 잔기를 생물학적 및/또는 화학적으로 유사한 다른 잔기로 대체하는 것을 의미하는 보존적 치환을 포함한다. 일부 양태에서, 보존적 치환은 폴리펩타이드의 구조 또는 기능을 현저하게 변경하지 않는다. 예시적인 보존적 치환은 표 3에 열거되어 있다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 치환, 결실, 삽입 또는 다른 아미노산 치환의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
아미노산 치환
원래 잔기 예시적 치환
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Gln
Ile Leu; Val
Leu Ile; Val
Lys Arg; Gln
Met Leu; Ile
Phe Met; Leu; Tyr
Pro Gly
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val Ile; Leu
일부 양태에서, 보존적 치환은 부위 지정 돌연변이 유발 또는 PCR; 표준 펩타이드 합성 방법; 및 알라닌 스캔과 같은 표준 절차에 의해 생성된다. 보존적 치환은 벤-바사트 등(J. Bacterial. 169:751-7, 1987), 오'리간 등(Gene 77:237-51, 1989), 사힌-토스 등(Protein Sci. 3:240-7, 1994), 호출리 등(Bio/Technology 6:1321-5, 1988) 및 유전학 및 분자 생물학의 표준 교과서에 더 자세히 기술되어 있다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드가 하나 이상의 보존 치환을 갖는 경우 폴리펩타이드의 생물학적 활성은 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하까지 감소된다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 2-10개의 보존적 치환, 4-8개의 보존적 치환, 5-7개의 보존적 치환, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 포함한다.
특정 양태에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 서열 SEQ ID NO: 1 내에 단일 보존적 치환을 포함하는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 내에 3개의 보존적 치환을 포함하는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
ACT 폴리펩타이드 변이체
서열 SEQ ID NO
RPRPDDLEI SEQ ID NO: 1
RPRPDDLEV SEQ ID NO: 3
RPRPDDVPV SEQ ID NO: 4
SSRASSRASSRPRPDDLEV SEQ ID NO: 44
RPKPDDLEI SEQ ID NO: 45
SSRASSRASSRPKPDDLEI SEQ ID NO: 46
RPKPDDLDI SEQ ID NO: 47
SSRASSRASSRPRPDDLDI SEQ ID NO: 48
SSRASTRASSRPRPDDLEI SEQ ID NO: 49
RPRPEDLEI SEQ ID NO: 50
SSRASSRASSRPRPEDLEI SEQ ID NO: 51
GDGKNSVWV SEQ ID NO: 52
SKAGSNKSTASSKSGDGKNSVWV SEQ ID NO: 53
GQKPPSRPSSSASKKLYV SEQ ID NO: 54
일부 양태에서, 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 알파 코넥신(ACT)의 정의된 c-말단의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 상동성을 포함할 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 4)는 인간 Cx43(SEQ ID NO: 1)의 카복시 말단에서 발생하는 9개 아미노산의 동일한 스트레치에 대해 약 66%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:90 또는 ID NO:91에 대해 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 상동성을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:90 또는 ID NO:91 또는 이의 보존적 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:90 또는 ID NO:91 또는 이의 보존적 변이체 또는 단편으로 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 세린(S) 및/또는 트레오닌(T) 풍부 서열 또는 모티프를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드의 세린 및/또는 트레오닌은 인산화된다. 이론에 얽매이지 않고, 인산화된 세린 및/또는 트레오닌 풍부 서열은 폴리펩타이드의 기능적 효능을 증가 또는 감소시킴으로써 ACT 펩타이드의 기능을 변형시킬 수 있다고 생각된다.
일부 양태에서, N-글리코실화(Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-글리코실화(Ser 또는 Thr) 부위가 폴리펩타이드에 삽입될 수 있다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드 내의 시스테인 또는 다른 불안정한 잔기가 결실될 수 있다. 일부 양태에서, 잠재적인 단백질 분해 부위, 예를 들어 Arg는 결실되거나 대체될 수 있다; 예를 들어, 염기성 잔기는 결실되거나 글루타미닐 또는 히스티딜 잔기로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드의 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 상응하는 글루타밀 및 아스파릴 잔기로 번역 후 탈 아미드화된다. 다른 번역 후 변형은 프롤린 및 리신의 하이드록실화; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 o-아미노기의 메틸화(T. E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]); N-말단 아민의 아세틸화; 및 C-말단 카복실의 아미드화를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 아미노산 및 펩타이드 유사체가 개시된 조성물의 폴리펩타이드 속에 통합될 수 있다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 표 3에 나타낸 아미노산과 상이한 기능성 치환기를 갖는 D-아미노산 또는 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산 유사체는 tRNA 분자를 선택된 아미노산으로 충전하고, 예를 들어 앰버 코돈을 이용하여 부위 특이적 방식으로 펩타이드 아미노산에 유사체 아미노산을 펩타이드 사슬에 삽입하는 유전자 구조체를 조작하는 것과 같은 표준 기술을 사용함으로써 폴리펩타이드 사슬에 쉽게 통합될 수 있다(Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994), 이들 모두는 적어도 아미노산 유사체와 관련된 물질에 대해 본 발명에 참조로 포함됨). 또한, 폴리펩타이드는 자연 발생 펩타이드의 반대 입체이성질체 또는 펩타이드 유사체의 입체이성질체를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 폴리펩타이드는 천연 펩타이드 연결이 아닌 연결을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 또는 아미노산 유사체에 대한 연결은 CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2, -CH=CH-(시스 및 트랜스), COCH2-, -CH(OH)CH2, 및 -CHH2SO-을 포함할 수 있다(이들 및 기타는 Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., VegaData (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468; Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986)(-CH H2-S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982)(-CH-CH-, 시스 및 트랜스); Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980)(-COCH2-); Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982)(-COCH2-); Szelke et al. European Appln, EP 45665 CA(1982): 97:39405(1982)(-CH(OH)CH2-); Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983)(-C(OH)CH2-); 및 Hruby Life Sci 31:189-199 (1982)(-CH2-S-)에서 발견할 수 있다; 이의 각각은 참조로 본 발명에 포함된다. 일부 양태에서, 펩타이드 유사체는 b-알라닌, g-아미노부티르산 등과 같은 결합 원자 사이에 하나 이상의 원자를 가질 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 아미노산 유사체 및 펩타이드 유사체는 종종 보다 경제적인 생산, 보다 큰 화학적 안정성, 강화된 약리학적 특성(반감기, 흡수, 효능, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성), 감소된 항원성, 생물학적 장벽(예를 들어, 장, 혈관, 혈액 뇌 장벽)을 가로지르는 더 큰 능력 등과 같은 강화되거나 바람직한 특성을 가진다고 생각된다. D-아미노산은 펩타이다제 등에 의해 인식되지 않기 때문에 보다 안정한 펩타이드를 생성하는데 사용될 수 있다. 동일한 유형의 D-아미노산에 의한 컨센서스 서열의 하나 이상의 아미노산의 체계적인 치환(예를 들어, L-리신 대신에 D-리신)은 보다 안정적인 펩타이드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 시스테인 잔기는 둘 이상의 펩타이드를 함께 고리화 또는 부착시키는 데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 이는 펩타이드를 특정 형태로 구속하는 데 유리할 수 있다고 생각된다. (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), 본 발명에 참조로 포함됨).
일부 양태에서, 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 세포 내재화 수송체 또는 서열을 포함할 수 있다. 세포 내재화 서열은 당업계에 공지되거나 새로 발견된 임의의 내재화 서열, 또는 이의 보존적 변이체일 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 폴리펩타이드의 세포질 국소화의 효율은 시스 또는 트랜스에서 화학적으로 폴리펩타이드와 결합된 세포 내재화 수송체에 의해 향상되는 것으로 생각된다. 일부 양태에서, 폴리타이드는 Tat-HA 펩타이드 또는 빛에 대한 노출과 조합하여 세포로 형질 도입될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 세포 내재화 수송체의 효율성은 빛 또는 Tat-HA 펩타이드에 의한 세포의 공동 형질도입에 의해 더욱 향상되는 것으로 생각된다.
세포 내재화 서열은 당업계에 공지되거나 새로 발견된 임의의 내재화 서열, 또는 이의 보존성 변이체일 수 있다. 세포 내재화 운반체 및 서열의 비 제한적 예는 안테나페디아(Antennapedia), TAT, HIV-Tat, 페네트라틴(Penetratin), Antp-3A(Antp 돌연변이), 부포린(Buforin) II, 트랜스포르탄(Transportan), MAP(model amphipathic peptide), K-FGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, HN-1, BGSC(Bis-Guanidinium-Spermidine-Cholesterol) 및 BGTC(Bis-Guanidinium-Tren-Cholesterol)를 포함한다(표 5 참조).
세포 내재화 운반체
명칭 서열 SEQ ID NO
Antp RQPKIWFPNRRKPWKK (SEQ ID NO: 7)
HIV-Tat GRKKRRQRPPQ (SEQ ID NO: 14)
페네트라틴 RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 15)
Antp-3A RQIAIWFQNRRMKWAA (SEQ ID NO: 16)
Tat RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 17)
부포린 II TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (SEQ ID NO: 18)
트랜스포탄 GWTLNSAGYLLGKINKALAALA KKIL (SEQ ID NO: 19)
모델 양친매성 펩타이드 (MAP KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 20)
K-FGF AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 21)
Ku70 VPMLK-PMLKE (SEQ ID NO: 22)
피리온 MANLGYWLLALFVTMWTDVGL CKKRPKP (SEQ ID NO: 23)
pVEC LLIILARRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO: 24)
Pep-1 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 25)
SynB1 RGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEQ ID NO: 26)
Pep-7 SDLWEMMMVSLACQY (SEQ ID NO: 27)
HN-1 TSPLNIHNGQKL (SEQ ID NO: 28)
Figure pct00001
Figure pct00002
개시된 조성물의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14 (Bucci, M. et al. 2000. Nat. Med. 6, 1362-1367), SEQ ID NO:15 (Derossi, D., et al. 1994. Biol. Chem. 269, 10444-10450), SEQ ID NO:16 (Fischer, P. M. et al 2000. J. Pept. Res. 55, 163-172), SEQ ID NO:17 (Frankel, A. D. & Pabo, C. O. 1988. Cell 55, 1189-1193; Green, M. & Loewenstein, P. M. 1988. Cell 55, 1179-1188), SEQ ID NO:18 (Park, C. B., et al. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8245-8250), SEQ ID NO:19 (Pooga, M., et al. 1998. FASEB J. 12, 67-77), SEQ ID NO:20 (Oehlke, J. et al. 1998. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-139), SEQ ID NO:21 (Lin, Y. Z., et al. 1995. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258), SEQ ID NO:22 (Sawada, M., et al. 2003. Nature Cell Biol. 5, 352-357), SEQ ID NO:23 (Lundberg, P. et al. 2002. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90), SEQ ID NO:24 (Elmquist, A., et al. 2001. Exp. Cell Res. 269, 237-244), SEQ ID NO:25 (Morris, M. C., et al. 2001. Nature Biotechnol. 19, 1173-1176), SEQ ID NO:26 (Rousselle, C. et al. 2000. Mol. Pharmacol. 57, 679-686), SEQ ID NO:27 (Gao, C. et al. 2002. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-4065), 또는 SEQ ID NO:28 (Hong, F. D. & Clayman, G. L. 2000. Cancer Res. 60, 6551-6556)로 나타내어진 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 BGSC(Bis-Guanidinium-Spermidine-Cholesterol) 또는 BGTC(Bis-Guanidinium-Tren-Cholesterol)(Vigneron, J. P. et al. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 9682-9686)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 참고 문헌은 세포 내재화 벡터 및 서열의 교시를 위해 그 전문이 본 발명에 참조로 포함된다. 현재 알려져 있거나 나중에 확인된 임의의 다른 내재화 서열은 본 발명에 개시된 조성물의 폴리펩타이드 중 임의의 것과 조합될 수 있다.
개시된 조성물의 폴리펩타이드는 임의의 세포 내재화 서열과 조합하여 임의의 ACT 서열을 포함할 수 있다. 상기 조합의 비 제한적인 예는 표 6에 제공된다. 개시된 조성물의 폴리펩타이드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:7; 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 12를 포함하는 안테나페디아 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 폴리펩타이드는 안테나페디아 서열에 연결된 코넥신 43의 9개의 카복시-말단 대부분의 아미노산을 포함하고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함한다.
예시적 폴리펩타이드
서열 SEQ ID NO
RQPKIWFPNRRKPWKK PSSRASSRASSRPRPDDLEI SEQ ID NO: 8
RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDLEI SEQ ID NO: 2
RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDLEV SEQ ID NO: 10
RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDVPV SEQ ID NO: 11
RQPKIWFPNRRKPWKK KARSDDLSV SEQ ID NO: 12
GRKKRRQRPPQ RPRPDDLEI SEQ ID NO: 56
RQIKIWFQNRRMKWKK RPRPDDLEI SEQ ID NO: 57
RQIAIWFQNRRMKWAA RPRPDDLEI SEQ ID NO: 58
RKKRRQRRR RPRPDDLEI SEQ ID NO: 59
TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK RPRPDDLEI SEQ ID NO: 60
GWTLNSAGYLLGKINKALAAL AKKIL RPRPDDLEI SEQ ID NO: 61
KLALKLALKALKAALKLA RPRPDDLEI SEQ ID NO: 62
AAVALLPAVLLALLAP RPRPDDLEI SEQ ID NO: 63
VPMLKPMLKE RPRPDDLEI SEQ ID NO: 64
MANLGYWLLALFVTMWTDVG LCKKRPKP RPRPDDLEI SEQ ID NO: 65
LLIILRRRIRKQAHAHSK RPRPDDLEI SEQ ID NO: 66
KETWWETWWTEWSQPKKKRKV RPRPDDLEI SEQ ID NO: 67
RGGRLSYSRRRFSTSTGR RPRPDDLEI SEQ ID NO: 68
SDLWEMMMVSLACQY RPRPDDLEI SEQ ID NO: 69
TSPLNIHNGQKL RPRPDDLEI SEQ ID NO: 70
용어 "αCT1"은 본 발명에서 "aCT1" 또는 "ΑCT1"과 상호 교환적으로 사용되며, SEQ ID NO: 2에 따른 25개 아미노산 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 발명에 개시된 폴리펩타이드에 대한 추가 세부 사항은 그 전체가 본 발명에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,786,074에 기술되어 있다.
나노 입자 조성물
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 나노 입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 나노 입자는 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머 및 본 발명에 제공된 치료적 유효량의 알파 코넥신 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 나노 입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 나노 입자는 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머 및 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 치료적 유효량을 포함한다. 일부 실시태양에서, 펩타이드는 세포 내재화 서열을 추가로 포함한다. 세포 내재화 서열은 안테나페디아, TAT, HIV-Tat, 페네트라틴, Antp-3A(Antp 돌연변이), 부포린 II, 트랜스포탄, MAP(model amphipathic peptide), K-FGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB 1, Pep-7, HN-1, BGSC((Bis-Guanidinium-Spermidine-Cholesterol) 및 BGTC(Bis-Guanidinium-Tren-Cholesterol)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 펩타이드는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 나노 입자는 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "생분해성 또는 생적합성 폴리머"는 생분해성 또는 생적합성, 또는 생분해성 및 생적합성 둘 모두인 폴리머를 지칭한다. 생적합성은 일반적으로 면역계의 적어도 일부에 의한 물질의 급격한 거부를 의미하는데, 즉, 피험자에게 주입된 비생적합성 물질은 면역 시스템에 의한 물질의 거부가 적절하게 제어될 수 없도록 충분히 심각할 수 있고 주로 물질이 피험자에서 제거돼야 하는 정도인 피험자의 면역 반응을 일으킨다. 생적합성을 결정하기 위한 한 가지 간단한 테스트는 시험관 내에서 폴리머를 세포에 노출시키는 것이다; 생적합성 폴리머는 일반적으로 중간 농도, 예를 들어 50 마이크로 그램/106 세포의 농도에서 유의한 세포 사멸을 초래하지 않는 폴리머이다. 예를 들어, 생적합성 폴리머는 식균되거나 그렇지 않으면 그러한 세포에 의해 흡수되더라도 섬유 아세포 또는 상피 세포와 같은 세포에 노출될 때 약 20% 미만의 세포 사멸을 유발할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "생분해성" 폴리머는 세포에 도입될 때 세포 기구(생물학적 분해성) 및/또는 가수 분해(화학적 분해성)와 같은 화학적 공정에 의해 세포가 세포에 심각한 독성 효과 없이 재사용하거나 처분할 수 있는 성분으로 분해되는 폴리머이다. 한 실시태양에서, 생분해성 폴리머 및 이들의 분해 부산물은 생적합성일 수 있다. 예를 들어, 고려되는 폴리머는 물에 노출되면(예를 들어, 피험자 내에서) 자발적으로 가수 분해되는 것일 수 있으며, 폴리머는 열에 노출될 때(예를 들어, 약 37℃의 온도에서) 분해될 수 있다. 폴리머의 분해는 사용되는 폴리머 또는 코 폴리머에 따라 다양한 속도로 발생할 수 있다. 예를 들어, 폴리머의 반감기(폴리머의 50%가 모노머 및/또는 다른 비 폴리머 모이어티로 분해될 수 있는 시간)는 폴리머에 따라 일, 주, 수개월 또는 수년의 순서일 수 있다. 폴리머는, 예를 들어, 효소 활성 또는 세포 기구에 의해, 일부 경우에, 예를 들어, 리소자임(예를 들어, 비교적 낮은 pH를 가짐)에 대한 노출을 통해 생물학적으로 분해될 수 있다. 일부 경우에, 폴리머는 모노머 및/또는 세포에 상당한 독성 효과 없이 재사용하거나 처분 할 수 있는 다른 비폴리머 모이어티로 분해될 수 있다(예를 들어, 폴리락타이드는 가수 분해되어 락트산을 형성할 수 있고, 폴리글리콜라이드는 가수 분해되어 글리콜산 등을 형성할 수 있다).
적합한 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 폴리(카프로락톤)(PCL), 에틸렌 바이닐 아세테이트 폴리머(EVA), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-코-글리콜산)(PLLGA), 폴리(D,L-락타이드)(PDLA), 폴리(L-락타이드)(PLLA), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤-코-글리콜라이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PEO-코-D,L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PPO-코-D,L-락타이드), 폴리알킬 사이아노아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리-L-라이신(PLL), 하이드록시프로필 메타크릴레이트(HPMA), 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-글루탐산, 폴리(하이드록시산), 폴리무수물, 폴리오르쏘에스터, 폴리(에스터 아마이드), 폴리아마이드, 폴리(에스터 에터), 폴리카보네이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리알킬렌 옥사이드(PEO), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리바이닐 알코올(PVA), 폴리바이닐에터, 폴리(바이닐 아세테이트), 폴리(바이닐 클로라이드)(PVC), 폴리바이닐피롤리돈(PVP), 폴리실록산, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 알킬 셀룰로오스, 하이드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에터, 셀룰로오스 에스터, 나이트로 셀룰로오스, 폴리(메틸(메트)아크릴레이트)(PMMA), 폴리(에틸(메트)아크릴레이트), 폴리(부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(아이소부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(헥실(메트)아크릴레이트), 폴리(아이소데실(메트)아크릴레이트), 폴리(라우릴(메트)아크릴레이트), 폴리(페닐(메트)아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(아이소프로필 아크릴레이트), 폴리(아이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리다이옥사논, 폴리다이옥사논 코폴리머, 폴리하이드록시 알카노에이트, 폴리프로필렌 푸마레이트, 폴리옥시메틸렌, 폴록사머, 폴록사민, 폴리(오르쏘)에스터, 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락타이드-코-카프로락톤), 트라이메틸렌 카보네이트, 폴리(N-아크릴로일모르폴린)(PAcM), 폴리(2-메틸-2-옥사졸린)(PMOX), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOZ) 및 폴리글리세롤을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLGA이다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLGA 및 PVA이다.
일부 실시양태에서, PLGA는 약 4,000 내지 약 240,000Da의 Mw를 갖는다. 일부 실시양태에서, PLGA는 약 7,000 내지 약 17,000Da의 Mw를 갖는다. 예를 들어, PLGA는 약 7,000Da, 약 8,000Da, 약 9,000Da, 약 10,000Da, 약 11,000Da, 약 12,000Da, 약 13,000Da, 약 14,000Da, 약 15,000Da, 약 16,000Da, 또는 약 17,000Da를 가지며, 그 사이의 모든 정수 및 범위를 포함한다. 일부 실시양태에서, PLGA는 50:50 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 5:95 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 10:90 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 15:85 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 20:80 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 25:75 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 30:70 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 35:65 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 40:60 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 45:55 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 50:50 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 55:45 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 60:40 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 65:35 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 70:30 락트산:글리콜산, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 75:25 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 80:20 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 85:15 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 90:10 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다. 일부 실시양태에서, PLGA는 95:5 락트산:글리콜산이며, 산 종결된다.
일부 실시태양에서, PVA는 약 8,000 내지 약 186,000Da, 예를 들어 약 13,000 내지 약 23,000Da의 Mw를 갖는다. 예를 들어, PVA는 약 13,000Da, 약 14,000Da, 약 15,000Da, 약 16,000Da, 약 17,000Da, 약 18,000Da, 약 19,000Da, 약 20,000Da, 약 21,000Da, 약 22,000Da 또는 약 23,000Da의 Mw를 가질 수 있으며, 그 사이의 모든 정수 및 범위를 포함한다.
일부 실시태양에서, PVA의 양은 약 0.05%(w/v) 내지 약 5%(w/v)이다. 예를 들어, 조성물에서 PVA의 양은 약 0.1%(w/v), 약 0.2%(w/v), 약 0.3%(w/v), 약 0.4%(w/v), 약 0.5%.(w/v), 약 0.6%(w/v), 약 0.7%(w/v), 약 0.8%(w/v), 약 0.9%(w/v), 약 1.0%(w/v) , 약 1.1%(w/v), 약 1.2%(w/v), 약 1.3%(w/v), 약 1.4%(w/v), 약 1.5%(w/v), 약 1.6% ( w / v), 약 1.7%(w/v), 약 1.8%(w/v), 약 1.9%(w/v), 약 2.0%(w/v), 2.1%(w/v), 약 2.2%(w/v), 약 2.3%(w/v), 약 2.4%(w/v), 약 2.5%(w/v), 약 2.6%(w/v), 약 2.7%(w/v) v), 약 2.8%(w/v), 약 2.9%(w/v), 약 3.0%(w/v), 3.1%(w/v), 약 3.2%(w/v), 약 3.3%(w/v), 약 3.4%(w/v), 약 3.5%(w/v), 약 3.6%(w/v), 약 3.7%(w/v), 약 3.8%(w/v) , 약 3.9%(w/v), 약 4.0%(w/v), 4.1%(w/v), 약 4.2%(w/v), 약 4.3%(w/v), 약 4.4%(w/v), 약 4.5%(w/v), 약 4.6%(w/v), 약 4.7%(w/v), 약 4.8%(w/v), 약 4.9%(w/v) 또는 약 5.0%(w/v)이며, 그 사이의 모든 정수 및 범위를 포함한다. 일부 실시태양에서, PVA의 양은 약 0.1%(w/v) 내지 약 5%(w/v) 범위일 수 있다. 예를 들어, PVA의 양은 약 0.1%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 약 0.1%(w/v) 내지 약 4%(w/v), 약 0.1%(w/v) 내지 약 3%(w/v), 약 0.1%(w/v) 내지 약 2%(w/v), 약 0.1%(w/v) 내지 약 1%(w/v), 약 0.2%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 약 0.2%(w/v) 내지 약 4%(w/v), 약 0.2%(w/v) 내지 약 3%(w/v), 약 0.2%(w/v) 내지 약 2%(w/v), 약 0.2%(w/v) 내지 약 1%(w/v), 약 0.3%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 약 0.3%(w/v) 내지 약 4%(w/v), 약 0.3%(w/v) 내지 약 3%(w/v), 약 0.3%(w/v) 내지 약 2%(w/v), 약 0.3%(w/v) 내지 약 1%(w/v), 약 0.4%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 약 0.4%(w/v) 내지 약 4%(w/v), 약 0.4%(w/v) 내지 약 3%(w/v), 약 0.4%(w/v) 내지 약 2%(w/v), 약 0.4%(w/v) 내지 약 1%(w/v), 약 0.5%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 약 0.5%(w/v) 내지 약 4%(w/v), 약 0.5%(w/v) 내지 약 3%(w/v), 약 0.5%(w/v) 내지 약 3%(w/v), 약 0.5(w/v) 내지 약 2%(w/v), 약 0.5%(w/v) 내지 약 1%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 4%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 3%(w/v), 약 1%(w/v) 내지 약 2%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 4%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 3%(w/v), 약 3%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 또는 약 4%(w/v) 내지 약 5%(w/v) 범위일 수 있다. 일부 실시태양에서, PVA의 양은 약 0.3%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v)이다.
일부 실시태양에서, PLGA의 양은 약 2%(w/v) 내지 약 10%(w/v)이다. 예를 들어, 조성물에서 PLGA의 양은 약 2.0%(w/v), 2.1%(w/v), 약 2.2%(w/v), 약 2.3%(w/v), 약 2.4%(w/v), 약 2.5%(w/v), 약 2.6%(w/v), 약 2.7%(w/v), 약 2.8%(w/v), 약 2.9%(w/v), 약 3.0%(w/v), 3.1%(w/v), 약 3.2%(w/v), 약 3.3%(w/v), 약 3.4%(w/v), 약 3.5%(w/v) v), 약 3.6%(w/v), 약 3.7%(w/v), 약 3.8%(w/v), 약 3.9%(w/v), 약 4.0%(w/v), 4.1%(w/v), 약 4.2%(w/v), 약 4.3%(w/v), 약 4.4%(w/v), 약 4.5%(w/v), 약 4.6%(w/v) , 약 4.7%(w/v), 약 4.8%(w/v), 약 4.9%(w/v), 약 5.0%(w/v), 약 5.1%(w/v), 약 5.2%(w/v), 약 5.3%(w/v), 약 5.4%(w/v), 약 5.5%(w/v), 약 5.6%(w/v), 약 5.7%(w/v), 약 5.8%(w/v), 약 5.9%(w/v), 약 6.0%(w/v), 6.1%(w/v), 약 6.2%(w/v), 약 6.3%(w/v), 약 6.4%(w/v), 약 6.5%(w/v), 약 6.6%(w/v), 약 6.7%(w/v), 약 6.8%(w/v), 약 6.9%(w/v), 약 7.0%(w/v), 7.1%(w/v), 약 7.2%(w/v), 약 7.3%(w/v), 약 7.4%(w/v), 약 7.5%(w/v), 약 7.6%(w/v), 약 7.7%(w/v), 약 7.8%(w/v), 약 7.9%(w/v), 약 8.0%(w/v), 8.1%(w/v), 약 8.2%(w/v), 약 8.3%(w/v), 약 8.4%(w/v), 약 8.5%(w/v), 약 8.6%(w/v), 약 8.7%(w/v), 약 8.8%(w/v), 약 8.9%(w/v), 약 9.0%(w/v), 약 9.1%(w/v), 약 9.2%(w/v), 약 9.3%(w/v), 약 9.4%(w/v), 약 9.5%(w/v), 약 9.6%(w/v), 약 9.7%(w/v), 약 9.8%(w/v), 약 9.9%(w/v) 또는 약 10.0%(w/v)이며, 그 사이의 모든 정수 및 범위를 포함한다. 일부 실시태양에서, PLGA의 양은 약 2%(w/v) 내지 약 9%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 7%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 약 2%(w/v) 내지 약 2%(w/v), 약 3%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 약 3%(w/v) 내지 약 9%(w/v), 약 3%(w/v) 내지 약 7%(w/v), 약 3%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 약 4%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 약 4%(w/v) 내지 약 8%(w/v), 약 4%(w/v) 내지 약 6%(w/v), 약 5%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 약 5%(w/v) 내지 약 8%(w/v), 약 5%(w/v) 내지 약 7%(w/v), 약 6%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 약 6%(w/v) 내지 약 9%(w/v), 약 6%(w/v) 내지 약 8%(w/v), 약 7%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 약 7%(w/v) 내지 약 9%(w/v), 또는 약 8%(w/v) 내지 약 10%(w/v) 범위일 수 있다.
일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 10nm 내지 약 1000nm이다. 예를 들어, 나노 입자의 평균 직경은 약 10nm, 약 20nm, 약 30nm, 약 40nm, 약 50nm, 약 60nm, 약 70nm, 약 80nm, 약 90nm, 약 100nm, 110nm, 약 120nm, 약 130nm, 약 140nm, 약 150nm, 약 160nm, 약 170nm, 약 180nm, 약 190nm, 약 200nm, 210nm, 약 220nm, 약 230nm , 약 240nm, 약 250nm, 약 260nm, 약 270nm, 약 280nm, 약 290nm, 약 300nm, 310nm, 약 320nm, 약 330nm, 약 340nm, 약 350nm, 약 360nm, 약 370nm, 약 380nm, 약 390nm, 약 400nm, 410nm, 약 420nm, 약 430nm, 약 440nm, 약 450nm, 약 460nm, 약 470nm, 약 480nm, 약 490nm, 약 500nm, 510nm, 약 520nm, 약 530nm, 약 540nm, 약 550nm, 약 560nm, 약 570nm, 약 580nm, 약 590nm, 약 600nm, 610nm, 약 620nm, 약 630nm, 약 640nm, 약 650nm, 약 660nm, 약 670nm, 약 680nm, 약 690nm, 약 700nm, 710nm, 약 720nm, 약 730nm, 약 740nm, 약 750nm, 약 760nm, 약 770nm, 약 780nm, 약 790nm, 약 800nm, 810nm, 약 820nm, 약 830nm, 약 840nm, 약 850nm, 약 860nm, 약 870nm, 약 880nm, 약 890nm, 약 900nm, 910nm, 약 920nm, 약 930nm, 약 940nm, 약 950nm, 약 960nm, 약 970nm, 약 980nm, 약 990nm, 또는 약 1000nm일 수 있으며, 그 사이의 모든 정수 및 범위를 포함한다. 일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 10nm 내지 약 1000nm 범위이다. 예를 들어, 나노 입자의 평균 직경은 약 10nm 내지 약 1000nm, 약 10nm 내지 약 800nm, 약 10nm 내지 약 600nm, 약 10nm 내지 약 400nm, 약 10nm 내지 약 200nm, 약 10nm 내지 약 50nm, 약 30nm 내지 약 1000nm, 약 30nm 내지 약 800nm, 약 30nm 내지 약 600nm, 약 30nm 내지 약 500nm, 약 30nm 내지 약 400nm, 약 30nm 내지 약 200nm, 약 30nm 내지 약 50nm, 약 50nm 내지 약 1000nm, 약 50nm 내지 약 800nm, 약 50nm 내지 약 600nm, 약 50nm 내지 약 400nm, 약 50nm 내지 약 200nm, 약 50nm 내지 약 100nm, 약 100nm 내지 약 1000nm, 약 100nm 내지 약 800nm, 약 100nm 내지 약 600nm, 약 100nm 내지 약 400nm, 약 100nm 내지 약 300nm, 약 100nm 내지 약 200nm, 또는 약 150nm 내지 약 200nm 범위이다. 일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 30nm 내지 약 500nm이다. 일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 100nm 내지 약 300nm이다. 일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 100nm 내지 약 200nm이다. 일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 180nm이다.
본 발명의 나노 입자는 균일 한 입자 크기를 가지며 응집이 거의 없거나 전혀 없다. 습식 및/또는 건식 밀링 단계와 같은 값 비싼 공정 단계의 필요성을 제거하기 때문에 균일한 입자 크기와 응집이 거의 또는 전혀 없는 것이 바람직하다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 100nm 내지 약 300nm이다. 일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 100nm 내지 약 200nm이다. 일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 180nm이다. 상기 실시태양 중 임의의 것에서, 나노 입자 응집이 거의 또는 전혀 없을 수 있다.
일부 실시태양에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 평균 양은 나노 입자 조성물 mg당 적어도 약 500ng이다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 평균 양은 나노 입자 조성물의 mg당 적어도 약 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000ng이며, 그 사이의 모든 정수 및 범위를 포함한다.
일부 실시태양에서, 나노 입자는 약 0mV 내지 약 -30mV의 제타 전위를 특징으로 하는 표면 전하를 갖는다. 예를 들어, 나노 입자는 약 0mV, 약 -1mV, 약 -2mV, 약 -3mV, 약 -4mV, 약 -5mV, 약 -6mV, 약 -7mV, 약 -8mV, 약 -9mV, 약 -10mV, 약 -11mV, 약 -12mV, 약 -13mV, 약 -14mV, 약 -15mV, 약 -16mV, 약 -17mV, 약 -18mV, 약 -19mV, 약 -20mV, 약 -21mV, 약 -22mV, 약 -23mV, 약 -24mV, 약 -25mV, 약 -26mV, 약 -27mV, 약 -28mV, 약 -29mV 또는 약 -30mV의 제타 전위를 특징으로 하는 표면 전하를 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 나노 입자는 약 -0mV 내지 약 -25 mV, 약 0 mV 내지 약 -20 mV, 약 0 mV 내지 약 -15 mV, 약 -0 mV 내지 약 -10mV, 약 0mV 내지 약 -5mV, 약 -5mV 내지 약 -30mV, 약 -5mV 내지 약 -25mV, 약 -5mV 내지 약 -20mV, 약 -5mV 내지 약 -15mV, 약 -5mV 내지 약 -10mV, 약 -5mV 내지 약 -8mV, 약 -10mV 내지 약 -30mV, 약 -10mV 내지 약 -25mV, 약 -10mV 내지 약 -20mV, 약 -10mV 내지 약 -15mV, 약 -10mV 내지 약 -12mV, 약 -15mV 내지 약 -30mV, 약 -15mV 내지 약 -25mV, 약 -15mV 내지 약 -20mV, 약 -15mV 내지 약 -18mV, 약 -20mV 내지 약 -30mV, 약 -20mV 내지 약 -25mV, 약 -20mV 내지 약 -23mV, 약 -25mV 내지 약 -30mV, 또는 약 -25mV 내지 약 -28mV 범위의 제타 전위를 특징으로 하는 표면 전하를 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 나노 입자는 약 0.120 내지 약 0.350의 다분산 지수(PDI)를 갖는다. 예를 들어, 나노 입자는 약 0.120, 약 0.130, 약 0.140, 약 0.150, 약 0.160, 약 0.170, 약 0.180, 약 0.190, 약 0.200, 약 0.210, 약 0.220, 약 0.230, 약 0.240, 약 0.250, 약 0.260, 약 0.270, 약 0.280, 약 0.290, 약 0.300, 약 0.310, 약 0.320, 약 0.330, 약 0.340, 내지 약 0.350의 PDI를 가지며, 그 사이의 모든 정수 및 범위를 포함한다.
일부 실시태양에서, 나노 입자는 추가 첨가제를 포함할 수 있다(예를 들어, 캡슐화 효율을 증가시키고 조밀하고 균질한 구체를 생성하기 위해 외부 상 속에). 예를 들어, 일부 실시태양에서, 나노 입자는 Zn2+(예를 들어, ZnO) 및/또는 Ca2+(예를 들어, CaO) 및/또는 Fe3+(예를 들어, FeCl3, Fe2(SO4)3, Fe(NO3)3)를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 나노 입자는 약 10ng 펩타이드/㎍ 입자보다 큰 펩타이드 적재량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 나노 입자는 약 20ng 펩타이드/μg 입자, 약 30ng 펩타이드/μg 입자, 약 40ng 펩타이드/μg 입자, 약 50ng 펩타이드/μg 입자, 약 60ng 펩타이드/μg 입자, 약 70ng 펩타이드/μg 입자, 약 80ng 펩타이드/μg 입자, 약 90ng 펩타이드/μg 입자, 약 100ng 펩타이드/μg 입자, 약 125ng 펩타이드/μg 입자, 약 150ng 펩타이드/μg 입자, 약 175ng 펩타이드/μg 입자, 약 200ng 펩타이드/μg 입자, 약 250ng 펩타이드/μg 입자, 약 300ng 펩타이드/μg 입자, 약 400ng 펩타이드/μg 입자, 또는 약 500ng 펩타이드/μg 입자보다 큰 펩타이드 적재량을 갖는다. 따라서, 일부 실시태양에서, 나노 입자는 약 1% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 25%, 또는 약 1% 내지 약 10%의 적재 용량; 또는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50%의 적재 용량을 갖는다.
일부 실시태양에서, 나노 입자는 펩타이드가 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주 또는 그 이상에 걸쳐 방출되도록 제어된 펩타이드 방출 프로파일을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 펩타이드 방출 프로파일은 캡슐화된 펩타이드의 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1%는 투여 후 처음 24시간 내에 방출된다. 일부 실시태양에서, 캡슐화된 펩타이드의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만 또는 약 10% 미만이 처음 24시간 동안 방출된다. 추가 실시태양에서, 나머지 캡슐화된 펩타이드 또는 실질적으로 모든 나머지 캡슐화된 펩타이드는 다음 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주 또는 4주에 걸쳐 방출된다. 일부 실시태양에서, 펩타이드 방출 프로파일은 실질적으로 다음 패턴에 상응한다: 24시간에 총 캡슐화된 펩타이드의 약 5% 내지 약 60%가 방출되고; 약 7, 14, 21, 28, 또는 그 이상의 일에 총 캡슐화된 펩타이드의 약 50% 내지 약 100%가 방출된다. 따라서, 예를 들어, 24시간 시점에 총 캡슐화된 펩타이드의 약 60% 미만이 방출되고, 21일 시점에 총 캡슐화된 펩타이드의 최대 약 100%가 방출된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 24시간 시점에, 총 캡슐화된 펩타이드의 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10% 또는 약 5% 미만이 방출된다. 일부 실시태양에서, 14일 시점에 총 캡슐화된 펩타이드의 최대 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100%가 방출된다. 일부 실시태양에서, 21일 시점에, 총 캡슐화된 펩타이드의 최대 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약100%가 방출된다. 일부 실시태양에서, 28일 시점에, 총 캡슐화된 펩타이드의 최대 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약100%가 방출된다. 일부 실시태양에서, 처음 24시간 내에 약 50% 미만, 약 10% 또는 약 10% 미만의 펩타이드의 초기 "폭발" 방출이 있고; 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 펩타이드의 방출이 다음 1, 2 또는 3주 동안 방출된다. 방출 특성이 특정 징후에 맞춰질 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 하나의 표적 징후는 14일까지 총 캡슐화된 펩타이드를 완전히 방출하는(예를 들어, 약 80% - 100%) 나노 입자로 최적으로 치료될 수 있는 반면, 두 번째 표적 징후는 28일까지 총 캡슐화된 펩타이드를 완전히 방출하는(예를 들어, 약 80%-100% 나노 입자로 최적으로 치료될 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 나노 입자는 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일 또는 31일까지 총 캡슐화된 펩타이드를 완전히 방출한다(예를 들어, 약 80% -100%).
일부 실시태양에서, 나노 입자는 상이하거나 추가의 안정화제, 계면 활성제, 및/또는 유화제를 포함할 수 있다. 적합한 제제는 폴리소르베이트, 알킬설포숙시 네이트, 알킬 페놀, 에톡실화 알킬 페놀, 알킬 벤젠 설포네이트, 지방산, 에톡실화 지방산, 프로폭실화 지방산, 지방산 염, 톨유, 피마 자유, 트라이글리세라이드, 에톡실화 트라이글리세리드, 알킬 글루코사이드, 및 혼합물 및 미국 특허 제6,849,581호에 개시된 것과 같은 유도체화된 지방산을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 폴리소르베이트는 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 모노데카노 에이트, 소르비탄 모노옥타데카노에이트, 소르비탄 트라이올레이트 등 및 이의 에톡실화된 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들 제제는 그 위에 최대 20개의 에톡시기를 가질 수 있다. 적합한 폴리소르베이트는 크로다 인터네셔날 PLC로부터 입수 가능한 SPAN® 40, SPAN 40, SPAN 60 및 SPAN 80 폴리소르 베이트를 포함하지만 반드시 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 제제는 스테아릴 알코올, 레시틴, 지방산 아민, 에톡실화 지방산 아민 및 이의 혼합물을 포함한다. 하나의 비 제한적인 실시태양에서, 하나 이상의 제제가 사용된다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 나노 입자를 포함하는 동결 및/또는 저장에 적합한 조성물이 고려되고, 동결에 적합한 용액, 예를 들어, 수크로스 및/또는 사이클로덱스트린 용액이 나노 입자 조성물에 첨가된다. 예를 들어, 동결 방지제는 입자가 동결시 응집되는 것을 방지하는 역할을 할 수 있다. 다양한 적합한 동결 방지제는 당업자에게 쉽게 명백할 것이며, 수크로스, 트레할로스, 덱스트로스 또는 소르비톨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
약학적 제제
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 나노 입자 조성물을 포함하는 약학적 제제를 제공한다.
본 발명에 기술된 바와 같은 본 발명의 나노 입자 조성물을 포함하는 약학적 제제는 유효량의 나노 입자 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 제공하는 임의의 경로에 의한 전달을 위해 제제화될 수 있다. 따라서, 약학적 조성물은 예를 들어, 국소, 경구, 장내, 비강(즉, 비강 내), 흡입, 척수강 내, 직장, 질, 안구 내, 결막 하, 협측, 설하, 폐내, 피내, 결절 내, 종양 내, 경피 또는 피하, 경피, 정맥 내, 근육 내, 흉골 내, 해면 내, 이관 내, 종양 내, 두개 내, 척추 내 또는 요도 내 주사 또는 주입을 포함하는 비경구 투여를 포함하는 임의의 적절한 투여 방식으로 제제화될 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 비경구는 이온 삼투(예를 들어, 미국 특허 제7,033,598호; 제7,018,345호; 제6,970,739호), 초음파 영동(예를 들어, 미국 특허 제4,780,212호; 제4,767,402호; 제4,948,587호; 제5,618,275호; 제5,656,016호; 제5,722,397호; 제6,322,532호; 제6,018,678호), 체온(예를 들어, 미국 특허 제5,885,211호; 제6,685,699호), 수동 경피(예를 들어, 미국 특허 제3,598,122호; 제3,598,123호; 제4,286,592호; 제4,314,557호; 제4,379,454호; 제4,568,343호; 제5,464,387호; 영국 특허 출원 제2232892호; 미국 특허 제6,871,477호; 제6,974,588호; 제6,676,961호), 미세 바늘(예를 들어, 미국 특허 제6,908,453호; 제5,457,041호; 제5,591,139호; 제6,033,928호) 투여 및 피하 주사, 정맥 내, 근육 내, 흉강 내, 요도 내, 종양 내 주사, 또는 해면 내, 종양 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 투여 방법은 본 발명에서 더 자세히 설명된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 나노 입자 조성물 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 제제를 제공한다.
약학적 조성물에 사용하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 생리학적 또는 약학적으로 적합한 부형제 또는 담체(즉, 활성 성분의 활성을 방해하지 않는 비 독성 물질)가 본 발명에 기술된 조성물에 사용될 수 있다. 예시적인 부형제는 단백질의 안정성 및 완전성을 유지하는 희석제 및 담체를 포함한다. 치료용 부형제는 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 21st Ed. Mack Pub. Co., Easton, Pa. (2005))에 기술되어 있으며 본 발명에 자세히 기술되어 있다.
치료용 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 제약 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다. 예를 들어, 생리학적 pH에서 멸균 식염수 및 인산염 완충 식염수가 사용될 수 있다. 방부제, 안정제, 염료 및 심지어 향미제가 약학적 조성물에 제공될 수 있다. 예를 들어, 벤조산 나트륨, 소르브산 및 p 하이드록시 벤조산의 에스터가 방부제로 첨가될 수 있다. 1449에서 전술한 바와 같음. 또한 항산화제 및 현탁제가 사용될 수 있다. 전술한 바와 같음.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 부착 방지제, 항산화제, 결합제, 코팅제, 압축 보조제, 붕해제, 염료(컬러), 완화제, 유화제, 충전제(희석제), 필름 형성제 또는 코팅제, 향료, 활택제(유동 강화제), 윤활제, 방부제, 흡착제, 현탁제 또는 분산제, 감미료 및 수화수로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 탄산 칼슘, 인산 칼슘(2 염기성), 스테아르산 칼슘, 크로스카멜로스, 가교 결합된 폴리바이닐피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로오스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 락토스, 스테아르산 마그네슘, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로오스, 메틸 파라벤, 미세결정 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리바이닐피롤리돈, 포비돈, 전호화 전분, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 셸락, 이산화규소, 카복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 구연산 나트륨, 전분 글리콜산 나트륨, 소르비톨, 전분(옥수수), 스테아르산, 수크로스, 활석, 이산화 티타늄, 비타민 A, 비타민 E(알파-토코페롤), 비타민 C 및 자일리톨로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 제제는 주사용으로 제제화된 액체일 수 있다. 액체 약학적 제제는 예를 들어 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수, 식염수, 바람직하게는 생리 식염수, 링거 용액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로 작용할 수 있는 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매와 같은 멸균 희석제; 항균제; 항산화제; 킬레이트제; 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조절을 위한 제제. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만든 다회 용량 바이알에 넣을 수 있다. 특정 실시태양에서, 생리 식염수의 사용이 사용되며, 주사 가능한 약학적 조성물은 선택적으로 멸균된다. 일부 실시태양에서, 완충제와 같은 희석제, 아스코르브산과 같은 항산화제, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트린과 같은 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트제 및 글루타티온을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 제제는 경구 투여용으로 제제화된다. 일부 실시태양에서, 부형제 및/또는 결합제가 존재할 수 있다. 본 출원에서 사용하기에 적합한 고체 담체는 락토스, 전분, 글루코스, 메틸-셀룰로스, 스테아르산 마그네슘, 인산이 칼슘, 만니톨 등과 같은 불활성 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 고체 담체는 향미제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 충전제, 활택제, 압축 보조제, 결합제 또는 정제-붕해제로서 작용하는 하나 이상의 물질을 추가로 포함할 수 있다; 캡슐화 재료일 수도 있다. 분말에서, 담체는 미분활성 화합물과 혼합된 미분 고체일 수 있다. 정제에서, 활성 화합물은 필요한 압축 특성을 갖는 담체와 적절한 비율로 혼합되고 원하는 모양과 크기로 압축된다. 분말 및 정제는 바람직하게는 최대 99%의 활성 화합물을 함유한다. 적합한 고체 담체는, 예를 들어, 인산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 활석, 당, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 폴리바이닐피롤리 딘, 저 융점 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다. 정제는 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축 정제는 임의로 결합제(예를 들어, 포비돈, 젤라틴, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제(예를 들어, 글리콜산 나트륨 전분, 가교된 포비돈, 가교된 카복시메틸 나트륨 셀룰로스) 표면 활성 또는 분산제와 혼합된 적합한 기계에서 활성 성분을 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 형태로 압축함으로써 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 적신 분말 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제는 선택적으로 코팅되거나 스코어링될 수 있고, 예를 들어, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스를 다양한 비율로 사용하여 원하는 방출 프로파일을 제공하는 활성 성분의 느린 또는 제어 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 위장 이외의 장 부분에서 방출을 제공하기 위해 정제에 장용 코팅이 선택적으로 제공될 수 있다.
일부 실시태양에서, 제제는 에어로졸, 크림, 폼, 에멀젼, 겔, 액체, 로션, 패치, 분말, 고체, 스프레이 또는 이의 임의의 조합의 형태이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 나노 입자 조성물을 포함하는 국소 제제를 제공한다. 일부 실시태양에서, 국소 제제는 하이드록시에틸셀룰로스 겔을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 하이드록시에틸셀룰로스 겔은 본 발명에 제공된 알파 코넥신 펩타이드를 안정화시킨다.
본 발명의 나노 입자 조성물을 포함하는 약학적 제제는 국소 투여용으로 의도될 수 있으며, 이 경우 담체는 용액, 에멀젼, 연고 또는 겔 베이스를 적합하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 염기는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 미네랄 오일, 물 및 알코올과 같은 희석제, 및유화제 및 안정화제. 증점제는 국소 투여를 위한 약학적 조성물에 존재할 수 있다. 경피 투여용인 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온 삼투 장치를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 제공된 약학적으로 허용 가능한 담체는 폴록사머이다. 상표명 Pluronics®로 불리는 폴록사머는 물 속 투명한 열가역성 겔을 형성하는 비이온성 계면활성제이다. 폴록사머는 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드(PEO-PPO-PEO) 3 블록 코폴리머이다. 2개의 폴리에틸렌 옥사이드 사슬은 친수성이지만 폴리프로필렌 사슬은 소수성이다. 이러한 소수성 및 친수성 특성은 수용액에 넣을 때 채워진다. PEO-PPO-PEO 사슬은 소수성 중심이 모여 미셀을 형성하는 작은 가닥의 형태를 취한다. 미셀은 순차적으로 겔화 특성을 갖는 경향이 있는데 이는 이들이 친수성 말단 근처에 물이 약간 존재하는 고체(겔)를 형성하기 위해 그룹으로 함께 모이기 때문이다. 차가워지면, 액체가 되지만 따뜻해지면 단단해진다. 이 특성은 추울 때 정확한 용량 측정을 위해 주사기로 끌어들일 수 있기 때문에 약학적 배합에 유용하다. (피부에 도포될 때) 체온으로 따뜻해지면, 완벽한 일관성(특히 대두 레시틴/아이소프로필 팔미테이트와 함께 사용하는 경우)으로 두껍게 되어 적절한 기능과 접착력을 촉진시킨다. Pluronic® F127(F127)은 쉽게 구할 수 있기 때문에 널리 사용되므로 이런 약학적 응용 분야에 사용된다. F127은 100:65:100의 EO:PO:EO 비율을 가지며, 중량은 2:1의 PEO:PPO 비율을 가진다. 플루로닉 겔은 수용액이며 전형적으로 20-30% F-127을 함유한다. 따라서, 제공된 조성물은 F127로 투여될 수 있다.
일부 실시태양에서, 국소 제제는 완충제를 추가로 포함한다. 적합한 완충제는 인산, 시트르산, 붕산, 아세트산, 중탄산 및 탄산 나트륨 또는 칼륨과 같은 알칼리(나트륨 및 칼륨) 또는 알칼리 토류(칼슘 및 마그네슘) 탄산염, 인산염, 중탄산염, 시트르산염, 붕산염, 아세트산염, 프탈산염, 타르타르산, 숙신산 등을 추가로 포함한다. 적합한 완충제의 비 제한적인 예는 알루미늄, 수산화 마그네슘, 수산화 알루미늄/수산화 마그네슘 공침전물, 수산화 알루미늄/중탄산 나트륨 공침전물, 아세트산 칼슘, 중탄산 칼슘, 붕산 칼슘, 탄산 칼슘, 중탄산 칼슘, 구연산 칼슘, 글루콘산 칼슘, 글리세로인산 칼슘, 수산화 칼슘, 젖산 칼슘, 프탈산 칼슘, 인산 칼슘, 숙신산 칼슘, 주석산 칼슘, 이염기성 인산 나트륨, 인산 수소 이칼륨, 인산이칼륨, 인산 수소 이나트륨, 숙신산 이나트륨, 건조 수산화 알루미늄 겔, L-아르기닌, 아세트산 마그네슘, 알루민산 마그네슘, 붕산 마그네슘, 중탄산 마그네슘, 탄산 마그네슘, 시트르산 마그네슘, 글루콘산 마그네슘, 수산화 마그네슘, 락트산 마그네슘, 마그네슘 메타실리케이트 알루미네이트, 산화 마그네슘, 프탈산 마그네슘, 인산 마그네슘, 규산 마그네슘, 숙신산 마그네슘, 타르트산 마그네슘, 아세트산 칼륨, 탄산 칼륨, 중탄산 칼륨, 붕산 칼륨, 시트르산 칼륨, 메타인산 칼륨, 프탈산 칼륨, 인산 칼륨, 폴리인산 칼륨, 피로인산 칼륨, 숙신산 칼륨, 타르타르산 칼륨, 아세트산 나트륨, 중탄산 나트륨, 붕산 나트륨, 탄산나트륨, 시트르산 나트륨, 글루콘산 나트륨, 인산 수소 나트륨, 수산화 나트륨, 락트산 나트륨, 프탈산 나트륨, 인산 나트륨, 폴리인산 나트륨, 피로인산 나트륨, 세스퀴탄산 나트륨, 숙신산 나트륨, 타르타르산 나트륨, 삼인산 나트륨, 합성 하이드로탈사이트, 피로인 산 사칼륨, 피로인산 사나트륨, 인산 삼칼륨, 인산 삼나트륨, 및 트로메타놀을 포함한다. (The Merck Index, Merck & Co. Rahway, N.J. (2001)에 제공된 목록을 부분적으로 기초로 함). 또한, 위산과 반응하는 단백질 또는 단백질 가수 분해물의 능력으로 인해, 이들 역시 본 실시태양에서 완충제 역할을 할 수 있다. 또한, 상기 언급된 완충제의 조합 또는 혼합물이 본 발명에 기술된 약학적 제제에 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 완충제는 인산염 완충제이다. 일부 실시태양에서, 완충제는 국소 제제의 pH를 약 5 내지 약 7로 유지한다. 예를 들어, 완충제는 국소 제제의 pH를 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 또는 약 7로 유지한다.
제조 방법
일부 실시태양에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 본 발명의 나노 입자 조성물의 제조 방법을 제공한다:
(a) 유기 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 포함하는 제 1 용액을 제 1 수성 용매에 용해된 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 제 2 용액과 조합하는 단계;
(b) 단계(a)의 혼합물을 유화하는 단계;
(c) 단계(b)의 에멀젼을 제 2 수성 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 포함하는 제 2 용액에 첨가하는 단계;
(d) 유기 용매를 제거하는 단계; 및
(e) 선택적으로 (d)의 생성물을 정제하는 단계.
일부 실시태양에서, 이 방법은 (d) 또는 (e)의 생성물을 동결 및/또는 동결 건조하는 단계(f)를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 단계(d)는 혼합물로부터 유기 용매를 제거하기에 충분한 시간 동안 (c)의 혼합물을 교반함으로써 수행된다. 일부 실시태양에서, 단계(d)가 혼합물로부터 유기 용매를 제거하기에 충분한 시간 동안 (c)의 혼합물을 교반함으로써 수행될 때, (예를 들어 증발을 통해) 혼합물로부터 용매를 제거하는 데 걸리는 시간은 약 15분, 약 30분, 약 45분, 약 1시간, 약 1시간 15분, 약 1시간 30분, 약 1시간 45분, 약 2시간, 약 2시간 15분, 약 2시간 30분, 약 2시간 45분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 9시간, 약 12시간, 약 15시간, 약 18시간, 약 21시간, 또는 약 1일일 수 있다. 일부 실시태양에서, 혼합물로부터 유기 용매를 제거하기에 충분한 시간은 약 1분 내지 약 10시간이다. 일부 실시태양에서, 혼합물로부터 유기 용매를 제거하기에 충분한 시간은 약 3시간이다. 혼합물에서 유기 용매를 제거하는 데 충분한 시간은 용매 제거 기술, 온도 및 압력, 유기 용매와 같은 여러 요인에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 단계(d)가 혼합물로부터 유기 용매를 제거하기에 충분한 시간 동안 (c)의 혼합물을 교반함으로써 수행되고 유기 용매가 에틸 아세테이트인 경우, (예를 들어, 증발을 통해) 혼합물에서 에틸 아세테이트를 제거하는 데 걸리는 시간은 약 15분, 약 30분, 약 45분, 약 1시간, 약 1시간 15분, 약 1시간 30분, 약 1시간 45분, 약 2시간, 약 2시간 15분, 약 2시간 30분, 약 2시간 45분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 9시간, 약 12시간, 약 15시간, 약 18시간, 약 21시간 또는 약 1일일 수 있다. 일부 실시태양에서, 혼합물로부터 에틸 아세테이트를 제거하기에 충분한 시간은 약 1 분 내지 약 10 시간이다. 일부 실시태양에서, 혼합물로부터 에틸 아세테이트를 제거하기에 충분한 시간은 약 3시간이다. 일부 실시태양에서, 유기 용매의 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90 또는 약 100%가 단계(d)에서 제거된다. 일부 실시태양에서, 단계(d)는 회전 증발에 의해 수행된다.
일부 실시태양에서, 단계(a)는 초음파 처리되는 동안 수행된다. 초음파 처리는 제 1 용액과 제 2 용액이 혼합된 후에도 지속될 수 있다. 예를 들어, 제 1 용액 및 제 2 용액은 혼합물이 초음파 처리되는 동안 혼합될 수 있고 혼합물은 이후 일정 기간 동안 초음파 처리가 지속될 수 있다. 따라서, 총 초음파 처리 시간은 몇 초 내지 1시간 초과 범위일 수 있다. 예를 들어, 초음파 처리 시간은 약 5초, 약 10초, 약 15초, 약 20초, 약 30초, 약 45초, 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 6분, 약 7분, 약 8분, 약 9분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 1시간일 수 있다. 일부 실시태양에서, 총 초음파 처리 시간은 약 2분이다. 일부 실시태양에서, 초음파 처리는 40% 진폭에서의 프로브 초음파 처리이다.
일부 실시태양에서, 단계(c)는 와동되는 동안 수행된다. 본 발명에 정의된 바와 같이, "와동되는 동안"은 에멀젼이 첨가되는 동안(예를 들어, 적하 방식으로) 와동이 간헐적으로 발생하는 것을 의미한다. 예를 들어, 단계(b)의 에멀젼의 일부가 제 2 용액에 첨가되고, 그 후 와동 단계가 수행되고 단계(b)의 에멀젼이 모두 첨가될 때까지 이 과정이 반복된다. 일부 실시태양에서, 단계(c)는 단계(b)의 에멀젼을 제 2 수성 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 포함하는 제 2 용액에 첨가한 후 혼합물을 와동하는 것을 포함한다. 초음파 처리는 단계(b)의 에멀젼 및 제 2 수성 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 포함하는 제 2 용액이 함께 첨가된 후에 지속될 수 있다. 예를 들어, 단계(b)의 에멀젼 및 제 2 수성 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 포함하는 제 2 용액은 혼합물이 와동되는 동안 첨가될 수 있고, 혼합물은 이후 일정 기간 동안 와동이 지속될 수 있다. 따라서, 총 와동 시간은 몇 초 내지 1시간 초과 범위일 수 있다. 예를 들어, 와동 시간은 약 5초, 약 10초, 약 15초, 약 20초, 약 30초, 약 45초, 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 6분, 약 7분, 약 8분, 약 9분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 1시간일 수 있다. 일부 실시태양에서, 단계(c)의 생성물은 단계(d) 전에 초음파 처리된다. 일부 실시태양에서, 단계(c)의 생성물은 단계(d) 동안 초음파 처리된다. 일부 실시태양에서, 단계(c)의 생성물은 단계(d) 이전 및 동안 초음파 처리된다.
당업자는 본 발명의 생성물을 정제하는 다양한 방법을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 단계(e)의 정제는 (d)의 생성물을 세척함으로써 수행된다. 일부 실시태양에서, 단계(e)의 정제는 투석, 증발 또는 순차적 원심 분리에 의해 수행된다.
일부 실시태양에서, 단계(c)-(f) 중 어느 하나의 생성물은 멸균된다. 적합한 멸균 방법은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 예를 들어, 적합한 멸균 기술은 열 멸균, 화학적 멸균, 방사선 멸균 및 여과를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 단계(a)의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLGA이다. 일부 실시태양에서, 단계(c)의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PVA를 추가로 포함한다.
다양한 유기 용매가 본 발명의 방법에 사용될 수 있고 당업자에게 용이하게 명백하다. 적합한 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 에틸 아세테이트, 아이소프로판올, 메톡시 프로판올, 부탄올, DMSO, 다이옥세인, DMF, NMP, THF, 아세톤, 다이클로로메테인, 톨루엔, 또는 혼합물의 둘 이상의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 유기 용매는 에틸 아세테이트이다.
용어 "수성 용매"는 물을 주성분으로 하고 실온에서 액체인 조성물을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 제 1 및 제 2 수성 용매는 물이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 본 발명의 나노 입자 조성물의 제조 방법을 제공한다:
(a) 다음을 제공하는 단계;
i. SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열 및 수혼화성 유기 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머;
ii. 반 용매;
(b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열 및 수혼화성 유기 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 반 용매와 혼합하여 나노 입자 조성물이 형성되도록 하는 단계; 및
(c) 선택적으로 (b)의 생성물을 정제하는 단계.
일부 실시태양에서, 이 방법은 (b) 또는 (c)의 생성물을 동결 및/또는 동결 건조하는 단계(d)를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 혼합은 제트 혼합기로 수행된다. 예를 들어, 제트 혼합기는 2개의 제트를 함유하는 국한 충돌 제트(CIJ) 혼합기 또는 최대 4개의 제트를 함유하는 다중 입구 와동 혼합기(MIVM)일 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 제트 혼합기는 2-제트 혼합기이다. 일부 실시태양에서, 제트 혼합기는 4-제트 혼합기이다. 일부 실시태양에서, 혼합은 동축 난류 제트 혼합기, 러프톤 혼합기, 티 혼합기, 와동 혼합기 또는 소형, 마이크로 또는 휴대용 CIJ 및 MIVM 혼합기로 수행된다.
다양한 수혼화성 유기 용매가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 용어 "수혼화성 유기 용매"는 실온 및 대기압에서 물과 균질한 용액을 쉽게 형성하는 물 이외의 용매를 의미한다. 적합한 수혼화성 유기 용매의 예는 에탄올, 메탄올, 아이소프로판올, 아세토나이트릴, 다이메틸포름아마이드, 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 및 포름산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 수혼화성 유기 용매는 DMSO이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "반 용매"는 폴리머를 용해시키는 데 사용된 용매가 또한 반 용매와 혼화성이지만 폴리머가 반 용매에 용해되지 않는 용매를 의미한다. 일부 실시태양에서, 물은 "반 용매"로 사용된다. 특별한 이론에 얽매이지 않고, 두 용매가 혼합될 때, 폴리머는 용액 밖으로 침전되어, 공정에서 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 포착한다.
일부 실시태양에서, 단계(a)의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLGA이다. 일부 실시태양에서, 단계(a)의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PVA를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 아미노산 서열의 나노 입자 캡슐화 효율은 약 20% 초과이다. 예를 들어, 아미노산 서열의 나노 입자 캡슐화 효율은 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 초과이다다.
상기 방법은 놀랍게도 입자 크기가 균일하고 응집이 거의 없거나 전혀 없는 나노 입자를 생성하였다. 습식 및/또는 건식 밀링 단계와 같은 값 비싼 공정 단계의 필요성을 제거하기 때문에 균일한 입자 크기와 응집이 거의 또는 전혀 없는 것이 바람직하다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 100nm 내지 약 300nm이다. 일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 100nm 내지 약 200nm이다. 일부 실시태양에서, 나노 입자의 평균 직경은 약 180nm이다. 상기 임의의 실시태양에서, 나노 입자 응집이 거의 또는 전혀 없을 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 습식 또는 건식 밀링과 같은 값 비싼 처리 단계를 필요로 하지 않는 나노 입자를 생성한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 국소 제제의 제조 방법을 제공한다:
a) 프로필렌 글리콜, 글리세린, 메틸 파라벤 및 프로필 파라벤을 파라벤이 완전히 용해될 때까지 혼합하는 단계;
b) 맑은 용액이 얻어질 때까지 정제수, EDTA, 일 염기성 인산 나트륨, 이 염기성 인산 나트륨 및 D-만니톨을 별도로 혼합하는 단계;
c) a)의 용액을 b)의 용액에 첨가하고, a)의 용액 용기를 정제수로 헹구고, 린스를 결합된 용액에 첨가하고, 결합된 용액이 시각적으로 균질해질 때까지 혼합하는 단계;
d) 균질화 혼합하면서, c)의 결합된 용액에 하이드록시에틸 셀룰로스를 첨가하고 중합체가 완전히 분산될 때까지 혼합하는 단계;
e) 펩타이드가 완전히 용해될 때까지 정제수를 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 별도로 혼합하는 단계;
f) e)의 용액을 d)의 용액에 첨가하고, e)의 용액 용기를 정제수로 헹구고, 린스를 결합된 용액에 첨가하고, 결합된 용액이 균질해질 때까지 혼합한다.
치료 방법
일부 실시태양에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 이 방법은 본 발명의 약학적 제제의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다양한 암이 본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 암은 신경교종, 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 균상 식육종, 호지킨병, 골수성 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계 암, 두경부암, 두경부 편평 세포 암, 신장암, 소세포 폐암 및 비 소세포 폐암과 같은 폐암, 신경 모세포종, 교모세포종, 난소암, 전립선암, 피부암, 간암, 흑색종, 구강, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포암종, 대장암, 자궁 경부암, 자궁 경부암종, 유방암, 상피암, 신장암, 비뇨생식기암, 폐암, 식도암, 두경부암, 대장암, 조혈암, 고환암, 결장암, 직장암, 전립선암, 췌장암, 횡문근육종, 척수 종양, 및 골육종, 유잉 육종, 연골 육종, 다발성 골암 및 거대 세포 골 종양과 같은 골암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 암은 신경교종이다. 일부 실시태양에서, 신경교종은 교모세포종이다.
본 발명의 약학적 제제는 유효량의 나노 입자 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 제공하는 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 약학적 제제는 다음 경로 중 임의의 것에 의해 투여될 수 있다: 국소, 경구, 장내, 비강(즉, 비강 내), 흡입, 척수강 내, 직장, 질, 안구 내, 결막 하, 협측, 설하, 폐내, 피내, 결절 내, 종양 내, 경피 또는 피하, 경피, 정맥 내, 근육 내, 흉골 내, 해면 내, 이관 내, 종양 내, 두개 내, 척추 내 또는 요도 내 주사 또는 주입. 일부 실시태양에서, 약학적 제제는 주사를 통해 투여된다. 예를 들어, 약학적 제제는 피하, 피내, 근육 내, 종양 내 또는 정맥 내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시태양에서, 약학적 제제는 종양 내 주사에 의해 투여된다.
최근 연구에 따르면 갭 접합부 단백질 코넥신 43(Cx43)은 GBM 세포가 카복실 말단(CT)을 통해 TMZ에 내성을 갖게 만든다(Murphy et al., Cancer Res. 76:139-49 (2016). 본 발명에 제공된 알파 코넥신 폴리펩티드 나노 입자 제제는 알파 코넥신 활성을 억제함으로써 TMZ 또는 다른 화학 요법제의 내성을 상쇄한다.
따라서, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 화학 요법제(예를 들어, TMZ)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 다양한 화학 요법제가 사용될 수 있고 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 적합한 화학 요법제는 독소(예를 들어, 사포린, 리신, 아브린, 에티듐 브로마이드, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 외독소); 탁산; 알킬화제(예를 들어, 테모졸로미드(TMZ), 클로람부실, 사이클로포스파미드, 아이소파미드, 메클로레타민, 멜팔란 및 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드, 티오테파와 같은 아지리딘; 부설판과 같은 메탄설포네이트 에스터; 카무스틴, 로무스틴 및 스트렙토조신과 같은 나이트로소 우레아; 백금 복합체(예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 테트라플라틴, 오마플라틴, 티오플라틴, 사트라플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 헵타플라틴, 이프로플라틴, 트랜스플라틴 및 로바플라틴); 미토마이신, 프로카바진, 다카바진 및 알트레타민과 같은 생환원성 알킬화제; DNA 가닥 파괴제(예를 들어, 블레오마이신); 토포아이소머라제 II 억제제(예를 들어, 암사크린, 메노가릴, 아모나피드, 닥티노마이신, 다우노루비신, N,N-다이벤질 다우노마이신, 엘립티신, 다우노마이신, 피라졸로아크리딘, 이다루비신, 미톡산트론, m-AMSA, 비산트렌, 독소루비신(아드리아마이신), 데옥시독소루비신, 에토포사이드(VP-16), 에토포사이드 포스페이트, 옥산트라졸, 루비다존, 에피루비신, 블레오마이신 및 테니포사이드); DNA 마이너 홈 결합제(예를 들어, 플리카마이딘); 항 대사산물(예를 들어, 메토트렉세이트 및 트라이메트렉세이트와 같은 엽산 길항제); 플루오로우라실, 플루오로데옥시우리딘, CB3717, 아자시티딘, 사이타라빈 및 플록수리딘과 같은 피리미딘 길항제; 머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 플루다라빈, 펜토스타틴과 같은 퓨린 길항제; 아스파르기나제; 및 하이드록시우레아와 같은 리보뉴클레오타이드 환원 효소 억제제; 안트라사이클린; 및 튜불린 상호 작용제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 파클리탁셀(Taxol®)) 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 화학 요법제는 TMZ이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 알파 코넥신 펩타이드-나노 입자 조성물은 화학 요법제와 같은 다른 요법으로 치료하기 위해 종양을 민감하게 한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 알파 코넥신 펩타이드-나노 입자 조성물은 화학 요법제, 방사선 요법 또는 수술과 같은 또 다른 암 요법의 효과를 증가시킨다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 다른 암 요법의 효과를 향상시키기 위해 본 발명에 제공된 알파 코넥신 펩타이드-나노 입자 조성물을 다른 암 요법과 조합하여 투여함으로써 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 알파 코넥신 펩타이드-나노 입자 조성물은 종양을 TMZ 치료에 민감하게 한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 알파 코넥신 펩타이드-나노 입자 조성물은 TMZ 치료에 대한 종양의 민감성을 회복시킨다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 알파 코넥신 펩타이드-나노 입자 조성물은 TMZ 치료에 대한 종양의 민감성을 유지한다.
약학적 제제는 치료 과정에 걸쳐 다중 용량에 걸쳐 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 약학적 제제는 치료 과정에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30회 (예를 들어, 종양 내 주사를 통해) 투여된다. 따라서 치료 과정은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60일 지속될 수 있다. 일부 실시태양에서, 약학적 제제는 연속 일에 (예를 들어, 종양 내 주사를 통해) 투여된다. 일부 실시태양에서, 약학적 제제는 교대 일에 (예를 들어, 격일로) (예를 들어, 종양 내 주사를 통해) 투여된다.
일부 실시태양에서, 화학 요법제(예를 들어, TMZ)는 본 발명의 약학적 제제와 동시에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 화학 요법제는 약학적 제제와 같은 날(들)에 투여된다.
일부 실시태양에서, 화학 요법제(예를 들어, TMZ)는 본 발명의 약학적 제제와 함께 투여되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 화학 요법제는 약학적 제제와 다른 날(들)에 투여된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 피험자에게 본 발명의 국소 제제를 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 만성 상처를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 제제는 만성 상처의 치료에 효과적인 투여 요법으로 투여된다. 일부 실시태양에서, 제제는 매일 또는 매주 투여된다. 일부 실시태양에서, 제제는 0일, 3일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 및 12주에 투여 요법으로 투여되며, 만성 상처의 증상이 감소된다. 추가 실시태양에서, 제제는 과도한 수준의 부작용을 유도하지 않는다. 다른 실시태양에서, 만성 상처는 임상적으로 유의한 이상이 없는 상태에서 개선된다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 표준 케어 치료가 사용될 때 100% 상처 봉합에 걸리는 시간과 비교하여 100% 상처 봉합에 걸리는 시간을 감소시킨다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 표준 케어 단독 치료와 비교하여 표준 케어와 함께 투여될 때 50% 상처 봉합에 걸리는 시간을 감소시킨다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 표준 케어 치료가 사용될 때 50% 상처 봉합에 걸리는 시간과 비교하여 50% 상처 봉합에 걸리는 시간을 감소시킨다. 다른 실시태양에서, 4주에 상처 봉합 백분율은 표준 케어 치료로 치료된 피험자에서 4주에 상처 봉합 백분율과 비교하여 본 발명에 개시된 방법 및 제제로 치료된 피험자에서 더 높다.
다른 실시태양에서, 상기 방법은 피험자에서 통증 수준의 감소를 초래한다. 추가 실시태양에서, 통증 수준은 환자 자가 평가를 통해 결정된다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 표준 케어 치료와 비교하여 12주, 11주, 10주, 9주, 8주, 7주, 6주, 5주, 4주, 3주 또는 2주에 상처 봉합의 평균 백분율을 증가시킨다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 12주에 상처 봉합의 평균 백분율을 증가시킨다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 표준 케어 요법으로 치료되는 피험자의 상처 면적과 비교하여 상처 면적을 감소시킨다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 피험자에서 항-알파 코넥신 폴리펩타이드 항체의 생산을 유도하지 않는다.
다른 실시태양에서, 상기 방법은 상처 치유를 위한 표준 케어 치료에 비해 100% 완전한 상처 봉합의 발생률 또는 빈도를 증가시킨다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 표준 케어의 1주, 4주, 12주, 24주, 36주 또는 그 이상의 주 내에 충분한 상처 크기 감소 없이 궤양을 치료하는 데 사용된다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 표준 케어의 1주, 4주, 12주, 24주, 36주 또는 그 이상의 주 내에 50% 미만 상처 봉합으로 궤양을 치료하는 데 사용된다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 표준 케어의 1주, 4주, 12주, 24주, 36주 또는 그 이상의 주 내에 충분한 상처 크기 감소 없이 궤양을 치료하는 데 사용된다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 표준 케어의 1주, 4주, 12주, 24주, 36주 또는 그 이상의 주 내에 충분한 상처 크기 감소 없이 궤양을 치료하는 데 사용된다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 만성 상처의 상처 면적 및 지속 기간 특성을 갖는 궤양을 가진 환자를 치료하는 데 사용된다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 치유되지 않는 상처 궤적을 갖는 상처를 보유한 궤양을 가진 환자를 치료하는 데 사용된다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 만성 상처의 상처 면적 및 지속 기간 특성을 갖는 궤양을 치료하는 데 사용된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 표준 케어 압축 요법에 추가하여 본 발명의 국소 제제를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 만성 상처를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 만성 상처는 표준 케어 압축 요법 단독으로 달성한 것보다 더 빠른 속도 및/또는 증가된 빈도로 치료된다.
일부 실시태양에서, 만성 상처 치료에 사용하기 위한 제제는 적어도 하나의 알파 코넥신 폴리펩타이드 및 하이드록시에틸셀룰로스 겔을 포함한다. 추가 실시태양에서, 하이드록시셀룰로스 겔은 약 2%, 약 1.75%, 약 1.5%, 약 1.25%, 약 1.0% 또는 약 0.75%의 농도로 존재한다. 한 실시태양에서, 하이드록시셀룰로스 겔은 약 1.25%(w/w)의 농도로 존재한다.
일부 실시태양에서, 만성 상처는 궤양이다. 추가 실시태양에서, 만성 상처는하지 궤양이다. 다른 실시태양에서, 만성 상처는 정맥성 하지 궤양, 당뇨병성 족부 궤양 및 욕창으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 만성 상처는 궤양(예를 들어, 하지 궤양)이다. 일부 실시태양에서, 만성 상처는 정맥성 하지 궤양, 당뇨병성 족부 궤양 및 욕창으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명에 설명된 모든 방법은 본 발명에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본 발명에 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예를 들어")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위에 제한을 두지 않는다. 명세서의 어떠한 언어도 본 발명의 실행에 필수적인 것으로 주장되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명에 인용된 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고 문헌은 각각의 참고 문헌이 개별적으로 그리고 구체적으로 참고로 포함되는 것으로 표시되고 그 전체가 본 발명에 기술된 것과 동일한 정도로 본 발명에 참고로 포함된다.
실시예
다음 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되며, 이를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이러한 예에서, 모든 부 및 백분율은 달리 명시되지 않는 한 중량 기준이다. 실시예의 약어는 아래에 표시된다.
실시예 1: 이중 에멀젼-용매 증발 방법을 통한 펩타이드의 제어된 전달을 위한 폴리(락트산-코-글리콜산) 나노 입자
PLGA는 다양한 용도로 소분자 약물 전달에 사용된다.2-4 PLGA는 백본 에스터 결합의 절단을 통한 가수 분해에 의해 몇 주에 걸쳐 분해되어 생물학적으로 적합한 부산물을 형성하기 때문에 소분자의 제어 방출에 유용하다. 락트산 및 글리콜산은 크렙스 사이클을 통해 신체에서 쉽게 대사되고 이산화탄소와 물로 제거된다.2,4
PLGA, 특히 작은 분자를 사용하여 친수성 및 소수성 약물을 캡슐화하는 데 많은 연구가 성공적으로 이루어졌지만, 펩타이드와 단백질은 특히 최소 입자 크기를 유지하면서 캡슐화하기가 훨씬 더 어렵다.13-18 나노 입자를 생성하는 여러 방법이 있지만, 이중 하나는 에멀젼-용매 증발 방법이다.19 에멀젼-용매 증발 방법은 계면 활성제로 물에 유화하기 전에 먼저 폴리머를 휘발성, 수불혼화성 용매에 용해시킨 다음 용매를 증발시키는 것이다. 소수성 약물은 일반적으로 위에서 설명한대로 단일 에멀젼 공정(o/w)을 통해 캡슐화되는 반면 친수성 약물은 이중 에멀젼(w/o/w) 방법을 사용한다.2,19
펩타이드 및 단백질 약물의 효과적인 치료 전달은 또한 빠른 분해로 인해 짧은 생체 내 반감기에 의해 도전 받고 있다. 25개 아미노산 펩타이드 약물인 αCT1의 지속 방출 제제는 만성 상처 및 암과 같은 장기 치료가 필요한 징후에서 더 낮은 투여 빈도를 제공하기 위해 제안되었다. 본 연구에서, PLGA 나노 입자 합성의 이중 에멀젼-용매 증발 법을 개발하고 최적화하기 위한 모델 약물로 로다민 B를 사용하였다. 이 나노 입자에서 αCT1의 캡슐화가 3주 동안 지속된 시험관 내 방출 프로파일을 초래하였으며, 첫 3일 동안의 초기 폭발 방출 후 나머지 2주 반 동안 총 캡슐화된 약물의 최대 73%가 지속 방출되는 특징이 있다.
보다 포괄적인 조사를 위해, 이중 에멀젼 공정을 사용하는 약물 적재를 단일 에멀젼 공정과 비교하였다.
재료 및 방법
일반. 구매한 모든 재료는 추가 정제 없이 사용하였다. PLGA(폴리(D,L-락타이드-코 글리콜라이드; 7000-17000MW, 50:50 락트산:글리콜산, 산 종결), PVA(폴리(바이닐 알코올); 13000-23000 MW, 87-89% 가수 분해), 로다민 B(RhB; HPLC 등급, ≥95%), 인산염 완충 식염수 분말(PBS; DI-수에 재구성됨, BioPerformance Certified, pH 7.4), 수크로스(BioUltra, 분자 생물학용, ≥99.5%(HPLC)), 트레할로스(제약 2 차 표준, 인증된 참조 재료) 및 소 혈청 알부민(BSA; 본질적으로 지방산이 없고 본질적으로 글로불린이 없음, ≥99%, 아가로스 겔 전기 영동)은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)에서 구입하였다. 에틸 아세테이트(EA; HPLC 등급)를 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)에서 구입하였다. 펩티드 약물인 α-코넥신 카복실-말단(αCT1) 펩타이드는 아메리칸 펩타이드 컴퍼니(American Peptide Company)(현재 Bachem; Sunnyvale, CA)에서 합성하였다. αCT1 펩타이드는 안테나피디아 내재화 서열(RQPKIWFPNRRKPWKK)에 연결된 코넥신43 C-말단 RPRPDDLEI에 있는 짧은 서열에 해당한다.
단일 에멀젼 입자의 합성. 단일 에멀젼 나노 입자(SE-NP) 합성 방법은 Mathew et al., 2012.12에서 수정되었다. 간단히 말해서, EA에 PLGA를 용해시킨 후, 0.1mg의 RhB를 PLGA 용액에 직접 첨가하였다. 용액을 와동한 다음 물 속 2.5 w/v% PVA 용액 1 mL에 첨가하였다. 용액은 40% 진폭에서 2분 동안 프로브 초음파 처리하였다. 용액을 물 속 0.3 w/v% PVA 50 mL에 즉시 첨가한 다음, 적어도 3시간 동안 교반하여 EA 증발을 허용하였다.
단일 및 이중 에멀젼 방법 사이의 입자에 적재된 약물 양의 차이를 테스트하기 위해 SE-NP에 로다민 B를 적재하였다. RhB는 농도 특징화가 용이하기 때문에 약물 적재의 추세를 찾기 위한 모델 약물로 사용되었다. 또한 RhB와 αCT1은 양전하를 포함하는 유사한 물리 화학적 특성을 공유한다. 분자의 크기가 다르고 입자 크기에 차이를 만들 수 있지만, 전하 때문에 적재 및 PLGA와의 상호 작용 경향은 비슷해야 한다. BSA는 펩타이드의 크기를 더 가깝게 모방하는 데 사용된다. αCT1(3.5kDa에 비해 MW 66.5kDa)보다 훨씬 크지만, 부피가 극도로 크고 공정 수정 중에 입자 크기의 경향을 쉽게 보여줄 수 있다.
이중 에멀젼 입자의 합성. 적용된 합성 프로토콜은 Mathew et al. and Zhang et al.12,18로부터 수정되었다. 간단히 말하면, αCT1(αCT1-NP)을 포함하는 이중 에멀젼 입자(DE-NP)는 먼저 0.025g의 PLGA를 EA 1mL에 30분 동안 간헐적으로 와동하면서 용해시켜 실온에서 합성하였다. 물에 2mmol αCT1 용액 50μL를 첨가하고 Qsonica Q55 프로브 초음파기를 사용하여 40% 진폭에서 2분 동안 초음파 처리하였다. 그 다음 1차 에멀젼을 와동하면서 물 속 2.5 w/v% PVA 용액 1 mL에 즉시 적가 하였다. 이 혼합물을 즉시 2분 동안 40% 진폭에서 다시 초음파 처리하였다. 이중 에멀젼을 물 속 0.3 w/v% PVA 용액 50 mL로 옮기고 적어도 3시간 동안 교반하여 에틸 아세테이트 증발을 허용하였다. 로다민 b 또는 BSA 나노 입자(RhB-NP, BSA-NP)의 경우, αCT1 용액을 물에 2mmol의 로다민 B 또는 BSA 용액으로 대체하여 동일한 프로토콜을 따랐다. 세포 배양 실험에 사용되는 입자는 0.2μm 기공 크기의 피셔브랜드(Fisherbrand) 25mm 나일론 멸균 주사기 필터를 사용하여 여과하여 멸균하거나 사용 전에 모든 물질을 멸균하여 입자 합성 중에 멸균 생물 안전 캐비닛에서 만들었다. 그런 다음 입자를 원심 분리 방법으로 세 번 세척하여 과잉 PVA를 제거하고 ≤-20℃에서 동결하고 동결 건조한 다음 -20℃에서 보관하였다.
재료 특징화 방법. 주사 전자 현미경(SEM)은 LEO(Zeiss) 전계 방출 SEM을 사용하여 버지니아 주 블랙스버그의 나노 스케일 특징화 및 제작 실험실에서 수행되었다. SEM 이미지 분석은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 완료하였다. 동적 광 산란(DLS) 및 제타 전위는 맬번 제타시저 나노-ZS(Malvern Zetasizer Nano-ZS)를 사용하여 측정하였다. 로다민 방출 연구에 대한 UV-vis 흡광도는 아질런트 테크놀러지(Agilent Technologies)의 Cary 60 UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 측정하였다.
나노 입자로부터 약물의 시험관 내 방출. 동결 건조된 나노 입자를 0.01M PBS 용액에 1mg/mL로 재현탁하고 방출 연구 기간 동안 37℃에서 배양하였다. 각 시점에서, 입자를 펠릿으로 원심 분리하고 약물 함량 분석을 위해 상청액을 수집하였다. 일관된 농도를 유지하기 위해 제거된 상청액을 동일한 부피의 새로운 PBS 용액으로 교체하고 입자를 10-15분 동안 수조 초음파 처리를 통해 재분산시켰다. 분산 샘플을 채취하여 동적 광 산란(DLS)에 대해 분석하였다. SEM 샘플은 향후 분석을 위해 SEM 스터브에 테이프로 붙인 실리콘 웨이퍼 조각에 입자 현탁액의 한 방울을 첨가하여 준비하였다.
세포 배양. 인간 교모세포종(GBM) 세포주 SF295는 10% 소 태아 혈청(Atlas Biologicals, Inc.), 스트렙토마이신(100μg/ml) 및 페니실린(100IU/ml)이 보충된 듈베코의 변형된 이글 배지(Thermo Scientific)에서 유지되었다. 앞서 설명한대로 카릴리온 클리닉(Carilion Clinic)에서 수술을 받은 GBM 환자로부터 분리된 인간 GBM 줄기 세포(GSC) VTC-0379과 LN229/GSC를 Gibco® B-27® 보충제(Thermo Scientific), 섬유아세포 성장 인자(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., 20ng/ml) 및 표피 성장 인자(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., 20ng/ml)로 보충된 듈베코 변형 이글 배지에 유지하였다.
효소 연결 면역 분석(ELISA). 시험관 내 및 생체 내 분석에서 펩타이드 추적을 가능하게 하기 위해, 아미노-말단 비오틴 태그를 αCT1 서열에 첨가하였다. 비오틴 태그가 붙은 αCT1의 시험관 내 방출은 OptEIA 키트(BD Biosciences)를 사용하여 샌드위치 효소 연결 면역 분석(ELISA)으로 측정하였다. Nunc MaxiSorp™ 96 웰 마이크로 플레이트(Thermo Scientific)의 각 웰을 1μg/mL의 항-C-말단 코넥신43 항체(Sigma-Aldrich)를 함유하는 코팅 완충제로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 웰을 세척한 후 실온에서 2시간 동안 1% 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 표준 물질로 비오틴 태그가 붙은 αCT1의 연속 희석과 시험관 내 방출 연구에서 상이한 시간에 수집한 비오틴 태그가 붙은 αCT1을 포함하는 샘플을 상응하는 웰에 첨가하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 웰을 세척한 후 1μg/ml 뉴트라비딘-접합 HRP(Thermo Scientific)를 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 세척 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 발색 기질 용액을 첨가하여 어둠 속에서 상온에서 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 사용하여 OD650에서 흡광도를 측정하였다. 그런 다음 2M 황산을 첨가하여 반응을 중단하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 OD450에서 흡광도를 측정하였다. 모든 측정은 세 번 수행하였다.
세포 이미징 및 면역 형광. 세포를 6-웰 플레이트 또는 35-mm 유리 바닥 접시(Mat-Tek)에 시드하고 동결 건조 전에 0.45mM 기공을 통해 여과된 RhB-NP 또는 αCT1-NP를 PBS에 재현탁하고 다른 농도로 배지에 첨가하였다. 밤새 배양한 후, 세포를 PBS로 5회 세척하고 신선한 배지로 보충하고 EVOS™ FL 자동 이미징 시스템(Thermo Scientific)을 사용하여 위상차 및 형광 현미경으로 여러 번 관찰하거나 4% 파라포름알데하이드로 20분 동안 다양한 시간에 여러 번 고정하고 실온에서 2시간 동안 3% BSA 차단 용액에서 0.1% Triton X-100으로 투과하였다. 면역 염색은 항-C-말단 코넥신43 항체(Sigma-Aldrich, 1:3000)로 수행하였고 Alexa Fluor® 488(Thermo Scientific, 1:500)에 접합된 2차 항체를 사용하여 검출하였다. 비오틴 태그가 붙은 αCT1은 Alexa Fluor® 647(Thermo Scientific, 1:500)에 접합된 스트렙타비딘으로 검출하였다. Alexa Fluor® 488(Thermo Scientific, 1:500)에 접합 된 밀 배아 응집체(WGA)를 사용하여 세포막을 염색하였다. 슬라이드는 DAPI(Thermo Scientific)와 함께 ProLong Gold 안티 페이드 시약을 사용하여 장착하였다. 세포는 옵테라 도립 형광 공 초점 현미경(Bruker) 하에서 조사하였다.
결과
입자 크기 최적화. 로다민 B와 αCT1을 캡슐화하는 PLGA 나노 입자를 합성하였다. 초기 이중 에멀젼 입자는 1차 에멀젼에서 0.05g PLGA 및 2mL의 EA를 사용하고 2차 에멀젼에서 5w/v% PVA를 사용하여 만들었다. 그러나, 멸균 목적으로 0.2μm의 필터링 요구 사항으로 인해, 합성 공정은 대부분의 입자가 0.2μm 미만이 될 때까지 입자 크기를 줄이기 위한 최적화가 필요하였다. 입자 크기를 최적화하기 위해 PLGA, 에틸 아세테이트 및 PVA의 양을 수정하였다. NP 유착을 방지하기 위해 고 에너지 초음파 처리 동안 PLGA를 유리 전이 온도(Tg) 아래로 유지하기 위해 얼음 욕조도 추가하였다. 마지막으로, αCT1이 입자의 크기 최적화 중에 입자 크기를 어떻게 변화시킬 수 있는지 더 잘 모방하기 위해, 물 속 2mM BSA는 부피가 크기 때문에 약물 모방체로 사용하였다.
표 7은 최적화 동안 수정된 매개 변수의 설명을 제공한다. 단일 에멀젼 입자의 피크 직경은 일반적으로 200nm 미만이기 때문에, 단일 에멀젼 입자에 대한 최적화 단계가 수행되지 않았다. 동적 광산란(DLS; Malvern Zetasizer Nano ZS)을 사용하여 평균 나노 입자 직경을 감지하였다(도 1). 입자를 만드는 데 사용된 원래 매개 변수(표 7, 샘플 1)는 229nm에서 가장 큰 평균 직경을 보여주었다. 작은 배치 크기와 유화 중에 외부 상에서 PVA 농도가 낮으면 다분산 지수(PDI)가 가장 낮은 평균 직경 크기가 가장 작았으며, 이는 이러한 작은 입자가 다른 샘플에 비해 크기가 더 균질했으며 수집된 입자는 살균 크기의 필터(0.2μm)를 통과할 수 있다. 샘플 3의 매개 변수는 가장 작은 입자와 PDI를 생성하였고, 샘플 3 매개 변수는 이중 에멀젼 입자의 합성에 적용되었다.
소 혈청 알부민을 사용하는 이중 에멀젼 입자의 입자 크기 최적화. BSA = 소 혈청 알부민, PLGA = 폴리(락트-코-글리콜산), EA = 에틸 아세테이트, PVA = 폴리(바이닐 알코올), Dia = 직경, 표준 편차 = 표준 편차, PDI = 다분산 지수.
샘플 BSA
(μL) 		PLGA
(g) 		EA
(mL) 		외부 상에서
w/v% PVA 		얼음 욕조 직경(nm)
(avg + stdev) 		PDI
(avg + stdev)
1 100 0.05 2 5 아니오 229±4 0.301±0.014
2 50 0.025 1 5 예 149±1 0.190±0.019
3 50 0.025 1 2.5 예 143±1 0.158±0.014
4 50 0.025 1 20 예 165±1 0.219±0.004
단일 및 이중 에멀젼 간의 RhB 적재량 및 효율 비교. 다음으로, 단일 에멀젼 및 이중 에멀젼 입자 모두에 대해 약물 적재량 및 방출의 초기 추정이 이루어졌다. 표 8은 단일 및 이중 에멀젼 입자의 적재량과 캡슐화 효율을 비교한다. 식 1을 사용하여 계산된 약물 함량은 단일 및 이중 에멀젼 모두에 대해 유사하였다. 그러나, 식 2를 사용하여 계산된 약물 포획은 단일 에멀젼에 비해 이중 에멀젼의 경우 더 높았다. 도 2는 또한 단일 및 이중 에멀젼 입자에서 약물의 방출 프로파일을 보여준다. 7일 동안, 단일 에멀젼 합성을 사용하여 생성된 입자는 로다민의 폭발 방출이 더 높았으며, 7일 후에 94%의 로다민을 방출한 이중 에멀젼 입자보다 더 빨리 완료까지 방출되었다.
RhB-PLGA-NP의 약물 적재량 및 캡슐화 효율(모든 입자는 적재량을 측정하기 전에 0.2μm로 필터링됨).
샘플 RhB 적재량(ng drug/mg 입자) RhB 적재량(%±st.dev) 캡슐화 효율(%±st.dev)
RhB-PLGA-NP, SE 160±53 0.0160±0.0053 0.00028±0.00015
RhB-PLGA-NP, DE 167±9 0.0167±0.0009 0.0018±0.0004
이중 에멀젼 입자는 더 높은 캡슐화 효율을 갖고 모든 캡슐화된 재료를 방출하는 데 더 오래 걸렸다. 목표가 서방형 αCT1 제형을 개발하는 것이므로, 이러한 결과는 이중 에멀젼 입자에 대한 추가 평가를 뒷받침하였다.
Figure pct00003
식 1
Figure pct00004
식 2
동결 방지제. 동결 건조는 입자를 건조하게 유지하기 위해 입자의 장기 저장에 사용된다. RhB-NP 및 αCT1-NP는 입자를 PLGA의 Tg 미만으로 유지하고 입자를 조기에 분해할 수 있는 수분에 대한 노출 가능성을 줄이기 위해 동결 상태로 유지되었다. 동결 건조를 위해서, 먼저 용액의 입자를 동결시켜야 한다. 임상 시험에 사용하기 전에, 입자를 DI-수 또는 PBS 완충액에 재현탁하고 입자가 멸균 캐비닛에서 합성되지 않은 경우 0.2μm에서 여과하여 멸균해야 한다.
동결 건조 및 재현탁 후, 입자의 상당 부분이 무균 여과 절차 동안 손실되었음을 알 수 있었다. 동결 건조(-28±2mV) 후 로다민이 적재된 NP의 제타 전위가 안정된 현탁액을 의미하더라도, 입자의 크기는 동결 및/또는 건조 과정에서 증가하였다. 동결이 얼음 결정이 인접한 입자를 뚫고 본질적으로 이들을 융합하여 더 큰 입자를 만들 수 있다는 가설을 세웠다. 동결 동안 PLGA 나노 입자를 보호하기 위해 다양한 방법이 연구되어 긍정적인 결과를 얻었지만 일반적으로 작은 당(수크로스, 트레할로스, 덱스트로스, 소르비톨 등)과 같은 동결 보호제가 가장 일반적으로 사용된다.20-23 이 연구에서, 입자 크기 성장을 제한하기 위해 액체 질소 및 동결 방지제 트레할로스 및 수크로스의 첨가가 사용되었다.
도 3은 동결 전 183nm의 입자 직경을 나타낸다. 동결 방지제가 없는 느린 동결은 입자 직경을 240nm 이상으로 증가시켰고 빠른 동결은 성장을 제한하여 평균 215nm에 도달하였다. 용액 속 15 w/v%와 같이 다량의 동결 방지제를 첨가하면, 입자 크기가 동결 방지제가 없는 느린 동결 크기보다 약 260nm에서 증가하였다. 다량(10% 이상)을 추가하면 일부 경우에 동결 방지제 없이 동결된 입자보다 입자 크기가 증가하는 것으로 나타났다.21,23 이 연구에서, 동결 방지제를 소량, 특히 1 w/v%으로 첨가하면 입자 크기 성장을 제한하였다. 트레할로스를 1w/v%로 사용하고 신속하게 동결시켰을 때, 입자 크기는 급속 동결만으로 동결된 입자의 크기 미만으로 떨어졌다. 빠른 또는 느린 동결과 함께 1w/v%로 수크로스를 첨가하면, 평균 입자 크기가 원래 입자 크기에 가장 가깝게 유지되었다. 1w/v%의 트레할로스의 첨가와 느린 동결은 동일한 농도에서 수크로스를 사용하는 방법과 유사한 입자 크기를 생성하였다. 다음으로, 1w/v% 수크로스를 모든 입자 현탁액에 첨가한 후 동결 및 동결 건조하였다.
αCT1-NP의 적재량 및 분해. 저장 중 NP 크기의 변화를 줄이기 위해 동결 방지 매개 변수를 최적화한 후, αCT1-NP에 대한 적재량 및 분해 연구가 완료되었다. 입자를 분석 전에 0.2μm로 여과하였다. 질량에 의한 약물 적재량은 962±88ng 약물/mg 입자이었고, % 적재량은 0.0962±0.0088%이었고, 캡슐화 효율은 0.000966±0.00049%이었다. 오차는 적어도 3개의 표본에 대한 표준 편차이다. 동결 건조 후 αCT1-NP의 제타 전위는 -23mV이었다. αCT1의 포획은 거의 1μg/mg 입자에서 RhB-NP에 대한 것보다 더 높은 것으로 보이지만, 약물 적재량 백분율은 RhB-NP 및 αCT1-NP의 경우 0.1% 미만이다.
도 4a는 샌드위치 ELISA를 통해 측정이 이루어진 21일에 걸친 αCT1의 누적 방출을 보여준다. 방출 프로파일은 분출 효과를 보였는데, 3일 후에 약 50%의 펩타이드가 방출된 다음, 전체 캡슐화된 약물의 73%가 방출될 때까지 후속 18일 동안 지속 방출이 이어졌다.
입자 형태 및 직경 변화는 ImageJ 소프트웨어를 통한 DLS 및 SEM 이미지 분석의 측정을 사용하여 시간이 지남에 따라 모니터링되었다. DLS를 사용하여 측정 한 입자 크기 직경은 SEM을 통해 측정한 크기의 약 두 배이었다. DLS와 SEM 모두 7일 동안 입자 크기가 186 내지 208로 증가한 다음, 2 내지 3주 사이에 223nm로 다시 증가하였다. 도 4b는 DLS에 의해 측정된 분해 연구 동안 시간에 따른 입자의 입자 크기 및 다분산 지수(PDI)를 보여준다. PDI도 시간이 지남에 따라 증가하였다. 유사한 입자 크기 경향이 SEM 측정에서도 발견되었다. 도 4c-h는 분해의 1일, 7일 및 21일에 SEM 이미지를 보여준다. 모공이나 구멍은 7일 이후에 나타나는 것처럼 보이며 시간이 지남에 따라 크기와 양이 증가한다.
GSC 및 GBM 세포에서 RhB-NP 및 αCT1-NP 흡수. VTC-037 GSC에 다양한 농도로 첨가된 RhB-NP는 세포 플레이트 접착에 영향을 주지 않고 적어도 300μg/mL의 NP를 세포에 첨가할 수 있음을 보여주었다(도 5a). 이 농도는 3주간의 세포 배양에 사용되어 분해된 RhB-NP와 세포에 미치는 영향과 시간이 지남에 따라 RhB가 세포에 얼마나 오래 남아있을 수 있는지를 연구하였다(도 5b). 방출 첫 주 동안, 다량의 RhB가 세포에 존재한다. 14일과 21일에, RhB 신호는 10일째에 트립신 처리를 통한 세포 통과 후에도 세포에서 여전히 검출된다.
200㎍/ml의 RhB-NP가 VTC-037 GSC에 첨가되었을 때, 37℃에서 배양된 세포는 도 5와 유사한 RhB-NP의 흡수를 보였지만 4℃에서 배양된 세포는 RhB-NP의 세포 흡수를 감소시켰다(도 6).
LN229/GSC의 배지에 200㎍/ml로 첨가된 RhB-NP의 유무에 관계 없이 세포막 및 핵의 염색은 RhB-NP가 세포질에 존재하지만 핵에서 제외되기 때문에 NP의 세포 흡수가 발생하고 있음을 보여준다(도 7). αCT1-NP가 SF295 세포의 배지에 1mg/ml로 첨가되었을 때(1mg/ml의 RhB-NP가 NP 세포 흡수에 대한 양성 대조군으로 사용되었다), αCT1-NP 섭취 후 비오틴 태그가 붙은 αCT1의 검출은 1일 및 4일 후 세포에 αCT1의 존재를 입증한다(도 8).
논의
본 실시예는 이중 에멀젼-용매 증발 방법을 사용하여 펩타이드 αCT1을 캡슐화하는 방법 및 여과를 통한 입자의 살균을 위해 입자 크기를 최소화하는 데 사용되는 방법을 기술한다. 입자는 시험관 내에서 약 21일 동안 펩타이드를 방출한다. 또한 입자가 VTC-037 GSC에 의해 섭취되고 세포 내 펩타이드의 존재가 적어도 4일 동안 검출 가능하다는 것이 입증되었다. 결과는 입자가 αCT1 펩타이드의 제어 방출에 사용될 수 있음을 나타낸다.
이식 가능한 재료를 만들 때 고려해야 할 한 요소는 멸균 공정이다. 여기에서, 여과에 의한 살균은 캡슐화된 펩타이드의 방출 프로파일을 변경하지 않을 것으로 결정되었으므로, 입자 크기는 가장 작은 직경을 달성하도록 최적화되었다. 입자 크기 최적화는 평균 입자 크기를 직경 229nm 내지 직경 143nm로 줄였다. 다른 모든 입자 크기는 평균 직경이 170nm 미만이었다. 이것은 더 작은 배치 크기를 사용했을 때 가능해진 와동 중에 1차 에멀젼을 PVA 용액에 떨어 뜨리기 때문일 수 있다. 더 작은 배치 크기가 1차 에멀젼이 2차 외부 단계에 첨가될 때 와동하는 동안 용액이 용기 밖으로 배출되는 것을 방지한다.
샘플 3은 크기 최적화 연구 동안 입자 직경을 최소화하기 위한 유리한 조건을 보여주었다.
단일 및 이중 에멀젼은 약물의 양을 다르게 캡슐화할 수 있다. 예를 들어, 단일 에멀젼은 일반적으로 더 높은 적재량 비율로 소수성 약물을 캡슐화하는 반면, 이중 에멀젼은 친수성 약물이 차지할 공간을 제공하여 최외곽 상으로 덜 이동된다.25 여기서 입자의 RhB 함량은 단일 및 이중 에멀젼 사이에서 유사하다. 너무 적은 RhB가 실제로 캡슐화되기 때문에, 낮은 적재량은 대부분 입자 내부의 통합보다는 입자 표면의 흡착 때문일 수 있다. 단일 에멀젼 입자보다 더 많은 입자가 수집 되었기 때문에 이중 에멀젼 입자의 경우 캡슐화 효율이 더 높을 수 있다.
시간이 지남에 따라 NP 크기의 증가는 PLGA가 일반적으로 작은 두께에서 중성 내지 산성 pH에서 대량으로 침식된다는 사실로 인해 예상되었다.27 대량 침식은 분해 속도가 폴리머의 분해 및 제거가 물 흡수보다 더욱 빠르게 일어나는 표면 침식에 비해 수분 흡수보다 느리게 발생할 때 발생한다. 표면 침식의 경우, 분해는 폴리머 매트릭스의 표면으로 제한한다.27, 28 본 발명에서, 벌크 침식 PLGA-NP는 처음 며칠 동안 물로 팽창하는 반면 폴리머는 가수 분해로 분해되지만 침식이 발생하기 전에 가수 분해된다.27, 29 3주 정도에 입자 크기가 다시 증가하면, 입자 응집이 크기 증가의 주요 원인이 될 수 있다. 레스시그가노 등은 또한 분해가 진행됨에 따라 나노 입자의 응집을 관찰하였다.30 이것은 나노 입자 침식 동안 표면에서 PVA 안정제가 제거되었기 때문일 수 있다. 세척 주기 후에도 PLGA 쉘에 통합될 가능성이 있는 PVA는 응집을 입체적으로 방해하는 데 도움이 된다. PVA는 물에 용해되므로 입자가 분해됨에 따라 PVA는 제거되어 주변 물에 용해될 수 있다. 입체 장애가 제거되면, 입자가 뭉치기 쉬워져 크기가 증가한다. NP에 나타나는 구멍은 분해 및 침식 과정에서 입자의 침식 채널을 통해 폴리머가 제거되었기 때문일 수 있다.29, 30
NP가 세포에 도입되었을 때, RhB-NP가 있거나 없는 세포막과 핵의 염색(도 7) RhB-NP가 세포질에서 검출되었으나 핵에서 제외되어, NP 세포 흡수를 지원하였다. 세포가 4℃에서 배양되면, RhB-NP의 세포 흡수가 거의 발생하지 않아 에너지 의존적 세포 내 이입이 NP 흡수의 주요 경로임을 의미한다.31, 32 RhB-NP 및 αCT1-NP는 세포에 의해 내재화된다.
결론적으로, PLGA 나노 입자는 αCT1을 성공적으로 캡슐화하고 시험관 내에서 3주에 걸쳐 약물의 73%를 방출하였다. 인간 GSC에 도입되었을 때, RhB는 처음 7일 동안 명확하게 검출된 다음 14일과 21일에 최소량으로 검출되었다. RhB는 방출된 RhB 분자로 검출되었을뿐만 아니라 입자에 여전히 캡슐화될 수 있다. GSC에 도입된 αCT1-NP는 적어도 4일 동안 세포에 αCT1이 존재하는 것으로 나타났다. 그러나, 약물 적재량 및 캡슐화 효율은 비실용적인 양의 나노 입자를 사용하지 않는 한 치료적으로 관련된 용량의 αCT1 미만으로 낮았다. 실시예 2는 환자에게 보다 효과적인 수준으로 투여량을 높이기 위해 약물 적재량을 개선한 추가 연구를 상세히 설명한다.
실시예 2: 플래시 나노 침전화에 의한 αCT1-적재된 PLGA 나노 입자의 제조
이중 에멀젼 기술(물/오일/물 에멀젼)은 αCT1-NP 적재량 프로파일(~1% 캡슐화 효율)과 같은 결점을 겪은 반면, 단일 에멀젼 합성 NP는 응집하는 경향을 보였다; 추가 합성 기술을 탐구하기 위해 이 목표를 확장할 필요를 초래한다. 조사 된 추가 기술은 i.) 폴리머를 효율적으로 용해하지만 αCT1은 용해시키지 않으면 서 빠르게 증발하는 최적의 무독성 유기 용매; ii.) 펩타이드가 외부 수성 상으로 확산되는 시간을 줄이기 위해 용매 제거를 촉진하기 위한 회전증발농축기의 적용; iii.) 캡슐화 효율을 높이고 조밀하고 균질한 구체를 만들기 위한 산화 아연 또는 칼슘의 외부 상으로의 첨가를 포함한다. 장기간 보관 및 운송을 위해 나노 입자를 보존하기 위한 동결 건조 및 동결 기술, 임상 중개(clinical translation) 및 제품 상용화를 위한 중요한 기능도 최적화되었다. 동결 및 동결 건조 프로토콜 동안 동결 보호제로서 수크로스를 첨가하면 입자 응집이 성공적으로 방지되었다.
플래시 나노 침전화는 더 높은 약물 적재량 및 더 작고 더 일관된 응집되지 않은 나노 입자의 관점에서 최적의 αCT1-NP를 제공하였다. 이 방법은 폴리머(PLGA)와 약물(αCT1)을 수혼화성 용매에 용해시키는 것을 필요로 한다. 물은 "반 용매"로 사용되었으며, 여기서 폴리머를 용해시키는 데 사용되는 용매는 또한 반 용매와 혼화성이지만 폴리머는 반 용매에 용해되지 않는다. 두 용매가 혼합되면, 폴리머가 용액에서 침전되어 그 과정에서 약물을 포획한다. 2-제트 혼합기와 4-제트 혼합기 접근법이 모두 평가되었다(도 10).
αCT1-NP 크기, 형태 및 표면 전하의 특성화, αCT1 적재량 및 방출 효율의 결정. 다음 특징화 매개 변수는 αCT1 및 대조군 NP에 대해 완료되었으며, 임상 개발 및 상용화를 위해 αCT1-NP에 대한 플래시 나노 침전화 방법(혼합 중 4 제트 혼합기 및 >1% 폴리바이닐 알코올(PVA)(w/v) 사용)을 지원한다: 나노 입자 크기 및 형태는 주사 전자 현미경(SEM); αCT1 캡슐화의 효율성; 및 αCT1 및 로다민 B의 효율성 및 방출을 사용하여 연구하였다.
나노 입자 크기 및 형태. 4-제트 혼합기와 PVA를 사용하여 혼합하는 동안 플래시 나노 침전화를 통해 만들어진 나노 입자는 다른 방법에 비해 ~180nm에서 보다 일관된 αCT1-NP 크기와 더 적은 응집을 나타내었다. 나노 입자 크기와 형태는 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 연구하였다. 이것은 형태와 크기의 균일한 분포가 최적화된 물리 화학적 특성을 가진 나노 입자를 생성하고 αCT1 방출과 관련하여 보다 일관된 결과를 생성하기 때문에 중요하다. 입자 크기는 동적 광산란 기술을 사용하여 Zetasizer Nano ZS로 측정되었다. 적재 효율 및 세포 흡수를 위한 최적의 나노 입자 크기는 CED 전달의 경우 100-300nm 및 <150nm +＼-40이다. αCT1-NP는 100-200nm의 평균 크기로 눈에 띄는 핀홀이나 균열 없이 매끄러운 표면 형태를 보여주었다(도 11). 혼합(0.3-2.5 %) 동안 PVA를 첨가하면 입자 크기가 더 작아졌다.
전반적으로, 혼합 동안 4-제트 혼합기 및 PVA를 사용하는 플래시 나노 침전화는 다른 방법에 비해 ~180nm에서 보다 일관된 αCT1-NP 크기와 더 적은 응집을 나타내었다.
캡슐화 효율은 분해된 입자의 αCT1 펩타이드 함량 및 로다민 B 함량을 측정하여 결정하였다. 이를 위해, 공지된 양의 동결 건조된 나노 입자를 DMSO에 재현 탁하고 용액을 50℃에서 30분 동안 교반한 후 0.1% 트라이플루오로 아세트산과 함께 50% 아세토나이트릴을 추가 60분 동안 첨가하여 PLGA의 분해를 허용하였다. 분해된 PLGA는 원심 분리에 의해 제거하였고 αCT1 및 로다민 B를 함유하는 상청액은 각각 새로 개발되고 최적화된 ELISA 및 형광 정량을 사용하여 분석하였다. 포획을 위해 C-말단 Cx43 항체(1μg/ml)를 사용하고 검출을 위해 HRP 태그가 붙은 뉴트라비딘을 사용하는 매우 민감하고 특이적인(>90%) 샌드위치 ELISA가 이러한 연구를 위해 특별히 개발되고 검증되었다. 나노 입자의 αCT1 농도는 알려진 농도의 αCT1 또는 로다민 B로 생성된 검량선을 사용하여 계산되었다. αCT1 약물 적재량은 4-제트 혼합기를 사용하는 플래시 나노 침전화 합성을 사용할 때 최적(~65.7%)이었다. 혼합 중에 >1% PVA를 추가하면 적재 효율이 크게 증가하였다. 염화나트륨의 첨가는 약물 적재 효율에 눈에 띄게 영향을 미치지 않았다.
NP로부터 캡슐화된 αCT1 및 로다민 B의 시험관 내 방출 속도는 자기 교반기에 의한 일정한 혼합과 함께 37℃에서 PBS 용액에서 배양함으로써 결정하였다. 0시간 내지 36일의 일정한 시간 간격으로, 현탁액 샘플을 수집하고, 새로운 PBS를 첨가하여 나노 입자 현탁액에서 일정한 부피를 유지하였다. 각각의 수집된 샘플을 원심 분리하여 NP를 제거하고, 상청액의 αCT1 및 로다민 B의 농도는 위에서 설명한대로 측정하였다. 분해 연구는 >36 일 동안 PLGA-Rhod-NP 완전성을 유지하는 것으로 나타났다(도 12a). 이중 에멀젼 방출에 의한 αCT1의 분석은 1일 후에 초기 분출을 보인 다음 7일 후에 최대에 도달한 지속 방출을 보여주었다. 입자는 1mg/mL의 농도로 PBS에 재분산되었고 37℃에서 분해되었다. 2-제트 플래시 나노 침전화 방법은 이중 에멀젼 입자에 비해 적은 분출 방출을 나타내며 이는 사용된 24시간 투석 단계의 포함이 용매를 제거하기 때문일 수 있다(도 12b).
따라서, 플래시 나노 침전화는 다른 방법에 비해 더 높은 αCT1 캡슐화 및 더 나은 αCT1 방출 동역학을 제공하였다.
실시예 3: αCT1-NP의 세포 흡수
GBM 세포에서 αCT1-NP 세포 흡수 분석. αCT1-NP의 세포 흡수는 시험관 내 인간 GBM 세포에서 평가하였다. 세포 내 αCT1-NP의 존재는 i.) 로다민 B(나노 입자의 존재) 및 ii.) αCT1 펩타이드의 검출에 의해 공 초점 현미경을 사용하여 평가하였다. αCT1-NP로 표지된 로다민 B의 상이한 농도(20-300μg/ml 범위)를 인간 GBM 및 정상 성상세포 세포주의 배지에 첨가하였다. 세포를 PBS로 5회 세척하고 1 내지 24의 다른 시점에 고정하고 형광 현미경으로 분석하였다. 형광성 밀 배아 응집소(WGA) Alexa Fluor® 488을 사용하여 세포막을 염색하여 각 세포의 둘레를 식별하였고; DAPI는 핵을 염색하는 데 사용하였다.
LN229/GSC는 24시간 후 RhodB-NPs의 강한 흡수를 보였다(도 13). 유사하게, 카릴리온 클리닉(Carilion Clinic)에서 수술을 받은 교모세포종 환자로부터 분리 된 배양된 GSC(VTC-037로 명명)에서, 강력한 RhodB-NP 흡수가 1시간 및 24시간에 관찰되었다(공간 제한으로 인해 데이터가 표시되지 않음). 세포 흡수는 4℃에서 감소하였다. GBM 환자로부터 유도된 GSC 신경구에 의한 Rhod-NP의 흡수는 더 높은 농도(>250μg/ml)에서 흡수를 나타냈으며, 여기서 세포의 분리 및 해리는 세포의 약 50-60%가 Rhod-NP에 양성인 것으로 나타났다. 이러한 연구는 PLGA NP가 75μg/ml 초과의 NP 농도에서 세포 내 이입을 통해 최적의 GBM 세포 흡수를 나타냈으며 GSC 신경구로 침투할 수 있음을 확인하였다. 흥미롭게도, 정상적인 인간 성상세포는 >500μg/ml 농도에서 PLGA-NP 흡수를 나타내었다.
시험관 내 NP 분해를 평가하기 위해, Rhod-NP(300μg/ml)를 VTC-037 세포에 24시간 동안 첨가하고 21일 동안 형광 현미경으로 관찰하였다. 세포는 10일째에 트립신 처리를 통해 계대배양하였다. 로다민 신호는 세포 배양 3주 후, 계대배양 후에도 여전히 검출되었고; 따라서 >21일 동안 PLGA NP의 완전성을 지원한다(도 14).
αCT1은 세포 흡수를 촉진하는 안테나피디아 세포 침투 도메인을 포함한다. 따라서, 세포 외부에서 αCT1-NP의 분해는 αCT1의 가용성과 세포로의 흡수를 초래할 것이다. Alexa Fluor® 647 스트렙타비딘을 사용하는 염색을 공초점 현미경을 사용하여 세포에서 비오틴 태그가 지정된 αCT1의 존재를 평가하고 αCT1 펩타이드를 내재화하는 안테나피디아 도메인의 효율성을 확인하는 데 사용하였다. 새로운 배지를 세척하고 첨가하기 전 하루 동안 αCT1-NP에 노출된 후, αCT1은 인간 GBM 세포에서 적어도 4일 동안 시험관 내에서 검출될 수 있었다(도 15). C 말단 Cx43 항체에 의한 염색이 αCT1 염색을 양성으로 확인시켰다.
실시예 4. αCT1-NP의 치료적 응용
TMZ 치료에 대한 민감성 뇌종양에서 αCT1-적재된 생분해성 입자의 생체 내 치료 잠재력을 평가하였다. 미세 주사 후 마우스 뇌의 αCT1-NP 생체 분포 평가 및 이종 이식 GBM 모델에서 TMZ와 조합된 αCT1-NP의 치료 잠재력 분석을 수행하였다.
결과: 미세 주사를 통해 전달된 생분해성, 멸균, αCT1-적재된 PLGA 나노 입자가 주사 부위 근처에서 검출되었으며 독성과 관련이 없었다. TMZ 치료와 함께 aCT-NP의 종양 내 전달은 GBM 마우스 모델에서 종양 부피를 상당히 감소시키는 효능을 나타내었다.
마우스 뇌에서 αCT1-NP 분포의 평가. 로다민 B(1mg/ml 농도)로 표지된 비오틴 태그가 붙은 αCT1-NP를 미세 주사 펌프를 사용하여 마우스 뇌에 주입하였다(3μl). 표지되지 않은 빈 NP를 음성 대조군으로 주입하였다. 마우스 뇌는 1일 및 1주에 채취하였다. 뇌를 수집하고 OCT 삽입 후 동결하기 전에 수크로스를 동결 보호 하였다. 또한, 추가 분석을 위해 폐, 심장 및 간을 포함하는 다른 기관의 혈액과 조직을 수집하였다. 1일 및 1주 후에 주사 부위에 가까운 뇌 절편에서 Rhod-NP의 검출이 확인되었다(공간 제한으로 인해 데이터가 표시되지 않음). 치료된 마우스에서 이상 반응은 검출되지 않았다. 이것은 신경 생체 행동 평가의 변화를 포함하지 않았으며 αCT1 PLGA-NP 전달과 관련된 신경 또는 전신 독성의 증거도 포함하지 않았다.
이종 이식 GBM 마우스 모델에서 αCT1-NP의 효과. αCT1-NP의 생체 내 안전성과 효능을 평가하기 위해, GBM의 마우스 이종 이식 모델을 사용하였다. U87MG GBM 세포를 배양하고 1 x 106 세포를 100μL의 Matrigel(R) 기질과 혼합하고 23 게이지 바늘을 사용하여 SCID/베이지 색 마취된 마우스의 측면에 피하 주사하였다. 8일 후, 마우스를 (i) TMZ 단독 및 (ii) TMZ + αCT1 입자의 두 그룹으로 나누었다. 치료 요법은 다음과 같았다: TMZ (7.5mg/kg)는 그룹 1 및 2 마우스 모두에 대해 8일에 시작하여 격일로 인슐린 주사기로 복강 내 주사로 투여하였다. αCT1 입자는 -80℃ 보관으로 1X PBS에서 재구성하였고 100uL 분취량을 준비하여 -20℃에서 보관하였다. 1회 용량의 입자(100 uL)로 전달된 αCT1의 농도는 1.2mg 입자/kg 마우스 체중에서 약 8μM이었다. αCT1 입자는 인슐린 주사기를 사용하여 그룹 2 마우스에 대해 10일부터 시작하여 격일로 종양 성장 부위에 전달하였다. 그룹 2 마우스는 치료 과정 동안 총 6회의 입자 주사를 받았다. 이 치료 요법은 13일 동안 지속하였다. 종양 크기는 캘리퍼를 사용하여 격일로 측정하였다. 종양 부피를 계산하였다((길이 x 너비 2)/2). TMZ + αCT1-NP에 의한 치료가 종양 부피의 현저한 감소를 초래하였다(도 16).
PLGA-NP 제제 개발의 결과, 생체 외 모델에서의 시험관 내 및 생체 내 전달 연구는 GBM 세포에 대한 αCT1의 지속적이고 제어된 전달을 위한 αCT1-NP 개발 가능성과 αCT1-NP의 치료 잠재력을 뒷받침한다.
요약하면, 포획용 C-말단 Cx43 항체(1μg/ml) 및 검출용 HRP-태그 뉴트라비딘을 사용하는 매우 민감하고 특이적인 αCT1(>90%) 샌드위치 ELISA가 특히 개발되고 검증되었다. 생분해성 αCT1 적재된 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 나노 입자(NP)가 특히 GBM 환자에서 표적 대류 강화 전달(CED)에 필요한 특징(FDA 승인 코폴리머; <150nm +＼-40 지름, 제어되고 지속적인(>3주) αCT1 방출 프로파일)을 갖도록 개발, 최적화 및 검증하였다. αCT1 적재된 나노 입자(αCT1-NP)는 인간 GMB 세포주 뿐만 아니라 GSC 신경구에 의해 효율적으로 흡수되고 NP는 >21일 내에 검출될 수 있음을 확인하였다. 설치류를 대상으로 한 생체 내 생체 분포 연구는 적어도 1주일 동안 주사 부위에 가까운 뇌에서 확장된 NP 존재를 확인하였다. αCT1-NP의 효능은 마우스 이종 이식 GBM 모델에서 생체 내에서 검증하였으며, TMZ와 조합된 aCT-NP는 GBM 종양 진행을 현저하게 감소시켰다.
본 발명은 전술한 특정 실시태양과 관련하여 기술되었지만, 많은 대안, 수정 및 기타 변형이 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 모든 대안, 수정 및 변경은 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함되도록 의도된다.
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참조 문헌
1. M. H. Xiong, Y. Bao, X. Z. Yang, Y. H. Zhu and J. Wang, Delivery of antibiotics with polymeric particles. Adv Drug Deliv Rev. 2014;78:63-76
2. T. Akagi, M. Baba and M. Akashi, Biodegradable Nanoparticles as Vaccine Adjuvants and Delivery Systems: Regulation of Immune Responses by Nanoparticle-Based Vaccine. 2011;247:31-64
3. J. M. Anderson and M. S. Shive, Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Advanced Drug Delivery Reviews. 1997;28:19
4. F. Danhier, E. Ansorena, J. M. Silva, R. Coco, A. Le Breton and V. Preat, PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 2012;161:505-22
5. K. E. Uhrich, S. M. Cannizzaro, R. S. Langer and K. M. Shakesheff, Polymeric Systems for Controlled Drug Release. Chemical Reviews. 1999;99:3181-3198
6. G. S. Ghatnekar, C. L. Grek, D. G. Armstrong, S. C. Desai and R. G. Gourdie, The effect of a connexin43-based Peptide on the healing of chronic venous leg ulcers: a multicenter, randomized trial. J Invest Dermatol. 2015;135:289-298
7. C. L. Grek, G. M. Prasad, V. Viswanathan, D. G. Armstrong, R. G. Gourdie and G. S. Ghatnekar, Topical administration of a connexin43-based peptide augments healing of chronic neuropathic diabetic foot ulcers: A multicenter, randomized trial. Wound Repair Regen. 2015;23:203-12
8. ClinicalTrials.gov, 2016. A Study of Granexin Gel to Treat Diabetic Foot Ulcer, NIH: U.S. National Library of Medicine,
9. S. F. Murphy, R. T. Varghese, S. Lamouille, S. Guo, K. J. Pridham, P. Kanabur, et al., Connexin 43 Inhibition Sensitizes Chemoresistant Glioblastoma Cells to Temozolomide. Cancer Res. 2016;76:139-49
10. K. Moore, J. Amos, J. Davis, R. Gourdie and J. D. Potts, Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release. Microsc Microanal. 2013;19:213-26
11. K. Moore, Z. J. Bryant, G. Ghatnekar, U. P. Singh, R. G. Gourdie and J. D. Potts, A synthetic connexin 43 mimetic peptide augments corneal wound healing. Exp Eye Res. 2013;115:178-88
12. A. Mathew, T. Fukuda, Y. Nagaoka, T. Hasumura, H. Morimoto, Y. Yoshida, et al., Curcumin loaded-PLGA nanoparticles conjugated with Tet-1 peptide for potential use in Alzheimer's disease. PLoS One. 2012;7:e32616
13. K. K. Chereddy, C. H. Her, M. Comune, C. Moia, A. Lopes, P. E. Porporato, et al., PLGA nanoparticles loaded with host defense peptide LL37 promote wound healing. J Control Release. 2014;194:138-47
14. M. S. Cartiera, E. C. Ferreira, C. Caputo, M. E. Egan, M. J. Caplan and W. M. Saltzman, Partial correction of cystic fibrosis defects with PLGA nanoparticles encapsulating curcumin. Mol Pharm. 2010;7:86-93
15. M. Morales-Cruz, G. M. Flores-Fernandez, M. Morales-Cruz, E. A. Orellano, J. A. Rodriguez-Martinez, M. Ruiz, et al., Two-step nanoprecipitation for the production of protein-loaded PLGA nanospheres. Results Pharma Sci. 2012;2:79-85
16. Q. Liu, X. Chen, J. Jia, W. Zhang, T. Yang, L. Wang, et al., pH-Responsive Poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) Nanoparticles with Rapid Antigen Release Behavior Promote Immune Response. ACS Nano. 2015;9:14
17. X. Zhang, G. Chen, L. Wen, F. Yang, A. L. Shao, X. Li, et al., Novel multiple agents loaded PLGA nanoparticles for brain delivery via inner ear administration: in vitro and in vivo evaluation. Eur J Pharm Sci. 2013;48:595-603
18. X. Zhang, M. Sun, A. Zheng, D. Cao, Y. Bi and J. Sun, Preparation and characterization of insulin-loaded bioadhesive PLGA nanoparticles for oral administration. Eur J Pharm Sci. 2012;45:632-8
19. H. K. Makadia and S. J. Siegel, Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 2011;3:1377-1397
20. S. S. L. Peppin, M. G. Worster and J. S. Wettlaufer, Morphological instability in freezing colloidal suspensions. Proceedings of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 2007;463:723-733
21. P. Fonte, S. Soares, A. Costa, J. C. Andrade, V. Seabra, S. Reis, et al., Effect of cryoprotectants on the porosity and stability of insulin-loaded PLGA nanoparticles after freeze-drying. Biomatter. 2012;2:329-39
22. K. S. Tang, S. M. Hashmi and E. M. Shapiro, The effect of cryoprotection on the use of PLGA encapsulated iron oxide nanoparticles for magnetic cell labeling. Nanotechnology. 2013;24:125101
23. S. Bozdag, K. Dillen, J. Vandervoort and A. Ludwig, The effect of freeze-drying with different cryoprotectants and gamma-irradiation sterilization on the characteristics of ciprofloxacin HCl-loaded poly(D,L-lactide-glycolide) nanoparticles. J Pharm Pharmacol. 2005;57:699-707
24. T. Musumeci, C. A. Ventura, I. Giannone, B. Ruozi, L. Montenegro, R. Pignatello, et al., PLA/PLGA nanoparticles for sustained release of docetaxel. Int J Pharm. 2006;325:172-9
R. A. Jain, The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices. Biomaterials. 2000:16
25. A. Budhian, S. J. Siegel and K. I. Winey, Haloperidol-loaded PLGA nanoparticles: systematic study of particle size and drug content. Int J Pharm. 2007;336:367-75
26. F. v. Burkersroda, L. Schedl and A. Gopferich, Why degradable polymers undergo surface erosion or bulk erosion. Biomaterials. 2002;23:11
27. J. A. Tamada and R. Langer, Erosion kinetics of hydrolytically degradable polymers. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90:5
28. A. Gopferich, Polymer Bulk Erosion. Macromolecules. 1997;30:7
29. N. Rescignano, M. Amelia, A. Credi, J. M. Kenny and I. Armentano, Morphological and thermal behavior of porous biopolymeric nanoparticles. European Polymer Journal. 2012;48:1152-1159
30. R. Firdessa, T. A. Oelschlaeger and H. Moll, Identification of multiple cellular uptake pathways of polystyrene nanoparticles and factors affecting the uptake: relevance for drug delivery systems. Eur J Cell Biol. 2014;93:323-37
31. L. Kou, J. Sun, Y. Zhai and Z. He, The endocytosis and intracellular fate of nanomedicines: Implication for rational design. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2013;8:1-10
SEQUENCE LISTING <110> FirstString Research, Inc. Grek, Christina L. Ghatnekar, Gautam S. <120> POLY(LACTIC-CO-GLYCOLIC ACID) NANOPARTICLES FOR CONTROLLED DELIVERY OF A PEPTIDE <130> FIRS-008/01WO <160> 91 <150> US 62/730,116 <151> 2018-09-12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 1 Pro Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp 1 5 10 15 Asp Leu Glu Ile 20 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 2 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 3 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Val 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 4 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Val Pro Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; 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note = synthetic construct <400> 55 Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Ile 1 5 10 15 Glu Leu Asp Asp Pro Arg Pro Arg 20 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 56 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Pro Pro Gln Arg Pro Arg Pro Asp 1 5 10 15 Asp Leu Glu Ile 20 <210> 57 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 57 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 58 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 58 Arg Gln Ile Ala Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Ala Ala 1 5 10 15 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 59 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu 1 5 10 15 Glu Ile <210> 60 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 60 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 1 5 10 15 Arg Leu Leu Arg Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 30 <210> 61 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 61 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Lys 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu Arg Pro Arg Pro Asp Asp 20 25 30 Leu Glu Ile 35 <210> 62 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 62 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 63 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 63 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 64 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 64 Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu Arg Pro Arg Pro Asp Asp 1 5 10 15 Leu Glu Ile <210> 65 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 65 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Arg Pro Arg Pro 20 25 30 Asp Asp Leu Glu Ile 35 <210> 66 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 66 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 1 5 10 15 Ser Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 67 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 67 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 30 <210> 68 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 68 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 69 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 69 Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr Arg 1 5 10 15 Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 <210> 70 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 70 Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu Arg Pro Arg Pro 1 5 10 15 Asp Asp Leu Glu Ile 20 <210> 71 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 71 Lys Gly Lys Ser Asp Pro Tyr His Ala Thr Ser Gly Ala Leu Ser Pro 1 5 10 15 Ala Lys Asp Cys Gly Ser Gln Lys Tyr Ala Tyr Phe Asn Gly Cys Ser 20 25 30 Ser Pro Thr Ala Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro Pro Gly Tyr Lys Leu 35 40 45 Val Thr Gly Asp Arg Asn Asn Ser Ser Cys Arg Asn Tyr Asn Lys Gln 50 55 60 Ala Ser Glu Gln Asn Trp Ala Asn Tyr Ser Ala Glu Gln Asn Arg Met 65 70 75 80 Gly Gln Ala Gly Ser Thr Ile Ser Asn Ser His Ala Gln Pro Phe Asp 85 90 95 Phe Pro Asp Asp Asn Gln Asn Ser Lys Lys Leu Ala Ala Gly His Glu 100 105 110 Leu Gln Pro Leu Ala Ile Val Asp 115 120 <210> 72 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 72 Lys Thr Asp Pro Tyr Ser His Ser Gly Thr Met Ser Pro Ser Lys Asp 1 5 10 15 Cys Gly Ser Pro Lys Tyr Ala Tyr Tyr Asn Gly Cys Ser Ser Pro Thr 20 25 30 Ala Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro Pro Gly Tyr Lys Leu Val Thr Gly 35 40 45 Asp Arg Asn Asn Ser Ser Cys Arg Asn Tyr Asn Lys Gln Ala Ser Glu 50 55 60 Gln Asn Trp Ala Asn Tyr Ser Ala Glu Gln Asn Arg Met Gly Gln Ala 65 70 75 80 Gly Ser Thr Ile Ser Asn Ser His Ala Gln Pro Phe Asp Phe Ala Asp 85 90 95 Glu His Gln Asn Thr Lys Lys Leu Ala Ser Gly His Glu Leu Gln Pro 100 105 110 Leu Thr Ile Val Asp Gln Arg Pro 115 120 <210> 73 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 73 Leu Gly Phe Gly Thr Ile Arg Asp Ser Leu Asn Ser Lys Arg Arg Glu 1 5 10 15 Leu Glu Asp Pro Gly Ala Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Trp Asn Thr Pro 20 25 30 Ser Ala Pro Pro Gly Tyr Asn Ile Ala Val Lys Pro Asp Gln Ile Gln 35 40 45 Tyr Thr Glu Leu Ser Asn Ala Lys Ile Ala Tyr Lys Gln Asn Lys Ala 50 55 60 Asn Thr Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Gly Ser His Glu Glu Asn Leu Pro 65 70 75 80 Ala Asp Leu Glu Ala Leu Gln Arg Glu Ile Arg Met Ala Gln Glu Arg 85 90 95 Leu Asp Leu Ala Val Gln Ala Tyr Ser His Gln Asn Asn Pro His Gly 100 105 110 Pro Arg Glu Lys Lys Ala Lys Val 115 120 <210> 74 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 74 Gly Phe Gly Thr Ile Arg Asp Thr Leu Asn Asn Lys Arg Lys Glu Leu 1 5 10 15 Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Trp Asn Thr Pro Ser 20 25 30 Ala Pro Pro Gly Tyr Asn Ile Ala Val Lys Pro Asp Gln Met Gln Tyr 35 40 45 Thr Glu Leu Ser Asn Ala Lys Met Ala Tyr Lys Gln Asn Lys Ala Asn 50 55 60 Ile Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Gly Ser Asn Glu Glu Asn Ile Pro Ala 65 70 75 80 Asp Leu Glu Asn Leu Gln Arg Glu Ile Lys Val Ala Gln Glu Arg Leu 85 90 95 Asp Met Ala Ile Gln Ala Tyr Asn Asn Gln Asn Asn Pro Gly Ser Ser 100 105 110 Ser Arg Glu Lys Lys Ser Lys Ala 115 120 <210> 75 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 75 Pro Tyr Leu Val Asp Cys Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile 1 5 10 15 Phe Ile Ile Phe Met Leu Val Val Gly Leu Ile Ser Leu Val Leu Asn 20 25 30 Leu Leu Glu Leu Val His Leu Leu Cys Arg Cys Leu Ser Arg Gly Met 35 40 45 Arg Ala Arg Gln Gly Gln Asp Ala Pro Pro Thr Gln Gly Thr Ser Ser 50 55 60 Asp Pro Tyr Thr Asp Gln Val Phe Phe Tyr Leu Pro Val Gly Gln Gly 65 70 75 80 Pro Ser Ser Pro Pro Cys Pro Thr Tyr Asn Gly Leu Ser Ser Ser Glu 85 90 95 Gln Asn Trp Ala Asn Leu Thr Thr Glu Glu Arg Leu Ala Ser Ser Arg 100 105 110 Pro Pro Leu Phe Leu Asp Pro Pro 115 120 <210> 76 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 76 Cys Gly Ser Lys Glu His Gly Asn Arg Lys Met Arg Gly Arg Leu Leu 1 5 10 15 Leu Thr Tyr Met Ala Ser Ile Phe Phe Lys Ser Val Phe Glu Val Ala 20 25 30 Phe Leu Leu Ile Gln Trp Tyr Leu Tyr Gly Phe Thr Leu Ser Ala Val 35 40 45 Tyr Ile Cys Glu Gln Ser Pro Cys Pro His Arg Val Asp Cys Phe Leu 50 55 60 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ile Leu Phe Met Leu Val Val 65 70 75 80 Ser Met Val Ser Phe Val Leu Asn Val Ile Glu Leu Phe Tyr Val Leu 85 90 95 Phe Lys Ala Ile Lys Asn His Leu Gly Asn Glu Lys Glu Glu Val Tyr 100 105 110 Cys Asn Pro Val Glu Leu Gln Lys 115 120 <210> 77 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 77 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 78 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 78 ccctcctccc gggcctcctc ccgggcctcc tcccggcccc ggcccgacga cctggagatc 60 <210> 79 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 79 cggccccggc ccgacgacct ggagatc 27 <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 80 cggccccggc ccgacgacct ggaggtg 27 <210> 81 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 81 cggccccggc ccgacgacgt gcccgtg 27 <210> 82 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 82 aaggcccggt ccgacgacct gtccgtg 27 <210> 83 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 83 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaag 48 <210> 84 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 84 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcc ctcctcccgg 60 gcctcctccc gggcctcctc ccggccccgg cccgacgacc tggagatc 108 <210> 85 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 85 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60 gacgacctgg agatc 75 <210> 86 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 86 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60 gacgacctgg aggtg 75 <210> 87 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 87 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60 gacgacgtgc ccgtg 75 <210> 88 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 88 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagaa ggcccggtcc 60 gacgacctgt ccgtg 75 <210> 89 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 89 Pro Cys Ser Arg Ala Ser Ser Arg Met Ser Ser Arg Ala Arg Pro Asp 1 5 10 15 Asp Leu Asp Val 20 <210> 90 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 90 Pro Arg Val Ser Val Pro Asn Phe Gly Arg Thr Gln Ser Ser Asp Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Val <210> 91 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is biotinylated <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is L-2-aminohexanoic acid <400> 91 Xaa Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys 1 5 10 15 Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25

Claims (77)

  1. 하나 이상의 나노 입자를 포함하는 조성물로서, 여기서 나노 입자는 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머 및 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 치료적 유효량을 포함하는 것인 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    펩타이드는 세포 내재화 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    세포 내재화 서열은 안테나피디아(Antennapedia), TAT, HIV-Tat, 페네트라틴(Penetratin), Antp-3A(Antp 돌연변이), 부포린(Buforin) II, 트랜스포탄(Transportan), MAP(model amphipathic peptide), K-FGF, Ku70, Prion, pVEC, Pep-1, SynB 1, Pep-7, HN-1, BGSC(Bis-Guanidinium-Spermidine-Cholesterol) 및 BGTC(Bis-Guanidinium-Tren-Cholesterol)로 이루어진 그룹에서 선택된 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩타이드는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 폴리(카프로락톤)(PCL), 에틸렌 바이닐 아세테이트 폴리머(EVA), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-코-글리콜산)(PLLGA), 폴리(D,L-락타이드)(PDLA), 폴리(L-락타이드)(PLLA), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤-코-글리콜라이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PEO-코-D,L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PPO-코-D,L-락타이드), 폴리알킬 사이아노아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리-L-라이신(PLL), 하이드록시프로필 메타크릴레이트(HPMA), 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-글루탐산, 폴리(하이드록시산), 폴리무수물, 폴리오르쏘에스터, 폴리(에스터 아마이드), 폴리아마이드, 폴리(에스터 에터), 폴리카보네이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리알킬렌 옥사이드(PEO), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리바이닐 알코올(PVA), 폴리바이닐에터, 폴리(바이닐 아세테이트), 폴리(바이닐 클로라이드)(PVC), 폴리바이닐피롤리돈(PVP), 폴리실록산, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 알킬 셀룰로오스, 하이드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에터, 셀룰로오스 에스터, 나이트로 셀룰로오스, 폴리(메틸(메트)아크릴레이트)(PMMA), 폴리(에틸(메트)아크릴레이트), 폴리(부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(아이소부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(헥실(메트)아크릴레이트), 폴리(아이소데실(메트)아크릴레이트), 폴리(라우릴(메트)아크릴레이트), 폴리(페닐(메트)아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(아이소프로필 아크릴레이트), 폴리(아이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리다이옥사논, 폴리다이옥사논 코폴리머, 폴리하이드록시 알카노에이트, 폴리프로필렌 푸마레이트, 폴리옥시메틸렌, 폴록사머, 폴록사민, 폴리(오르쏘)에스터, 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락타이드-코-카프로락톤), 트라이메틸렌 카보네이트, 폴리(N-아크릴로일모르폴린)(PAcM), 폴리(2-메틸-2-옥사졸린)(PMOX), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOZ) 및 폴리글리세롤로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 나노 입자 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLGA인 나노 입자 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLGA 및 PVA인 나노 입자 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노 입자의 평균 직경은 약 10nm 내지 약 1000nm인 나노 입자 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    나노 입자의 평균 직경은 약 30nm 내지 약 500nm인 나노 입자 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    나노 입자의 평균 직경은 약 100nm 내지 약 300nm인 나노 입자 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    나노 입자의 평균 직경은 약 100nm 내지 약 200nm인 나노 입자 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    나노 입자의 평균 직경은 약 180nm인 나노 입자 조성물.
  13. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    PLGA는 약 7,000 내지 약 17,000Da의 MW를 갖는 것인 나노 입자 조성물.
  14. 제 6 항, 제 7 항 또는 제 13 항에 있어서,
    PLGA는 50:50 락트산:글리콜산이며, 산 종결되는 것인 나노 입자 조성물.
  15. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    PVA는 약 13,000 내지 약 23,000Da의 MW를 갖는 것인 나노 입자 조성물.
  16. 제 7 항에 있어서,
    PVA의 양은 약 0.05%(w/v) 내지 약 5%(w/v)인 나노 입자 조성물.
  17. 제 8 항에 있어서,
    PVA의 양은 약 0.3%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v)인 나노 입자 조성물.
  18. 제 6 항에 있어서,
    PLGA의 양은 약 2%(w/v) 내지 약 10%(w/v)인 나노 입자 조성물.
  19. 제 6 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 평균 양은 나노 입자 조성물 mg당 적어도 약 500ng인 나노 입자 조성물.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    동결 보호제를 추가로 포함하는 것인 나노 입자 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    동결 보호제는 수크로스, 트레할로스, 덱스트로스 또는 소르비톨인 나노 입자 조성물.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노 입자는 약 0mV 내지 약 -30mV의 제타 전위를 특징으로 하는 표면 전하를 갖는 것인 나노 입자 조성물.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노 입자는 약 0.120 내지 약 0.350의 다분산 지수(PDI)를 갖는 것인 나노 입자 조성물.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노 입자는 산화 아연 또는 칼슘을 추가로 포함하는 것인 나노 입자 조성물.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노 입자는 약 10ng 펩타이드/㎍보다 큰 펩타이드 적재량을 갖는 것인 나노 입자 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서,
    나노 입자는 약 100ng 펩타이드/㎍ 입자보다 큰 펩타이드 적재량을 갖는 것인 나노 입자 조성물.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노 입자는 하기 패턴에 실질적으로 상응하는 제어된 펩타이드 방출 프로파일을 나타내는 것인 나노 입자 조성물:
    24시간 후, 전체 캡슐화된 펩타이드의 약 5% 및 60%가 방출된다; 및
    21일 후, 전체 캡슐화된 펩타이드의 약 50% 내지 100%가 방출된다.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 나노 입자 조성물 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 것인 약학적 제제.
  29. 제 28 항에 있어서,
    제제는 주사용으로 제제화된 액체인 약학적 제제.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 주사용수, 식염수, 바람직하게는 생리 식염수, 링거 용액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로 작용할 수 있는 스쿠알렌, 스쿠알란, 미네랄 오일, 만니드 모노올레에이트, 콜레스테롤 및/또는 합성 모노 또는 다이글리세라이드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브 산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌다이아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조절을 위한 제제인 약학적 제제.
  31. 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    완충제와 같은 희석제, 아스코르브산과 같은 항산화제, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트린과 같은 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트제 및 글루타티온을 추가로 포함하는 것인 약학적 제제.
  32. 제 28 항에 있어서,
    하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 부착 방지제, 항산화제, 결합제, 코팅제, 압축 보조제, 붕해제, 염료(컬러), 완화제, 유화제, 충전제(희석제), 필름 형성제 또는 코팅제, 향료, 활택제(유동 강화제), 윤활제, 방부제, 흡착제, 현탁제 또는 분산제, 감미료 및 수화수로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 약학적 제제.
  33. 제 28 항 또는 제 32 항에 있어서,
    하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 탄산 칼슘, 인산 칼슘(2 염기성), 스테아르산 칼슘, 크로스카멜로스, 가교 결합된 폴리바이닐피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로오스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 락토스, 스테아르산 마그네슘, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로오스, 메틸 파라벤, 미세결정 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리바이닐피롤리돈, 포비돈, 전호화 전분, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 셸락, 이산화규소, 카복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 구연산 나트륨, 전분 글리콜산 나트륨, 소르비톨, 전분(옥수수), 스테아르산, 수크로스, 활석, 이산화 티타늄, 비타민 A, 비타민 E(알파-토코페롤), 비타민 C 및 자일리톨로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 약학적 제제.
  34. 제 28 항에 있어서,
    제제는 에어로졸, 크림, 폼, 에멀젼, 겔, 액체, 로션, 패치, 분말, 고체, 스프레이, 또는 이들의 임의의 조합의 형태인 약학적 제제.
  35. 제 28 항에 있어서,
    피하, 피내, 근육 내, 종양 내 또는 정맥 내 주사 투여용으로 제제화된 것인 약학적 제제.
  36. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 나노 입자 조성물을 포함하는 것인 국소 제제.
  37. 제 36 항에 있어서,
    완충제를 추가로 포함하는 것인 국소 제제.
  38. 제 37 항에 있어서,
    완충제는 인산염 완충제인 국소 제제.
  39. (a) 유기 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 포함하는 제 1 용액을 제 1 수성 용매에 용해된 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 제 2 용액과 조합하는 단계;
    (b) 단계(a)의 혼합물을 유화하는 단계;
    (c) 단계(b)의 에멀젼을 제 2 수성 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 포함하는 제 2 용액에 첨가하는 단계;
    (d) 유기 용매를 제거하는 단계; 및
    (e) 선택적으로 (d)의 생성물을 정제하는 단계
    를 포함하여 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 나노 입자 조성물을 제조하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    (d) 또는 (e)의 생성물을 동결 및/또는 동결 건조하는 단계(f)를 추가로 포함하는 것인 방법.
  41. 제 39 항 또는 제 40 항에 있어서,
    단계(d)는 혼합물로부터 유기 용매를 제거하기에 충분한 시간 동안 (c)의 혼합물을 교반함으로써 수행되는 것인 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    혼합물로부터 유기 용매를 제거하기에 충분한 시간은 약 1분 내지 약 10시간인 방법.
  43. 제 42 항에 있어서,
    혼합물로부터 유기 용매를 제거하기에 충분한 시간은 약 3시간인 방법.
  44. 제 39 항 또는 제 40 항에 있어서,
    단계(d)는 회전 증발에 의해 수행되는 것인 방법.
  45. 제 39 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(a)는 초음파 처리되는 동안 수행되는 것인 방법.
  46. 제 39 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(c)는 와동되는 동안 수행되는 것인 방법.
  47. 제 39 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(c)의 생성물은 단계(d) 이전에 초음파 처리되는 것인 방법.
  48. 제 39 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서,
    정제하는 단계(e)는 (d)의 생성물을 세척하여 수행되는 것인 방법.
  49. 제 39 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(c)-(f) 중 어느 하나의 생성물은 멸균되는 것인 방법.
  50. 제 39 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(a)의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLGA인 방법.
  51. 제 39 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(c)의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PVA를 추가로 포함하는 것인 방법.
  52. 제 39 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유기 용매는 에틸 아세테이트인 방법.
  53. 제 39 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 수용 용매와 제 2 수용 수성 용매는 물인 방법
  54. (a) 다음을 제공하는 단계;
    i. SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열 및 수혼화성 유기 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머;
    ii. 반 용매;
    (b) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열 및 수혼화성 유기 용매에 용해된 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머를 반 용매와 혼합하여 나노 입자 조성물이 형성되도록 하는 단계; 및
    (c) 선택적으로 (b)의 생성물을 정제하는 단계
    를 포함하여 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 나노 입자 조성물을 제조하는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    (b) 또는 (c)의 생성물을 동결 및/또는 동결 건조하는 단계(d)를 추가로 포함하는 것인 방법.
  56. 제 54 항에 있어서,
    혼합은 제트 혼합기로 수행되는 것인 방법.
  57. 제 56 항에 있어서,
    제트 혼합기는 2-제트 혼합기 또는 4-제트 혼합기인 방법.
  58. 제 57 항에 있어서,
    제트 혼합기는 2-제트 혼합기인 방법.
  59. 제 57 항에 있어서,
    제트 혼합기는 4-제트 혼합기인 방법.
  60. 제 39 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    수혼화성 유기 용매는 DMSO인 방법.
  61. 제 39 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서,
    반 용매는 물인 방법.
  62. 제 39 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계(a)의 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLGA인 방법.
  63. 제 62 항에 있어서,
    단계(a)의 하나 이상의 생분해성 또는 생적합성 폴리머는 PLA를 추가로 포함하는 것인 방법.
  64. 제 54 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미노산 서열의 나노 입자 캡슐화 효율은 약 20% 초과인 방법.
  65. 제 54 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미노산 서열의 나노 입자 캡슐화 효율은 약 65% 초과인 방법.
  66. a) 프로필렌 글리콜, 글리세린, 메틸 파라벤 및 프로필 파라벤을 파라벤이 완전히 용해될 때까지 혼합하는 단계;
    b) 맑은 용액이 얻어질 때까지 정제수, EDTA, 일 염기성 인산 나트륨, 이 염기성 인산 나트륨 및 D-만니톨을 별도로 혼합하는 단계;
    c) a)의 용액을 b)의 용액에 첨가하고, a)의 용액 용기를 정제수로 헹구고, 린스를 결합된 용액에 첨가하고, 결합된 용액이 시각적으로 균질해질 때까지 혼합하는 단계;
    d) 균질화 혼합하면서, c)의 결합된 용액에 하이드록시에틸 셀룰로스를 첨가하고 중합체가 완전히 분산될 때까지 혼합하는 단계;
    e) 펩타이드가 완전히 용해될 때까지 정제수를 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 별도로 혼합하는 단계;
    f) e)의 용액을 d)의 용액에 첨가하고, e)의 용액 용기를 정제수로 헹구고, 린스를 결합된 용액에 첨가하고, 결합된 용액이 균질해질 때까지 혼합하는 단계
    를 포함하여 국소 제제를 제조하는 제조 방법.
  67. 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 여기서 이 방법은 제 28 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항의 약학적 제제의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  68. 제 67 항에 있어서,
    암은 신경교종, 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 균상 식육종, 호지킨병, 골수성 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계 암, 두경부암, 두경부 편평 세포 암, 신장암, 소세포 폐암 및 비 소세포 폐암과 같은 폐암, 신경 모세포종, 교모세포종, 난소암, 전립선암, 피부암, 간암, 흑색종, 구강, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포암종, 대장암, 자궁 경부암, 자궁 경부암종, 유방암, 상피암, 신장암, 비뇨생식기암, 폐암, 식도암, 두경부암, 대장암, 조혈암, 고환암, 결장암, 직장암, 전립선암, 췌장암, 횡문근육종, 척수 종양, 및 골육종, 유잉 육종, 연골 육종, 다발성 골암 및 거대 세포 골 종양과 같은 골암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  69. 제 68 항에 있어서,
    암은 신경교종인 방법.
  70. 제 69 항에 있어서,
    신경교종은 교모세포종인 방법.
  71. 제 67 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학적 제제는 피하, 피내, 근육 내, 종양 내 또는 정맥 내 주사에 의해 환자에게 투여되는 것인 방법.
  72. 제 71 항에 있어서,
    약학적 제제는 종양 내 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
  73. 제 67 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학 요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  74. 제 73 항에 있어서,
    화학 요법제는 사포린, 리신, 아브린, 에티듐 브로마이드, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 외독소, 테모졸로미드(TMZ), 클로람부실, 사이클로포스파미드, 아이소파미드, 메클로레타민, 멜팔란, 우라실 머스타드, 티오테파, 부설판, 카무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 시스플라틴, 카보플라틴, 테트라플라틴, 오마플라틴, 티오플라틴, 사트라플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 헵타플라틴, 이프로플라틴, 트랜스플라틴, 로바플라틴, 미토마이신, 프로카바진, 다카바진, 알트레타민, 블레오마이신, 암사크린, 메노가릴, 아모나피드, 닥티노마이신, 다우노루비신, N,N-다이벤질 다우노마이신, 엘립티신, 다우노마이신, 피라졸로아크리딘, 이다루비신, 미톡산트론, m-AMSA, 비산트렌, 독소루비신(아드리아마이신), 데옥시독소루비신, 에토포사이드(VP-16), 에토포사이드 포스페이트, 옥산트라졸, 루비다존, 에피루비신, 블레오마이신, 테니포사이드, 플리카마이딘, 메토트렉세이트, 트라이메트렉세이트, 플루오로우라실, 플루오로데옥시우리딘, CB3717, 아자시티딘, 사이타라빈, 플록수리딘, 머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 플루다라빈, 펜토스타틴, 아스파르기나제, 하이드록시우레아, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 파클리탁셀(Taxol®)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  75. 제 73 항 또는 제 74 항에 있어서,
    화학 요법제는 약학적 제제와 동시에 투여되지 않는 것인 방법.
  76. 제 75 항에 있어서,
    화학 요법제는 약학적 제제와 다른 날에 투여되는 것인 방법.
  77. 피험자에게 제 36 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항의 국소 제제를 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 만성 상처를 치료하는 방법으로서, 상기 제제는 만성 상처의 치료에 효과적인 투여 요법으로 투여되는 것인 방법.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021174193A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 Dupage Medical Technology, Inc. Method of manufacturing peptide nanoparticles
CN111825956A (zh) * 2020-07-07 2020-10-27 江西师范大学 聚乳酸嵌段共聚物的共混物的制备方法
KR20230117342A (ko) * 2020-10-22 2023-08-08 시퀄 바이오 인코포레이티드 펩타이드 제제 및 이의 안과적 용도

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0519737A2 (pt) * 2004-12-21 2009-01-27 Musc Found For Res Dev composiÇÕes e mÉtodos para promover a cura de feridas e a regeneraÇço de tecidos
AU2012202117B2 (en) * 2004-12-21 2014-06-26 Musc Foundation For Research Development Compositions and methods for promoting wound healing and tissue regeneration
CN101151043B (zh) * 2004-12-21 2013-09-04 南卡罗来纳州医科大学研究发展基金会 促进伤口愈合和组织再生的组合物和方法
US9408381B2 (en) * 2004-12-21 2016-08-09 Musc Foundation For Research Development Alpha Connexin c-Terminal (ACT) peptides for use in transplant
WO2013073968A2 (en) * 2011-09-12 2013-05-23 Industrial Research Limited Agents for modulation of cell signalling
SG11201405359YA (en) * 2012-03-01 2014-09-26 Firststring Res Inc Topical gels containing alpha connexin c-terminal (act) peptides
US20160166637A1 (en) * 2013-08-02 2016-06-16 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Methods of treating a cancer through targeted disruption of alpha connexin 43-zonula occludens-1 (zo-1) interaction
CA2958879A1 (en) * 2014-08-22 2016-02-25 Auckland Uniservices Limited Channel modulators
US20180028468A1 (en) * 2016-04-29 2018-02-01 Ocunexus Therapeutics, Inc. Sustained release drug delivery devices
BR112019017087A2 (pt) * 2017-02-16 2020-04-14 Firststring Res Inc composição e métodos para prevenir a lesão por radiação e promover a regeneração do tecido.

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