BR112019017087A2 - composição e métodos para prevenir a lesão por radiação e promover a regeneração do tecido. - Google Patents

Abstract

composições e métodos para uso no tratamento ou prevenção de lesões por radiação em um indivíduo em risco de tal dano.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

Pedido de Patente de Invenção para “COMPOSIÇÃO E MÉTODOS PARA PREVENIR A LESÃO POR RADIAÇÃO E PROMOVER A REGENERAÇÃO DO TECIDO”

REFERÊNCIA CRUZADA À PEDIDOS RELACIONADOS [001] O presente pedido reivindica Prioridade para o pedido de patente US No. 62/459.924, depositado em 16 de fevereiro de 2017, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

DESCRIÇÃO DO ARQUIVO DE TEXTO SUBMETIDO ELETRONICAMENTE [002] Os conteúdos do arquivo de texto submetidos eletronicamente com o presente documento são incorporados aqui por referência em sua totalidade: Uma cópia em formato legível por computador da Listagem de Sequências (nome de arquivo: FIRS_007_WO_SeqList_ST25.txt, data registrada: 16 de fevereiro de 2017, tamanho do arquivo: 34 quilobytes).

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [003] Os acontecimentos da atualidade têm salientado várias ações terroristas que podem eventualmente ser propostas para estabelecer uma explosão nuclear ou disseminar materiais radioativos utilizando um dispositivo de dispersão radiológica (por exemplo, uma bomba suja). Em tal evento, a exposição da população a doses grandes de radiação ionizante externa e/ou interna é provável, como também de lesões traumáticas. No caso de uma explosão nuclear, a exposição a grandes doses externas de radiação ionizante aguda pode resultar em sintomas de síndrome de radiação aguda (ARS) além de ou independente de dano à pele e tecidos subjacentes, denominado dano à radiação cutânea (CRI).

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2/m [004] O CRI é definido como dano dérmico resultante da exposição direta ou indireta à radiação de baixa penetração. Em eventos de precipitação, a deposição de partículas quentes sobre a pele pode resultar em altas doses de exposição à radiação localizada aguda. A exposição à radiação causa danos à camada celular basal da pele e resulta em inflamação, eritema, descamação, avermelhamento intenso, formação de bolhas, fibrose debilitante, infecção, ulceração e necrose do tecido exposto.

[005] ARS descreve uma ou uma combinação de síndromes clínicas que ocorrem após exposição à radiação ionizante. Síndromes de ARS incluem síndrome hematopoiética, síndrome gastrointestinal, síndrome neurovascular, síndrome cardíaca, e outras, e cada uma destas síndromes pode ocorrer sozinha ou em combinação com outras. Em cenários de detonação nucleares, a exposição à radiação frequentemente ocorre em combinação com outros danos traumáticos, tais como queimaduras, traumas fechados e feridas abertas, todos podendo ser complicados por infecção microbiana. Dano por radiação combinado descreve condições onde a lesão por radiação é acompanhada de outros problemas, tais como queimaduras, feridas, infecção ou traumatismo fechado.

[006] A dermatite por radiação é uma lesão que resulta da terapia de radiação, tal como radioterapia ou quimioraditerapia aplicada a um indivíduo em tratamento, por exemplo, um tratamento contra o câncer. Dermatite por radiação é um efeito colateral comum ou toxicidade de tais terapias. A dermatite por radiação pode ser aguda, surgindo dentro de cerca de 90 dias da terapia de radiação, e/ou crônica. Manifestações de dermatite por radiação incluem eritema, descamação, necrose, ulceração, atrofia, telangiectasias, fibrose e/ou outras mudanças da pele. Uma dermatite de radiação severa pode requerer a redução, interrupção, ou cessação de um programa de terapia de radiação, o que pode impactar negativamente na eficácia do tratamento do câncer ou outra doença.

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 141/280 /127 [007] Enquanto tecidos humanos danificados por lesões mecânicas, processos de doenças e outras causas são capazes de recuperação, a estrutura complexa tecidual e suas funções raramente, se alguma vez, são capazes de restauração completa. Ao invés disso, a recuperação de quase todos os tecidos da lesão em humanos e outros vertebrados superiores é dominada pela formação de cicatrizes. O exemplo mais conhecido é a formação de tecidos de cicatriz sem cores e fibrosas que permanecem após a cura de uma pele cortada ou raspada. Mais gravemente, ocorre também a formação de cicatrizes em células gliais após danos ao cérebro ou medula espinhal, sendo um dos principais obstáculos à restauração da função neural após danos ao sistema nervoso central (Prata e Miller JH, 2004). Não há atualmente nenhum meio de tratamento ou prevenção de tal processo de cicatrização e regeneração da estrutura complexa do tecido e suas funções após a lesão.

[008] Existe uma necessidade no estado da técnica de agentes terapêuticos adequados que possam tratar, prevenir e/ou mitigar a progressão da lesão por radiação, incluindo dermatite por radiação, CRI, ARS, e suas combinações. A presente invenção resolve esta e outras necessidades.

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO [009] A presente invenção apresenta um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos carbóxi-terminal de uma alfa Conexina (também referida aqui como um Polipeptídeo alfa Conexina carbóxi-terminal (ACT)), ou uma variante conservadora da mesma. A presente invenção refere-se a um método de prevenção, de mitigação e tratamento de lesões por radiação em um indivíduo em risco de tal dano, compreendendo administrar no indivíduo uma ou mais das composições fornecidas aqui (por exemplo, polipeptídeos, ácidos nucleicos, ou vetores). Por exemplo, são apresentados aqui métodos para prevenir, mitigar a progressão de, e tratar lesões cutâneas (CRI), síndrome de radiação aguda (ARS), danos por radiação combinados, ou qualquer combinação dos

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4/127 mesmos. Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos para prevenir, mitigar a progressão de, e tratar o CRI, ARS e/ou dano por radiação combinado após a exposição à radiação ionizante, por exemplo, resultante de dispositivos de dispersão radiológicos, dispositivos nucleares improvisados, armas nucleares, ou explosões de instalações de energia nuclear. Em algumas formas de realização, a presente invenção refere-se a métodos para prevenir, mitigar a progressão de, e tratar dermatite por radiação.

[010] Em algumas formas de realização, são apresentados aqui métodos para prevenir, mitigar a progressão, e tratar lesões por radiação que resultem do sol, raios-x e outras máquinas de diagnóstico, leitos de bronzeamento ou outras fontes de radiação ionizante. Por exemplo, em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui são usadas em um método para prevenir ou mitigar a progressão de tais lesões antes da exposição à fonte de radiação ionizante, ou após a exposição, mas antes ou depois do início dos sintomas da lesão.

[011] Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos para prevenir, mitigar a severidade, e tratar a lesão por radiação em um indivíduo em risco de tal dano, compreendendo administrar no indivíduo uma composição contendo um polipeptídeo isolado compreendendo um polipeptídeo alfa Conexina. Em algumas modalidades, a composição é administrada antes da exposição do sujeito à radiação. Em outras modalidades, a composição é administrada no sujeito após exposição à radiação. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição é administrada no indivíduo pelo menos um dia após a exposição à radiação. Em algumas modalidades, o método impede a progressão da lesão por radiação. Em algumas formas de realização, a composição é administrada topicamente ao indivíduo. Em algumas formas de realização, a composição é administrada topicamente ao indivíduo em uma dose de cerca de 10 μΜ a

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5/m cerca de 2.000 μΜ. Em outras modalidades, a composição é administrada ao indivíduo em uma dose de cerca de 50 μΜ, cerca de 100 μΜ, cerca de 150 μΜ, cerca de 200 μΜ, cerca de 300 μΜ, cerca de 400 μΜ, cerca de 500 μΜ, cerca de 600 μΜ, cerca de 700 μΜ, cerca de 800 μΜ, cerca de 900 μΜ, ou cerca de 1.000 μΜ. Em algumas formas de realização, a composição é administrada em um regime de dosagem diária. Em algumas formas de realização, a composição é administrada parenteralmente no indivíduo. Em outras modalidades, a composição é administrada ao indivíduo por uma via intravenosa, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular. Em algumas formas de realização, a composição é administrada ao indivíduo por injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intraperitoneal, ou injeção intramuscular. Em algumas formas de realização, a composição é administrada parenteralmente ao indivíduo em uma dose de cerca de 1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em outras modalidades, a composição é administrada ao indivíduo em uma dose de cerca de 1 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, ou cerca de 50 mg/kg. Em algumas formas de realização, a composição é administrada em um regime de dosagem diária. Em algumas formas de realização, a administração parenteral da composição trata, impede e/ou inibe a progressão do dano à radiação interna.

[012] Em algumas formas de realização, a lesão por radiação é selecionada a partir do grupo que consiste em CRI, ARS, queimaduras de radiação, dermatite por radiação, dano por radiação ao sistema nervoso ou cérebro, pneumonite por radiação, enterite induzida por radiação e radiação interna. Em certas formas de realização, a lesão por radiação é CRI. Em certas modalidades, o dano à radiação é ARS. Em certas formas de realização, a lesão por radiação é uma lesão por radiação combinada. Assim, em algumas formas de realização, a lesão por radiação compreende dano por

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6/127 radiação em combinação com queimaduras, feridas, infecção ou trauma fechado. Em algumas formas de realização, o dano à radiação resulta da exposição a uma fonte de radiação selecionada do grupo que consiste em armas de destruição de massa (WMD), explosões nucleares e bombas sujas. Em algumas formas de realização, a lesão por radiação compreende dermatite por radiação, que é um tipo específico de dano por radiação resultante de regimes de radioterapia ou outros procedimentos médicos de intervenção. Em algumas formas de realização, o dano à radiação resulta da exposição ao sol, raios-x e outras máquinas diagnosticas, ou fontes de emissão de radiação ionizante, tais como leitos de bronzeamento. Em algumas formas de realização, os peptídeos providos aqui são providos em uma composição de protetor solar, bloqueador solar ou bronzeadores.

[013] Em algumas formas de realização, a lesão por radiação ocorre em um tecido selecionado do grupo consistindo em pele, coração, osso, cérebro, medula espinhal, córnea, retina, sistema hematopoiético, sistema gastrointestinal e nervo periférico. Em formas de realização particulares, a lesão por radiação ocorre sobre a pele. Em algumas formas de realização, a pontuação média da pele é diminuída em pelo menos cerca de 30% na presença do polipeptídeo em comparação com um controle. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo impede a formação de cicatriz. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo promove a regeneração do tecido. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo impede danos ao tecido.

[014] Em algumas formas de realização, o polipeptídeo alfa conexina compreende o carbóxi terminal-mais 4 a 30 aminoácidos contíguos de uma alfa conexina. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo consiste do terminal carbóxi-mais 5 a 19 aminoácidos contíguos da alfa conexina. Em algumas formas de realização, o alfa conexina é conexina 37, conexina 40, conexina 43, ou conexina 45. Em outras modalidades, o polipeptídeo

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7/127 compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ainda compreende uma sequência de intemalização celular. Em outras formas de realização, a sequência de intemalização celular compreende uma sequência de aminoácidos de uma proteína selecionada a partir de um grupo consistindo em Antenapedia, TAT, HIV-tat, penetratina, Antp-3 a (Antp Mutante), Buforin II, Transportan, MAP (peptídeo anfipático modelo), K-FGF, Ku70, Prion, pVEC, Pep-1, SynB 1, Pep-7, HN-1, BGSC (Bis-GuanidínioEspermidina-colesterol) e BGTC (Bis-guanidínio-Tren-Colesterol). Em algumas formas de realização, a sequência de intemalização celular é a Antenapedia, e em que a sequência compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada do gmpo consistindo em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12 em algumas modalidades, o polipeptídeo alfa conexina compreende uma biotina no N-terminal E/ou no C-terminal do polipeptídeo. Em algumas formas de realização, a composição compreende SEQ ID NO: 91.

[015] Em algumas modalidades, a composição é administrada topicamente. Em algumas formas de realização, a composição compreende ainda um gel de hidroxietilcelulose. Em outras modalidades, o gel de hidroxietilcelulose está presente em uma concentração de cerca de 0,25% (W/w), cerca de 0,5% (w/w), cerca de 0,75% (w/w), cerca de 1,00% (w/w), cerca de 1,25% (w/w), cerca de 1,5% (w/w) ou cerca de 2,0% (w/w). Em algumas formas de realização, a composição é administrada sistemicamente. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição é administrada por via parenteral. Em algumas formas de realização, a composição para administração sistêmica compreende ainda um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração sistêmica a um

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8/127 indivíduo. Em algumas formas de realização, a composição pode ser administrada tanto topicamente quanto sistemicamente a um indivíduo em necessidade do mesmo. Por exemplo, em algumas formas de realização, um sujeito exposto à lesão por radiação é administrado com uma composição fornecida aqui tanto topicamente quanto sistemicamente a fim de tratar, prevenir e/ou mitigar a progressão tanto de CRI quanto de ARS. Por exemplo, em algumas formas de realização, é administrado em um indivíduo uma composição que compreende um polipeptídeo fornecido aqui topicamente, e é administrada uma composição que compreende um polipeptídeo aqui sistemicamente. Em algumas formas de realização, as composições para administração tópica e sistêmica compreendem o mesmo polipeptídeo alfa conexina. Em algumas formas de realização, um sujeito exposto à lesão por radiação é administrado com uma composição fornecida aqui tanto topicamente quanto sistemicamente a fim de tratar, evitar e/ou mitigar a progressão da lesão combinada de radiação envolvendo CRI e/ou ARS em combinação com queimaduras, feridas, infecção ou trauma fechado.

[016] As vantagens adicionais do método e das composições apresentadas serão apresentadas em parte na descrição que se segue, e em parte será entendida a partir da descrição, ou pode ser aprendida pela prática do método e composições apresentados. As vantagens do método e das composições apresentadas serão realizadas e obtidas por meio dos elementos e combinações particularmente apontadas nas reivindicações anexas. Deve ser entendido que tanto a descrição geral precedente como a descrição detalhada a seguir são apenas exemplificativas e explicativas e não são restritivas da invenção conforme reivindicada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [017] Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem parte deste relatório descritivo, ilustram diversas modalidades do método e

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 147/280 /127 composições apresentadas e junto com a descrição, servem para explicar os princípios do método e composições apresentados.

[018] As figuras 1 A, IB e 1C mostram que a administração tópica do peptídeo ACT é eficaz na prevenção, mitigação e tratamento da lesão cutânea (CRI). Os porcos Yorkshire foram anestesiados e expostos a frações únicas de elétrons de baixa energia (6 MeV). Começando no Dia 1 e a cada 3 dias depois disso, os locais da pele foram classificados para eritema e descamação utilizando uma escala Kumar. O tratamento tópico com Granexin ® (100 μΜ ou 200 μΜ) ou veículo foi iniciado mediante observação de eritema (índice Kumar > 1,0). E foi aplicada uma vez por dia aos locais de exposição. A figura 1A mostra comparações médias de escore de pele com gel Granexin® (200 μΜ) tratamento e tratamento do veículo. A figura 1B mostra o efeito da aplicação do peptídeo ACT no aparecimento da lesão. O tratamento com gel Granexin ® (200 μΜ), indicado na fileira inferior, foi comparado com o tratamento do veículo (fileira superior) nos dias 1, 22, e 31. Figura 1C mostra Coloração de H&E de biópsias de pele de regiões irradiadas e controle nãoirradiados retirados do mesmo animal no dia 43 (Fim de estudo).

[019] A figura 2 mostra o efeito profilático do peptídeo ACT sobre a prevenção e a atenuação do CRI pós-exposição. Os locais irradiados foram profilaticamente (antes da apresentação de sintomas CRI) tratados com veículo ou Granexin® gel 1.000 μΜ (início do dia 1; isto é, o dia após a exposição à radiação) no mesmo regime de tratamento diário. As comparações fotográficas do dia 21 mostram que o tratamento profilático com gel Granexin ® a 1.000 μΜ impede a progressão da lesão e reduz a severidade da lesão em comparação com o veículo controle.

[020] A figura 3 ilustra o Fluxograma do processo de fabricação de um peptídeo ACT da presente invenção.

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10/127 [021] A figura 4 mostra que o polipeptídeo ACT1 reduz a mortalidade precoce em um modelo de irradiação de toxicidade GI. Camundongos C57BL/6 tratados diariamente com peptídeo administrado sistemicamente (10 mg/kg) mostraram sobrevivência aumentada em comparação com aqueles tratados com solução salina de controle.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [022] O método e as composições apresentados podem ser entendidos mais facilmente por referência à descrição detalhada a seguir de modalidades particulares e dos exemplos aqui incluídos e às figuras e suas descrições anteriores e a seguir.

[023] E apresentado um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos carbóxi-terminal de uma alfa conexina (também referida aqui como um alfa conexina carboxi-terminal (ACT) polipeptídeo), ou uma variante conservadora do mesmo. Em algumas formas de realização, as composições e métodos aqui providos estão relacionados a prevenir, tratar e/ou mitigar a progressão da lesão por radiação. Em algumas formas de realização, as composições e métodos aqui providos estão relacionados a prevenir, tratar e/ou mitigar a progressão da lesão cutânea (CRI). Em algumas formas de realização, as composições e métodos aqui estão relacionados a prevenir, tratar e/ou mitigar a progressão de síndrome de radiação aguda (ARS). Em algumas formas de realização, as composições e métodos aqui estão relacionados a prevenir, tratar e/ou mitigar a progressão de danos à radiação combinados.

[024] Surpreendentemente, os presentes inventores descobriram que as composições e métodos aqui providos são capazes de ação profilática em dano por radiação. Por exemplo, as composições e métodos aqui providos previnem lesões por CRI, ARS ou radiação combinada, e/ou mitigam a progressão da lesão após a exposição à radiação, mas antes da manifestação

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11/127 do sintoma. Assim, as composições e métodos fornecidos podem ser usados para evitar, tratar ou mitigar a progressão dos tipos particulares de danos por radiação causados por dispositivos de dispersão radiológica, dispositivos nucleares improvisados, armas nucleares, explosões de instalações de energia nuclear, e semelhantes, em populações de indivíduos que estão em alto risco de exposição a tais dispositivos, armas e explosões, e/ou em indivíduos que experimentaram recentemente tal exposição.

[025] Lesões por ARS, CRI e dano por radiação combinado são tipos particulares de danos por radiação que resultam, por exemplo, de um ataque de bomba suja ou uma explosão de usina de energia nuclear. Em algumas formas de realização, as composições e o método da presente invenção estão relacionados a prevenir, tratar e/ou mitigar a progressão de danos internos por radiação, bem como danos por radiação na pele e nos tecidos subjacentes. Em algumas formas de realização, as composições e métodos aqui são particularmente úteis para prevenir e/ou mitigar a progressão de CRI e/ou ARS e/ou dano por radiação combinado em populações de indivíduos que estão em alto risco de experimentar CRI e/ou ARS e/ou dano à radiação combinado.

[026] Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui são aplicadas topicamente a um indivíduo para tratar, prevenir e/ou mitigar a progressão de uma lesão à pele e tecidos subjacentes como resultado da exposição à radiação. Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui são administradas sistemicamente a um indivíduo para tratar, prevenir e/ou mitigar a progressão de lesões sistêmicas, tais como lesões a órgãos internos, que resulta da exposição à radiação. Em algumas formas de realização, o mesmo indivíduo é administrado a uma ou mais das composições fornecidas aqui tanto topicamente para tratar, prevenir, e/ou mitigar a progressão de danos à pele e tecidos subjacentes e

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12/127 sistemicamente para tratar, prevenir e/ou mitigar a progressão de danos internos (por exemplo, danos aos órgãos sistêmicos).

[027] Adicionalmente, a surpreendente ação profilática dos métodos e composições fornecidos é útil para prevenir, tratar e mitigar a progressão de danos por radiação que resulta do sol, das máquinas de diagnóstico e dos leitos de bronzeamento. Máquinas de diagnóstico que usam radiação ionizante incluem, por exemplo, máquinas de raios-x e scanners de tomografia computadorizada (CT). Em algumas formas de realização, os métodos e composições podem ser usados para prevenir, tratar ou mitigar a progressão de uma lesão por radiação resultante do sol, uma máquina de diagnóstico, ou um leito de bronzeamento, em populações de indivíduos que estão em alto risco de exposição a níveis de radiação ionizante do sol, máquina diagnostica, ou leito de bronzeamento, ou que experimentaram recentemente tal exposição. Assim, em algumas formas de realização, as composições e métodos aqui são aplicados a um indivíduo antes da exposição do indivíduo à máquina de diagnóstico, ao sol, ou leito de bronzeamento, e/ou são aplicados ao indivíduo após a exposição do indivíduo à máquina de diagnóstico, solar, ou de bronzeamento.

[028] Em algumas formas de realização, as composições aqui apresentadas estão sob a forma de um protetor solar ou um bloqueador solar, ou um produto que está disponível em uma instalação que forneça produtos de bronzeamento e/ou serviços de leito de bronzeamento (por exemplo, uma loção bronzeadadora, um acelerador de bronzeamento, ou um óleo de bronzeamento). Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos e composições para administração a um indivíduo antes do uso do paciente de um leito de bronzeamento ou antes da exposição do indivíduo ao sol, a fim de evitar, tratar ou mitigar a progressão da lesão por radiação que pode ser causada pelo uso ou exposição. Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos e composições para

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[029] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos e composições para administração em um indivíduo antes da exposição a uma máquina ou procedimento de diagnóstico que emite radiação ionizante, tal como uma varredura de raios-x ou de CT, em que os métodos e composições impedem, tratam ou aliviam a progressão da lesão por radiação que é causada por essa exposição. Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos e composições para administração em um indivíduo após a exposição a uma máquina diagnostica ou procedimento que emite radiação ionizante, em que os métodos e composições evitam, tratam ou aliviam a progressão da lesão por radiação que é causada por essa exposição.

[030] Além disso, a ação profilática surpreendente dos métodos e composições fornecidos é útil para prevenir, tratar e mitigar a progressão da dermatite por radiação. A dermatite por radiação resulta da terapia de radiação tal como uma terapia para o tratamento de doenças tais como o cancer. Assim, em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos e composições para administração em um indivíduo após a administração de uma terapia de radiação, a fim de evitar, tratar ou mitigar a progressão da lesão por radiação causada pela terapia de radiação. Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos e composições para administração em um indivíduo após a exposição a uma terapia de radiação, em que os métodos e composições evitam, tratam ou aliviam a progressão da lesão por radiação que é causada pela terapia de radiação. Em algumas formas de realização, os métodos e composições aqui fornecidos são administrados no indivíduo durante o tratamento com a terapia de radiação, em que os métodos e composições evitam, tratam ou

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14/127 aliviam a progressão da lesão por radiação que é causada pela terapia de radiação. Em algumas formas de realização, os métodos e composições aqui fornecidos são administrados no indivíduo antes, durante e/ou após a terapia de radiação, em que os métodos e composições evitam, tratam ou aliviam a progressão da lesão por radiação que é causada pela terapia de radiação.

[031] Deve ser entendido que as composições e métodos descritos não são limitados a métodos sintéticos específicos, técnicas analíticas específicas, ou a reagentes particulares a menos que especificado de outra forma, e, como tal, podem variar. Deve-se também entender que a terminologia usada aqui é para a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitativa. Os materiais, composições e componentes que podem ser usados, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados em preparação para, ou são produtos dos métodos e composições apresentados. Estes e outros materiais são aqui divulgados e entende-se que quando são descritas combinações, subconjuntos, interações, grupos, etc. destes materiais, embora a referência específica de cada uma das várias combinações individuais e coletivas e permutação destes compostos possa não ser explicitamente divulgada, cada um é especificamente contemplado e descrito aqui. Por exemplo, se um vetor é descrito e discutido e um número de componentes vetoriais incluindo os promotores é discutido, cada e toda combinação e permutação de promotores e outros componentes de vetor e as modificações que são possíveis são especificamente contempladas, a menos que especificamente indicadas ao contrário. Assim, se uma classe de moléculas A, B e C for revelada, bem como uma classe de moléculas D, E, e F, e um exemplo de uma molécula de combinação, A-D é apresentada, então mesmo se cada um não é individualmente citado, cada um é individualmente e coletivamente contemplado. Assim, neste exemplo, cada uma das combinações A-E, AF, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, e C-F são especificamente contemplados e

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15/127 devem ser considerados revelados a partir da descrição de A, B e C; D, E, e F; e a combinação exemplar A-D. Da mesma forma, qualquer subconjunto ou combinação destes é também especificamente contemplada e revelada. Assim, por exemplo, o sub-grupo de A-E, B-F e C-E é especificamente contemplado e deve ser considerado apresentado a partir da descrição de A, B e C; D, E, e F; e a combinação exemplar A-D este conceito se aplica a todos os aspectos desde pedido incluindo, mas não limitado a, etapas em métodos de produção e utilização das composições apresentadas. Assim, se houver uma variedade de etapas adicionais que podem ser realizadas, entende-se que cada uma destas etapas adicionais pode ser realizada com qualquer forma de realização específica ou combinação de modalidades dos métodos descritos, e que cada tal combinação é especificamente contemplada e deve ser considerada revelada.

[032] Uma variedade de sequências é fornecida aqui e estas e outras podem ser encontradas no Genbank em www.pubmed.gov. Aqueles versados na técnica sabem como resolver discrepâncias e diferenças de sequência e ajustar as composições e métodos relacionados a uma sequência particular a outras sequências relacionadas. Iniciadores e/ou sondas podem ser projetados para qualquer sequência dada a informação apresentada aqui e conhecida na técnica.

[033] O polipeptídeo aqui fornecido pode ser qualquer polipeptídeo compreendendo os aminoácidos mais terminais carbóxi de uma alfa conexina, em que o polipeptídeo não compreende a proteína alfa conexina de comprimento total. Assim, em um aspecto, o polipeptídeo fornecido não compreende o domínio N-terminal citoplásmico da alfa connexina. Em outro aspecto, o polipeptídeo fornecido não compreende os dois domínios extracelulares da alfa conexina. Em outro aspecto, o polipeptídeo fornecido não compreende os quatro domínios de transmembrana da alfa conexina. Em outro aspecto, o polipeptídeo fornecido não compreende o domínio de dobra

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16/127 citoplásmica da alfa conexina. Em outro aspecto, o polipéptido fornecido não compreende a parte da sequência do domínio do terminal carboxil citoplasmático da alfa Conexina próxima do quarto domínio transmembranar. Existe um resíduo de prolina ou glicina conservado em alfa Conexinas, consistentemente posicionados de 17 a 30 aminoácidos do aminoácido carboxi terminal-mais (tabela 2). Por exemplo, para o Cx43 humano, um resíduo prolina no aminoácido 363 é posicionado 19 aminoácidos de volta do terminal carboxila-mais isoleucina. Em outro exemplo, para ratos Cx43, um resíduo prolina no aminoácido 362 é posicionado 18 aminoácidos de volta do terminal carboxila-mais isoleucina. Em outro exemplo, para o resíduo de glicina Cx45 um resíduo de glicina no aminoácido 377 é posicionado 19 aminoácidos de volta a partir do terminal carboxila-mais isoleucina. Em outro exemplo para o rato Cx33, um resíduo prolina no aminoácido 258 é posicionado 28 aminoácidos de volta do terminal carboxila-mais metionina. Assim, em outro aspecto, o polipeptídeo fornecido não compreende aminoácidos proximais ao dito resíduo conservado prolina ou glicina da alfa Conexina. Assim, o polipeptídeo fornecido pode compreender os aminoácidos c-terminais-mais de 4 a 30 aminoácidos da alfa Conexina, incluindo o c-terminal-mais 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 aminoácidos da alfa Conexina.

[034] Os aminoácidos carboxi-terminais-mais de uma alfa conexina nos peptídeos apresentados podem ser flanqueados por Aminoácidos nãoalfa conexina ou não-ACT Conexina amino ácidos. Exemplos dos aminoácidos de flanqueamento não-alfa conexina e não-ACT São fornecidos aqui. Um exemplo de aminoácidos não-ACT conexina são os aminoácidos carbóxi-terminais 20 a 120 de Cx43 humano (SEQ ID NO: 72). Um outro exemplo seria o carbóxi-terminal 20 a 120 aminoácidos de pinto Cx43 (SEQ ID NO: 73). Um outro exemplo seria o carbóxi-terminal 20 a 120

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 155/280 / 127 aminoácidos de Cx45 humano (SEQ ID NO: 74). Um outro exemplo seria o carbóxi-terminal 20 a 120 aminoácidos de pinto Cx45 (SEQ ID NO: 75). Um outro exemplo seria o carbóxi-terminal 20 a 120 aminoácidos de Cx37 humano (SEQ ID NO: 76). Um outro exemplo seria o carbóxi-terminal 20 a 120 aminoácidos de rato Cx33 (SEQ ID NO: 77).

[035] Um exemplo de um não-alfa Conexina é a sequência de 239 aminoácidos de proteína fluorescente verde melhorada. Em outro aspecto, é mostrado que ACT1 é funcional quando fundido ao terminal carbóxi da sequência de 239 aminoácidos da GFP, peptídeos ACT são esperados de reter função quando flanqueados com polipéptidos não conexina de até pelo menos 239 aminoácidos. De fato, contanto que a sequência ACT seja mantida como o terminal carbóxi livre de um dado polipeptídeo, e o peptídeo ACT é capaz de acessar seus alvos. Assim, polipeptídeos que excedem 239 aminoácidos além do peptídeo ACT podem funcionar na redução da inflamação, promoção de cicatrização, aumento da resistência à tração, redução da cicatrização e promoção da regeneração do tecido após danos.

[036] Conexinas são a sub-unidade da proteína do canal de junção de lacuna, que é responsável pela comunicação Intercelular (Goodenough e Paul, 2003). Com base em padrões de conservação de sequência de nucleotídeos, os genes que codificam proteínas Connexina são divididos em duas famílias denominadas genes alfa e beta Conexina. As sequências de aminoácidos mais terminais carbóxi-terminais de alfa Connexinas são caracterizadas por múltiplas características distintas e conservadas (ver tabela 2). Esta conservação de organização é consistente com a capacidade de péptidos ACT para formar estruturas 3D distintas, interagir com múltiplas proteínas parceiras, mediar interações com lipídeos e membranas, interagir com ácidos nucleicos incluindo DNA, transitar ou bloquear canais de membrana e fornecer motivos de consenso para a clivagem proteolítica, reticulação de proteína, ADP-ribosilação, glicosilação e fosforilação.

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Assim, o polipeptídeo fornecido interage com um domínio de uma proteína que normalmente media a ligação da referida proteína ao carbóxi-término de uma alfa Conexina. Por exemplo, proteína superexpressa nefroblastoma (NOV) interage com um domínio c-terminal Cx43 (Fu et al, J Biol. Chem. 2004 279 (35): 36943 -50). Considera-se que estas e outras proteínas interagem com o carbóxi-término de alfa Conexinas e interagem ainda com outras proteínas que formam um complexo macromolecular. Assim, o polipeptídeo fornecido pode inibir a operação de uma máquina molecular, tal como, por exemplo, um envolvimento na regulação da agregação de canais de junção de intervalo Cx43.

[037] Como usado aqui, inibição significa diminuir uma atividade, resposta, condição, doença ou outro parâmetro biológico. Isto pode incluir, mas não é limitado a: perda completa de atividade, resposta, condição ou doença. Isto também pode incluir, por exemplo, uma redução de 10% na atividade, resposta, condição ou doença em comparação com o nível nativo ou de controle. Assim, a redução pode ser de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% ou qualquer quantidade de redução entre em comparação com os níveis nativos ou de controle.

[038] A sequência ACT do polipeptídeo fornecido pode ser a Partir de qualquer alfa conexina. Assim, o componente alfa Conexina do polipeptídeo fornecido pode ser de um ser humano, murino, bovino, monotreno, marsupial, primata, roedor, cetaceano, mamífero, aviário, réptiano, anfíbio, piesina, cóide, protocóide ou outro alfa Conexinas.

[039] Assim, o polipeptídeo fornecido pode compreender um ACT de um Conexina selecionado do grupo consistindo em Conexina 47, Conexina 47 humana, Conexina 46.6 humana, Conexina 46.6 de vaca, Conexina 30.2 de camundongo, Conexina 30.2 de rato, Conexina 31.9 humana, Conexina 31.9 de cachorro, Conexina 44 de ovelha, Conexina de vaca, Conexina 33 de rato, Conexina 33 de camundongo, Conexina 36 humana, Conexina 36 de

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19/127 camundongo, Conexina 36 de rato, Conexina 36 de cachorro, Conexina 36 de pinto. Conexina 36 de peixe-zebra, Conexina 35 de Morone, Conexina 35 de Cynops, Conexina 36 de Tetraodon, Conexina 37 humana, Conexina de chipanzé, Conexina 37 de cachorro, Conexina 37 de cricetulus, Conexina 37 de camundongo, Conexina 37 de mesocricetus, Conexina 37 de rato, Conexina 39 de camundongo, Conexina 39 de rato, Conexina humana 40.1, Conexina 38 de Xenopus, Conexina 39.9 de peixe-zebra, Conexina 40 humana, Conexina 40 de chipanzé, Conexina 40 de cachorro, Conexina 40 de vaca, Conexina 40 camundongo, Conexina 40 de rato, Conexina 40 de Cricetulus, Conexina 40 de pinto, Conexina 43 humana, Conexina 43 de Cercopithecus, Conexina 43 de Oryctolagus, Conexona 43 de Spermophilus, Conexina 43 de Cricetulus, Conexina 43 de Phodopus, Conexina 43 de rato, Conexina 43 de Sus, Conexina 43 de Mesocricetus, Conexina 43 de camundongo, conexina 43 de Cavia, Conexina 43 de vaca, Conexina 43 de Erinaceus, conexina 43 de pinto, conexina 43 de Xenopus, conexina 43 de Oryctolagus, conexina 43 de Cyprinus, conexina 43 de peixe-zebra, conexina 43 de Danio aequipinnatus, conexina 43.4 de peixe-zebra, Danio aequipinnatus 44.2 de peixe-zebra, conexina 44.1 de peixe-zebra, conexina humana 45, conexina 45 d ecachorro, conexina 45 de chipanzé, Conexina 45 de camundongo, Conexina 45 de vaca, Conexina 45 de rato, Conexina 45 de pinto, Conexina 45 de Tetraodon, Conexina 46 humana, Conexina 46 de chipanzé, Conexina 46 de camundongo, Conexina 46 de cachorro, Conexina 46 de rato, conexina 46 de Mesocricetus, conexina 46 de cricetulus, conexina 56 de pinto, conexina 39.9 de peixe-zebra, conexina 49 de vaca, conexina 50 humana, conexina 50 de chipanzé, conexina 50 de rato, conexina 50 de amundongo, conexina 50 de cachorro, conexina 49 de ovelha, conxina 50 de Mesocricetus, conexina 50 de cricetulus, conexina 50 de pinto, conexina 59 humana, ou outra alfa conexina. As sequências de aminoácidos para alfa

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 158/280 / 127 conexinas são conhecidas na técnica e incluem aquelas identificadas na Tabela 1 pelo número de acesso.

Tabela 1: Alfa Conexinas

Proteína	N° de Acesso	Proteína	N° de Acesso
Conexina 47 de camundongo	NP_536702	Conexina 43 de Phodopus	AAR33085
Conexina 47 humana	AAH89439	Conexina 43 de rato	AAH81842
Conexina 46.6 humana	AAB94511	Conexina 43 de Sus	AAR33087
Conexina 46.6 de vaca	XP_5 82393	Conexina 43 de Mesocricetus	AAO61857
Conexina 30.2 de camundongo	NP_848711	Conexina 43 de Camundongo	AAH55375
Conexina 30.2 de rato	XP_343966	Conexina 43 de cavia	AAU06305
Conexina 31.9 humana	AAM188O1	Conexina 43 de vaca	NP_776493
Conexina 31.9 de cachorro	XP_548134	Conexina 43 de Erinaceus	AAR33083
Conexina 44 de ovelha	AAD56220	Conexina 43 de pinto	AAA53027
Conexina 44 de vaca	146053	Conexina 43 de Xenopus	NP_988856
Conexina 33 de rato	P28233	Conexina 43 de Oryctolagus	AAS 89649
Conexina 33 de camundongo	AAR28037	Conexina 43 de Cyprinus	AAG17938
Conexina 36 de humano	Q9UKL4	Connexin 43 de peixe-zebra	CAH69066
Conexina 36 de camundongo	NP_034420	Conexina 43 de Danio aequipinnatus	AAC19098
Conexina 36 de rato	NP_062154	Conexina 43.4 de peixe-zebra	NP_571144
Conexina 36 de cachorro	XP 544602	Conexina 44.2 de peixe-zebra	AAH45279
Conexina 36 de pinto	NP_989913	Conexina 44.1 de peixe-zebra	NP_571884
Conexina 36 de peixe-zebra	NP_919401	Conexina 45 humana	138430
Conexina 35 de morone	AAC31884	Conexina 45 de chipanzé	XP_511557
Conexina 35 de morone	AAC31885	Conexina 45 de cachorro	XP_548059
Conexina 35 de Cynops	BAC22077	Conexina 45 de camundongo	AAH71230
Conexina 36 de Tetraodon	CAG06428	Conexina 45 de vaca	XP_588395
Conexina 37 humana	155593	Conexina 45 de rato	AAN17802
Conexina 37 de chipanzé	XP_524658	Conexina 45 de pinto	NP_990834
Conexina 37 de cachorro	XP_539602	Conexina 45 Tetraodon	CAF93782
Conexina 37 de Cricetulus	AAR98615	Conexina 45.6 de pinto	150219
Conexina 37 de camundongo	AAH56613	Conexina 46 humana	NP_068773
Conexina 37 de Mesocricetus	AAS83433	Conexina 46 de chipanzé	XP_522616

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Conexina 37 de rato	AAH86576	Conexina 46 de camundongo	NP_058671
Conexina 39 de camundongo	NP_694726	Conexina 46 de cachorro	XP_543178
Conexina 39 de rato	AAN17801	Conexina 46 de rato	NP_077352
Conexina 40.1 humana	NP_699199	Conexina 46 de Mesocricetus	AAS83437
Conexina 38 de Xenopus	AAH73347	Conexina 46 de Cricetulus	AAS77618
Conexina 39.9 de peixe zebra	NP997991	Conexina 46 de pinto	A45338
Conexina 40 humana	NP_859054	Conexina 39.9 de peixe-zebra	NP997991
Conexina 40 de chipanzé	XP_513754	Conexina 49 de vaca	XP_602360
Conexina 40 de cachorro	XP_540273	Conexina 50 humana	P48165
Conexina 40 de vaca	XP_5 87676	Conexina 4650 de chipanzé	XP_524857
Conexina 40 de camundongo	AAH53054	Conexina 50 de rato	NP_703195
Conexina 40 de rato	AAH70935	Conexina 50 de camundongo	AAG59880
Conexina 40 de Cricetulus	AAP37454	Conexina 50 de cachorro	XP_540274
Conexina 40 de pinto	NP_990835	Conexina 49 de ovelha	AAF01367
Conexina 43 humana	P17302	Conexina 50 de Mesocricetus	AAS83438
Conexina 43 de Cercophitecus	AAR33082	Conexina 50 de Cricetulus	AAR98618
Conexina 43 de Oryctolagus	AAR33084	Conexina 50 de pinto	BAAO5381
Conexina 43 de Spermophilus	AAR33086	Conexina 59 humana	AAG09406
Conexina 43 de cricetulus	AAO61858

[040] Assim, o polipeptídeo fornecido pode compreender a Sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 ou SEQ ID NO: 91 ou variantes conservativas ou seus fragmentos.

[041] A sequência de aminoácidos 20-30 carbóxi-terminal de alfa Conexinas é caracterizada por uma organização distinta e conservada. Esta organização distinta e conservada incluiría um motivo de ligação de PDZ do tipo II (phi-x-phi; em que x = qualquer aminoácido e phi = um aminoácido

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Hidrofóbico; por exemplo, Tabela 2, BOLD) e proximal a este motivo, Prolina (P) e/ou glicina (G) resíduos de articulação; resíduos de fosfo-Serina (S) e/ou Fosfo-treonina (T) de alta frequência; e uma Alta Frequência de arginina positivamente carregada (R), Lisina (k) e ácido aspártico negativamente carregado (D) ou aminoácidos de ácido glutâmico (E). Para muitas alfa Conexinas, os Resíduos de P e G ocorrem em motivos agrupados (por exemplo, tabela 2, itálico) próximo ao motivo de ligação de PDZ do tipo II de carbóxi-terminal. Os aminoácidos S e T da maioria das alfa Conexinas também são tipicamente organizados em motivos semelhantes a repetição agrupados (por exemplo, tabela 2, sublinhado). Esta organização é particularmente o caso para Cx43, onde 90% de 20 aminoácidos mais terminais carboxila são compreendidos dos últimos sete aminoácidos. Em um exemplo adicional da alta conservação da sequência, a organização de peptídeos ACT de Cx43 é altamente conservada de seres humanos a peixes (por exemplo, comparar as Sequências Cx43 ACT para os seres humanos e peixe-zebra na Tabela 2). Em outro exemplo, a organização de peptídeos ACT de Cx45 é altamente conservada de seres humanos a pássaros (por exemplo, comparação de sequências Cx45 ACT para humanos e pintos na Tabela 2). Em um outro exemplo, a organização de peptídeo ACT de Cx36 é altamente conservada de primatas a peixea (por exemplo, comparar As Sequências Cx36 ACT para chimpanzé e peixe-zebra na Tabela 2).

Tabela 2:

Sequências de aminoácidos Alfa Connexin Carbóxi-Terminais (ACT)

Gene	Sequência	SEQ ID NO
Alfa Cx43 humana	P SSRA SSR PRP D DLEI	(SEQ ID NO:1)
Alfa Cx43 de pinto	P S RA SSRA SSR PRP D DLEI	(SEQ ID NO:29)
Alfa Cx43 de peixezebra	P CSRA SSRM SSRA R P D DLDV	(SEQ ID NO:90)
alfa Cx45 humana	G SNKS TA SSKS GDG KN SVWI	(SEQ ID NO:30)
alpha Cx45 de pinto	G SNKSS A SSKS GDG KN SVWI	(SEQIDNO:31)

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alpha Cx46 humana	G RA SKAS RASS GRARP E DLAI	(SEQ ID NO:32)
alpha Cx46.6 humana	G SASS RD G K TVWI	(SEQ ID NO:33)
alfa Cx36 de chipanzé	P RVSV PNFG R TQ SSD SAYV	(SEQ ID NO:34)
alfa Cx36 de pinto	P RMSM PNFG R TQ SSD SAYV	(SEQ ID NO:35)
alfa Cx36 de peixe zebra	P RMSM PNFG R TQ SSD S AYV	(SEQ ID NO:90)
alfa Cx47 humana	P RAGSEK G SASS R DG ΚΤ TVWI	(SEQ ID NO:36)
alfa Cx40 humana	G HRL PHG YHSDKRRL SKASS KARSD DLSV	(SEQ ID NO:37)
alfa Cx50 humana	P ELTTDDAR P LSRL SKASS RARSD DLTV	(SEQ ID NO:38)
alfa Cx59 humana	P NHVV SLTN NLI GRRVP t dlqi	(SEQ ID NO:39)
alfa Cx33 de rato	P S CV SSS A VLTTIC ss DQVV pvg l ss FYM	(SEQ ID NO:40)
alfa Cx44 de ovelha	G R SSKA SKSS GG RARAA DLAI	(SEQ ID NO:41)
beta Cx26 humana	LC YLLIR YCSGK SKKPV	(SEQ ID NO:42)

[042] Assim, em um aspecto, o polipeptídeo fornecido compreende um, dois, três ou todos os motivos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em 1) um motivo de ligação de PDZ do tipo II, 2) Prolina (P) e/ou resíduos de articulação de glicina (G); 3) grupos de resíduos de fosfoSerina (S) e/ou fosfo-treonina (T); e 4) uma alta frequência de arginina positivamente carregada (R) e Lisina (k) e ácido aspártico negativamente carregado (D) e/ou ácido glutâmico (E) aminoácidos). Em outro aspecto, o polipeptídeo fornecido compreende um motivo de ligação de PDZ do tipo II No carboxi-terminal, Prolina (P) e/ou Resíduos de articulação de Glicina (G) próximo ao motivo de ligação de PDZ, e resíduos carregados positivamente (K. R.D.S.E) próximo aos resíduos de articulação.

[043] Domínios PDZ foram originalmente identificados como elementos de sequência conservadas dentro da proteína de Densidade póssináptica PSD95/SAP90, o supressor de tumor de Drosophila Dlg-a, e a

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 162/280 / 127 proteína de junção apertada ZO -1. Embora Originalmente referida como motivos GLGF Ou DHR, são agora conhecidos por um acrônimo representando estas primeiras três proteínas contendo PDZ (PSD95/DLG/ZO-1). Estas sequências de 80 -90 aminoácidos foram agora identificadas bem sobre 75 proteínas e são caracteristicamente expressas em cópias múltiplas dentro de uma única proteína. Assim, em um aspecto, o polipeptídeo fornecido pode inibir a ligação de uma alfa Co nexina a uma proteína que compreende um domínio PDZ. O domínio PDZ é um tipo específico de módulo de interação proteína que tem um bolsão de interação estruturalmente bem definido que pode ser preenchido por um motivo de ligação de PDZ, referido aqui como um Motivo PDZ Motivos PDZ são sequências de consenso que são normalmente, mas nem sempre, localizadas no terminal carboxila intracelular extremo. Quatro tipos de motivos PDZ foram classificados: tipo I (S/T-x-phi), tipo II (phi-x-phi), tipo III (psi-x-phi ) e tipo IV (DXJV), onde x é qualquer aminoácido, phi é um resíduo hidrofóbico (V. I.L.L.A.G.W.C.M.FJ e psi é um resíduo hidrofílico básico (H.R.R.KQK). (Songyang, Z, et al 1997. science 275, 73 -77). Assim, em um aspecto, o polipeptídeo fornecido compreende um motivo de ligação de PDZ do tipo II.

[044] Observa-se que a sequência de aminoácidos da maioria do terminal de 18 carbóxi de alfa Cx37 representa uma variação excepcional no tema de peptídeo ACT. A Sequência similar a Cx37 ACT é GQKPPSRPSSSASKKQ * YV (SEQ ID NO: 43). Assim, os aminoácidos carbóxi terminais de Cx37 se conformam apenas em parte a um domínio de ligação de PDZ do tipo II. Ao invés de um domínio de ligação de PDZ do tipo II Clássico, Cx37 tem uma posição Neutra Q * na posição 2 onde um aminoácido hidrofóbico seria esperado. Como tal Cx37 compreende o que pode ser chamado de uma Sequência tipo domínio de ligação de PDZ do tipo

II. Não obstante, Cx37 mantém estritamente todos os outros aspectos da

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Organização de peptídeos ACT incluindo resíduos de serina agrupados, resíduos R e K frequentes e uma Sequência rica em P próximo à sequência semelhante a domínio de ligação de PDZ. Dado este nível global de conservação de organização semelhante a ACT, em comum com as outras > 70 alfa Conexinas listadas acima, é entendido que o Terminal Carbóxi Cx37 ACT funciona na capacidade fornecida.

[045] Para comparação, o beta Conexina Cx26 é mostrado na Tabela

2. Cx26 não tem nenhum motivo de ligação de PDZ do tipo II do terminal carboxila; menos do que 30% dos aminoácidos da maioria dos terminais carboxila compreendem resíduos s, t, r, d ou e; não tem evidência de motivos próximo a um motivo de ligação de PDZ do tipo II ou um motivo similar à ligação de PDZ contendo agrupamentos de resíduos de articulação de P e G; e nenhuma evidência de motivos semelhantes a repetições de serina e treonina fosfo-aminoácidos. Cx26 tem três resíduos de lisina (k), agrupados um após o outro próximo ao carbóxi término da sequência. No entanto, não foi verificado que nenhuma alfa conexina desenvolvida em >70 alpha conexinas listadas acima exibe este aspecto de três resíduos de resíduos K repetidos no término carbóxi (Cx26 é uma beta connexina, assim por definição não tem um domínio ACT).

[046] Como fornecido aqui, as características funcionais únicas deste estiramento relativamente curto de aminoácidos englobam papéis inesperados na redução da inflamação, promovendo a cicatrização, redução da cicatrização, aumento da resistência à tração, e promoção da regeneração da estrutura de tecido complexa e função seguindo danos nos tecidos diversos, tanto pele, quanto cérebro. Assim, em um aspecto, o polipeptídeo fornecido compreende um motivo de ligação de PDZ do tipo II (phi-x-phi; em que x = qualquer aminoácido e phi = um aminoácido hidrofóbico). Em outro aspecto, mais do que 50%, 60%, 70%, 80%, 90% dos aminoácidos do polipeptídeo ACT fornecido compreendem um ou mais de Prolina (P),

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Glicina (G), Fosfo-serina (S), fosfo-treonina (T), Arginina (R), Lisina (k), ácido aspártico (D), ou resíduos de aminoácido ácido glutâmico (E).

[047] Os aminoácidos prolina (P), glicina (G), Arginina (R), Lisina (k), ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E) são determinantes necessários da estrutura e função da proteína. Resíduos prolina e glicina proporcionam voltas apertadas na estrutura 3D de proteínas, possibilitando a geração de conformações de dobras do polipeptídeo requerido para função. As sequências de aminoácidos carregadas são frequentemente localizadas na superfície das proteínas dobradas e são necessárias para as interações químicas mediadas pelo polipeptídeo incluindo as interações proteínaproteína, interações proteína-lipídio, interações enzima-substrato e interações proteína-ácido nucleico. Assim, em outro aspecto Prolina (P) e Glicina (G) lisina (k), ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E), regiões ricas próximas ao motivo de ligação PDZ do tipo II, proporcionam propriedades necessárias para as ações providas de peptídeos ACT. Em outro aspecto, o polipeptídeo fornecido compreende Ácido Prolina (P) e Glicina (G), ácido aspártico (D) e/ou Ácido glutâmico (E) próximo ao motivo de ligação de PDZ do tipo II.

[048] A fosforilação é a modificação pós-traducional mais comum das proteínas e é crucial para a modulação ou a modificação da estrutura e função da proteína. Aspectos de estrutura de proteína e função modificada por fosforilação incluem conformação de proteína, interações proteína-proteína, interações proteína-lipídio, interações proteína-ácido nucleico, bloqueio de canal, tráfego de proteína e renovação de proteína. Assim, em um aspecto, as sequências ricas em fosfo-Serina (S) e/ou Fosfo-treonina (T) são necessárias para modificar a função de péptidos ACT, aumento ou redução da eficácia dos polipéptidos em suas ações providas. Em outro aspecto, o polipeptídeo fornecido compreende sequências ou motivos ricos em Serina (S) e/ou Fosfo-treonina (T).

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 165/280 / 127 [049] Em um outro exemplo, com relação à definição de um peptídeo ACT, é altamente ausculante, à luz do alto grau de potencial de regeneração de tecido/órgão em animais inferiores, tais como peixe, em que uma metionina ocorre próximo ao término amino da sequência ACT de peixezebra Cx43 (tabela 2). Em adição à codificação de metionina, o tripleto de par de base de metionina é um local de início de tradução alternativo. Se a tradução iniciada a partir desta metionina, a sequência SSRARPDDLDV (SEQ ID NO: 89) seria produzida. Este produto de tradução mantém todos os aspectos conservados e distintivos de um peptídeo ACT Canônico. Especificamente, este peptídeo compreende um domínio de ligação de PDZ do tipo II Carbóxi terminal e tem um domínio enriquecido em resíduos P, R e D, próximo ao domínio de ligação de PDZ. Além disso, a sequência compreende um motivo S agrupado, com potencial para modular a função de peptídeos ACT em seu terminal amino. Isto aumenta a perspectiva interessante que os animais com alto potencial de regeneração de tecido/órgão, tais como peixes, podem traduzir sequências de peptídeos ACT diretamente.

[050] Assim, o polipeptídeo fornecido pode compreender a sequência c-terminal de Cx43 humano. Assim, o polipeptídeo fornecido pode compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO : 2. O polipeptídeo pode compreender 9 aminoácidos do carbóxi términal do Cx40 humano. Assim, o polipeptídeo pode compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

[051] Quando proteínas específicas são referidas aqui, variantes, derivados e fragmentos são contemplados. Variantes e derivados de proteína são bem entendidos por aqueles versados na técnica e podem envolver modificações de sequência de aminoácidos. Por exemplo, modificações de sequência de aminoácidos tipicamente caem em uma ou mais das três classes: variantes substitutas, insercionais ou delecionais. Inserções incluem

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 166/280 / 127 fusões terminais amino e/ou carboxila bem como inserções intrasequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. As inserções serão usualmente menores inserções do que aquelas das fusões terminais amino ou carboxila, por exemplo, da ordem de um a quatro resíduos. As eliminações são caracterizadas pela remoção de um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de proteínas. Estas variantes são normalmente preparadas por mutagênese específica local de nucleotídeos no DNA que codifica a proteína, desse modo produzindo DNA que codifica a variante e, depois disso, expressar o DNA em cultura celular recombinante. Técnicas para fazer mutações de substituição em locais predeterminados em DNA tendo uma sequência conhecida são bem conhecidas e incluem, por exemplo, mutagênese de iniciador Ml3 e Mutagênese de PCR. As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos únicos, mas podem ocorrer em vários locais diferentes de uma vez; as inserções usualmente serão da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácidos. Eliminações ou inserções preferencialmente são feitas em pares adjacentes, isto é, uma deleção de 2 resíduos ou inserção de 2 resíduos. Substituições, eliminações, inserções ou qualquer combinação das mesmas podem ser combinadas para chegar a uma construção final. As mutações não devem colocar a sequência para fora da estrutura de leitura e, de preferência, não irão criar regiões complementares que poderíam produzir uma estrutura secundária de mRNA, a menos que tal mudança na estrutura secundária do mRNA seja desejada. As variantes substitutas são aquelas em que pelo menos um resíduo foi removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar. Tais substituições são geralmente feitas de acordo com a Seguinte Tabela 3 e são referidas como substituições conservadoras.

Tabela 3: Substituições de Aminoácidos

Resíduo Original	Exemplos de Substituições
Ala	Ser

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Arg	Lys
Asn	Gin
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Gin
Ile	Leu; Vai
Leu	Ile; Vai
Lys	Arg;Gin
Met	Leu; Ile
Phe	Met; Leu; Tyr
Pro	Gly
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Vai	Ile; Leu

[052] Por exemplo, a substituição de um resíduo de aminoácido com outro que é biologicamente e/ou quimicamente similar é conhecida por aqueles versados na técnica como uma substituição conservativa. Por exemplo, uma substituição conservativa podería substituir um resíduo hidrofóbico para outro, ou um resíduo polar para outro. As substituições incluem combinações mostradas na Tabela 3. Variações Conservativamente substituídas de cada sequência explicitamente descrita estão incluídas dentro dos polipeptídeos fornecidos aqui.

[053] Tipicamente, as substituições conservadoras têm pouco ou nenhum impacto sobre a atividade biológica de um polipeptídeo resultante. Em um exemplo específico, uma substituição conservativa é uma substituição de aminoácidos em um peptídeo que não afeta substancialmente a função biológica do peptídeo. Um peptídeo pode incluir uma ou mais

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30/127 substituições de aminoácidos, por exemplo, 2-10 substituições conservadoras, 2-5 substituições conservadoras, 4-9 substituições conservadoras, tais como 2, 5 ou 10 substituições conservadoras.

[054] O polipeptídeo pode ser produzido para conter uma ou mais substituições conservadoras manipulando a sequência de nucleotídeos que codifica aquele polipeptídeo usando, por exemplo, procedimentos padrões tais como mutagênese direcionada ao local ou PCR. Altemativamente, um polipeptídeo pode ser produzido para conter uma ou mais substituições conservadoras usando métodos de síntese de peptídeo padrão. Uma varredura de alanina pode ser usada para identificar quais resíduos de aminoácidos em uma proteína podem tolerar uma substituição de aminoácidos. Em um exemplo, a atividade biológica da proteína não é diminuída em mais do que 25%, por exemplo não mais do que 20%, por exemplo não mais do que 10%, quando uma alanina, ou outro aminoácido conservador (tal como aqueles listados abaixo), é substituída por um ou mais aminoácidos nativos.

[055] Informações adicionais sobre substituições conservadoras pode ser encontrada em, entre outras localizações, Em Ben-Bassat e Outros, (J Bacterial. 169: 751 -7, 1987), O’Regan e outros, {Gene ΊΤ. 237 -51, 1989), Sahin-Toth e outros, (Protein Sei 3: 240 -7, 1994), Hochuli et al., (Bio/Technology 6: 1321 -5, 1988) e em livros-textos padrão de genética e biologia molecular.

[056] Mutagênese substituta ou delecional pode ser empregada para inserir locais para N-glicosilação (Asn-X-Thr/Ser) ou O-glicosilação (Ser ou Thr). Eliminações de cisteína ou outros resíduos lábeis também podem ser desejáveis. Eliminações ou substituições de locais de proteólise potenciais, por exemplo, Arg, é realizado, por exemplo, por deleção de um dos resíduos básicos ou substituição de resíduos de glutaminil ou histdilo.

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31/127 [057] As derivações pós-traducionais são o resultado da ação de células hospedeiras recombinantes no polipeptídeo expresso. Resíduos de glutaminil e asparaginil são frequentemente pós-translacionalmente desamidados para os resíduos glutamil e asparilo correspondentes. Altemativamente, estes resíduos são desamidados sob condições moderadamente ácidas. Outras modificações pós-traducionais incluem a hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serilo ou treonila, metilação dos grupos o-amino de lisina, arginina, E cadeias laterais de histidina (T E Creigton, Proteínas: Estrutura e Propriedades Moleculares, W H Freeman & am; Co, San Francisco pp 79 86 [ 1983 ]), a acetilação da amina N-terminal e, em alguns casos, a amidação da carboxila C-terminal.

[058] E compreendido que há numerosos análogos de aminoácidos e peptídeos que podem ser incorporados nas composições apresentadas. Por exemplo, existem numerosos aminoácidos D ou aminoácidos que têm um substituinte funcional diferente dos aminoácidos mostrados na Tabela 3. São descritos estereoisômeros opostos de peptídeos de ocorrência natural, assim como os estereoisômeros de análogos peptídicos. Estes aminoácidos podem ser facilmente incorporados em cadeias de polipeptídeo carregando moléculas de tRNA com o aminoácido de escolha e construções genéticas de engenharia que utilizam, por exemplo, códons de âmbar, para inserir o aminoácido analógico em uma cadeia de peptídeos em um modo específico local (Thorson e outros, Methods in Molec. Biol. 77 : 43 -73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3: 348 -354 (1992); Isba, Biotechnology & am; Genetic engineering Reviews 13: 197 -216 (1995), Cahill et Al, TIBS, 14 (10): 400 -403 (1989); Benner, TIB Tech, 12: 158 -163 (1994); Ibba E hnecke, Bio/technology, 12: 678 -682 (1994), todos os quais são aqui incorporados por referência pelo menos para material relacionado a análogos de aminoácidos).

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 170/280 / 127 [059] Moléculas podem ser produzidas de forma que se assemelhem a polipeptídeos, mas que não são conectadas via uma ligação peptídica natural. Por exemplo, ligações para aminoácidos ou análogos de aminoácidos podem incluir CH2NH-,-CH2S-, -CH2-,-CH = CH-(cis e trans ),-COCH2-,-CH (OH) CH2-, e-CHH2SO-(estes E outros podem ser encontrados em Spatola, a F in Chemistry and Biochemistry of amino acids, Peptides, and Proteins, b Weinstin, eds., Mareei Dekker, New York, p 267 (1983); Spatola, A F, Vega Data (março de 1983), Vol 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review ); Morley, Trends Pharm Sei (1980) pp. 463 -468; Hudson, D e outros, Int J Pept Prot Res 14: 177 -185 (1979) (-CH2NH-, CH2CH2- ); Spatcola Et al Life Sei 38: 1243 -1249 (1986) (-CH H2-s); Hann J Chem soe. Perkin trans. I 307 -314 (1982) (-CH-, cis e trans); Almquist Et Al J Med. Chem. 23: 1392 -1398 (1980) (COCH2-); Jennings-White e Outros Tetrahedron Lett 23: 2533 (1982) (COCH2-); Szelke et al. European apply, EP 45665 CA (1982): 97: 39405 (1982) (-CH (OH) CH2-); Holladay e outros, Tetrahedron. Lett 24: 4401 46404 (1983) (-C (OH) CH2-); e Hruby Life Sei 31: 189 -199 (1982) (-CH2S-); cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Entende-se que os análogos peptídicos podem ter mais de um átomo entre os átomos de ligação, tais como b-alanina, ácido g-aminobutírico e semelhantes.

[060] Análogos de aminoácidos e análogos peptídicos frequentemente têm propriedades melhoradas ou desejáveis, tais como produção mais econômica, estabilidade química maior, propriedades farmacológicas melhoradas (meia vida, absorção, potência, eficácia, etc.), especificidade alterada (por exemplo, um amplo espectro de atividades biológicas), antigenicidade reduzida, maior capacidade de cruzar barreiras biológicas (por exemplo, intestino, vasos sanguíneos, barreira hematoencefálica) e outras.

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 171/280 / 127 [061] Os D-aminoácidos podem ser usados para gerar peptídeos mais estáveis, porque os aminoácidos D não são reconhecidos por peptidases e afins. Substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar de L-lisina) podem ser usados para gerar peptídeos mais estáveis. Os resíduos de cisteína podem ser usados para ciclizar ou fixar dois ou mais peptídeos juntos. Isto pode ser benéfico para restringir peptídeos em conformações particulares. Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biochem 61 : 387 (1992) incorporado aqui por referência).

[062] Assim, o polipeptídeo fornecido pode compreender uma variante conservadora do c-terminal de uma alfa Connexina (ACT). Como mostrado na Tabela 4, é dado um exemplo de uma única substituição conservadora dentro da sequência da SEQ ID NO: 2 na sequência da SEQ ID NO:3. Um exemplo de três substituições conservadoras dentro da sequência SEQ ID NO: 2 é dada na sequência SEQ ID NO : 4. Assim, o polipeptídeo fornecido pode compreender o aminoácido SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.

Tabela 4: Sequência de Variantes de Polipeptídeo ACT

Sequência	SEQ ID NO
RPRPDDLEI	SEQ ID NO:2
RPRPDDLEV	SEQ ID NO:3
RPRPDDVPV	SEQ ID NO:4
SSRASSRASSRPRPDDLEV	SEQ ID NO:44
RPKPDDLEI	SEQ ID NO:45
SSRASSRASSRPKPDDLEI	SEQ ID NO:46
RPKPDDLDI	SEQ ID NO:47
SSRASSRASSRPRPDDLDI	SEQ ID NO:48
SSRASTRASSRPRPDDLEI	SEQ ID NO:49
RPRPEDLEI	SEQ ID NO:50
SSRASSRASSRPRPEDLEI	SEQIDNO:51
GDGKNSVWV	SEQ ID NO:52

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SKAGSNKSTASSKSGDGKNSVWV	SEQ ID NO:53
GOKPPSRPSSSASKKLYV	SEQ ID NO: 54

[063] E compreendido que uma forma de definir quaisquer variantes, modificações, ou derivados dos genes e proteínas descritos aqui é através da definição das variantes, modificação e derivados em termos de identidade de sequência (também referido aqui como homologia) a sequências conhecidas específicas. Especificamente descritas são variantes dos ácidos nucleicos e polipeptídeos aqui descritos que têm pelo menos 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por cento de identidade de sequência para a sequência estabelecida ou conhecida. Os versados na técnica compreenderão prontamente como determinar a identidade de sequência de duas proteínas ou ácidos nucleicos. Por exemplo, a identidade de sequência pode ser calculada após o alinhamento das duas sequências, de modo que a identidade de sequência esteja em seu nível mais alto.

[064] Um outro modo de calcular a identidade de sequência pode ser executado por algoritmos publicados. Um alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de identidade de sequência local de Smith e Waterman Adv. Appl. Math 2 : 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de identidade de sequência de Needleman e Wunsch, J Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela pesquisa de Método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc Natl Acad Sei USA 85: 2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTEFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr, Madison, WI), ou por inspeção. Estas referências são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para os métodos de cálculo da identidade de sequência.

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 173/280 / 127 [065] Os mesmos tipos de identidade de sequência podem ser obtidos para ácidos nucleicos, por exemplo, por algoritmos descritos Em Zuker, M Science 244 : 48 -52, 1989, layer et al. Proc Natl Acad Sei USA 86: 7706 7710, 1989, jayerE outros Methods Enzymol. 183: 281 -306, 1989 que São aqui incorporados por referência para pelo menos um material relacionado ao alinhamento de ácido nucleico.

[066] O polipeptídeo fornecido pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por cento de identidade de sequência para o c-terminal de uma alfa Conexina (ACT). Assim, em um aspecto, o polipeptídeo fornecido compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por cento de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 90. Como um exemplo, é fornecido um polipeptídeo (SEQ ID NO: 4) tendo 66% de identidade de sequência com o mesmo estiramento de 9 aminoácidos ocorrendo NO carbóxi-término de Cx43 Humano (SEQ ID NO: 2).

[067] Os polipeptídeos aqui fornecidos podem ser adicionados diretamente a uma lesão de tecido em um indivíduo. Entretanto, a eficiência da localização citoplásmica do polipeptídeo fornecido é melhorada pelo transportador de intemalização celular quimicamente ligado em cis ou trans com o polipeptídeo. A eficiência dos transportadores de intemalização celular é melhorada mais por luz ou co-transdução de células com peptídeo Tat-HA.

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36/127 [068] Assim, o polipeptídeo fornecido pode compreender um transportador de internalização celular ou sequência. A sequência de intemalização celular pode ser qualquer sequência de internalização conhecida ou recém-descoberta na técnica, ou suas variantes conservadoras. Exemplos não limitantes de transportadores de intemalização celular e sequências incluem sequências de Antenapedia, TAT, HIV-tat, penetratina, Antp-3 a (Antp Mutante), Buforin II, Transporttan, MAP (peptídeo anfipático modelo), K-FGF, Ku70, Prion, pVEC, Pep-1, sybl, Pep-7, HN-1, BGSC (Bis-Guanidínio-Espermidina-colesterol E BGTC (Bis-guanidínioTren-Colesterol) (ver tabela 5).

Tabela 5: Transportadores de Internalização Celular

Nome	Sequência	SEQ ID NO
Antp	RQPKIWFPNRRKPWKK	(SEQ ID NO: 7)
HIV-Tat	GRKKRRQRPPQ	(SEQ ID NO: 14)
Penetratina	RQIKIWFQNRRMKWKK	(SEQ ID NO: 15)
Antp-3A	ROIAIWFQNRRMKWAA	(SEQ ID NO: 16)
Tat	RKKRRQRRR	(SEQ ID NO: 17)
Buforin II	TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK	(SEQ ID NO: 18)
Transportan	GWTLNSAGYLLGKINKALAAL AKKIL	(SEQ ID NO: 19)
peptídeo anfiático modelo (MAP)	KLALKLALKALKAALKLA	(SEQ ID NO: 20)
K-FGF	AAVALLPAVLLALLAP	(SEQ ID NO: 21)
Ku70	VPMLK-PMLKE	(SEQ ID NO: 22)
Prion	MANLGYWLLALFVTMWTDV GL CKKRPKP	(SEQ ID NO: 23)
pVEC	LLIILRRRIRKQAHAHSK	(SEQ ID NO: 24)
Pep-1	KETWWETWWTEWSQPKKKR KV	(SEQ ID NO: 25)
SynBl	RGGRLSYSRRRFSTSTGR	(SEQ ID NO: 26)
Pep-7	SDLWEMMMVSLACQY	(SEQ ID NO: 27)

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HN-1	TSPLNIHNGQKL	(SEQ ID NO: 28)
BGSC (Bis- GuanidinaSpermidina- Colesterol)	' ri-A i 1 ’ A
BGTC (Bis- Guanidina-TrenColesterol)	> & _	_

[069] Assim, o polipeptídeo fornecido pode ainda compreender a sequência de Aminoácidos SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 (buckci, m e outros 2000. nat. Med. 6, 1362 -1367 ), SEQ ID NO : 15 (derossi, d e outros 1994. biol. Chem 269, 10444 -10450), SEQ ID NO: 16 (fischer, p m e outros 2000. J pept. Res 55, 163 -172 ), SEQ ID NO: 17 (frankel, a d & am; pabo, c o 1988. celi 55, 1189 -1193; green, m & loewenstein, p m 1988. celi 55, 1179 -1188 ), SEQ ID NO: 18 (park, c b e outros 2000. Proc natl acad sei USA 97, 8245 -8250 ), SEQ ID NO: 19 (pooga, m, et al 1998. FASEB j 12, 67 -77), SEQ ID NO: 20 (oehlke, j et al 1998. biochim. Biophys acta. 1414, 127 -139 ), SEQ ID NO : 21 (lin, y z e outros 1995. J biol. Chem 270, 14255 -14258), SEQ ID NO: 22 (sawada, m e outros 2003. Nature celi biol. 5, 352 -357), SEQ ID NO: 23 (lundberg, p et al. 2002. Biochem biophys res commun. 299, 85 -90), SEQ ID NO: 24 (elmquist, a, et al. 2001. Exp celi res 269, 237 -244), SEQ ID NO: 25 (morris, MC, et al. 2001. Nature biotechnol. 19, 1173 -1176), SEQ ID NO: 26 (rousselle, c e outros 2000. mol. Pharmacol. 57, 679 -686 ), SEQ ID NO : 27 (gao, c e outros 2002. bioorg. Med. Chem 10, 4057 -4065), ou SEQ ID NO: 28 (hong, f d & am; clayman, g 1 2000. câncer res 60, 6551 -6556). O polipeptídeo fornecido pode ainda compreender BGSC (bis-guanidínio-espermidina-colesterol) ou BGTC (bisguanidínio-tren-colesterol) (vignon, j p e outros 1998. Proc natl acad sei

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USA. 93, 9682 -9686). As referências precedentes são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para os ensinamentos de vetores e sequências de intemalização celular. Quaisquer outras sequências de internalização agora conhecidas ou posteriormente identificadas podem ser combinadas com um peptídeo da invenção.

[070] O polipeptídeo fornecido pode compreender qualquer sequência ACT (por exemplo, qualquer Um dos peptídeos ACT aqui descritos) em combinação com qualquer uma das sequências de intemalização de células fornecidas aqui. Exemplos de tais combinações são dados na Tabela 6. Assim, o polipeptídeo fornecido pode compreender uma sequência de Antennapedia compreendendo a sequência de Aminoácidos SEQ ID NO: 7 assim, o polipeptídeo fornecido pode compreender a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.

Tabela 6:

Polipeptídeos ACT com Sequências de Intemalização Celular (CIS)

CIS/ACT	Sequência	SEQ ID NO
Antp/ ACT 2	RQPKIWFPNRRKPWKK PSSRASSRASSRPRPDDLEI	SEQ ID NO:8
Antp/ ACT 1	RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDLEI	SEQ ID NO:9
Antp/ ACT 3	RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDLEV	SEQ ID NO: 10
Antp/ ACT 4	RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDVPV	SEQ ID NO: 11
Antp/ ACT 5	RQPKIWFPNRRKPWKK KARSDDLSV	SEQ ID NO: 12
HIV-Tat/ ACT 1	GRKKRRQRPPQ RPRPDDLEI	SEQ ID NO:56
Penetratin/ ACT 1	RQIKIWFQNRRMKWKK RPRPDDLEI	SEQ ID NO:57
Antp-3A/ ACT 1	RQIAIWFQNRRMKWAA RPRPDDLEI	SEQ ID NO:58
Tat/ ACT1	RKKRRQRRR RPRPDDLEI	SEQ ID NO:59
Buforin 11/ ACT 1	TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK RPRPDDLEI	SEQ ID NO:60
Transportan/ ACT 1	GWTLNSAGYLLGKINKALAALAKKIL RPRPDDLEI	SEQ ID NO:61

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MAP/ ACT 1	KLALKLALKALKAALKLA RPRPDDLEI	SEQ ID NO:62
K-FGF/ ACT 1	AAVALLPAVLLALLAP RPRPDDLEI	SEQ ID NO:63
Ku70/ ACT 1	VPMLKPMLKE RPRPDDLEI	SEQ ID NO:64
Prion/ ACT 1	MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP RPRPDDLEI	SEQ ID NO:65
pVEC/ ACT 1	LLIILRRRIRKQAHAHSK RPRPDDLEI	SEQ ID NO:66
Pep-1/ ACT 1	KETWWETWWTEWSQPKKKRKV RPRPDDLEI	SEQ ID NO:67
SynBl/ ACT 1	RGGRLSYSRRRFSTSTGR RPRPDDLEI	SEQ D NO:68
Pep-7/ ACT 1	SDLWEMMMVSLACQY RPRPDDLEI	SEQ ID NO:69
HN-1/ ACT 1	TSPLNIHNGQKL RPRPDDLEI	SEQ ID NO:70

[071] Também fornecido são ácidos nucleicos isolados que codificam os polipeptídeos fornecidos aqui. Os ácidos nucleicos descritos são feitos, por exemplo, nucleotídeos, análogos de nucleotídeos, ou substitutos de nucleotídeos. Exemplos não limitantes dessas e outras moléculas são discutidos aqui. Entende-se que, por exemplo, quando um vetor é expresso em uma célula, o mRNA expresso tipicamente será constituído de A, C, G e U [072] Por ácido nucleico isolado ou ácido nucleico purificado Significa DNA que é livre dos genes que, no genoma de ocorrência natural do organismo a partir do qual o DNA da invenção é derivado, flanquea o gene. O termo, portanto, inclui, por exemplo, Um DNA recombinante que é incorporado a um vetor, tal como um plasmídeo ou vírus de replicação autônoma; ou incorporado no DNA genômico de um procarioto ou eucarte (por exemplo, um transgene ); ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento genômico ou cDNA produzido por PCR, digestão de endonuclease de restrição, ou síntese química ou in vitro). Também inclui um DNA recombinante, que é parte de um gene híbrido que codifica uma sequência de polipeptídeo adicional. O termo

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 178/280 / 127 ácido nucleico isolado também se refere a RNA, por exemplo, uma molécula de mRNA que é codificada por uma molécula de DNA isolada, ou que é quimicamente sintetizada, ou que é separada ou substancialmente isenta de pelo menos alguns componentes celulares, por exemplo, outros tipos de moléculas de RNA ou moléculas de polipeptídeo.

[073] [ 0073 ] assim, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de Aminoácidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.

[074] Assim, o ácido nucleico fornecido pode compreender a Sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO : 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 88, ou SEQ ID NO: 89.

[075] O ácido nucleico fornecido aqui pode ser operavelmente ligado a uma sequência de controle de expressão. Também é fornecido um vetor que compreende um ou mais dos ácidos nucleicos fornecidos aqui, em que o ácido nucleico é operavelmente ligado a uma sequência de controle de expressão. Existem várias composições e métodos que podem ser usados para a liberação de ácidos nucleicos a células, tanto in vitro quanto in vivo. Estes métodos e composições podem ser amplamente divididos em duas classes: sistemas de distribuição baseados em vírus e sistemas de distribuição não-virais. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser liberados através de um número de sistemas de administração diretos, tais como, eletroporação, lipofecção, precipitação de fosfato de cálcio, plasmídeos, vetores virais, ácidos nucleicos virais, ácidos nucleicos de fagos, fagos, cosmídeos ou por transferência de material genético em células ou veículos tais como lipossomas catiônicos. Meios apropriados para transfecção, incluindo vetores virais, transfectantes químicos, ou métodos físico-mecânicos tais

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 179/280 / 127 como eletroporação e difusão direta de DNA, são descritos, por exemplo, Wolff, J a, et al, Science, 247, 1465 -1468, (1990); e Wolff, J a Nature, 352, 815 -818, (1991). Tais métodos são bem conhecidos na técnica e facilmente adaptáveis para uso com as composições e métodos aqui descritos. Em certos casos, os métodos serão modificados para funcionar especificamente com grandes moléculas de DNA. Além disso, estes métodos podem ser usados para direcionar certas doenças e populações de células utilizando as características de direcionamento do veículo.

[076] Vetores de transferência podem ser qualquer construção de nucleotídeos usada para liberar genes em células (por exemplo, um plasmídeo), ou como parte de uma estratégia geral para liberar genes, por exemplo, como parte de retrovirus recombinante ou adenovirus (aríete E outros, Câncer Res 53: 83 -88, (1993)).

[077] Conforme usado aqui, plasmídeos ou vetores virais são agentes que transportam os ácidos nucleicos descritos, tal como A SEQ ID NO: 6, para dentro da célula sem degradação e incluem um promotor que produz a expressão do gene nas células em que ela é distribuída. Em algumas formas de realização, os promotores são derivados de um vírus ou um retrovirus. Vetores virais são, por exemplo, Adenovirus, vírus Adeno-associado, vírus da Herpes, vírus de Vacínia, vírus Polio, vírus da AIDS, vírus trófico neuronal, Sindbis e outros Vírus RNA, incluindo estes vírus com a Cadeia principal do HIV. Também são descritas quaisquer famílias virais que compartilham as propriedades destes vírus que os tomam adequados para utilização como vetores. Retrovirus incluem vírus de leucemia Maloney De Murino, MMLV, e retrovirus que expressam as propriedades desejáveis de MMLV como um vetor. Os vetores retrovirais são capazes de transportar uma carga útil genética maior, como um transgene ou gene marcador, do que outros vetores virais, e por esta razão são um vetor comumente usado. No entanto, elas não são úteis em células não proliferantes. Os vetores

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Adenovirus são relativamente estáveis e fáceis de trabalhar, têm altos títulos, e podem ser aplicados em formulação de aerossol, e podem transfectar células não-divisórias. Os vetores virais de Pox são grandes e têm vários locais para inserir genes, eles são termoestáveis e podem ser armazenados em temperatura ambiente. Também é descrito um vetor viral que foi desenvolvido de modo a suprimir a resposta imune do organismo hospedeiro, elicitado pelos antígenos virais. Vetores deste tipo podem transportar regiões de codificação para Interleucina 8 ou 10.

[078] Vetores virais podem ter uma maior habilidade de transação (capacidade de introduzir genes) do que métodos químicos ou físicos para introduzir genes em células. Tipicamente, os vetores virais contêm, genes precoces não estruturais, genes atrasados estruturais, um transcrito de RNA Polimerase III, repetições terminais invertidas necessárias para replicação e encapsulação, e promotores para controlar a transcrição e replicação do genoma viral. Quando engenheirado como vetores, os vírus têm tipicamente um ou mais dos genes precoces removidos e um gene ou cassete gene/promotor é inserido no genoma viral no lugar do DNA viral removido. Construções deste tipo podem conter até cerca de 8 kb de material genético estranho. As funções necessárias dos genes precoces removidos são tipicamente supridas por linhagens celulares, que foram engenheiradas para expressar os produtos genéticos dos genes precoces em trans.

[079] Retrovirus é um vírus animal pertencente à família do Vírus de Retroviridae, incluindo quaisquer tipos, subfamílias, gênero ou tropismos. Vetores retrovirais, em geral, são descritos por Verma, IM, retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229 -232, Washington, (1985), que é incorporado aqui por referência. Exemplos de métodos para a utilização de vetores retrovirais para terapia genética são descritos nas patentes US 4.868.116 e 4.980.286; pedidos PCT WO 90/02806 e WO 89/07136; e Mulligan, (Science 260: 926

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-932 (1993); os ensinamentos das quais são aqui incorporados para referência.

[080] Um retrovirus é essencialmente uma embalagem que foi empacotada em uma carga de ácido nucleico. A carga de ácido nucleico transporta com o mesmo um sinal de embalagem, que garante que as moléculas secundárias replicadas sejam eficientemente embaladas dentro do revestimento de embalagem. Além do sinal de embalagem, existe um número de moléculas que são necessárias em eis, para a replicação e embalagem do vírus replicado. Tipicamente, um genoma retroviral contém os genes gag, pol e env que estão envolvidos na produção do revestimento de proteína. E os genes gag, pol e env que são tipicamente substituídos pelo DNA estranho que é para ser transferido para a célula alvo. Os vetores retrovirais contêm tipicamente um sinal de embalagem para incorporação no revestimento de embalagem, uma sequência que sinaliza o início da unidade de transcrição gag, elementos necessários para a transcrição inversa, incluindo um local de ligação de iniciador para ligar o primer de tRNA de transcrição reversa, sequências de repetição terminais que guiam o interruptor de filamentos de RNA durante a síntese de DNA, uma sequência rica em purina 5 'para a LTR 3 'que serve como o local de iniciação para a síntese do segundo filamento de síntese de DNA, e sequências específicas próximas às extremidades dos LTRs que permitem a inserção do estado de DNA do retrovirus para inserir no genoma hospedeiro. A remoção dos genes gag, pol e env permite que cerca de 8 kb de sequência estranha seja inserida no genoma viral, tomar-se a transcrição inversa, e após a replicação ser empacotada em uma nova partícula retroviral. Esta quantidade de ácido nucleico é suficiente para a administração de um a muitos genes, dependendo do tamanho de cada transcrito.

[081] Uma vez que a maquinaria de replicação e as proteínas de embalagem na maioria dos vetores retrovirais foram removidas (gag, pol e

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 182/280 / 127 env), os vetores são tipicamente gerados pela sua colocação em uma linha de células de embalagem. Uma linha de células de embalagem é uma linhagem celular que foi transfectada ou transformada com um retrovirus que contém a replicação e maquinaria de embalagem, mas carece de qualquer sinal de embalagem. Quando o vetor que carrega o DNA de escolha é transfectado nessas linhagens celulares, o vetor contendo o gene de interesse é replicado e embalado em novas partículas retrovirais, a maquinaria provida em eis pela célula auxiliar. Os genomas para o maquinário não são embalados porque eles carecem dos sinais necessários.

[082] A construção de adenovirus defeituosos em replicação foi descrita (Berkner et al., J Virology 61: 1213 -1220 (1987); Massie et al, Mol. Célula. Biol. 6 : 2872 -2883 (1986); Haj-Ahmad et al, J Virology 57: 267 274 (1986); Davidson e outros, J Virology 61: 1226 -1239 (1987); Zhang Generation and identification of recombinant adenovirus by lipossomamediated transfection and PCR analysis BioTechniques 15: 868 -872 (1993). O benefício do uso destes vírus como vetores é que eles são limitados na extensão em que eles podem se espalhar para outros tipos de células, uma vez que elas podem se replicar dentro de uma célula infectada inicial, mas são incapazes de formar novas partículas virais infecciosas. Os adenovirus recombinantes foram mostrados para obter transferência de genes de alta eficiência após a entrega direta, in vivo para o epitélio das vias aéreas, hepatócitos, endotélio vascular, parênquima do SNC e um número de outros locais de tecido (Morsy, J Clin. Invest. 92 : 1580 -1586 (1993); Kirshenbaum, J Clin. Invest. 92 : 381 -387 (1993); Roessler, J Clin. Invest. 92: 1085 -1092 (1993); moulilier, Nature Genetics 4: 154 -159 (1993); La Salle, Science 259: 988 -990 (1993); gmez-Foix, J Biol. Chem 267: 25129 25134 (1992); Rich, Human gene Therapy 4: 461 -476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6: 75 -83 (1994); Guzman, Circulation Research 73: 1201 1207 (1993); Bout, Human gene Therapy 5: 3 -10 (1994); Zabner, celi 75:

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207 -216 (1993); Caillaud, Eur. J Neuroscience 5: 1287 -1291 (1993); e Ragt, J Gen Virology 74: 501 -507 (1993). Adenovirus recombinantes obtêm transdução de genes pela ligação a receptores de superfície celular específicos, após o que o vírus é internalizado por endocitose mediada por receptor, da mesma maneira que adenovirus tipo selvagem ou de replicação defeituosa (Chardonnet e Dales, Virology 40: 462 -477 (1970); Brown e Burlingham, J Virology 12: 386 -396 (1973); Svensson e Persson, J Virology 55: 442 -449 (1985) Seth, et al., J Virol. 51: 650 -655 (1984); Seth, et Al, Mol. Célula. Biol. 4: 1528 -1533 (1984); Varga et al, J Virology 65: 6061 6070 (1991); Wickham Et al., celi 73: 309 -319 (1993).

[083] Um vetor viral pode ser um com base em um adenovirus que teve o gene El removido, e estes virons são gerados em uma linhagem celular tal como a linhagem celular 293 humana. Em um aspecto, ambos os genes El e E3 são removidos do genoma do adenovirus.

[084] Um outro tipo de vetor viral é baseado em vírus adenoassociado (AAV). Este parvovirus defeituoso pode infectar muitos tipos celulares e não é patogênico para seres humanos. Os vetores do tipo AAV podem transportar cerca de 4 a 5 kb e é conhecido um AAV do tipo selvagem para inserção estável no cromossoma 19. Como um exemplo, este vetor pode ser o vetor P4.1 C produzido por Avigen, San Francisco, Califórnia, que pode conter o gene da timidina cinase do vírus do herpes simplex, HSV-tk e/ou um gene marcador, tal como o gene que codifica a proteína fluorescente verde, GFP.

[085] Em um outro tipo de vírus AAV, O AAV contém um par de repetições terminais Invertidas (ITRs) que flanqueia pelo menos um cassete contendo um promotor que direciona a expressão específica da célula operavelmente ligada a um gene heterólogo. Heterologo neste contexto refere-se a qualquer sequência de nucleotídeos ou gene que não seja nativa ao vírus AAV ou BI9.

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 184/280 / 127 [086] Tipicamente as regiões de codificação de AAV e B19 foram excluídas, resultando em um vetor seguro e não-citotóxico. ITRs de AAV, ou suas modificações, conferem infectividade e integração específica no local, mas não a citotoxicidade, e o promotor direciona a expressão específica da célula. A Patente US 6.261.834 é aqui incorporada por referência para material relacionado ao vetor AAV.

[087] Os vetores descritos fornecem assim moléculas de DNA que são capazes de integrar em um cromossomo de mamífero sem toxicidade substancial.

[088] Os genes inseridos em vírus e retrovirus contêm promotores e/ou intensificadores para ajudar a controlar a expressão do produto genético desejado. Um promotor é geralmente uma sequência ou sequências de DNA que funcionam quando em um local relativamente fixo com relação ao local de início da transcrição. Um promotor contém elementos de núcleo requeridos para a interação básica de RNA polimerase e fatores de transcrição, e pode conter elementos a montante e elementos de resposta.

[089] Os experimentos genéticos moleculares com grandes vírus de herpes humana proporcionaram um meio pelo qual fragmentos de DNA heterólogos grandes podem ser clonados, propagados e estabelecidos em células permissivas para infecção com vírus da herpes (Sun Et al, Nature genetics 8: 33 -41, 1994; Contrapand Robertson, Curr Opin Mol Ther 5: 633 -644, 1999). Estes grandes virus de DNA (virus do herpes simplex (HSV) e virus Epstein-Barr (EBV) têm o potencial de liberar fragmentos de DNA heterólogo humano > 150 kb a células específicas. Recombinantes de EBV Podem manter grandes pedaços de DNA nas células B infectadas como DNA episômico. Clones individuais conduzidos por inserções genômicas humanas até 330 kb pareceram geneticamente estáveis. A manutenção destes epissomas requer uma proteína nuclear EBV específica, EBNA1, constitutivamente expressa durante a infecção com EBV. Adicionalmente,

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 185/280 / 127 estes vetores podem ser usados para transfecção, onde grandes quantidades de proteína podem ser geradas transitoriamente in vitro. Os sistemas de amplicon de repesvírus também estão sendo usados para acondicionar pedaços de DNA > 220 kb e para infectar células que podem manter estavelmente DNA como epissomas.

[090] Outros sistemas úteis incluem, por exemplo, vetores de vírus de vacínia não replicados e não replicados em hospedeiro.

[091] As composições apresentadas podem ser liberadas para as células alvo em uma variedade de modos. Por exemplo, as composições podem ser liberadas através de eletroporação, ou através de lipofecção, ou através de precipitação de fosfato de cálcio. O mecanismo de aplicação escolhido dependerá em parte do tipo de célula alvo e se o fornecimento está ocorrendo, por exemplo, in vivo ou in vitro.

[092] Assim, as composições podem compreender, além dos polipeptídeos descritos, ácidos nucleicos ou vetores, por exemplo, lipídeos como lipossomas, tais como lipossomas catiônicos (por exemplo, DOTMA, DOPE, DC-colesterol) ou lipossomas aniônicos. Os lipossomas podem ainda compreender proteínas para facilitar o direcionamento de uma célula particular, se desejado. A administração de uma composição compreendendo um composto e um lipossoma catiônico pode ser administrada ao sangue aferente a um órgão alvo ou inalada no trato respiratório em células alvo do trato respiratório. Com relação aos lipossomas, ver, por exemplo, Brigham e outros J Resp. Célula. Mol. Biol. 1: 95 -100 (1989); Feigner Et Al Proc Natl Acad sei USA 84: 7413 -7417 (1987); a Patente US No. 4.897.355. Além disso, o composto pode ser administrado como um componente de uma microcápsula que pode ser direcionada a tipos específicos de células, tal como macrófagos, ou onde a difusão do composto ou fornecimento do composto da microcápsula é projetada para uma taxa ou dosagem específica.

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 186/280 / 127 [093] Nos métodos descritos acima que incluem a administração e captação de DNA exógeno nas células de um indivíduo (isto é, transdução de genes ou transfecção), a administração das composições a células pode ser através de uma variedade de mecanismos. Como um exemplo, a administração pode ser através de um lipossoma, usando-se preparações de lipossoma comercialmente disponíveis, tais como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc, Gaithersburg, Md), SUPERFECT (Qiagen, Inc Hilden, alemanha ) e TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc, Madison, WI), bem como outros lipossomas desenvolvidos de acordo com procedimentos padrão na técnica. Além disso, o ácido nucleico ou vetor descrito pode ser liberado in vivo por eletroporação, a tecnologia para a qual é disponível de Genetronics, Inc (San Diego, CA) bem como por meio de uma Máquina SONOPORATION (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Ariz).

[094] Ácidos nucleicos que são aplicados a células que devem ser integradas no genoma da célula hospedeira contêm tipicamente sequências de integração. Estas sequências são frequentemente sequências relacionadas virais, particularmente quando sistemas baseados em vírus são usados. Estes sistemas de integração viral também podem ser incorporados em ácidos nucleicos que devem ser liberados utilizando um sistema de entrega à base de ácido não nucleico, tal como um lipossoma, de modo que o ácido nucleico contido no sistema de distribuição pode se tomar integrado ao genoma hospedeiro.

[095] Outras técnicas gerais para integração no genoma hospedeiro incluem, por exemplo, sistemas projetados para promover recombinação homóloga com o genoma hospedeiro. Estes sistemas se baseiam tipicamente em sequência que flanqueia o ácido nucleico a ser expresso que tem homologia suficiente com uma sequência alvo dentro do genoma da célula hospedeira que a recombinação entre o ácido nucleico do vetor e o ácido

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 187/280 / 127 nucleico alvo ocorre, fazer com que o ácido nucleico fornecido seja integrado ao genoma hospedeiro. Estes sistemas e os métodos necessários para promover a recombinação homóloga são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[096] As composições podem ser aplicadas às células do sujeito in vivo e/ou ex vivo por uma variedade de mecanismos bem conhecidos na técnica (por exemplo, captação de DNA nu, fusão de lipossoma, injeção intramuscular de DNA através de uma pistola de gene, endocitose e semelhantes).

[097] Os métodos ex vivo são empregados, células ou tecidos podem ser removidos e mantidos fora do corpo de acordo com protocolos padrão bem conhecidos na técnica. As composições podem ser introduzidas nas células através de qualquer mecanismo de transferência de gene, tal como, por exemplo, administração de gene mediada por fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção ou proteolipossomas. As células transduzidas podem então ser infundidas (por exemplo, em um veículo farmaceuticamente aceitável) ou transplantadas homotopicamente no indivíduo por métodos padrão para o tipo de célula ou tecido. Métodos padrão são conhecidos para transplante ou infusão de várias células em um indivíduo.

[098] Os ácidos nucleicos que são aplicados a células contêm tipicamente sistemas de controle de expressão. Por exemplo, os genes inseridos em sistemas virais e retrovirais usualmente contêm promotores e/ou intensificadores para ajudar a controlar a expressão do produto genético desejado. Um promotor é geralmente uma sequência ou sequências de DNA que funcionam quando em um local relativamente fixo com relação ao local de início da transcrição. Um promotor contém elementos de núcleo requeridos para A interação básica de RNA polimerase e fatores de transcrição, e pode conter elementos a montante e elementos de resposta.

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 188/280 / 127 [099] Os promotores que controlam a transcrição de vetores em células hospedeiras de mamíferos podem ser obtidos a partir de várias fontes, por exemplo, os genomas de vírus tais como: polioma, Vírus de símio 40 (SV40 ), adenovirus, retrovirus, vírus da hepatite-B, citomegalovírus ou de promotores de mamíferos heterólogos, por exemplo, promotor de beta actina. Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que também contém a origem viral SV40 de replicação (Geners e outros, Nature, 273: 113 (1978)). O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição hindlii e (Greenway, P J Et al., Gene 18: 355 -360 (1982)). Naturalmente, promotores da célula hospedeira ou espécies relacionadas também são úteis aqui.

[0100] Intensificadores geralmente se referem a uma sequência de DNA que funciona em uma distância fixa do local de início da transcrição e pode ser 5 '(Laimins, L e Outros, Proc Natl Acad sei 78: 993 (1981)) ou 3 '(Lusky, M L e outros, Mol. Célula. Bio. 3: 1108 (1983) para a unidade de transcrição. Além disso, os intensificadores podem estar dentro de um íntron (Banerji, J L e outros, celi 33: 729 (1983)) bem como dentro da própria sequência de codificação (Osborne, T F e outros, Mol. Célula. Bio. 4: 1293 (1984)). Elas estão usualmente entre 10 e 300 bp de comprimento, e funcionam em eis. Função de intensificadores para aumentar a transcrição de promotores próximos. Os intensificadores também contêm frequentemente elementos de resposta que mediam a regulação da transcrição. Os promotores também podem conter elementos de resposta que mediam a regulação da transcrição. Os intensificadores determinam, com frequência, a regulação da expressão de um gene. Embora muitas sequências intensificadoras sejam agora conhecidas a partir de genes mamíferos (globina, elastase, albumina, beta-fetoproteína e insulina), tipicamente, utilizará um intensificador a partir de um vírus de célula eucariótica para a

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51/127 expressão geral. Os exemplos são o intensificador SV40 no lado tardio da origem de replicação (bp 100 -270), o intensificador de promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e intensificadores de adenovirus.

[0101] O promotor e/ou intensificador pode ser especificamente ativado por eventos químicos leves ou específicos que disparam sua função. Os sistemas podem ser regulados por reagentes tais como tetraciclina e dexametasona. Existem também modos de aumentar a expressão gênica do vetor viral por exposição à irradiação, tal como irradiação gama, ou fármacos de quimioterapia de alquilação.

[0102] Em certas formas de realização, a região promotora e/ou intensificadora pode agir como um promotor e/ou intensificador constitutivo para maximizar a expressão da região da unidade de transcrição a ser transcrita. Em certas construções, a região promotora e/ou intensificadora é ativa em todos os tipos de células eucarióticas, mesmo se ela for apenas expressa em um tipo particular de célula em um determinado momento. Um promotor deste tipo é o promotor CMV (650 bases). Outros tais promotores são promotores SV40, citomegalovírus (promotor de comprimento total) e LTR de vetor Retroviral.

[0103] Foi mostrado que todos os elementos reguladores específicos podem ser clonados e usados para construir vetores de expressão que são seletivamente expressos em tipos específicos de células tais como células de melanoma. O promotor da proteína acético fibrilar gliária (GFAP) foi usado para expressar seletivamente genes em células de origem glial.

[0104] Vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (levedura, fungos, insetos, plantas, animais, células humanas ou nucleadas) também podem conter sequências necessárias para a terminação da transcrição que pode afetar a expressão de mRNA. Estas regiões são

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 190/280 / 127 transcritas como segmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica a proteína do fator de tecido. As regiões não traduzidas 3 'também incluem locais de terminação de transcrição. A unidade de transcrição também pode conter uma região de poliadenilação. Um benefício desta região é que ele aumenta a probabilidade de que a unidade transcrita seja processada e transportada como mRNA. A identificação e uso de sinais de poliadenilação em construções de expressão é bem estabelecida. Sinais de poliadenilação homólogos podem ser usados nas construções de transgene. Em certas unidades de transcrição, a região de poliadenilação é derivada do sinal de poliadenilação precoce de SV40 e consiste em cerca de 400 bases. As unidades transcritas que contêm outras sequências padrão sozinhas ou em combinação com as sequências acima melhoram a expressão ou a estabilidade da construção.

[0105] Os vetores virais podem incluir uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto marcador. Este produto marcador é usado para determinar se o gene foi liberado para a célula e uma vez entregue está sendo expresso. Os genes marcadores de exemplo são o gene lacZ de E Coli, que codifica a beta-galactosidase e a proteína fluorescente verde.

[0106] Em algumas modalidades, o marcador pode ser um marcador selecionável. Exemplos de marcadores selecionáveis adequados para células de mamíferos são a reductase de diidrofolato (DHFR), timidina cinase, neomicina, G418 de análogo de neomicina, hidromicina e puromicina. Quando tais marcadores selecionáveis são transferidos com sucesso em uma célula hospedeira de mamíferos, a célula hospedeira de mamífero transformada pode sobreviver se colocada sob pressão seletiva. Existem duas categorias distintas amplamente utilizadas de regimes seletivos. A primeira categoria é baseada no metabolismo da célula e ao uso de uma linhagem celular mutante que carece da capacidade de crescer independente de um meio suplementado. Dois exemplos são: células DHFR de ovário de hamster

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 191/280 / 127 chinês (CHO) e células LTK de camundongo. Estas células carecem da capacidade de crescer sem a adição de tais nutrientes como timidina ou hipoxantina. Como estas células carecem de certos genes necessários para uma via completa de síntese de nucleotídeos, elas não podem sobreviver a menos que os nucleotídeos faltantes sejam fornecidos em um meio suplementado. Uma alternativa para suplementar o meio é introduzir um gene DHFR ou TK Intacto em células que carecem dos respectivos genes, alterando assim suas exigências de crescimento. Células individuais que não foram transformadas com o gene DHFR ou TK Não serão capazes de sobrevivência em meios não suplementados.

[0107] A segunda categoria é a seleção dominante que se refere a um esquema de seleção usado em qualquer tipo celular e não requer o uso de uma linhagem celular mutante. Estes esquemas utilizam tipicamente uma droga para deter o crescimento de uma célula hospedeira. Essas células que possuem um novo gene expressariam uma proteína de transporte de proteína que sobrevivem à seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam as drogas neomicina, (Southern P e Berg, P, J Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982), ácido micofenólico (Mulligan, R C e Berg, P Science 209: 1422 (1980) ou higromicina (Sugden, B E outros, Mol. Célula. Biol. 5 : 410 -413 (1985). Os três exemplos empregam genes bacterianos sob controle eucariótico para transporte de resistência à droga apropriada G418 ou Neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) ou higromicina, respectivamente. Outros incluem o análogo de neomicina G418 e puramicina.

[0108] Também é fornecido uma célula que compreende um ou mais dos referidos vetores fornecidos aqui. Como usado aqui, célula , linha celular, e cultura celular pode ser utilizada de forma intercambiável e todas tais designações incluem progênie. A célula revelada pode ser qualquer célula usada para clonar ou propagar os vetores fornecidos aqui. Assim, a

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 192/280 / 127 célula pode ser de qualquer cultura de células primárias ou de uma linhagem celular estabelecida. O método pode ser aplicado a qualquer célula, incluindo procariótica ou eucariótica, como bactérias, plantas, animais e semelhantes. O tipo de célula pode ser selecionado por alguém versado na técnica com base na escolha do vetor e uso desejado.

[0109] São descritos animais produzidos pelo processo de transfectar uma célula dentro do animal com qualquer uma das moléculas de ácido nucléico ou vetores aqui descritos. São apresentados animais produzidos pelo processo de transfectar uma célula dentro do animal qualquer das moléculas de ácido nucléico ou vetores aqui descritos, em que o animal é um mamífero. Também são apresentados animais produzidos pelo processo de transfectar uma célula dentro do animal qualquer das moléculas de ácido nucléico ou vetores aqui descritos, em que o mamífero é rato, rato, coelho, vaca, ovelha, porco ou primata.

[0110] Fornecido é uma composição que compreende um ou mais dos referidos polipeptídeos, ácidos nucleicos, ou vetores em um veículo farmaceuticamente aceitável. Assim, é fornecida uma composição que compreende uma combinação de dois ou mais de qualquer um dos referidos polipeptídeos ACT em um veículo farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, é fornecida uma composição que compreende a SEQ ID NO: 1 e a SEQ ID NO: 5 em um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0111] Farmaceuticamente aceitável significa um material que não é biologicamente ou de outro modo indesejável, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo, junto com o ácido nucleico ou vetor, sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de uma maneira deletéria com qualquer um dos outros componentes da composição farmacêutica na qual ele está contido. O veículo seria naturalmente selecionado para minimizar qualquer degradação do ingrediente ativo e

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 193/280 / 127 minimizar quaisquer efeitos colaterais adversos no indivíduo, como seria bem conhecido por aqueles versados na técnica.

[0112] O presente pedido de patente pode ainda compreender qualquer substância conhecida ou recém descoberta que pode ser administrada a um ferimento, lesão do tecido, local de inflamação ou câncer. Por exemplo, a composição fornecida pode ainda compreender uma ou mais classes de antibióticos (por exemplo, Aminoglicosídeos, Cefalosporinas, cloranfenicol, clindamicina, Eritromicinas, Fluoroquinolonas, Macrolídeos, Azolidas, metronidazol, penicilina, tetraciclina 's, Trimetoparo-sulfetoxazol, vancomicina), esteróides (por exemplo, Testosterona ), Castanoses (por exemplo, colesterol), ácidos eólico (por exemplo, ácido eólico), corticosteróides (por exemplo, dexametasona), Estrenos (por exemplo, estradiol), pregnanos (por exemplo, progesterona ), analgésicos narcóticos e não narcóticos (por exemplo, Morfina, codeína, Heroina, Hidromorfona, levoranol, meperidina, metadona, Oxidone, propoxifeno, fentanil, metadona, naloxona, Buprenorfina, Butorfina, Nalbufina, Pentazocina ), quimioterapia (por exemplo, drogas anticâncer tais como mas não limitadas a Altretamina, Asparaginase, Bleomicina, Busulfano, Carboplatina, camustina, clorambucil, cisplatina, cladribina, Ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, Dietilestilbesterol, Etinil estradiol, Etoposida, Floxuridina, fludarabina, Fluorouracil, flutamida, goserelina, hidroxiuréia, Idarubicina, ifosfamida, leuprolida, levamisol, lomustina, meccloretamina, medroxiprogesterona, Megestrol, melfalano, mercaptopurina, Metotrexato, Mitomicina, mitotano, mitoxantrona, Paclitaxel, pentostatina, Pipobro, Plicamicina, prednisona, procarbazina, estreptozocina, Tamoxifeno, Teniposida, Vinblastina, Vincristina), agentes antiinflamatórios (por exemplo, Alclofenac; Dipropionato de alclmetasona; acetonida de Algestona; alfa amilase; Amcinafal; Amcinafide; Amfenac Sódico; Cloridrato De amipriose; anaquinra; Anirolac; Anitrazafen; apazona; Bálsazida dissódico; Bendazac;

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 194/280 / 127 benoxaprofeno; cloridrato de Benzydamina; bromatas; Broperamol; budesonida; carprofeno; cicloprofeno; cinazona; cliprofeno; Propionate de Clobetasol; butirato de clobetasona; Clopirac; Propionato de Cloticasona; Acetato de Cormetasona; cortodoxona; Decanoato; Desoximetilcasona; Deslatestro; deo-testosterona; propionato; Desoximetasona; Dipropionato De dexametasona; Diclofenaco potássio; Diclofenaco sódico; diacetato de Diflorasona; Diflumidona Sódico; Diflunial; difluprednato; ditamona; Sulfóxido de Dimetila; Flucinonida; Ensecsona; Enlimomab; Enolicam Sódio; Epirizol; Etodolac; Etofenamato; Felbinac; fenamol; Fenbufen; Fenclofenac; fentlorac; fendsal; fenpipsozinho; fentazac; Fluorita; flumizol; Acetato de Flunisolida; flunixina; flunixina Meglumina; Fluocortina; acetato De fluoroetolona; fluquazona; flurbiprofeno; Fluretofeno; Propionato de fluticasona; furaprofeno; Furulfeno; Halcinonida; Propionato De Halobetasol; acetato Haloprefeito; flufenac; Ibuprofeno; ibuprofeno Alumínio; Ibuprofeno Piconol; Ilonidap; Indometacina; Sódio Indometacina; Indoprofeno; Indoxi; Intra-zol; acetato de Isofluprol; Isoxepac; Isoxicam; Cetoprofeno; Cloridrato De lofemol; Lomoxicam; Loteprednol etabonato; Meclofenamato de Sódio; Ácido meclofenâmico; Meclorisona Dibutirato; ácido Mefenâmico; Mesalamina; Meseccilzona; Mesterolona; Metoandrostolona; Metenolona; Acetato De metenolona; Suleptanato De metilprednisolona; Moifluconona; nabumetona; Nandrolone; Naproxeno; Naproxeno sódico; Nabol; Nimona; olsalazina Sódico; orgoteina; orpanoxina; oxandrolano; Oxaprozina; Oxifenbutazona; Oximetolona; Cloridrato de Paranilina; Polissulfato De Pentanano; glicerato de Fenilbutazona; pirfenidona; Piroxicam; Derivados de Piroxicam; Piroxicam Olamina; Pirprofeno; Prequazato; Prifelona; Ácido prodólico; Proquazona; Proxazol; Citrato de proxazol; Furazalo; Salcolex; salnacedina; Salsalato; Cloreto de Sanguinário; Seclazona; Sermetacina; estanozolol; Sudoxicam; Sulindoac; Suprofeno; Talmetina; Talnifluconona; Talosalato;

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 195/280 / 127 tebufelona; Tenidap; Tenidap Sódico; Tenoxicam; Tesicam; Tesimida; Testosterona; Misturas De Testosterona; tetra-Damina; Tiopinac; pivalato De Tixocortol; Tolmetina; tolmetina de Sódio; tricloida; Triflumina; Zidometacina; Zmepirac sódico), ou agentes anti-histaminicos (Por exemplo, etanolaminas (como difenilidmina carbinamida ), Etilenodiamina (como tripelenina piridiamina), Alquilamina (como clorfeniramina, dexfeniramina, bromofenilamina, triproidina ), outras anti-histaminas como aemizol, loratadina, fexofenadina, brofenina, clemastina, acetaminofeno, pseudoefedrina, triprolidina).

[0113] As composições podem ser administradas topicamente, oralmente ou parenteralmente. Por exemplo, as composições podem ser administradas extracorporeamente, intracranialmente, intravaginalmente, intracoralmente, subcutaneamente, intradermicamente, intracardíaca, intragástrico, intravenosa, intramuscular, por injeção intraperitoneal, transdermicamente, intranasalmente, ou por inalante. Como usado aqui, administração intracraniana significa a administração direta de substâncias ao cérebro incluindo, por exemplo, administração intratecal, intracistemal, intra-ventricular ou trans-sphenoidal via cateter ou agulha.

[0114] A administração parenteral da composição, se usada, é geralmente caracterizada por injeção. Os injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, ou como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para solução de suspensão em líquido antes da injeção, ou como emulsões. Uma abordagem mais recentemente revisada para administração parenteral envolve o uso de um sistema de liberação lenta ou libertação prolongada tal que uma dosagem constante é mantida. Veja, por exemplo, a Patente US No. 3.610.795, que é aqui incorporada para referência.

[0115] Como usado aqui, administração intranasal tópica significa a administração das composições nas passagens nasais e nasais através de um

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 196/280 / 127 ou mais ambas as narinas e podem compreender a aplicação por um mecanismo de pulverização ou mecanismo de gotícula, ou através de aerossolização do ácido nucleico ou vetor. A administração das composições por inalante pode ser através do nariz ou da boca por meio de um mecanismo de pulverização ou gotícula. A administração também pode ser diretamente a qualquer área do sistema respiratório (por exemplo, pulmões) através da intubação.

[0116] Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui podem ser aplicadas topicamente uma vez por dia, duas vezes por dia, três vezes por dia, quatro vezes por dia, cinco vezes por dia, ou mais. Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui podem ser aplicadas topicamente uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez a cada quatro dias, uma vez a cada quatro dias, uma vez a cada seis dias, uma vez a cada seis dias, ou uma vez por semana. Em algumas formas de realização, as composições aqui fornecidas podem ser aplicadas topicamente em uma base como necessária. Por exemplo, em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui podem ser aplicadas durante ou após a manifestação ou o aumento da severidade dos sintomas da lesão por radiação. Em algumas formas de realização, as composições aqui fornecidas podem ser aplicadas topicamente uma vez por dia por cerca de 5, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 95, cerca de 100 ou mais dias consecutivos. Em algumas formas de realização, as composições aqui providas compreendem um peptídeo ACT fornecido aqui e um gel, e podem ser aplicadas topicamente. Em outras formas de realização, as composições fornecidas aqui compreendem a SEQ ID NO: 91. Em algumas modalidades, as composições fornecidas aqui compreendem A

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SEQ ID NO: 91 e o gel de hidroxietilcelulose, em que as composições são aplicadas topicamente.

[0117] Em algumas formas de realização, as composições aqui apresentadas incluem um Gel Tópico denominado flavex®. Em algumas formas de realização, Granexin® compreende 1, 25% de gel de hidroxietil celulose e o Peptídeo ACT1. A estrutura química do peptídeo ACT1 em Granex® é: biotina-Ahx-Arg-gin-Pro-Lys-lle-Trp-Phe-Pro-Asn-Arg- Arg Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Arg-Pro-Arg-Pro-Asp-Asp-Leu-Glu-Lle-OH (SEQ ID NO: 91), em que Ahx é Ácido L -2-aminohexanóico (ácido 6aminohexanóico). Em algumas formas de realização, Granexin® compreende ainda um ou mais conservante, solvente, agente tamponante, estabilizante, agente quelante e/ou qualquer excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável adicional.

[0118] Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui são topicamente e/ou sistemicamente administradas a cerca de 1, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 24, cerca de 48 ou mais horas antes da exposição à radiação ionizante. Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui são administradas topicamente e/ou sistemicamente cerca de 1, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 24, cerca de 48, ou mais horas após a exposição à radiação ionizante. Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui são administradas topicamente e/ou sistemicamente em uma janela de tempo de cerca de 1 a cerca de 48 horas após a exposição à radiação ionizante, ou cerca de 4 a cerca de 24 horas após a exposição, ou cerca de 10 a cerca de 36 horas após a exposição. Em modalidades particulares, as composições fornecidas aqui são aplicadas topicamente a cerca de 24 horas após a exposição à radiação ionizante. Em algumas formas de realização, uma camada fina de uma composição fornecida aqui (por exemplo, uma composição compreendendo um peptídeo

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ACT fornecido aqui e um gel) é aplicada sobre as áreas expostas à radiação ionizante. Assim, em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para tratamento de exposição à radiação ionizante, compreendendo aplicação tópica à área de exposição de uma camada de uma composição compreendendo SEQ ID NO: 91 e gel de hidroxietilcelulose.

[0119] Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui podem ser administradas sistemicamente uma vez por dia, duas vezes por dia, três vezes por dia, quatro vezes por dia, cinco vezes por dia, ou mais. Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui podem ser administradas sistemicamente uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez a cada quatro dias, uma vez a cada quatro dias, uma vez a cada seis dias, uma vez a cada seis dias, ou uma vez por semana. Em algumas formas de realização, as composições aqui fornecidas podem ser administradas sistemicamente em uma base como necessária antes ou depois da exposição à radiação ionizante. Por exemplo, em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui podem ser administradas durante ou após a manifestação ou o aumento da severidade dos sintomas da lesão por radiação. Em algumas formas de realização, as composições aqui fornecidas podem ser administradas sistemicamente uma vez por dia por cerca de 5, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 95, cerca de 100 ou mais dias consecutivos. Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui para administração sistêmica a um indivíduo em necessidade da mesma compreendem um peptídeo ACT fornecido aqui. Em certas formas de realização, as composições fornecidas aqui para administração sistêmica a um indivíduo em necessidade da mesma compreendem polipeptídeo ACT1 (SEQ ID NO: 2). Em outras formas de realização, as composições fornecidas aqui para administração sistêmica a

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 199/280 / 127 um indivíduo em necessidade da mesma compreendem um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[0120] Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui são administradas sistemicamente de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 24, cerca de 48, ou mais horas após a exposição à radiação ionizante. Em formas de realização particulares, as composições fornecidas aqui são administradas sistemicamente cerca de 24 horas após a exposição à radiação ionizante. Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui são administradas sistemicamente após a exposição à radiação ionizante e antes da manifestação de sintomas de ARS. Em algumas formas de realização, as composições fornecidas aqui são administradas sistemicamente após exposição à radiação ionizante e após manifestação de sintomas de ARS, em que as composições tratam, inibem ou aliviam a progressão de ARS.

[0121] A quantidade exata das composições requeridas variará de sujeito a assunto, dependendo da espécie, idade, peso e condição geral do indivíduo, a severidade do distúrbio alérgico sendo tratado, o ácido nucleico particular ou vetor usado, seu modo de administração e similares. Assim, não é possível especificar uma quantidade exata para cada composição. Entretanto, uma quantidade apropriada pode ser determinada por alguém versado na técnica utilizando apenas experimentação de rotina dado os ensinamentos aqui.

[0122] Os materiais podem estar em solução ou suspensão (por exemplo, incorporados em micropartículas, lipossomas ou células). Estes podem ser dirigidos a um tipo de célula particular através de anticorpos, receptores, ou ligandos de receptor. As seguintes referências são exemplos do uso desta tecnologia para direcionar proteínas específicas para o tecido tumoral (Senter, et al., Bioconjugate Chem. 2: 447 -451, (1991) Bagshawe, K D, Br. J Câncer, 60 : 275 -281, (1989); Bagshawe, et al, Br. J Câncer, 58:

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700 -703, (1988); Senter, et Al., Bioconjugate Chem, 4: 3 -9, (1993); blatli, Et Al., câncer Immunol. Immunother., 35 : 421 -425, (1992); Pietersz e McKenzie, imunolog. Reviews, 129: 57 -80, (1992); e Roller, et al., Biochem Pharmacol, 42: 2062 -2065, (1991). Veículos tais como Stealth e outros lipossomas conjugados de anticorpos (incluindo o direcionamento da droga mediada por lipideo para o carcinoma colônico), alvo mediado por receptor de DNA através de ligantes específicos de células, alvo de tumor direcionado por linfócitos e alvo retroviral terapêutico altamente específico de células de glioma murino in vivo. As seguintes referências são exemplos do uso desta tecnologia para direcionar proteínas específicas para tecido tumoral (Hughes Et Al, Cancer Research, 49: 6214 -6220, (1989); e Litzinger e Huang, Biochimica Et Biophysica Acta, 1104: 179 -187, (1992). Em geral, os receptores estão envolvidos em vias de endocitose, ou constitutivos ou ligandos induzidos. Estes receptores se agrupam em depressões revestidas de citrina, entram na célula através de vesículas revestidas de clatrina, passam através de um endossoma acidificado no qual os receptores são separados, e então a reciclagem para a superfície celular, se toma armazenada intracelularmente, ou é degradada em lisossomas. As vias de intemalização servem a uma variedade de funções, tais como absorção de nutrientes, remoção de proteínas ativadas, depuração de macromoléculas, entrada oportunista de vírus e toxinas, dissociação e degradação de ligante e regulação de nível de receptor. Muitos receptores seguem mais de uma via intracelular, dependendo do tipo de célula, concentração do receptor, tipo de ligante, valência do ligante e concentração do ligante. Mecanismos moleculares e celulares de endocitose mediada por receptor foram revistos (Brown e Greene, DNA and Cell Biology 10: 6, 399 -409 (1991).

[0123] Os veículos adequados e suas formulações São descritos em Remington: The Science And Practice of Pharmacy (19th ed) Ed A R Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa 1995. Tipicamente, uma

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 201/280 / 127 quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável é usada na formulação para tomar a formulação isotônica. Exemplos do veículo farmaceuticamente aceitável incluem, mas não estão limitados a solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução pode ser de cerca de 5 a cerca de 8, de cerca de 7 a cerca de 7,5. Veículos adicionais incluem preparações de libertação prolongada tais como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas, lipossomas ou micropartículas. Será evidente para aqueles versados na técnica que certos veículos podem ser mais preferíveis dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração de composição que está sendo administrada.

[0124] Veículos farmacêuticos são conhecidos por aqueles versados na técnica. Estes mais tipicamente seriam veículos padrões para administração de fármacos a humanos, incluindo soluções tais como água estéril, solução salina, e soluções tamponadas em pH fisiológico. As composições podem ser administradas intramuscular ou subcutaneamente. Outros compostos serão administrados de acordo com procedimentos padrões usados por aqueles versados na técnica.

[0125] as composições farmacêuticas podem incluir veículos, espessantes, diluentes, tampões, conservantes, agentes ativos de superfície e semelhantes, além da molécula de escolha. As composições farmacêuticas também podem incluir um ou mais ingredientes ativos tais como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatórios, anestésicos e similares.

[0126] A composição farmacêutica pode ser administrada de várias maneiras, dependendo de se o tratamento local ou sistêmico é desejado, e sobre a área a ser tratada. A administração pode ser tópica (incluindo oftalmicamente, vaginalmente, retalmente, intranasalmente), oralmente, por inalação, ou parenteralmente, por exemplo por injeção intravenosa,

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 202/280 / 127 subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular. Em certas formas de realização, a administração é por administração tópica. Em certas formas de realização, a administração é por administração sistêmica. Administração sistêmica inclui, por exemplo, administração enteral ou parenteral. Em algumas formas de realização, a administração sistêmica é por injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intradérmica, injeção intramuscular, ou inalação. Em algumas formas de realização, a administração sistêmica é por aplicação aerossolizada.

[0127] Preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Exemplos de solventes não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila. Veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo soluções salinas e tamponadas. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactada, ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (tais como aqueles com base na dextrose deRinger) e semelhantes. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e semelhantes.

[0128] As formulações para administração tópica podem incluir unguentos, loções, cremes, géis (por exemplo, gel poloxâmero), gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Veículos farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e similares podem ser necessários ou desejáveis. As composições apresentadas podem ser administradas, por exemplo, em uma microfibra, polímero (por exemplo, colágeno), nanoesfera, aerossol, loção, creme, tecido, plástico, estrutura de engenharia de tecido, material matriz, comprimido, recipiente implantado,

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 203/280 / 127 pó, óleo, resina, curativo de ferida, pérola, micropérola, conta de liberação lenta, cápsula, injetáveis, gotejos intravenosos, dispositivo de bomba, implantes de silicone, ou quaisquer materiais bioengenheirados. Em algumas formas de realização, a formulação para administração tópica é um protetor solar, bloqueio solar ou formulação similar. Tais composições podem absorver, filtrar, refletir ou bloquear radiação UV do sol ou outra fonte de radiação UV. Assim, em algumas modalidades, a presente descrição proporciona formulações que funcionam tanto para reduzir a exposição à radiação UV e para prevenir, tratar ou mitigar a progressão da radiação UV. Em outras formas de realização, a formulação para administração tópica é uma loção bronzeada, acelerador de bronzeamento, óleo de bronzeamento ou formulação similar. Em algumas formas de realização, o protetor solar, o bloqueio solar, a loção bronzeada, o acelerador de bronzeamento, ou o óleo de bronzeamento, inclui uma quantidade dos polipeptídeos providos aqui que podem impedir, tratar ou mitigar a progressão de uma lesão por radiação causada por luz UV (por exemplo, a partir do sol, um leito de bronzeamento ou outra fonte). Por exemplo, em algumas formas de realização, o protetor solar inclui uma concentração de um polipeptídeo fornecido aqui (por exemplo, de cerca de 0,001% (w/w) a cerca de 5,0% (w/w), ou de cerca de 10 μΜ a cerca de 2.000 μΜ.

[0129] Em um aspecto, o veículo farmaceuticamente aceitável fornecido é um poloxâmero. Os poloxâmeros, referidos pelo nome comercial Pluronics ®, são tensoativos não iónicos que formam géis termorreversíveis claros em água. Poloxâmeros são óxido de polietileno-óxido de polipropileno-óxido de polietileno (PEO-PPO-PEO) copolímeros em tribloco. As duas cadeias de óxido de polietileno são hidrofílicas, mas a cadeia de polipropileno é hidrofóbica. Estas características hidrofóbicas e hidrofílicas tomam carga quando colocadas em soluções aquosas. As cadeias de PEO-PPO-PEO tomam a forma de pequenos filamentos, onde os centros

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 204/280 / 127 hidrofóbicos se juntam para formar micelas. A micela, sequencialmente, tende a ter características de gelificação porque elas se juntam em grupos para formar sólidos (géis) onde a água está apenas ligeiramente presente próxima às extremidades hidrofílicas. Quando é resfriada, torna-se líquida, mas endurece quando aquecido. Esta característica toma útil em composição farmacêutica porque ela pode ser puxada para dentro de uma seringa para medição precisa da dose quando é fria. Quando é aquecida até a temperatura do corpo (quando aplicada à pele), ela espessa a uma consistência perfeita (especialmente quando combinada com lecitina de soja/palmitato de isopropila) para facilitar a dissociação e a adesão apropriadas. O Pluronic® F127 (F127) é amplamente usado porque ele é obtido com facilidade e assim é usado em tais aplicações farmacêuticas. F127 tem uma razão EO: PO: EO de 100: 65: 100, que, em peso, tem uma razão de PEO: PPO de 2: 1. Gel de Pluronic é uma solução aquosa e tipicamente contém 20 - 30% de F-127. Assim, as composições fornecidas podem ser administradas em F127.

[0130] Os excipientes para uso em géis tópicos são bem conhecidos na técnica e os exemplos podem ser encontrados No Handbook of Pharmaceutical Excipients (Rowe, R C et al, Afa Publications; 5th ed, 2005). Os excipientes exemplares podem incluir ceras, vários açúcares e tipos de amido, polímeros, géis, emolientes, agentes espessantes, modificadores de reologia, umectantes, glicerol, compostos básicos orgânicos, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais, polietileno glicóis e solventes. Exemplos de modificadores de reologia incluem Carbopol, hidróxipropil celulose, alquil C26-28 alquil dimeticona, alquil Dimeticona C26-28, polifenilsisiloxano, trimetilsiloxissilicato, polímeros cruzados de ciclopentas siloxano e dimeticona/viniltrimetilsiloxissilicato, silica defumada (por exemplo Cab-O-Sil M5P), e misturas dos mesmos. Exemplos de emolientes incluem glicerina, pentileno glicol, ácido metil pirrolidona carboxílico, lanolina, isomerato de sacarídeo, estearoxi dimeticona, estearil

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 205/280 / 127 dimeticona e misturas dos mesmos. Os emolientes podem ser úteis para evitar a desidratação da camada córnea da epiderme, devido ao uso de solventes anidros na formulação. Exemplos de bases orgânicas incluem 2amino-2-metil propanol, niacinamida, metanolaminas, trietanolaminas, triaminino, AMP-95, amp-Ultra PC 2000, triisopropanolamina, diisopropanolamina, Neutrol TE, Ethomeen e misturas dos mesmos. A base orgânica pode tornar o pH do medicamento básico ou neutro.

[0131] Outros excipientes exemplares incluem porogênios solúveis em água. Um porgeno solúvel em água é um aditivo que pode facilitar A absorção de água e A difusão no gel. Qualquer porogênlo adequado pode ser usado, mas em algumas formas de realização, o porogênlo pode incluir cloreto de sódio, cloreto de potássio, sacarose, glicose, lactose, sorbitol, xilitol, polietileno glicol, polivinil pirrolida, álcool polivinrlico ou suas misturas.

[0132] Polímeros também podem atuar como excipientes em géis tópicos. Polímeros exemplares incluem poliuretanos hidrofílicos, poliacrilatos hidrófilos, co-polímeros de carboximetilcelulose e ácido acrílico, N-vinilpirrolidona, poli (hidróxi ácidos), polianidridos, poliortoésteres, poliamidas, policarbonatos, polialquilenos (por exemplo, polietileno e polipropileno), polialquileno glicóis (por exemplo, poli (etileno glicol), óxidos de polialquileno (por exemplo, óxido de polietileno), tereftalatos de polialquileno (por exemplo, tereftalato de polietileno), álcoois polivimlicos, éteres polivimlicos, ésteres polivinilicos, haletos polivinílicos (por exemplo, poli (cloreto de vinila), polivinilpirrolidona, polissiloxanos, poli (acetatos de vinila), poliestirenos, copolímeros de poliuretano, celulose, celuloses derivadas (por exemplo, hidroxietil celulose, hidróxi propil celulose, hidroxipropil metil celulose, metil celulose, etilcelulose, carboximetil celulose, ou acetato de celulose), alginatos, poli (ácido acrílico), derivados de poli (ácido acrílico), copolímeros de ácido acrílico,

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 206/280 / 127 ácido metacrílico, derivados de ácido metacrílico, copolímeros de ácido metacrílico, ácido poli (butírico), poli (ácido valérico), poli (lactídeo-cocaprolactona), copolímeros dos mesmos e misturas dos mesmos.

[0133] Em algumas modalidades da invenção, os polímeros podem ser polímeros superabsorventes (SAPs). Um polímero é considerado superabsorvente, como definido por IUPAC, como um polímero que pode absorver e reter quantidades extremamente grandes de água em relação a seus próprios SAPs em massa, pode absorver água até 500 vezes seu próprio peso e pode expandir até 1000 vezes seu volume original. Os SAPs específicos de interesse incluem poliacrilato de sódio, o poliuretano Tecfílico TG-2000, e polímeros preparados pelo uso de copolímero de poliacrilamida, copolímero de etileno-anidrido maléico, carbóxi-metil-celulose reticulada, copolímeros de álcool polivinílico, polivinilpirrolina e óxido de polietileno reticulado.

[0134] Em algumas formas de realização da invenção, polímeros que são relativamente hidrofóbicos podem ser usados. Qualquer polímero hidrofóbico adequado pode ser usado. Entretanto, polímeros exemplares que são relativamente hidrofóbicos incluem poliuretanos aromáticos, borracha de silicone, polissiloxanos, policaprolactona, policarbonato, cloreto de polivinila, polietileno, poli-L-lactídeo, poli-DL-glicolídeo, polieteretercetona (PEEK) poliamida, poliimida e acetato de polivinila. Além disso, uma base de gel hidrofóbica e/ou modificador de reologia pode ser usada.

[0135] Em algumas modalidades da invenção, os polímeros podem atuar como agentes espessantes nos medicamentos. Especificamente, a porção polimérica do gel pode agir como uma substância visco-elástica e pode reter o gel no local de aplicação, junto com os polipeptídeos alfa conexina dispersos nele.

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 207/280 / 127 [0136] Em algumas outras formas de realização, um gel que inclui um polímero pode ter uma propriedade de espalhamento, de modo que ele forma uma película fina quando aplicado sobre a superfície da pele. Este filme pode permitir a aplicação dos polipéptidos alfa conexina contidos sobre uma ampla área, podendo servir para manter os polipéptidos alfa conexina sobre a área afetada da pele.

[0137] Os outros excipientes podem incluir vários compostos iónicos ou não iónicos para manter a estabilidade da formulação, desse modo protegendo a desemulsificação, sedimentação, aglomeração ou degradação dos constituintes da formulação que podem reduzir seu valor terapêutico ou estético.

[0138] Exemplos de compostos iónicos podem incluir sais tais como cloreto de sódio, cloreto de potássio; tensoativos catiônicos, aniônicos ou zwitteriônicos, tais como dodecil sulfato de sódio (SDS), perfluorooctanoato (PFOA), perfluorooctanosulfonato (PFOS), lauril sulfato de amónio (ALS), lauril éter sulfato de sódio (SLES), sulfonato de alquil benzeno, brometo de cetil trimetilamônio (CTAB), cloreto de cetilpiridínio (CPC ), amina de sebo polietoxilada (POEA), cloreto de benzalcônio (BAC), cloreto de benzetônio, dodecil betaína, cocamidopropil betaína e glicinato de coco [0139] Exemplos de compostos não-iônicos que podem agir como excipientes incluem Tensoativos não-iônicos, tais Como Pluronic, Tween, AMP, e família Brij de tensoativos; e tensoativos derivados de fontes biológicas, por exemplo, tensoativos naturais ou semi-sintéticos, tal como ácido oléico, trioleato de sorbitano, monooleato de sorbitano, lecitina, MEA de cocamida, cocamida DEA e cocamidopropil Betaína. Os tensoativos (tanto iónicos como não-iônicos) podem reduzir a energia superficial interfacial e podem facilitar o espalhamento da formulação tópica sobre uma área mais ampla.

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 208/280 / 127 [0140] Em algumas formas de realização da invenção, os excipientes solventes podem ser usados como veículo para os polipéptidos alfa conexina e outros excipientes. As cadeias de polímero podem interagir com o solvente e sofrer intumescimento para formar uma rede que pode conferir propriedades visco-elásticas à formulação tópica. Em algumas formas de realização da formulação tópica, o solvente pode evaporar quando da aplicação, deixando uma película residual do polímero junto com os polipéptidos alfa connexina [0141] Os excipientes de solvente exemplares que podem ser úteis em formulações hidrofílicas podem incluir dimetil isosorbida, propileno glicol, glicerol, isopropanol, etanol, álcool benzílico, etileno glicol, polietileno glicol, etoxidiglicol ou suas misturas. Os excipientes solventes exemplares que podem ser úteis em formulações hidrofóbicas podem incluir triglicerídeos cáprico/caprílico, miristato de isopropila, óleo mineral, isododecano, neopentanoato de isodecila, butileno glicol, pentileno glicol, hexileno glicol, metoxipolietilenoglicol, ciclopentassiloxano, ciclotetrassiloxano, dimeticona, caprilil dimeticona ou misturas dos mesmos.

[0142] Em adição aos polipeptídeos e excipientes alfa conexina, a formulação tópica também pode incluir pelo menos um agente terapêutico adicional como agentes antimicrobianos, agentes anti-acne, agentes antiinflamatórios, agentes analgésicos, agentes anestésicos, agentes antihistamínicos, agentes anti-sépticos, imunossupressores, agentes antihemorrágicos, vasodilatadores, agentes de cicatrização de feridas, agentes anti-biofilme e misturas dos mesmos.

[0143] Exemplos de agentes antimicrobianos incluem penicilinas e drogas relacionadas, carbapenems, cefalosporinas e drogas relacionadas, eritromicina, aminoglicosídeos, bacitracina, gramicidina, mupirocina, cloranfenicol, tianfenicol, fusidata sódica, lincomicina, clindamicina, macrolídeos, novobioina, poliyxinas, rifamicinas, spectinomina,

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71/127 tetraciclinas, vanomicina, tecoplanina, estreptograminas, agentes anti-folato, incluindo sulfonamidas, trimetioparo e suas combinações e pirimetamina, antibacterianos sintéticos incluindo nitrofuranos, mandelato de metenamina e hipurato de metenamina, nitroimidazóis, quinolonas, fluoroquinolonas, isoniazido, etambutol, pirazinamido, ácido para-aminosalicilico (PAS ), cicloserina, caprenomicina, etilionamida, protionamida, tiaceina, viomicina, eeminmicina, glicopeptideo, gliclclonclina, cetolides, oxazolidinona; imipenen, amicacina, netilmicina, fosfmicina, gentamicina, ceftriaxona, Ziracina, Linezolid, sinercóide, Aztreonam e Metronidazol, Epiroprim, Sanfetrona sódico, Biapenem, Dynemicina, Cefluprenam, Cefoselis, Sanfetrona celexetil, Cefpiroma, mersacidina, Rifalazil, Kosan, Lenapena, Venezprim, Sulopenem, ritipenam acoxila, ciclotialidina, Micacocidina A, carumbido, Cefozopran e Cefetamet pivoxil.

[0144] Exemplos de agentes antiacne tópicos incluem adapaleno, ácido azelaico, peróxido de benzoíla, clindamicina e fosfato de clindamicina, doxiciclina, eritromicina, queratolíticos, tais como ácido salicílico e ácido retinóico (Retin-A), norgestime, peróxidos orgânicos, retinóides, tais como isotretinoína e tretinoína, sulfacetamida sódica e tazaroteno. Agentes anti-acne específicos incluem adapaleno, ácido azelaico, peróxido de benzoíla, clindamicina (por exemplo, fosfato de clindamicina), doxiciclina (por exemplo, doxiciclina monohidrato), eritromicina, isotretinoína, norgestimativa, sulfacetamida sódica, tazaroteno, etretinato e acetontina.

[0145] Exemplos de agentes anti-histamínicos incluem cloridrato de difenidramina, salicilato de difenidramina, difenidramina, cloridrato de clorfenamina, cloridrato de cloreto de clorfenazina, cloridrato de tripelenina, cloridrato de prometazina, cloridrato de metilina, e semelhantes. Exemplos de agentes anestésicos locais incluem cloridrato de dibucaína, dibucaína, cloridrato de lidocaína, lidocaína, benzocaína, ácido p-butilaminobenzóico 2-(metil-etilamino) cloridrato de acetato de etila, cloridrato de procaína,

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 210/280 / 127 tetracaína, cloridrato de tetracaína, cloridrato de cloroprocaína, cloridrato de oxiprocaína, mepivacaína, cloridrato de cocaína, cloridrato de piperocaína, diclonina e cloridrato de diclonina.

[0146] Exemplos de agentes anti-sépticos incluem álcoois, compostos de amónio quaternário, ácido bórico, clorexidina e derivados de clorexidina, iodo, fenóis, terpenos, bactericidas, desinfetantes incluindo timerosal, fenol, timol, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, clorexidina, povidona iode, cloreto de cetilpiridínio, eugenol e brometo de trimetilamônio.

[0147] Exemplos de agentes antiinflamatórios incluem agentes antiinflamatórios não esteroidais (NSAIDs); derivados de ácido propiônico tais como ibuprofeno e naproxeno; derivados de ácido acético tais como indometacina; derivados de ácido enólico tais como meloxicam, acetaminofeno; salicilato de metila; salicilato de monoglicol; aspirina; ácido mefenâmico; ácido flufenâmico; indometacina; diclofenaco; alclofenac; diclofenaco sódico; ibuprofeno; cetoprofeno; naproxeno; pranoprofeno; fenoprofeno; sulindoac; fenclofenac; clidanac; flurbiprofeno; fentazac; bufexac; piroxicam; fenilbutazona; oxifenbutazona; clofezona; pentazocina; mepirizol; cloridrato de tiaramida; esteróides tais como propionato de clobetasol, dipropionato de bethetasona, propionato de diflorasona, fluocinonida, halcinonida, amcinonida, desoximetasona, acetonida de triancinolona, furoato de mometasona, propionato de fluticasona, dipropionato de triancinolona, acetonida de triancinolona, propionato de fluticasona, acetonida, acetonida de fluocinolona, vlaerato de hidrocortisona, acetonarbato, acetonida de triancinolona, acetonida de fluocinolona, hidrocortisona e outros conhecidos na técnica, predonisolona, dexametasona, acetonida de fluocinolona, acetato de hidrocortisona, acetato de prenisolona, metilpredonisolona, acetato de dexametasona, betametasona, valerato de betametasona, flumetasona, fluoroetolona, dipropionato de beclometasona, fluocinonida, corticosteróides tópicos, e pode ser um dos

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 211/280 / 127 corticosteróides de potência mais baixa tal como hidrocortisona, derivados de hidrocortisona-21-monoésteres (por exemplo, nicotinamida-21-acetato, hidrocortisona-21 -butirato, hidrocortisona-21 -propionato, hidrocortisona21-valerato, etc. ), derivados de hidrocortisona-17.21-diésteres (por exemplo, dexametasona-17.21-diacetato, hidrocortisona-17-acetato-21butirato, hidrocortisona-17.21-dibutirato, etc.), alcinmetasona, dexametasona, flumetasona, prednisolona, ou metilprednisolona, ou pode ser um corticosteróide de potência mais elevada tal como propionato de clobetasol, benzoato de betametasona, dipropionato de betametasona, diacetato de diflorasona, fluocinonida, furoato de mometasona, acetonida de triancinolona.

[0148] Exemplos de agentes analgésicos incluem alfentanil, benzocaína, buprenorfina, butoranol, butameno, capsaicina, clonidina, codeína, dibucaína, encefalina, fentanil, hidrocodona, hidromorfona, indometacina, lidocaína, levoranol, meperidina, metadona, morfina, nicmorfina, opólio, oxibuprocaína, oxicodona, oximorfona, pentazocina, pramoxina, proparaína, propoxifeno, proxymetacaína, sufentanil, tetracaína e tramadol.

[0149] Exemplos de agentes anestésicos incluem álcoois tais como fenol; benzoato de benzila; calamina; cloroxilenol; discionina; cetamina; mentol; pramoxina; resorcinol; troclosan; drogas de procaína tais como benzocaína, bupivacaína, cloroprocaína; cinchocaína; cocaína; dexivacaína; diamocaína; dibucaína; etidocaína; hexilcaína; levobupivacaína; lidocaína; mepivacaína; oxetazaína; prilocne; procaína; proparaína; propoxicaína; pirrolina; risocaína; rodocaína; ropivacaína; tetracaína; e derivados, tais como sais farmaceuticamente aceitáveis e ésteres incluindo bupivacaína HCI, Cloroprocaína HCI, dibucaína, ciclamato, dibucaína HCI, diclononina HCI, HCI etidocaína, HCI De Levobupivacaína, HCI de Lidocaína, HCI de

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 212/280 / 127 pivacaína, HCI de pramoxina, HCI de praminol, HCI de Procaína, HCI de proparaína, HCI de propoxicaína, HCI De ropivacaína e HCI de tetracaína.

[0150] Exemplos de agentes antihemorrágicos incluem trombina, fitonadiona, sulfato de protamina, ácido aminocapróico, ácido tranexico, carbazocromo, sulfato de carbaxocromo, rutina e hesperidina.

[0151] Além do componente de polipeptídeo bioativo, a presente invenção também pode conter outros agentes ativos tais como niacinamida, fitantriol, famesol, bisabolol e ácido salicílico. Espera-se que certos agentes ativos adicionais atuarão sinergicamente com o componente de peptídeo bioativo, ou melhorarão a vida de prateleira da formulação.

[0152] Exemplos de tratamentos de feridas que podem ser usados junto com o produto de fármaco da presente invenção incluem enzimas fibrinolíticas, tais como fibrinoliina, desoxirribonuclease, estreptoquinase e estreptodomase, agentes de tecido necrottomia contendo cloreto de lisozima, agentes antimicrobianos contendo sulfato de gentamicina, prata de sulfadiazina, bacitracina, e sulfato de fradimicina, agentes incnolantes contendo traferminina, sódio de butodesina, tretinoína de tretinoína (tocoretinato ), alprosteridil alfadex, solcoseril (extrato de sangue hemolizado de gado jovem), e alcloxa, preparações de iodo contendo açúcar branco suave, iodopovidona e iodo, e preparações contendo bendazac, dimetil isopropilazuleno (guaiazuleno) e epinefrina como ingredientes ativos.

[0153] Em adição aos polipeptídeos alfa conexina, excipientes e outros agentes terapêuticos, os géis também podem incluir outros compostos que melhoram as propriedades organolépticas da formulação tópica.

[0154] Exemplos de tais compostos incluem perfumes, corantes e corantes; agentes quelantes incluindo mas não limitados a Edetato dissódico (EDTA), EGTA, CP94, ácido cítrico, conservantes incluindo mas não

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 213/280 / 127 limitados a compostos de amônio quaternário, tais como cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, cetrimida, cloreto de dequalínio e cloreto de cetilpiridínio; agentes merclal, tais como nitrato fenilmercúrico, acetato fenilmercúrico e timerosal; agentes alcoólicos, por exemplo, clorobutanol, álcool feniletílico, e álcool benzrlico; ésteres antibacterianos, por exemplo, ésteres de ácido parahidroxibenzóico; e outros agentes antimicrobianos tais como cloroexidina, clorocresol, ácido benzóico e polimixina.

[0155] Em certas formas de realização, é fornecida uma formulação tópica compreendendo pelo menos um polipeptídeo de alfa conexina e gel de hidroxietilcelulose, em que o gel de hidroxietilcelulose estabiliza o polipeptídeo de alfa conexina. Em certas modalidades, o gel de hidroxietilcelulose estabiliza o polipeptídeo alfa connexin, de modo que após 3 meses de armazenamento a 5°C, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% do polipeptídeo alfa connexin é detectável por métodos analíticos. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo alfa conexina está presente na formulação em uma concentração de cerca de 0,0025% (w/w), de cerca de 0,005% (w/w), de cerca de 0,0075% (W/w), de cerca de 0,010% (w/w), de cerca de 0,015% (w/w), de cerca de 0,020% (w/w), de cerca de 0,025% (w/w), de cerca de 0,030% (w/w), de cerca de 0,035% (W/w), de cerca de 0,040% (w/w), de cerca de 0,045% (w/w), de cerca de 0,050% (w/w), de cerca de 0,055% (w/w), de cerca de 0,060% (W/w), de cerca de 0,065% (w/w), de cerca de 0,070% (w/w), de cerca de 0,075% (w/w), de cerca de 0,080% (w/w), de cerca de 0,085% (w/w), de cerca de 0,090% (W/w), de cerca de 0,095% (w/w), de cerca de 0,100% (w/w), de cerca de 0,150% (w/w), de cerca de 0,200% (w/w), de cerca de 0,250% (W/w), de cerca de 0,500% (w/w), de cerca de 1, 00% (w/w), de cerca de 1, 00% (w/w), de cerca de 1,50% (w/w), de cerca de 2,00% (w/w), de cerca de 2,50% (W/w), ou de cerca de 3,00% (w/w), ou de cerca de 3,50% (w/w), ou

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 214/280 / 127 de cerca de 4,00% (w/w), ou de cerca de 4,50% (w/w), ou de cerca de 5,00% (W/w) ou mais. Em uma modalidade, o polipeptídeo alfa conexina está presente na formulação em uma concentração entre cerca de 0,005% (W/w) e cerca de 1,00% (w/w).

[0156] em outras modalidades, o produto de fármaco da invenção é um gel incolor claro que contém 0,0072% (w/w) (20 μΜ) do peptídeo ACT, 0,018% (w/w) (50 μΜ ) do peptídeo ACT, 0,036% (w/w) (100 μΜ) Do peptídeo ACT, 0,072% (W/w) (200 μΜ) do peptídeo ACT, ou 0,36% (w/w) (1000 μΜ) do peptídeo ACT. O peptídeo ACT pode ser dissolvido em uma forma de dosagem semi-sólida que contém > 0% de água, > 10% de água, > 20% de água, > 30% de água, > 40% de água, > 50% de água, > 60% de água, > 70% de água, > 80% de água, ou > 90% de água e 0,25% de agente de gelificação (polímero), 0,55% de agente de gelificação (polímero), 0,75% de agente de gelificação (polímero), 1,00% de agente de gelificação (polímero ), 1,25% de agente de gelificação (polímero), 1,50% de agente de gelificação (polímero), 1,75% de agente de gelificação (polímero), 2,00% de agente de gelificação (polímero), 2,25% de agente de gelificação (polímero), ou 2,50% de agente de gelificação (polímero), ou 3,00% de agente de gelificação (polímero), ou 3,50% de agente de gelificação (polímero ), ou 4,00% de agente de gelificação (polímero), ou 4,50% de agente de gelificação (polímero), ou 5,00% de agente de gelificação (polímero).

[0157] Em certas modalidades, o peptídeo ACT pode ser bem preservado e adequadamente tamponado a cerca de pH 5,5, cerca de pH 6, cerca de pH 6,5, cerca de pH 7, cerca de pH 7,5 ou cerca de pH8. Em certas modalidades da formulação tópica, a composição qualitativa e quantitativa é apresentada na Tabela 7.

Tabela 7:

Formulação quantitativa de Gel de Produto e composição quantitativa

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Ingredientes	Grau	Função	Concentração (% w/w)
Peptídeo 328967 (peptídeo ACT)	—	Ativa	0.0072; 0.018 0.036; 0.072
Metilparabeno	NF	Preservativa	0.17
Propilparabeno	NF	Preservativa	0.02
Glicerina	USP	Solvente	5.0
Fosfato de sódio monobásico	USP	Agente tampão	0.263
Fosfato de sódio dibásico	USP	Agente tampão	0.044
Propilenoglicol	USP	Solvente	3.0
Edetato dissódico	USP	Agente quelante	0.05
D-Manitol	USP	Estabilizador	0.05
Hidroxietilcelulose, 250HHX	NF	Agente gelificante	1.25%
Agua purificada, qsad	USP	Solvente	100%

[0158] A sequência de peptídeos ACT1 é listada na tabela 8 abaixo em que Ahx refere-se a ácido L-2-aminohexanóico, também conhecido como ácido 6-aminohexanóico:

Tabela 8: Sequência de Peptídeo 328967 (ACT1) (SEQ ID NO: 91)

Biotina-Ahx-Arg-Gln-Pro-Lys-lle-Trp-Phe-Pro-Asn-Arg-Arg-Lys-Pro-Trp-Lys-LysArg-Pro-Arg-Pro-Asp-Asp-Leu-Glu-lle-OH [0159] As Propriedades gerais do peptídeo 328967 São listadas na tabela 9 abaixo.

Tabela 9: Propriedades Físicas Gerais do Peptídeo 328967

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Aparência física	Pó branco a esbranquiçado
Peso molecular	3597.33 ± 2.0 amu
íon-contrário	AcOH
Solubilidade	Solubilidade em água em temperatura ambiente

[0160] Em certos aspectos, os excipientes usados na preparação tópica do produto de fármaco são selecionados a partir do grupo que consiste em ou são um ou mais dos seguintes:

Metilparabeno

Propilparabeno

Glicerina

Fosfato de sódio Monobásico

Fosfato Dibásico de sódio

Propileno Glicol

Edetato Dissódico (EDTA)

D-Manitol

Hidroxietilcelulose, 250 HHX

Agua purificada [0161] Em algumas formas de realização, a preparação tópica de produto de fármaco compreende um peptídeo, D-manitol, hidroxietilcelulose e água purificada. A dita preparação pode ainda compreender um ou mais de metilparabeno, propilparabeno, glicerina, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico, propileno glicol, e edetato dissódico (EDTA). Em outras modalidades, a hidroxietilcelulose é 250 HHX. Em outras formas de realização, o peptídeo é um polipeptídeo alfa conexina.

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 217/280 / 127 [0162] Em algumas formas de realização, a preparação tópica de produto de fármaco compreende um peptídeo em uma concentração entre cerca de 0,001% (w/w) e cerca de 0,5% (w/w) (por exemplo, a cerca de 0,0072%, 0,018%, 0,036%, ou 0,072% (w/w)); metilparabeno em uma concentração entre cerca de 0,10% (w/w) e cerca de 0,25% (w/w) (por exemplo, cerca de 0,17% (w/w) ); propilparabeno em uma concentração entre cerca de 0,01% (w/w) e cerca de 0,03% (w/w) (por exemplo, cerca de 0,02% (w/w)); glicerina em uma concentração entre cerca de 1% (w/w) e cerca de 10% p/ W) (por exemplo, cerca de 5% (w/w)); fosfato de sódio monobásico em uma concentração entre cerca de 0,1% (w/w) e cerca de 0,5% (w/w) (por exemplo, cerca de 0,263% (w/w) ); fosfato de sódio dibásico a uma concentração entre cerca de 0,02% e cerca de 0,06% (por exemplo, cerca de 0,044% (w/w); propileno glicol em uma concentração entre cerca de 1% (w/w) e cerca de 5% (W/w) (por exemplo, cerca de 3% (w/w)); EDTA em uma concentração entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% (por exemplo, cerca de 0,05% (w/w)); D-manitol em uma concentração entre cerca de 0,01% (w/w) e cerca de 0,1% (w/w) (por exemplo, cerca de 0,05% (w/w)); hidroxietilcelulose em uma concentração entre cerca de 0,5% e cerca de 2,5% (por exemplo, cerca de 1,25% (w/w) ) e água purificada em uma concentração de cerca de 0,1% a cerca de 10% (por exemplo, cerca de 1%). Em outras formas de realização, o peptídeo é um polipeptídeo alfa conexina.

[0163] Derivados através de estudos in vitro e in vivo, estes estabilizantes e excipientes são incorporados no produto de fármaco uma vez que eles são não-irritantes, não-manchantes e não-imunogênicos. Estudos de estabilidade mostraram que o peptídeo ACT1 é mais estável no agente gelificante hidroxietilcelulose, 250 HHX (1,25%) em comparação com os géis Pluronic. O peptídeo ACT dentro do produto de fármaco contendo 1,25% de hidroxietilcelulose veio a 98% da reivindicação de rótulo (isto é, concentração inicial) quando armazenado a 5°C. Para três meses e 84% da

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 218/280 / 127 reivindicação de rótulo quando armazenado a 25 °c para a mesma duração. Em um aspecto da invenção, edetato dissódico (EDTA) e Manitol são incorporados no produto de fármaco para fornecer estabilidade ao peptídeo ACT1. Em algumas formas de realização da invenção, o Manitol está presente na formulação a 0,01% (w/w) a 1,6% (W/w), 0,01% (w/w) a 1,5% (w/w), 0,01% (w/w) a 1,4% (w/w), 0,01% (W/w) a 1,3% (w/w), 0,01% (w/w) a 1,2% (w/w), 0,01% (w/w) a 1,1% (W/w), 0,01% (w/w) a 1,0% (w/w), 0,01% (w/w) a 0,9% (w/w), 0,01% (w/w) a 0,8% (W/w), 0,01% (w/w) a 0,7% (w/w), 0,01% (w/w) a 0,6% (w/w), 0,01% (w/w) a 0,5% (w/w), 0,01% (w/w) a 0,4% (w/w), 0,01% (w/w) a 0,3% (W/w), 0,01% (w/w) a 0,2% (w/w), 0,01% (w/w) a 0,1% (w/w), ou 0,01% (W/w) a 0,0,05% (w/w). Em modalidades específicas, o Manitol está presente na formulação a cerca de 0,05% (w/w).

[0164] em outros aspectos, um agente de tamponamento é incluído na formulação tópica para manter o pH em uma certa faixa. Agentes de tamponamento adequados podem incluir, mas não estão limitados a: tampões de acetato, tampões de citrato, tampões de fosfato, tampões de ácido láctico, tampões de ácido málico, tampões de ácido succínico, tampões de borato, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e hidróxido de amónio. Sais de fosfato tais como fosfato de monossódio (nah2p04; também conhecido como fosfato de sódio monobásico), fosfato de hidrogênio dissódico (na2hp04; também Conhecido Como fosfato de sódio dibásico), fosfato de monopotássio (KH2P04), fosfato de dipotássio (K2HP04), e misturas dos mesmos também podem ser usados. Em certas formas de realização, o tampão de fosfato proporciona estabilidade superior em comparação com o tampão de citrato. Em determinados aspectos, descobriu-se que uma capacidade de tampão a 25 mM é adequada para o produto de fármaco. O tampão é necessário para controlar o pH do sistema de gel e para manter a estabilidade do fármaco do peptídeo. Em certas modalidades, a faixa de pH

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81/127 da formulação tópica pode ser pH 2 a pH 12, pH 4 a pH 10 ou pH 6 a pH 8. Em algumas modalidades, o pH da formulação tópica da presente invenção é de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0. Em outros aspectos, propileno glicol na quantidade de 3% fornece melhor solubilização de parabenos no sistema aquoso.

[0165] Em algumas formas de realização, a formulação com um peptídeo ACT incorporado em hidroxietilcelulose permite a produção em grande escala de um produto com as características que tornam prática para tratamentos clínicos bem como as exigências de armazenamento e estabilidade desejadas. Enquanto uma formulação para ACT1 usando O gel de Pluronic pode requerer um tempo de incorporação relativamente longo de aproximadamente 2,5 horas e somente produzir bateladas de 50 gramas, uma formulação com hidroxietilcelulose proporciona uma incorporação significativamente mais rápida do peptídeo ACT no gel e produz bateladas muito maiores. Por exemplo, quando se usa o gel de Pluronic F 127 na formulação tópica, leva mais de uma hora para incorporar o polímero, e a formulação precisa ser colocada em um banho de água para ajudar a incorporar a incorporação. Em contraste, hidroxietilcelulose (por exemplo, HEC 250 HHX) é facilmente incorporada à temperatura ambiente e hidratos dentro de 30 minutos. Assim, o uso de hidroxietilcelulose pode facilitar a fabricação em grande escala. O processo de fabricação com gel de Pluronic pode requerer um banho frio para trazer a sua viscosidade para uma faixa desejada e requerer mais energia do que o processo de fabricação com hidroxietilcelulose. Além disso, a formulação final em gel de Pluronic pode ser muito fina a uma condição de armazenamento de 5°C.

[0166] Descobriu-se que hidroxietilcelulose (HEC) é um agente gelificante adequado e veículo aceitável do produto de fármaco da presente invenção. Em algumas modalidades, o agente gelificante é hidroxietilcelulose (HEC), 250 HHX. Em certas modalidades, a percentagem

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 220/280 / 127 (w/w) de HEC está na faixa de 1 a 5%. Em outras modalidades, a porcentagem (W/w) de HEC é de 1,25%. Na fabricação de HEC, uma celulose purificada é reagida com hidróxido de sódio para produzir uma celulose alcalina expandida. A celulose tratada com álcali é mais quimicamente reativa do que a celulose. Pela reação da celulose alcalina com óxido de etileno, é produzida uma série de éteres de hidroxietilcelulose. Nesta reação, os átomos de hidrogênio nos grupos hidroxila de celulose são substituídos por grupos hidroxietila, que conferem solubilidade em água ao gel. Contempla-se nesta invenção que um único éter HEC pode ser usado, ou uma mistura de éteres HEC de peso molecular de diferença e estrutura pode ser usada. Graus adequados de HEC para propósitos farmacêuticos são bem conhecidos e completamente descritos na literatura farmacêutica. As marcas comercialmente disponíveis adequadas de HEC incluem, mas não estão limitadas a, Fuji HEC-HP; Fuji HEC-AG 15; NATO-SOL 250 HR; NATROSOL 250 MH; NATROSOL 250G; CELLOSIZE QP 30000; TYLOSE h SERIES; NATROSOL 180L; NATROSOL 300H; TYLOSE PX; NATROSOL 250M; CELLOSIZE WP 4400; CELLOSIZE UT 40; NATROSOL 250 H4R; Tyloh 20P; NATROSOL LR; TYLOSE MHB; NATROSOL 250 HHP; HERULES N 100; CELLOSIZE WP 300; TYLOSE P-Z SERIES; NATROSOL 250H; TYLOSE PS-X; Celbond HEC 400; CELLOSIZE QP; CELLOSIZE QP 1500; NATO-SOL 250; HYNLOSE MHB-Y; NATROSOL 240 JR; HYDROXYESTARCH; CELLOSIZE WP; CELLOSIZE WP 300H; 2-HIDROXIETIL CELLULOSE ETAER; BL 15; CELLOSIZE QP 4400; CELLOSIZE QP3; TYLOSE MB; CELLULOSE HYDROXY-TEATE; CELLOSIZE WPO 9H17; CELLOSIZE 4400H16; CELLULOSE HYDROXIETIL ETAER; Hidroxietil Celulose; hidróxi etil celulose (HEC ); hidroxietil celulose 100H (celocell lOOh); TYLOSE MHXP; NATROSOL 250 HX; natrosol; Daicel EP 500; HEC-Unicel; HEC (hidroxietil celulose ); celusize; HEC-al 5000; Fuji HEC-AL 15; HEC

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Unicel QP 09L; celulose, éteres, 2-hidroxietil éter; Unicel QP 52000H; HECQP 4400; SP 250 (celulose ); Hetaamido; celulose, éteres, 2-hidroxietil éter; Glutofix 600; FL 52; Fuji HEC-AX 15F; tyloh 300P; HEC-Unicel QP 300H; tyloh 300; Daicel SP 550; daDASE 600; Unicel QP 15000; HEC-QP 100 MH; HEC-QP 9H; OETs; Daicel EP 850; h E celulose; Celbond 25T; Unicel QP 100 MH; tyloh 4000; SE 850K; Tylomer h 20; daYSE 850K; tyloh 30000 YP; Unicel QP 4400; SP 407; tyloh 100000; daac SP 200; Culminai HEC 5000 PR; Tlopur H 300; Daac SP 750; Sanhec; BL 15 (derivado de celulose); Unicel QP 300H; tymer H 200; J 164; tyloh 10; tyloh 20; AH 15; Daicel SP 600; DaDASE 900; HEC-Unicel QP 4400H; AX 15; DairSP 800; Fuji HECAW 15F; HEC-SE 850; HEC-A 5 -25 CF; Metolose 90 SEW; AW 15 (Polissacarideo ); Celbond HEC 5000; HEC-QP 100M; Celbond HEC 15A; tyloh 1500YP2; Walocel HT 6,000 PFV; 2-hidroxietil celulose (natrosol tipo 250 HRCS); Fuji HEC-BL 20; Fuji HEC-SY 25F; Telhec; HEC-SP 200; HEC-AH 15; HEC-Unicel QP 30000H; ver; HEC 10A; DavelSP 400; admial 3089 FS; Fuji HEC-A 5000F; HEC-SP 400; hidroxietil metil celulose (HEMC); HYDROXYETIL CELLOSE (HEC ); Hidróxi etil celulose (CAS No: 9004 -62 -0); Hidróxi Etil celulose; natrosol [Aquaion]; HEC; 2HIDROXIETIL CELLOSE; NATROSOL 150L; TYLOSE MHB-YP; HYDROXYETIL ETAER CELLOSE; NATROSOL 250L; CELLOSIZE WP 400H; TYLOSE P; CELLULOSE, 2-HIDRÓXI ETIL ETAER; TYLOSE MH-K; NATROSOL 250 HHR.

[0167] Em outras formas de realização, o produto de fármaco da presente invenção é embalado em Frasco de 20 mL (tipo USP I, vidro de cintilação transparente de borossilicato com tampa de parafuso de ureia em cone de poli-vedação). Uma mistura de metilparabeno a 0,17% (w/w) e propilparabeno 0,02% (w/w) é usada como um conservante.

[0168] em algumas formas de realização, a presente invenção inclui um método de reação ou prevenção de lesões por radiação em um indivíduo em

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 222/280 / 127 risco de tal dano, compreendendo administrar ao indivíduo uma formulação tópica compreendendo pelo menos um polipeptídeo de alfa conexina e gel de hidroxietilcelulose, em que o gel de hidroxietilcelulose estabiliza o polipeptídeo de alfa connexin. Em certas formas de realização, o produto de fármaco da presente invenção pode ser usado para mitigar a formação de cicatriz excessiva associada com dano por radiação. Nestas formas de realização, o produto de fármaco da presente invenção pode ser aplicado no momento de exposição à radiação, 1 hora após exposição à radiação, 2 horas após a exposição à radiação, 3 horas após a exposição à radiação, 4 horas após a exposição à radiação, 5 horas após a exposição à radiação, 6 horas após a exposição à radiação, 7 horas após a exposição à radiação, 8 horas após a exposição à radiação, 9 horas após a exposição à radiação, 10 horas após a exposição à radiação, 11 horas após a exposição à radiação, 12 horas após a exposição à radiação, 13 horas após a exposição à radiação, 14 horas após a exposição à radiação, 15 horas após a exposição à radiação, 16 horas após a exposição à radiação, 17 horas após a exposição à radiação, 18 horas após a exposição à radiação, 19 horas após a exposição à radiação, 20 horas após a exposição à radiação, 21 horas após a exposição à radiação, 22 horas após exposição à radiação 23 horas após exposição à radiação, 24 horas após exposição à radiação, 48 horas após exposição à radiação, 72 horas após exposição à radiação, ou depois disso.

[0169] Em outros aspectos, o produto fármaco é fabricado com as seguintes etapas:

[0170] Etapa 1 : em um tamanho adequado do béquer, adicionar propileno glicol, glicerina, metilparabeno e propilparabeno. Misturar com um propulsor até que os parabenos estejam completamente dissolvidos.

[0171] Etapa 2: em um recipiente de fabricação, adicionar Agua purificada (Parte I), EDTA, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 223/280 / 127 dibásico e D-manitol. Mistura com um propulsor até que seja obtida uma solução límpida.

[0172] Etapa 3 : adicionar a solução da etapa 1 ao recipiente de fabricação. Enxaguar o béquer com água purificada (parte II, dividida em aproximadamente 3 partes iguais) e adicionar o enxaguamento de volta ao recipiente. Continuar com a mistura em hélice até que a solução seja visualmente homogênea.

[0173] Etapa 4: com mistura de homogeneização, adicionar hidroxietil celulose no recipiente de Fabricação a partir da etapa 3. Misturar até que o polímero esteja totalmente disperso.

[0174] Etapa 5 : em um béquer separado, adicionar Agua purificada (parte III) e um Polipeptídeo alfa connexin (por exemplo, peptídeo 328967, peptídeo ACT1). Mistura com uma barra de agitação ou misturador de hélice, até que o peptídeo seja completamente dissolvido e seja formado um gel.

[0175] Etapa 6 : com mistura contínua de hélice, adicionar a solução de fármaco da etapa 5 ao recipiente de fabricação. Enxaguar o béquer com água purificada (parte IV, dividida em aproximadamente 3 partes iguais) e adicionar o enxaguamento de volta ao recipiente. Misturar até que o gel fique homogêneo.

[0176] O fluxograma do processo de fabricação é apresentado na figura

3.

[0177] Formulações de polipeptídeos alfa connexina que podem ser usadas na presente invenção são descritas em detalhes Na Patente US No. 4.846.605, que é aqui incorporada por referência. Os conteúdos inteiros das Patentes US Nos. 786.074, 7.888.319; 8.357.668; 8.809.257; 8.859.733; 8.916.515; e 394.351; 9.408.381; 9.844.214; e 9, 8955.313 são também aqui incorporados para referência.

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 224/280 / 127 [0178] Composições para administração oral incluem pós ou grânulos, suspensões ou soluções em meios aquosos ou não aquosos, cápsulas, sachês ou comprimidos. Espessantes, aromatizantes, diluentes, emulsificantes, auxiliares dispersantes ou aglutinantes podem ser desejáveis.

[0179] Algumas das composições podem ser potencialmente administradas como um sal de adição de ácido ou base farmaceuticamente aceitável, formado pela reação com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociânico, ácido sulfúrico, e ácido fosfórico, e ácidos orgânicos tais como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maléico e ácido fumárico, ou por reação com uma base inorgânica tal como hidróxido de sódio, hidróxido de amónio, hidróxido de potássio, e bases orgânicas tais como mono-, di-, trialquil e aril aminas e etanolaminas substituídas.

[0180] Dosagens eficazes e cronogramas para a administração das composições podem ser determinadas empiricamente, e a obtenção de tais determinações está dentro da habilidade na técnica. As faixas de dosagem para a administração das composições são aquelas grandes o bastante para produzir o efeito desejado no qual os sintomas do distúrbio são efetuados. A dosagem não deve ser tão grande para causar efeitos colaterais adversos, tais como reações transversais indesejadas, reações anafiláticas e similares. Geralmente, a dosagem variará com a idade, condição, sexo e extensão da doença no paciente, via de administração, ou se outras drogas estão incluídas no regime, e pode ser determinado por uma pessoa versada na técnica. A dosagem pode ser ajustada pelo médico individual no caso de quaisquer contraindicações. A dosagem pode variar, e pode ser administrada em uma ou mais administrações de doses diárias, por um ou vários dias. Orientação pode ser encontrada na literatura para dosagens apropriadas para determinadas classes de produtos farmacêuticos. A faixa de dosagem

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 225/280 / 127 depende grandemente da aplicação das composições aqui, da gravidade da condição e da sua via de administração.

[0181] Por exemplo, em aplicações como uma ferramenta de laboratório para pesquisa, as composições de peptídeos ACT podem ser usadas em doses tão baixas quanto 0,01 % em peso/ v a dosagem pode ser tão baixa quanto 0,0002% p/v e possivelmente tão alta quanto 20% p/v em tratamentos tópicos para ferimentos da pele. Concentrações significativamente maiores das composições por si só ou em combinação com outros compostos podem ser usadas em aplicações como terapia de câncer/tumor ou bolus concentrado precoce imediatamente seguindo uma lesão aguda do tecido, tal como o CRI. Os limites superiores recomendados de dosagem para vias parenterais de administração, por exemplo, intramuscular, intracerebral, intracardinal e intra-espinhal, podem ser até 1 % p/v ou v/v, dependendo da severidade da lesão. Este limite superior de dosagem pode variar por formulação, dependendo, por exemplo, de como o polipeptídeo (s) é combinado com outros agentes que promovem sua ação ou atuando em conjunto com o polipeptídeo (s).

[0182] Para distribuição contínua dos polipeptídeos providos, por exemplo, em combinação com um gotejamento intravenoso, limites superiores de 0,01 g/Kg de peso corporal sobre cursos de tempo determinados pelo médico com base no aperfeiçoamento na condição podem ser usados. Em outro exemplo, os limites superiores de concentração dos ácidos nucleicos providos aplicados topicamente, por exemplo, em ferimentos de pele devem ser de 5 a 10 g/cm2 de feridas, dependendo, por exemplo, de como o ácido nucleico é combinado com outros agentes que promovem sua ação ou atuando em conjunto com os ácidos nucleicos. Isto seria repetido em uma frequência determinada pelo médico com base no aperfeiçoamento. Em outro exemplo, os limites superiores de concentração dos ácidos nucleicos fornecidos distribuídos internamente, por exemplo,

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 226/280 / 127 intramuscular, intracerebral, intracardíaca e intra-espinhal seria de 50 a 100 mg/ml de solução. Novamente, a frequência seria determinada pelo médico com base no aperfeiçoamento.

[0183] Também é descrito o pré-condicionamento de uma área com os polipeptídeos fornecidos antes da cirurgia. A concentração dos polipeptídeos pode ser de 10 a 200%, misturada com 10 a 30% de gel de pluronic ou qualquer tal veículo que permita a penetração do peptídeo (S) dentro do local de interesse por um período de pelo menos 3 -6 horas antes da cirurgia. Este condicionamento pré-procedimento pode melhorar a resposta de cura subsequente à cirurgia, incluindo resposta inflamatória reduzida.

[0184] Também é descrito o tratamento de um indivíduo em risco de exposição à radiação com os polipeptídeos fornecidos. Em certos aspectos, este tratamento impede danos à radiação subsequentes, tais como danos à radiação cutânea. Em certas formas de realização, os polipeptídeos providos são administrados em uma concentração de cerca de 10 μΜ a cerca de 1000 μΜ em algumas modalidades, os polipeptídeos providos são administrados em uma concentração de cerca de ΙμΜ, cerca de 5μΜ, cerca de 10μΜ, cerca de 15μΜ, cerca de 20μΜ, cerca de 25μΜ, cerca de 30μΜ, cerca de 35μΜ, cerca de 40μΜ, cerca de 45μΜ, cerca de 50μΜ, cerca de 55μΜ, cerca de 60μΜ, de cerca de 65μΜ, cerca de 70μΜ, cerca de 75μΜ, cerca de 80μΜ, cerca de 85μΜ, cerca de 90μΜ, cerca de 95μΜ, cerca de 100μΜ, cerca de 110μΜ, cerca de 120μΜ, cerca de 130μΜ, cerca de 140μΜ, cerca de 150μΜ, cerca de 160μΜ, cerca de 170μΜ, cerca de 180μΜ, cerca de 190μΜ, cerca de 200μΜ, cerca de 225μΜ, cerca de 250μΜ, cerca de 275μΜ, ou cerca de 300μΜ, ou cerca de 400μΜ, ou cerca de 500μΜ, ou cerca de 600μΜ, ou cerca de 700μΜ, ou cerca de 800μΜ, ou cerca de 800μΜ, ou cerca de ΙΟΟΟμΜ, ou cerca de 1200μΜ, ou cerca de 1500μΜ, ou cerca de 2000μΜ. Em algumas formas de realização, os polipeptídeos providos são administrados em uma concentração de pelo menos cerca de 100 μιη. Em

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 227/280 / 127 outras formas de realização, os polipeptídeos providos são administrados em uma concentração de pelo menos cerca de 200 μιη. Em ainda outras formas de realização, os polipeptídeos providos são administrados em uma concentração de pelo menos cerca de 1000 pm.

[0185] Em algumas modalidades, a composição é administrada sistemicamente ao indivíduo. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição é administrada por inalação. Em outras formas de realização, a composição é administrada parenteralmente ao indivíduo. Por exemplo, em algumas formas de realização, a composição é administrada ao indivíduo por injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intraperitoneal ou injeção intramuscular. Em algumas formas de realização, a composição é administrada parenteralmente ao indivíduo em uma dose de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, ou cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, ou cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, ou cerca de 2 mg/kg a cerca de 25 mg/kg, ou cerca de 5 mg/kg a cerca de 25 mg/kg. Em algumas formas de realização, a composição é administrada ao indivíduo em uma dose de cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, ou cerca de 100 mg/kg.

[0186] Em certas formas de realização, os polipeptídeos providos são administrados ao indivíduo em um regime de dosagem diária. Em outros aspectos, os polipeptídeos fornecidos são administrados ao indivíduo em um regime de dosagem semanal. Em outros aspectos, os polipeptídeos fornecidos são administrados ao indivíduo em um regime de dosagem mensal.

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 228/280 / 127 [0187] Em certas formas de realização, os polipeptídeos providos são administrados ao indivíduo ao menos cerca de 2 anos, pelo menos cerca de 1 ano, pelo menos cerca de 6 meses, pelo menos cerca de 60 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 1 dia, pelo menos cerca de 23 horas, pelo menos cerca de 22 horas, pelo menos cerca de 21 horas, pelo menos cerca de 20 horas, pelo menos cerca de 19 horas, pelo menos cerca de 18 horas, pelo menos cerca de 17 horas, pelo menos cerca de 16 horas, pelo menos cerca de 15 horas, pelo menos cerca de 14 horas, pelo menos cerca de 13 horas, pelo menos cerca de 12 horas, pelo menos cerca de 11 horas, pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cerca de 9 horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 7 horas, pelo menos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 4 horas, pelo menos cerca de 3 horas, pelo menos cerca de 2 horas, ou pelo menos cerca de 1 hora antes da exposição à radiação. Em outras formas de realização, os polipeptídeos providos são administrados ao indivíduo pelo menos cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos cerca de 3 horas, pelo menos cerca de 4 horas, pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 7 horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 9 horas, pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cerca de 11 horas, pelo menos cerca de 12 horas, pelo menos cerca de 13 horas, pelo menos cerca de 14 horas, pelo menos cerca de 15 horas, pelo menos cerca de 16 horas, pelo menos cerca de 17 horas, pelo menos cerca de 18 horas, pelo menos cerca de 19 horas, pelo menos cerca de 20 horas, pelo menos cerca de 21 horas, pelo menos cerca de 22 horas, pelo menos cerca de 23 horas pelo menos cerca de 1 dia, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 60 dias, pelo menos cerca de 6 meses, menos cerca de 1 ano, ou menos cerca de 2 anos depois da

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 229/280 / 127 exposição à radiação. Em certos aspectos, os polipeptídeos fornecidos são administrados de pelo menos cerca de 1 dia a pelo menos cerca de 30 dias após a exposição à radiação. Em formas de realização específicas, os polipeptídeos fornecidos são administrados pelo menos cerca de 1 dia após a exposição à radiação.

[0188] Em algumas formas de realização, o tecido exposto à radiação inclui, sem limitação, pele, coração, osso, cérebro, medula espinhal, córnea, retina e nervo periférico. Em determinados aspectos, o tecido exposto à radiação é a pele. Em certos aspectos, a prevenção de dano por radiação pelos polipeptídeos providos a um indivíduo em risco de exposição a tal dano é avaliada medindo a pontuação média da pele. Em certas modalidades, a pontuação média da pele é reduzida em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90% na presença dos polipeptídeos fornecidos em comparação com um controle. Em formas de realização específicas, a pontuação média da pele é reduzida em pelo menos em 30% na presença dos polipeptídeos fornecidos em comparação com um controle.

[0189] Como aqui usado, o termo pontuação de pele refere-se a qualquer meio para avaliar a extensão de danos à pele e aos tecidos subjacentes. Por exemplo, em algumas formas de realização, a pontuação da pele é obtida utilizando-se uma escala conhecida como escala Kumar, um exemplo do qual é fornecido aqui na Tabela 11. Desse modo, o termo pontuação média da pele, como usado aqui, é a média das pontuações obtidas utilizando-se qualquer método para avaliação e pontuação de danos à pele e aos tecidos subjacentes.

[0190] Em certas modalidades, a lesão por radiação resultante da exposição à radiação inclui, sem limitação, danos à radiação Cutânea (CRI;

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 230/280 / 127 isto é, danos à pele e tecidos subjacentes da exposição aguda à radiação), síndrome de radiação aguda (ARS; doença séria que ocorre seguindo uma alta dose aguda de penetração do corpo inteiro de penetração) queimaduras de radiação, dermatite por radiação, lesão por radiação ao sistema nervoso ou cérebro, pneumonite por radiação e enterite induzida por radiação. Em determinados aspectos, o dano à radiação é a lesão cutânea. Em outros aspectos, o dano à radiação é a queima de radiação. Em ainda outros aspectos, a lesão por radiação é dermatite por radiação.

[0191] Em algumas modalidades, o ARS inclui qualquer um ou mais de síndrome hematopoiética ou síndrome da medula óssea; síndrome gastrointestinal; síndrome neurovascular; síndrome cardiovascular ou síndrome do sistema nervoso central. Estes termos são usados de forma intercambiável com outros termos conhecidos no estado da técnica, tais como o “ARS de direcionamento hematopoiético”, “ARS de direcionamento da medula óssea”, “ARS direcionamento gastrointestinal”, “ARS de direcionamento cardíaco”, e similares. Em algumas modalidades, um sujeito exposto à radiação ionizante pode ter qualquer uma ou qualquer combinação destas síndromes.

[0192] Em algumas formas de realização, as composições e métodos aqui providos são úteis para o tratamento de um indivíduo com dano à radiação combinado. Em algumas formas de realização, um indivíduo tendo lesão por radiação combinada tem trauma dérmico, queimaduras de radiação, CRI, ARS, dermatite por radiação, e/ou qualquer outra lesão ou síndrome relacionada à exposição à radiação ionizante. Assim, em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos e composições para o tratamento de várias complicações de exposição à radiação ionizante, e pode incluir aplicação tópica, bem como sistêmica das composições fornecidas.

[0193] Em algumas formas de realização, o dano à radiação resulta de um ataque de bomba suja. Uma bomba suja é um dispositivo explosivo que

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 231/280 / 127 dispersa substâncias radiológicas prejudiciais. A exposição a altos níveis de radiação de uma bomba suja podería resultar em sintomas de síndrome de radiação aguda ou queimaduras de radiação. A exposição à radiação causa danos à camada de células basais da pele e resulta em inflamação, eritema, descamação, avermelhamento intenso, formação de bolhas e ulceração do local irradiado.

[0194] Em certas formas de realização, feridas contaminadas com radionuclídeos e queimaduras promovem a absorção sistêmica de radionuclídeos que complicam grandemente a descontaminação tópica e a triagem. Em outras formas de realização, a contaminação do radionuclídeo também interfere com a cicatrização de feridas. Portanto, em certos aspectos, os polipeptídeos providos impedem a captação sistêmica de radionuclídeos a partir de um local de danos à radiação. Em outros aspectos, os polipeptídeos providos evitam ou tratam a lesão por radiação pela redução de hemorragia, gravidade de dano por queimadura térmica, e formação de tecido de cicatriz no local de dano por radiação. Em ainda outros aspectos, os polipeptídeos providos promovem a regeneração do tecido no local da lesão por radiação.

[0195] Também são providos materiais que compreendem as composições fornecidas aqui (por exemplo, polipeptídeos, ácidos nucleicos, ou vetores). Por exemplo, são providos materiais usados para tratar feridas e/ou lesões por radiação, em que os materiais são revestidos com um polipeptídeo ACT. Exemplos não limitantes de materiais usados para tratar ferimentos incluem bandagens, tiras, suturas, grampos ou enxertos (por exemplo, enxertos de pele).

[0196] Por exemplo, o material (como bandagem, tira-tira, sutura, grampo, enxerto) pode ser embebido no polipeptídeo fornecido em uma concentração variando de 10 a 200 mg. O material pode então ser secado e selado num recipiente estéril. O material também pode ser imerso em líquido 10-30% de pluronic gel a 4°C contendo polipeptídeo a concentração de 10

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200%. O material pode então ser trazido para a temperatura ambiente aproximada de modo que o gel polimeriza, deixando um revestimento de gel impregnado com polipéptido que circunda o material, que pode ser vedado num recipiente estéril. O polipeptídeo também pode ser incorporado em um sistema de hidrogel reticulável, tal como o ácido láctico-co-glicólico (PLGA) ou poliuretano, que pode então ser moldado em materiais para o tratamento de feridas (por exemplo, bandagem, sutura, sutura, grampo, enxerto). Assim, são providos materiais compostos de hidrogel-peptídeo.

[0197] Também são apresentados implantes médicos revestidos com o polipeptídeo fornecido antes da implantação em um indivíduo. Por exemplo, um problema comum em tais cirurgias de implante é a formação de uma cápsula de contração em tomo do implante de formação de tecido de cicatriz que leva a um endurecimento indevido, contração e, por fim, a modelagem do tecido de interesse. O uso dos presentes polipeptídeos em ou sobre o implante pode reduzir ou impedir esta falta de conformação. Exemplos não limitantes de implantes médicos incluem: próteses de membros, implantes de mama, implantes penianos, implantes testiculares, olhos artificiais, implantes faciais, juntas artificiais, próteses de válvula cardíaca, próteses vasculares, próteses dentárias, prótese facial, válvula de disco inclinada, válvula de bola envelhecida, prótese de orelha, prótese de nariz, marcapassos, implantes coclear, e substitutos da pele (por exemplo, heteroenxerto de Porcino/pele de porco, BIOBRANE, queratinócitos cultivados).

[0198] Fornecido aqui é um método de promover a cicatrização de feridas após a lesão do tecido em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma ou mais das composições fornecidas aqui (por exemplo, polipeptídeos, ácidos nucleicos, ou vetores) em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas formas de realização, o ferimento é um resultado de uma lesão cutânea. Ainda fornecido é um método de tratamento de um indivíduo com lesão de tecido (por exemplo, CRI),

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 233/280 / 127 compreendendo administrar ao indivíduo uma ou mais das composições fornecidas aqui (por exemplo, polipeptídeos, ácidos nucleicos, ou vetores) em um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0199] Promover, promoção e promovendo referem-se a um aumento em atividade, resposta, condição, doença ou outro parâmetro biológico. Isto pode incluir, mas não está limitado ao início da atividade, resposta, condição ou doença. Isto também pode incluir, por exemplo, um aumento de 10% na atividade, resposta, condição ou doença em comparação com o nível nativo ou de controle. Assim, o aumento pode ser de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% ou qualquer quantidade de aumento entre em comparação com os níveis nativos ou de controle.

[0200] Por tratar ou tratamento significa um método de redução dos efeitos de uma doença ou condição. O tratamento também se refere a um método de redução da causa subjacente da doença ou condição em si, ao invés de apenas os sintomas. O tratamento pode ser qualquer redução de níveis nativos e pode ser, mas não é limitado à completa ablação da doença, condição, ou os sintomas da doença ou condição. Por exemplo, um método revelado para promover a cicatrização de feridas é considerado como sendo um tratamento se houver uma redução de 10% em um ou mais sintomas da doença em um indivíduo com a doença em comparação com os níveis nativos no mesmo indivíduo ou indivíduos controle. Assim, a redução pode ser de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% ou qualquer quantidade de redução entre em comparação com os níveis nativos ou de controle.

[0201] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece composições e métodos Para a Prevenção de ARS, CRI, dano à radiação combinado e/ou dermatite por radiação; ou mitigar a progressão da lesão como resultado do ARS, CRI, lesão por radiação combinada e/ou dermatite por radiação, em uma população particular de pacientes, em que a população de pacientes compreende indivíduos que estão em risco de tal lesão.

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 234/280 / 127 [0202] Como usado aqui, indivíduo inclui, mas não está limitado a: animais, plantas, bactérias, vírus, parasitas e qualquer outro organismo ou entidade que tenha ácido nucleico. O indivíduo pode ser um vertebrado, mais especificamente um mamífero (por exemplo, um humano, cavalo, porco, coelho, cachorro, ovelha, cabra, primata não-humano, vaca, gato, porquinhoda-índia ou roedor), um peixe, um pássaro ou um réptil ou um anfíbio. O indivíduo pode ser um invertebrado, mais especificamente um artrópodo (por exemplo, insetos e crustáceos). O termo não denota uma idade ou sexo particular. Assim, indivíduos adultos e recém-nascidos, bem como fetos, sejam masculinos ou femininos, destinam-se a ser cobertos. Em algumas formas de realização, um paciente refere-se a um indivíduo afligido com uma doença ou distúrbio. Em algumas formas de realização, uma população de pacientes refere-se a um conjunto definido particular de indivíduos tendo uma doença ou distúrbio ou em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio particular. Por exemplo, em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos para o tratamento, prevenção, ou mitigar a severidade de dano por radiação em uma população de pacientes que compreende solvadores e/ou civilianos presentes em uma área sujeita a guerra e/ou terrorismo. Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos para tratar, prevenir ou mitigar a severidade de dano por radiação em uma população de pacientes que compreende pacientes com câncer que recebem terapia de radiação. O termo paciente inclui indivíduos humanos e veterinários.

[0203] O método fornecido pode reduzir a formação de tecido de cicatriz em um indivíduo após a lesão do tecido. Por tecido de cicatriz entenda-se o tecido fibroso (fibrótico) tecido conjuntivo que se forma no local de dano ou doença em qualquer tecido do corpo, causado pela superprodução de colágeno desorganizada e outras proteínas de tecido conjuntivo, que atua para patch da ruptura no tecido. O tecido de cicatriz

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 235/280 / 127 pode substituir a pele lesionada e o músculo subjacente, músculo cardíaco danificado, ou áreas doentes de órgãos internos tais como o fígado. Denso e espesso, é usualmente mais pálido do que o tecido circundante porque ele é fracamente suprido com sangue, e ainda que ele estruturalmente substitui o tecido destruído, não pode realizar as funções do tecido perdido. Ela é composta de fibras colagenosas, que frequentemente restringem a elasticidade normal no tecido envolvido. O tecido de cicatriz pode, portanto, limitar a faixa de movimento muscular ou impedir a circulação apropriada de fluidos, ao afetar o sistema linfático ou circulatório. Tecido de cicatriz Glial seguindo dano ao cérebro ou medula espinhal é um dos obstáculos principais à restauração da função neural após dano ao sistema nervoso central. Uma redução no tecido de cicatriz pode ser avaliada pela população de tipos de células dentro do local ferido. Por exemplo, uma redução no tecido de cicatriz glial pode ser estimada por uma proporção aumentada de células neuronais para astrocíticas. Uma redução na formação de tecido de cicatriz pode ser medida por uma simples medição de largura de cicatriz ou área de tecido de cicatriz (Wilgus et al, 2003). Além disso, podem ser feitas avaliações histológicas em relação à restauração da complexidade estrutural dentro do tecido tratado em comparação com o tecido normal.

[0204] Além de reduzir a formação de tecido fibrótico em um indivíduo em seguida à lesão do tecido, as composições e métodos fornecidos também podem ser usados para tratar distúrbios associados com aumentos patológicos na formação de tecido fibrótico em um indivíduo, tais como, por exemplo, psoríase, mastocitose cutânea e sistêmica, asma, eczema, sinusite, aterosclerose, artrite reumatóide, doença inflamatória intestinal, esclerose múltipla, fibrose pulmonar e fibrose cística. Uma redução na formação de tecido fibrótico em um indivíduo pode ser medida pelo julgamento clínico de um médico avaliando se uma recuperação na estrutura normal e função de um dado tecido e/ou órgão em um indivíduo resultou em um tratamento.

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Como um exemplo, para a psoríase, o médico avaliaria a pele do sujeito para determinar se houve uma redução de manchas de pele vermelha elevada e coberta por acúmulo de branco escamoso. Certos tipos de psoríase, são caracterizados por uma aparência aguda (psoríase pustular) ou queimada (eritrodermica). Em tais casos, o médico determinaria se o tratamento resultou na redução destes sintomas. No caso de um tecido ou órgão no qual um indivíduo em que um médico julga que uma biópsia é clinicamente disponível e/ou necessária ou em um modelo animal da doença humana, fragmentos de tecido de bioposicionadores seriam preparados e a estrutura histológica do tecido seria avaliada por um patologista clínico e/ou histoologista treinado para determinar se a redução na fibrose e restauração da estrutura e função do tecido normal ocorreu. A área de fibrose ao tecido normal também podería ser avaliada quantitativamente em tais preparações histológicas.

[0205] O método fornecido pode restaurar as propriedades mecânicas normais do tecido tais como a resistência à tração após a lesão do tecido em um indivíduo, resistência à tração refere-se à quantidade de tensão ou tensão necessária para romper o tecido ou ferida.

[0206] A resistência à tração de feridas tratadas pode ser de 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% de tecido não-ferido dentro de 3 meses após o tratamento. Desse modo, é fornecido um método de restaurar as propriedades mecânicas do tecido, incluindo aumentar a resistência à tração de uma lesão de envelhecimento a fim de se aproximar ou atingir aquela do tecido não lesionado normal, em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma ou mais das composições fornecidas aqui (por exemplo, polipeptídeos, ácidos nucleicos, ou vetores) em um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0207] O tipo de feridas que seria importante com relação à resistência à tração/extensibilidade podería incluir lesões às estruturas/tecidos

Petição 870190079594, de 16/08/2019, pág. 237/280 / 127 musculoesquelética, e a pele que cobre estas estruturas. Por exemplo, os métodos providos podem melhorar a resistência à tração de juntas articuladas, ossos, cartilagem, tendões ou ligamentos. Os métodos providos também podem melhorar a resistência à tração da pele sob maiores graus de tensão/deformação, tal como a pele que cobre o joelho, cotovelo ou pé. Os problemas mais comuns associados com a cicatrização de lesões de articulações é que a cicatrização excessiva nessas áreas leva à contração e à não-extensibilidade da área de junta em estado de estadiça. Isto tem consequências cosméticas e psicológicas sérias. As propriedades dos peptídeos ajudarão a modular e diminuir a formação de tal tecido de cicatrização, levando a maior mobilidade da junta.

[0208] O método fornecido pode melhorar a regeneração do tecido após a lesão do tecido em um indivíduo. Por regeneração entenda-se a renovação, re-crescimento, ou restauração de um corpo ou uma parte corpórea, tecido ou substância após a lesão ou como um processo corporal normal. Em contraste com a cicatrização, a regeneração do tecido envolve a restauração do tecido em sua condição estrutural, funcional e fisiológica original. Este é também referido aqui como complexidade do tecido. A restauração pode ser parcial ou completa, significando 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,100% de restauração, ou qualquer quantidade de restauração entre em comparação com os níveis nativos ou de controle. Como um exemplo, no caso de uma lesão da pele, a regeneração do tecido pode envolver a restauração de folículos capilares, estruturas glandulares, vasos sanguíneos, músculos ou gordura. No caso de uma lesão cerebral, a regeneração do tecido pode envolver manutenção ou restauração de neurônios. Como um exemplo no caso da pele, um aperfeiçoamento na regeneração do tecido pode ser avaliado por medições do volume de tecido de cicatriz fibroso à pele regenerada normal como uma relação. Como um outro exemplo, as contagens podem ser feitas de estruturas de regeneração discretas tais como

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100 / 127 as glândulas da pele de regeneração normalizadas até o volume da área da ferida.

[0209] Em um aspecto, a regeneração do tecido envolve o recrutamento e diferenciação de células tronco para substituir as células danificadas. Como aqui usado, uma célula-tronco é uma célula não diferenciada encontrada entre células diferenciadas em um tecido ou órgão, ou introduzida a partir de uma fonte externa, por exemplo, células-tronco Embrionárias, células-tronco de medula óssea adulta, que podem se renovar e diferenciar para produzir os principais tipos de células especializadas do tecido ou órgão. Os papéis primários de células tronco em um organismo vivo são manter e reparar o tecido no qual são encontrados. Por diferenciação celular de tronco entendase o processo pelo qual uma célula não especializada (por exemplo, célulatronco) adquire as características de uma célula especializada tal como uma célula de pele, neural, coração, fígado ou músculo. Como um exemplo, no caso de uma lesão da pele, a regeneração do tecido pode envolver a diferenciação das células-tronco presentes no epitélio nos folículos capilares (Alonassim e Fuchs, 2003). No caso de uma lesão cerebral, a regeneração do tecido pode envolver a diferenciação de células tronco em neurônios. O método fornecido pode melhorar a diferenciação celular da haste após a lesão do tecido em um indivíduo. A diferenciação de células-tronco melhorada pode ser medida pela provisão de um sistema genético clinicamente aceitável ou outro meio de marcação de células-tronco endógenas ou enxertados e determinação da frequência de diferenciação e incorporação de célulastronco marcadas em estruturas de tecido normais. Como um outro exemplo, sabe-se que certas estruturas tais como folículos capilares são regeneradas a partir de células tronco endógenas após a lesão do tecido. Como tal, as contagens de folículos de cabelo normalizadas à área de dano ao tecido serviríam como uma avaliação quantitativa do aumento da diferenciação de células-tronco.

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101 / 127 [0210] O método fornecido pode reduzir a inflamação em um indivíduo. Por inflamação, resposta inflamatória ou resposta imunológica significa a reação de tecidos vivos a danos, infecção ou irritação caracterizada por vermelhidão, calor, inchaço, dor e perda de função, produzida como resultado de fluxo sanguíneo aumentado e influxo de células imunes e secreções. A inflamação é a reação do corpo para invadir microorganismos infecciosos e resulta em um aumento no fluxo sanguíneo para a área afetada, a liberação de produtos químicos que retiram células brancas do sangue, um fluxo aumentado de plasma, e a chegada de monócitos (ou astrócitos no caso do cérebro) para limpar os detritos. Qualquer coisa que estimule a resposta inflamatória é considerada inflamatória. Assim, além de reduzir a inflamação em um sujeito em resposta à lesão do tecido, as composições e métodos fornecidos também podem ser usados para tratar distúrbios associados com aumentos patológicos em níveis de células inflamatórias, incluindo, por exemplo, asma, eczema, sinusite, aterosclerose, artrite reumatóide, doença inflamatória intestinal, mastocitose cutânea e sistêmica, psoríase e esclerose múltipla. O tratamento com o polipeptídeo fornecido também pode reduzir a coceira, por exemplo, de cicatrização de feridas. Geralmente, o prurido resulta da libertação de histamina por mastócitos. O polipeptídeo fornecido pode reduzir a desgranulação de mastócitos e a liberação de histamina. Desse modo, o polipeptídeo fornecido pode ser usado para tratar condições envolvendo liberação de histamina, incluindo, mas não limitado a coceira, arranhão, irritação do seio, tosse alérgica, olhos vermelhos, asma e eczema.

[0211] A redução na inflamação pode ser medida por uma redução na densidade de tipos de células inflamatórias tais como monócitos ou astrócitos. Uma redução na inflamação pode ser medida por uma redução na densidade de tipos de células inflamatórias tais como, por exemplo, neutrófilos, mastócitos, basófilos e monócitos. Uma redução na inflamação

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102 / 127 pode ser calculada por uma medição in vivo da atividade neutrófilo (Jones Et al, 1994). Adicionalmente, fatores como frequência de desgranulação de mastócitos ou medição de níveis de histamina ou níveis de espécies reativas de oxigênio podem ser usados como medições de redução na inflamação. O nível de inflamação também pode ser medido indiretamente pela verificação de níveis de transcrição de certos genes por qRT-PCR, por exemplo, genes como Interferon-alpha,-beta e gama, fator de necrose tumoral-alpha, Interleucina 1 beta, -2, -4, -5, -6, -8, -12, -18, -23, -27, CD4, CD28, CD80, CD86, MHCII e iNOS. Medição de níveis pró-inflamatórios de citoquinas nos tecidos e ou fluidos corporais do indivíduo, incluindo plasma, pode medir uma redução na inflamação. Nota-se que um mecanismo de ação de peptídeo ACT pode ser por inibição da migração de células inflamatórias e/ou inibição de produtos químicos pró-inflamatórios (histamina, espécies de oxigênio reativo ) e citocinas pró-inflamatórias tais como Interleucina (IL) 1, IL-6, IL-8 e fator de necrose tumoral (TNF).

[0212] O método fornecido pode inibir a proliferação de uma célula transformada em um indivíduo. Por célula transformada entende-se um neoplasma, câncer, ou célula tumoral que divide e reproduz anormalmente com crescimento descontrolado. Assim, a inibição da proliferação (isto é, hiperplasia) da referida célula transformada resulta em uma redução no crescimento e assim a malignidade do câncer. Uma lista representativa mas não limitante de cânceres que as composições e métodos descritos podem ser usados para tratar é o seguinte: glioma, linfoma, linfoma de células B, linfoma de células T, micose fungoides, Doença de Hodgkin, leucemia mielóide, câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer do sistema nervoso, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer de rim, cânceres pulmonares tais como câncer de pulmão de células pequenas e câncer de pulmão de células não pequenas, neuroblastoma, glioblastoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer da

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103 / 127 próstata, câncer da pele, câncer do fígado, melanoma, carcinomas de células escamosas da boca, garganta, laringe e pulmão, câncer de cólon, câncer cervical, carcinoma cervical, câncer de mama, e câncer epitelial, câncer renal, câncer geniturinário, câncer pulmonar, carcinoma esofágico, carcinoma de cabeça e pescoço, câncer de intestino grosso, cânceres hematopoiéticos, câncer testicular, câncer de cólon e retal, câncer de próstata, ou câncer pancreático. Assim, o método fornecido pode ser usado para tratar o câncer em um indivíduo. Por exemplo, o método fornecido pode ser usado para tratar glioma em um indivíduo.

[0213] A inibição da proliferação celular transformada pode ser medida por uma variedade de marcadores e Kits de proliferação celular, por Exemplo, imunomanchamento de KÍ67/MIB-1, inibidores de rotulação de timidina tritiada ou de bromodeoxiuridina, fração de fase S de DNA, expressão de antígeno nuclear de células proliferantes, tempo de duplicação potencial e análise das proteínas associadas à região de organizador nucleolar (AgNORs). Uma vez que a atividade proliferativa do tumor depende tanto da proporção das células comprometidas para o ciclo (fração de crescimento) e a velocidade do ciclo celular, a atividade proliferativa real de um tumor pode bem ser medida pela equação [ PA = K67 ou Contagens Do MIB-1 X AgNORs ] (Pich et al, 2004). Em outro exemplo, os histopatologistas são versados na avaliação de seções de tecido de biópsia usando índices qualitativos e quantitativos simples de mitose para determinar a proliferação em populações de células transformadas.

[0214] Vários modelos de camundongo foram desenvolvidos para pesquisa de câncer. Existem modelos específicos de camundongo para tipos específicos de cânceres. Por exemplo, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer endometrial, câncer gastrointestinal, câncer geniturinário, câncer de cabeça e Pescoço, câncer Hematopoiético, câncer de Rim, câncer de Pulmão, câncer de Glândula Mamária, Melanoma, Mieloma, câncer do Sistema

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Nervoso, câncer Oral, câncer Ovariano, câncer Pancreático, câncer da Próstata, Sarcoma, câncer da pele. Estes modelos são bem descritos e usados. Os efeitos favoráveis dos polipeptídeos, ácidos nucleicos ou vetores providos aqui podem ser estudados em qualquer um destes modelos. Por exemplo, o modelo de rato de câncer de pele pode ser facilmente usado para demonstração. Os cânceres podem ser cultivados aplicando-se o modelo de xenoenxerto de tecidos cancerosos humanos crescentes, usando-se o camundongo homogêneo específico, livre de patôgeneo (um camundongo nu). Os polipeptídeos, ácidos nucleicos ou vetores providos aqui podem ser administrados localmente, por exemplo, materiais bioengenheirados tais como membranas de fibra oca (orlandina E mararia. 1983; Ming Chu et al, 1998) e microfibras, filetes de liberação lenta, agulhas hipodérmicas, cateteres residentes, que podem ser inseridos localmente no crescimento canceroso, ou sistemicamente administrada para atingir seu alvo, por exemplo, infusões intravenosas, intramuscularmente, injeção intraperitoneal. Este tratamento pode ser administrado por si só ou em combinação com outros compostos terapêuticos, por exemplo, agentes quimioterapêuticos.

[0215] O método fornecido pode inibir a metástase de uma célula transformada em um indivíduo. Por metástase entenda-se a transmissão de células cancerosas de um local original para um ou mais locais em qualquer lugar no corpo, usualmente por meio de vasos sanguíneos ou linfáticos. A metástase pode ser quebrada em uma série de eventos. Primeiro, a migração da célula cancerosa começa o processo pelo qual as células tumorais deixam o local primário de crescimento, com frequência penetrando na membrana basal e se movendo na direção da vasculatura local. A intravasação descreve o processo de entrada de células cancerosas na vasculatura, e distribuição para locais distantes. O extravasamento se refere ao processo de saída de células cancerosas a partir da vasculatura. Finalmente, a proliferação de células cancerosas no local distante é prejudicada profundamente por

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105 / 127 disponibilidade de fator de crescimento localizado, influências de células estromais, e o meio de matriz extracelular circundante (o chamado solo) bem como a disponibilidade de nutrientes e fatores providos pela vascularização resultante do tumor crescente. Assim, as composições e métodos fornecidos podem inibir a metástase de uma célula transformada em um indivíduo por inibição da migração (isto é, migração metastática) da referida célula. A gênese é o resultado da desorganização do ciclo celular, levando a uma proliferação celular descontrolada. Processos celulares específicos-mecanismos que controlam a progressão do ciclo celular e a transcrição do ponto de controle através das fases intermitentes são desregulados. Normalmente, estes eventos são altamente conservados devido à existência de mecanismos conservadores e moléculas tais como genes de ciclo celular e seus produtos. Uma inibição na migração metastática pode ser medida pelos níveis de tais genes e produtos de ciclo celular, por exemplo, ciclinas, quinases dependentes de ciclina (Cdks), inibidores de Cdk (CKI) e fatores celulares extras (isto é, fatores de crescimento). Técnicas de revolucionária utilizando citometria de laser e software comercial estão disponíveis para quantificar e avaliar processos de ciclo celular e crescimento celular. As medições de fração em fase S, incluindo os valores de ploidy, utilizando-se histogramas e estimativa de índices tais como o índice mitótico e os índices de tempo de duplicação do tumor, proporcionam informações adequadas ao clínico para avaliar a agressividade do tumor.

[0216] Como aqui usado, o dano ao tecido pode resultar, por exemplo, de um raspador, corte, laceração, ferida por esmagamento, ferida por compressão, lesões por estiramento, feridas da mordida, crostas, feridas com bala, lesões por explosão, perfuração do corpo, ferida por corte, a queima do vento, queimadura solar, queimadura química, ferida cirúrgica, intervenção cirúrgica, intervenção médica, rejeição de hospedeiro em seguida de enxerto de célula, tecido ou órgão, efeito farmacêutico, efeito colateral farmacêutico,

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106 / 127 ferida de cama, lesão por radiação, ferida por cosmético, lesão de órgão interno, processo de doença (por exemplo, asma, câncer ), infecção, agente infeccioso, processo de desenvolvimento, processo de amadurecimento (por exemplo, acne), anormalidade genética, anormalidade de desenvolvimento, a toxina ambiental, o alérgeno, a lesão do couro cabeludo, a lesão facial, a lesão da mandíbula, a lesão do pé, a lesão do dedo, a lesão dos dedos, lesões ósseas, lesões sexuais, lesões de articulações, lesões de órgãos excretados, lesões oculares, lesões comeanas, lesões musculares, lesão do tecido adiposo, lesões pulmonares, lesões das vias aéreas, hérnia, lesões do ânus, estacas, lesões da orelha, lesões retinianas, danos à pele, lesões abdominais, danos ao braço, danos à perna, danos atléticos, danos ao nascimento, danos ao nascimento, lesões prematuras prematuros, lesões tóxicas, danos no tendão, danos ao ligamento, dano do coração, dano da válvula cardíaca, lesão do sistema vascular, lesão da cartilagem, lesão do sistema linfático, trauma crânio, disposição, perfuração esofágica, fistula, lesão da unha, corpo estranho, fratura, laceração, dano à mão, distúrbio de estresse térmico, laceração, lesão do pescoço, auto-tratamento, choque, dano traumático do tecido mole, lesão da medula espinhal, danos espinhais, lesões de escora, esforços do tendão, dano ao ligamento, dano à cartilagem, lesão torácica, lesão do dente, trauma, lesão do sistema nervoso, envelhecimento, aneuismo, acidente vascular cerebral, lesão do trato digestivo, infarto, ou lesão isquêmica.

[0217] Em certas modalidades, o dano ao tecido resulta da lesão por radiação. Em certas modalidades, o dano à radiação inclui, sem limitação, danos à radiação cutânea (isto é, danos à pele e tecidos subjacentes de exposição aguda à radiação ), síndrome de radiação aguda (isto é, doença séria que ocorre seguindo uma alta dose aguda de penetração do corpo inteiro de penetração ) queimaduras de radiação, dermatite por radiação, lesão por radiação ao sistema nervoso ou cérebro, pneumonite por radiação e enterite

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107 / 127 induzida por radiação. Em determinados aspectos, o dano à radiação é a lesão cutânea. Em outros aspectos, o dano à radiação é a queima de radiação. Em ainda outros aspectos, a lesão por radiação é dermatite por radiação. Em algumas formas de realização, o dano cutâneo da radiação resulta de um ataque da bomba suja.

[0218] Em algumas formas de realização, a lesão por radiação ocorre em um tecido incluindo, sem limitação, pele, coração, osso, cérebro, medula espinhal, córnea, retina e nervo periférico. Em determinados aspectos, ocorre a lesão por radiação sobre a pele. Em certas modalidades, o dano ao tecido induzido por radiação causa danos à camada de células basais da pele. Em alguns aspectos, o dano induzido por radiação à camada de células basais da pele resulta em sintomas que incluem, mas não limitado a: inflamação, eritema, descamação, avermelhamento intenso, formação de bolhas e ulceração do local irradiado.

[0219] Em certas formas de realização, feridas contaminadas com radionuclídeos e queimaduras promovem a absorção sistêmica de radionuclídeos que complicam grandemente a descontaminação tópica e a triidade. Em outras formas de realização, a contaminação do radionuclídeo também interfere com a cicatrização de feridas. Portanto, em certos aspectos, os polipéptidos providos evitam ou tratam a lesão por radiação, impedindo a captação sistêmica de radionuclídeos a partir de uma ferida ou queimadura no local da lesão por radiação. Em outros aspectos, os polipéptidos providos evitam ou tratam a lesão por radiação por redução de hemorragia, gravidade de dano por queimadura térmica e formação de tecido de cicatriz no local de dano por radiação. Em ainda outros aspectos, os polipéptidos providos promovem a regeneração do tecido no local da lesão por radiação.

[0220] Os peptídeos e/ou outras formulações que incorporam a invenção modulam a migração e proliferação celular, reduzindo assim a inflamação, acelerar a cicatrização de feridas, reduzir a cicatrização e

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108 / 127 finalmente promover reparo, regeneração e restauração da estrutura e função em todos os tecidos. A cicatrização de feridas, a aplicação pós-peptídeo envolverá a fibrose significativamente reduzida, consequentemente a cicatrização reduzida em ferimentos da pele e manchas fibrosas em lesões internas do tecido, promovendo a regeneração do tecido e restaurando o tecido e a estrutura e função do órgão.

[0221] Os referidos peptídeos e/ou outras formulações podem ser usados para tratar lesões internas causadas por uma ferida externa. Em certas modalidades, a ferida externa é causada por danos por radiação. Em algumas formas de realização, a lesão interna pode ser causada por radionuclídeos que causam a contaminação sistêmica interna através de queimaduras e feridas contaminadas. Assim, em algumas formas de realização, os métodos e composições aqui fornecidos proporcionam tratamento, prevenção e/ou inibição da progressão de dano à radiação interna. O dano à radiação interna, em algumas modalidades, resulta da contaminação sistêmica com radiação. A contaminação sistêmica com radiação pode resultar da administração direta de radionuclídeos ou entrada de radionuclídeos de queimaduras e feridas contaminadas. Em determinados aspectos, a lesão por radiação inclui, sem limitação, danos à radiação cutânea (isto é, danos à pele e tecidos subjacentes da exposição aguda à radiação ), síndrome de radiação aguda (isto é, doença séria que ocorre seguindo uma alta dose aguda de penetração do corpo inteiro de penetração ) queimaduras de radiação, dermatite por radiação, lesão por radiação ao sistema nervoso ou cérebro, pneumonite por radiação e enterite induzida por radiação. Em determinados aspectos, o dano à radiação é a lesão cutânea. Em outros aspectos, o dano à radiação é a queima de radiação. Em ainda outros aspectos, a lesão por radiação é dermatite por radiação. Em algumas formas de realização, o dano cutâneo da radiação é causado por um ataque da bomba suja.

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109 / 127 [0222] A lesão à órgãos internos causa uma resposta fibrótica, que leva à perda de estrutura e função em sistemas de órgãos. Sistema nervoso central (SNC) esta resposta à lesão é mediada por astrócitos (células semelhantes a fibroblastos no SNC) e assim será referida como uma resposta astrocítica. As formas de realização da presente invenção irão aliviar esta resposta fibrótica/astrocítica, assim ajudando no reparo e regeneração de tecidos lesionados e restauração de tecido e estrutura de órgão e função. Outras modalidades da invenção incluem o uso de ditos peptídeos e/ou outras formulações para melhorar a angiogénese pela estimulação de fatores angiogênicos, mas não limitado ao VEGF, e melhorar a diferenciação de tecidos vasculares, desse modo aperfeiçoando o fluxo sanguíneo para o local de danos ao tecido. O suprimento de sangue aumentado para o local do ferimento estimulado por nossos tratamentos resultará em cicatrização reduzida em ferimentos externos e internos e promover reparo melhorado e regeneração de tecidos e órgãos. As formas de realização adicionais da invenção compreendem o uso de ditos péptidos e/ou outras formulações para a regeneração do tecido e órgão, quando administrado em associação com células de haste e/ou fármacos e/ou outros regimes endógenos e/ou clínicos que promovem a mobilização de células tronco e/ou a regeneração do tecido. As células tronco ajudarão na regeneração do tecido e nosso tratamento promoverá a diferenciação direta e/ou indiretamente por processos que incluem, mas não estão limitados a formação de cicatriz fibrótica/astrocítica reduzida, restaurando assim a estrutura e função do tecido normal.

[0223] As composições e métodos promovem a geração de um ambiente permissivo in vivo para regeneração e restauração da estrutura e função de tecidos e órgãos. Os processos regenerativos auxiliados por nosso peptídeo incluem, mas não estão limitados a, danos internos e externos, regeneração de tecidos, órgãos ou outras partes do corpo, cicatrização e restauração da função após oclusão vascular e isquemia, acidente vascular

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110/127 cerebral, infarto do miocárdio, dano do cordão espinhal, dano do cérebro, dano do nervo periférico, dano retinal, dano ósseo, exposição à radiação, e outras descargas de líquido para tecidos que causam destruição, danos ou, de outro modo, resultantes, mas não limitados a, danos por cirurgia, câncer, mal formação congênita e de desenvolvimento, e doenças que causam perda progressiva de estrutura e função de tecido, incluindo mas não limitadas a diabetes, bactérias bacterianas, virais e associadas a prion, doença de Alzheimer, Agentes de Doença de Parkinson, auxiliares e outros processos de doença geneticamente determinados, ambientalmente determinados ou idiopática, causando a perda de estrutura e função do tecido/órgão/parte do corpo. Além disso, os peptídeos providos podem ser administrados com fármacos ou outros compostos que promovem a regeneração do tecido e celular incluindo, mas não se limitando a, fatores tróficos em processos que incluem, mas não se limitam a, retina, medula espinhal e regeneração do sistema nervoso periférico (por exemplo, Ngofs, FGFs, neurotrofinas, neuregulinas, endotelinas, GDNFs, BDNF, BMPs, TGFs, Wnts).

[0224] As modalidades adicionais da invenção compreendem a distribuição dos referidos peptídeos e/ou outras formulações que utilizam técnicas tais como, mas não limitadas a, todas as sequências de Antenapedia, e vetores de intemalização de células relacionadas (por exemplo, Domínio de transdução de Proteína de TAT, todos os peptídeos de TAT, Todas as proteínas de fusão de TAT), vetores de distribuição de genes virais, vetores de expressão de DNA, e qualquer outro método de administração que possa ajudar a obter o seu peptídeo ao tecido e/ou local celular de ação por si só ou em associação com outros agentes incluindo, mas não se limitando a, cofatores que auxiliam esta distribuição (por exemplo, incluindo mas limitado a TAT-HA2) e/ou células tronco, fármacos e outras formulações que ajudam no reparo, regeneração e restauração de estrutura e função de órgão e tecido.

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Ill / 127 [0225] As composições aqui descritas e as composições necessárias para realizar os métodos descritos podem ser feitas utilizando-se qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica para esse reagente ou composto particular, a menos que de outra forma especificamente notado.

[0226] Por exemplo, os ácidos nucleicos providos podem ser produzidos utilizando métodos de síntese química padrão ou podem ser produzidos utilizando métodos enzimáticos ou qualquer outro método conhecido. Tais métodos podem variar de digestão enzimática padrão seguido por isolamento de fragmentos de nucleotídeos (veja, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) Capítulos 5, 6) a métodos puramente sintéticos, por exemplo, pelo método de cianofosforamidita utilizando um sintetizador de DNA Miligen Ou Beckman 1 acrescido De DNA (Por exemplo, Modelo 8700 automatizado de MilgenBiosearch, Burlington, MA ou ABI Modelo 380B). Métodos sintéticos úteis para a produção de oligonucleotídeos também são descritos por Ikuta e outros, Ann. Rev. Biochem 53: 323 -356 (1984), (compostos de fosfotriéster e de fosfito-triéster), e Narang e outros, Methods Enzymol. 65: 610 -620 (1980), (método de fosfotriéster). Moléculas de ácido nucleico de proteína podem ser feitas utilizando métodos conhecidos tais como aqueles descritos por Nielsen e outros, Bioconjug. Chem. 5:3 -7 (1994).

[0227] Um método de produção dos polipeptídeos descritos, Tal Como a SEQ ID NO: 2, é ligar dois ou mais peptídeos ou polipeptídeos juntos por técnicas de química de proteínas. Por exemplo, peptídeos ou polipeptídeos podem ser sintetizados quimicamente utilizando equipamento de laboratório atualmente disponível utilizando Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonil) química Boc (terc-butiloxicarbonoil) (Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA). Alguém versado na técnica pode facilmente compreender que um peptídeo ou polipeptídeo correspondendo às proteínas descritas, por

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112/127 exemplo, pode ser sintetizado por reações químicas padrão. Por exemplo, um peptídeo ou polipeptídeo pode ser sintetizado e não clivado a partir de sua resina de síntese enquanto que o outro fragmento de um peptídeo ou proteína pode ser sintetizado e subsequentemente clivado da resina, desse modo expondo um grupo terminal que é funcionalmente bloqueado no outro fragmento. Por reações de condensação de peptídeos, estes dois fragmentos podem ser ligados covalentemente através de uma ligação peptídica em seus terminais carboxila e amino, respectivamente, para formar uma proteína, ou fragmento do mesmo. Péptidos sintéticos (Grg A (1992): Um Guia de usuário. WH Freeman And Co, NY (1992); Bodansky M e Trost B, Ed (1993) principies of peptide synthesis. Springer-Verlag Inc, NY (que é aqui incorporado por referência pelo menos para material relacionado à síntese de peptídeos). Alternativamente, o peptídeo ou polipeptídeo é sintetizado independentemente in vivo como descrito aqui. Uma vez isolada, estes peptídeos ou polipeptídeos independentes podem ser ligados para formar um peptídeo ou fragmento do mesmo através de reações de condensação de peptídeos similares.

[0228] Por exemplo, ligação enzimática de segmentos de peptídeos clonados ou sintéticos permite que fragmentos de peptídeo relativamente curtos sejam unidos para produzir fragmentos de peptídeos maiores, polipeptídeos ou domínios de proteína total (Abrahmsen L et al, Biochemistry, 30: 4151 (1991)). Altemativamente, a ligação química nativa de peptídeos sintéticos pode ser utilizada para construir sinteticamente grandes peptídeos ou polipeptídeos a partir de fragmentos peptídicos mais curtos. Este método consiste em uma reação química de duas etapas (Dawson e outros) síntese de Proteínas por ligação química nativa. Science, 266: 776 -779 (1994)). A primeira etapa é a reação quimioselectiva de um peptídeo sintético desprotegido-tioéster com outro segmento peptídico desprotegido contendo um resíduo Cys amino-terminal para dar um intermediário

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113/127 derivado de tioéster como o produto covalente inicial. Sem uma mudança nas condições de reação, este intermediário é submetido à reação intramolecular rápida e espontânea para formar uma ligação peptídica nativa no local de ligação (Baggiolini M e outros (1992) FEBS Lett. 307: 97 -101; Clark-Lewis I et al., J Biol. Chem. 269: 16075 (1994); Clark-Lewis I e outros, Biochemistry, 30: 3128 (1991); raetathnamket AL, biochemistry 33: 6623 -30 (1994).

[0229] Altemativamente, segmentos de peptídeo não protegidos são quimicamente ligados onde a ligação formada entre os segmentos de peptídeo como resultado da ligação química é um peptídeo não natural (nãopeptídeo) bond (Schnolzer, M et al Science, 256: 221 (1992). Esta técnica foi usada para sintetizar análogos de domínios de proteína assim como grandes quantidades de proteínas relativamente puras com atividade biológica total (deLisle Milton R C e outros, Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257 -267 (1992).

[0230] São processos para a produção das composições assim como dos intermediários que levam às composições. Há uma variedade de métodos que podem ser usados para a produção destas composições, tais como métodos químicos sintéticos e métodos padrões de biologia molecular. Entende-se que os métodos de produção destes e de outras composições reveladas são especificamente descritos. São apresentadas moléculas de ácido nucleico produzidas pelo processo que compreendem ligação em um modo operativo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo aqui descrito e uma sequência que controla a expressão do ácido nucleico. São apresentadas células produzidas pelo processo de transformação da célula com qualquer um dos ácidos nucleicos aqui apresentados. São apresentados quaisquer dos peptídeos descritos produzidos pelo processo de expressão de qualquer um dos ácidos nucleicos aqui apresentados. São apresentados animais produzidos pelo processo de transfectar uma célula dentro do animal

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114/127 com qualquer das moléculas de ácido nucleico aqui descritas. São apresentados animais produzidos pelo processo de transfectar uma célula dentro do animal qualquer das moléculas de ácido nucleico aqui descritas, em que o animal é um mamífero. Também são apresentados animais produzidos pelo processo de transfectar uma célula dentro do animal qualquer das moléculas de ácido nucléico aqui descritas, em que o mamífero é camundongo, rato, coelho, vaca, ovelha, porco ou primata. Também são apresentados animais produzidos pelo processo de adição ao animal de qualquer das células aqui descritas.

[0231] Os materiais descritos acima assim como outros materiais podem ser embalados juntos em qualquer combinação adequada como um kit útil para a realização, ou auxílio no desempenho do método descrito. E útil se os componentes do kit em um dado kit forem projetados e adaptados para uso em conjunto no método revelado. Por exemplo, são apresentados kits para promover cicatrização de feridas, o kit compreendendo um ou mais dos polipeptídeos, ácidos nucleicos ou vetores fornecidos aqui em um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais kits também podem incluir géis, bandagens, fitas Millipore, cotonetes, sprays, xaropes, líquidos, tubos ou bolsas descartáveis. Os kits também podem conter instruções para utilização apropriada e informações de segurança do produto ou formulação. Os kits podem conter informação de dosagem com base na aplicação e método de administração conforme determinado por um médico.

[0232] Os métodos e composições apresentados são aplicáveis a numerosas áreas incluindo, mas não limitadas a ferramentas de pesquisa de laboratório. Estas formulações desempenham papéis reguladores em diversos processos celulares, por exemplo, proliferação celular, migração celular. Estas formulações podem ser usadas no laboratório em sistemas de modelo in vitro e in vivo para estudar vários processos celulares, regulamentos de ciclo celular, comportamento celular, respostas de células,

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115/127 órgãos ou tecidos para testar compostos, etc. as formulações podem ser fornecidas por si sós ou em combinação com outros compostos ou como parte de um kit, tal como um kit para o ensaio de proliferação celular. O kit pode conter as formulações mencionadas aqui por si sós ou em combinação com outros compostos. Tal kit incluiría instruções projetadas para facilitar o experimento. Outros usos são apresentados, evidentes a partir da descrição, e/ou serão entendidos por aqueles versados na técnica.

Exemplos

Exemplo 1: Eficácia de administração tópica de Granexin® no tratamento e prevenção de um estudo de aplicação prolongada de lesões por radiação cutânea [0233] Devido às similaridades de pele do porco e da pele humana, o porco é considerado como sendo o modelo Animal ótimo para o estudo da CRI. Estudos de validação corroboram os porcos Yorkshire como o melhor modelo de animal para a avaliação da eficácia de contramedidas médicas para prevenir e mitigar a progressão da CRI, onde a exposição cutânea de 45 Gy (distribuída em uma dose) resulta em um controlado dano à radiação cutânea de espessura total reproduzível; sem causar morbidez ou mortalidade sistêmica. Utilização deste modelo de Porco Yorkshire validado de CRI, um estudo de eficácia e resposta de dose foi conduzido para avaliar a eficácia da administração tópica de Granexin® para prevenir e mitigar a progressão e gravidade de CRI. Quatro animais de (2 machos e 2 fêmeas de Yorkshire (S&.S Fazendas)), aproximadamente 3 meses de idade, de 32,4 41,1 kg em irradiação foram usados. No Dia 0, cada animal foi anestesiado e exposto a frações únicas de elétrons de baixa energia (6 MeV) utilizando-se um acelerador Linear Varian CLINAC 21 EX Para 10 segmentos separados de 4 cm de diâmetro na superfície da pele dorsal paraespinhal, em uma dose alvo aguda de 45 Gy. Os parâmetros de irradiação foram estabelecidos para simular padrões característicos de queda de dose em profundidade

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116/127 associados com exposições de irradiação do tipo beta, similar à energia beta de Sr-90 e outros isótopos prováveis de um RDD. Para cada local, a blindagem de chumbo foi usada para restringir o campo de feixe de elétrons gerado por cone (cone de 15 xl5 cm²) à área de exposição desejada de um círculo de 4 cm de diâmetro. Bolus equivalente ao tecido (8 mm) foi colocado sobre a superfície da pele para assegurar que mais do que 90% da dose prescrita fosse limitada a uma profundidade máxima de 2 cm. Para irradiação, exposição (unidades de monitor, MU ) foi calculada utilizando a fórmula: MU = dose/(fator de saída Total) X (fator de Normalização) onde: MU é o ajuste da unidade do monitor da máquina; a dose é a dose aplicada nominal, em cGy; o Fator de saída Total é o fator de saída que inclui o corte de cone e condutor apropriado a uma fonte de 100 cm para a distância de superfície; e o fator de normalização é a saída medida no dia de irradiação.

[0234] O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da administração tópica De Granexin® no tratamento e prevenção de um modelo de lesão cutânea utilizando o porco Yorkshire. Mais especificamente, o estudo foi conduzido para avaliar se o gel Granex® podería retardar a progressão e/ou mitigar a severidade dos sintomas associados Com o CRI.

[0235] Granexin® é um gel tópico compreendendo 1, 25% de gel de Hidroxietil celulose e o peptídeo ACT1. A estrutura química do peptídeo ACT1 em Granexin® é : Pro-Lys-lle-Trp-Phe-Pro-Asn-Arg-Arg-Lys-ProTrp-Lys-Lys-Arg-Pro-Arg-Pro-Asp-Asp-Leu-Glu-lle-OH (SEQ ID NO: 91), em que Ahx é Ácido L -2-aminohexanóico (ácido 6-aminohexanóico). Granex ® usado no presente exemplo também incluiu os seguintes ingredientes inativos:

•Preservativos: metilparabeno (0,17% p/p) e propilparabeno (0,02% p/p)

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117/127 • Solventes: glicerina (5% p/p), propileno glicol (3% p/p), e água purificada (quantidade suficiente) • Agentes Tampões: fosfato de sódio monobásico (0,263% p/p) e fosfato de sódio dibásico (0,044% p/p) •Agente Quelante: edetato dissódico (0,05% p/p) •Estabilizador: D-manitol (0,05% empeso/peso) [0236] No estudo, o gel Granex® foi embalado em recipientes de uso único, contendo 5 g de gel por tubo. Granex® é um gel transparente, inodoro, hipoalergênico e fácil de aplicar [0237] Neste estudo, tratamento tópico Com Granexin ® (100 μΜ ou 200 μΜ) ou tratamento de veículo foi iniciado com observação de Eritema (valor Kumar > 1,0) em qualquer local (entre 11-14 dias após a exposição à lesão por radiação) e continuou durante o curso do estudo. Começando no Dia 1 e a cada 3 dias após isso, a documentação de eritema, descamação e lesão (escarvão, ulceração e necrose) foi tomado e os locais da pele foram classificados sistematicamente (cegamente) para eritema e descamação, utilizando-se a escala Kumar.

[0238] Os resultados do tratamento são mostrados na tabela 10 abaixo e ilustrados na figura IA. A Escala Kumar é mostrada na tabela 11.

Tabela 10: Comparações médias da pontuação da pele (± SD)

Dia após irradiação	Veículo (n=8)	Granexin 100 μΜ (n=8)	Granexin 200 μΜ (n=8)
19	1.88 + 0.25	1.63 + 0.48	1.63+0.75
22	2.38 + 0.48	1.75 + 0.50	1.88 + 0.75
28	3.63 + 0.25	2.88 + 1.25	2.50+1.73
31	3.75 + 0.29	3.00+1.35	2.63 + 1.60

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Tabela 11: Escala Kumar

Pontuação	Mudanças na pontuação da pele
1.0	Sem efeito
1.5	Eritema mínimo, pele levemente seca
2.0	Eritema moderado, pele seca
2.5	Eritema visível, descamação seca
3.0	Descamação seca, crostas secas mínimas
3.5	Descamação seca, crostas secas, crosta superficial mínima
4.0	Descamação úmida e desigual, crosta moderada.
4.5	Descamação úmida confluente, úlceras, grandes crostas profundas
5.0	Ferida aberta, perda total da espessura da pele
5.5	Necrose

[0239] Os pontos de tempo subsequentes demonstram diferenças visuais claras do tratamento, conforme mostrado na figura 1B.

[0240] Os resultados do estudo mostraram que os locais de radiação tratados com Granexina ® (100 μΜ ou 200 μΜ) mostrou uma diminuição em eritema e desenvolvimento de descamação, como avaliado pela escala Kumar em comparação com os locais tratados com veículo. Assim, a composição foi eficaz na prevenção de progressão e gravidade de lesões, na diminuição em eritema e desenvolvimento de descamação.

[0241] Observações de classificações de Kumar inferiores com Granexin® 100 μΜ e 200 μΜ foram consistentes com descobertas histopatológicas microscópicas. O tecido da pele foi coletado a partir de cada local de irradiação, fixado em formalina tamponada neutra a 10%, processado em bloco de parafina, seções e coradas com hematoxilina e eosina (H&E). As seções foram examinadas (cegas) microscopicamente. O gel Granexin® foi mais eficaz para mitigar a severidade da lesão do que em locais que tratados com gel de veículo, como avaliado por H & Ampc; E coloração de biópsias tomadas na necropsia de Animal terminal (dia 43; Fim de estudo) (Figura 1C). O estudo histopatológico mostrou um efeito de

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119/127 resposta de dose, onde a concentração de 200 μΜ de Granexin® foi altamente eficaz para mitigar a severidade (ulceração, infiltração de neutrófilo).

Exemplo 2: Tratamento com composição de polipeptídeo ACT para prevenir e mitigar a progressão de CRI após exposição à radiação ionizante-estudo de aplicação antecipada (iniciação de tratamento 24 horas pós-irradiação) [0242] Para avaliar o potencial de Granexin® para prevenir a progressão da CRI cutânea, a gravidade e a ulceração, os locais irradiados foram profilaticamente tratados (antes da apresentação de sintomas de CRI) com veículo ou Granexin® 1.000 μΜ. Granexin® foi aplicado iniciando em 24 horas após a exposição e continuado uma vez por 30 dias. Resumidamente, no dia 0, cada animal foi anestesiado e exposto a frações únicas de elétrons de baixa energia (6 MeV) utilização de um acelerador linear varian CLINAC 21EX em uma dose alvo de 45 Gy. Granexin® ou gel veículo foi aplicado uma vez por dia iniciando em 24 horas após a exposição à radiação.

[0243] Os locais irradiados tratados com gel Granexin® mostraram progressão de lesão retardada e ulceração e severidade de dano reduzido de CRI em comparação com locais tratados com gel de veículo. Comparações fotográficas do dia 21 mostram que o tratamento profilático com Granexin® a 1.000 μΜ impede o desenvolvimento cutâneo de danos à radiação em comparação com o controle (Figura 2).

[0244] Estes dados demonstraram que Granexin® tem um efeito benéfico tanto na prevenção quanto no tratamento da lesão cutânea. Os dados ainda documentam uma curva de resposta de dose positiva.

Exemplo 3: Tratamento com composição de polipeptídeo ACT em um modelo de irradiação de corpo parcial murino GI-direcionado

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120 / 127 [0245] Neste estudo, camundongos C557BL/6 (η = 40; 20 fêmeas e 20 machos) foram expostos a irradiação de corpo parcial por uma dose de exposição de 15,6 a 50 cGy/min utilizando uma fonte de 60 Co. Uma câmara de ionização de fazendeiro foi usada para fornecer a quantificação em tempo real da dose de radiação. Os animais foram irradiados em um restritor projetado personalizado onde seu membro pélvico esquerdo foi estendido e mantido em posição para permitir a proteção com uma estrutura de “cerrobend”. Este método de proteção de 5% de medula óssea serve para a recuperação de camundongos contra a dor hematopoiética. Iniciando 24 horas após a exposição, os animais foram tratados diariamente com 0,9% de cloreto de sódio (veículo) ou 10 mg/kg de polipeptídeo ACT11 (polipeptídeo ACT1) administrado por via intraperitoneal por até 21 dias. Metade dos animais (subtraindo aqueles que morreram nos dias 1-7) foram submetidos à eutanásia no dia 8 para permitir o exame histológico dos órgãos GI (resultados de histologia pendentes). As análises preliminares de sobrevivência de Kaplan Maier Indicam que o tratamento Sistêmico ACT11 tem um efeito precoce sobre a mortalidade animal (Figura.4). Portanto, os resultados do estudo mostraram que o polipeptídeo ACT1 reduz o dano à radiação interna da irradiação.

[0246] E entendido que o método e composições descritos não são limitados à metodologia, protocolos e reagentes específicos descritos, como estes podem variar. Deve-se também entender que a terminologia aqui usada tem a finalidade de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0247] Deve ser observado que, conforme usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares um e o incluem uma referência plural, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a um polipeptídeo inclui uma pluralidade

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121 / 127 de tais polipeptídeos, referência ao polipeptídeo é uma referência a um ou mais polipeptídeos e equivalentes dos mesmos conhecidos por aqueles versados na técnica, e assim por diante.

[0248] Opcional ou opcionalmente significa que o evento, circunstâncial ou material subsequentemente descrito pode ou não ocorrer ou estar presente, e que a descrição inclui casos onde o evento, circunstância, ou material ocorre ou está presente e casos em que não ocorre ou não está presente.

[0249] Faixas podem ser expressas aqui como a partir de cerca de um valor particular e/ou a cerca de um outro valor particular. Quando tal faixa é expressa, também especificamente contemplada e considerada revelada é a faixa de um valor particular e/ou para o outro valor particular a menos que o contexto indique especificamente de outra forma. Similarmente, quando os valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente cerca de”, deve ser entendido que o valor particular forma uma outra modalidade especificamente contemplada que deve ser considerada apresentada a menos que o contexto indique especificamente de outra forma. Será adicionalmente entendido que os pontos finais de cada uma das faixas são significativos tanto em relação ao outro ponto final, e independentemente do outro ponto final, a menos que o contexto indique especificamente de outra forma. Finalmente, deve ser entendido que todos os valores individuais e sub-faixas de valores contidos dentro de uma faixa explicitamente descrita são também especificamente contemplados e devem ser considerados expostos a menos que o contexto indique especificamente de outra forma. O precedente se aplica independentemente de se, em particular casos, algumas ou todas estas modalidades são explicitamente descritas.

[0250] A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados como comumente entendidos por aqueles versados na técnica à qual o método e as composições

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122 / 127 apresentadas pertencem. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste do presente método e composições, os métodos, dispositivos e materiais particularmente úteis são como descritos. As publicações citadas aqui e o material para o qual são citados são aqui especificamente incorporados para referência. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não é intitulada para antecipar tal divulgação em virtude da invenção anterior. Não é feita admissão de que qualquer referência constitui a técnica anterior. A discussão de referências declara que seus autores afirmam, e os requerentes reservam a direita para desafiar a precisão e a pertinência dos documentos citados. Será claramente entendido que, embora várias publicações sejam referidas aqui, tal referência não constitui uma admissão de que qualquer um destes documentos forma parte do conhecimento geral comum na técnica.

[0251] Por toda a descrição e reivindicações desta especificação, a palavra compreende e variações da palavra, tal como compreendendo e compreende , significa incluindo, mas não limitado a” e não se destina a excluir, por exemplo, outros aditivos, componentes, inteiros ou etapas.

[0252] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou podem ser capazes de determinar usando não mais do que experimentação rotineira, muitos equivalentes às modalidades específicas do método e composições aqui descritos. Pretende-se que tais equivalentes sejam abrangidos pelas reivindicações a seguir.

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Claims (36)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para tratar ou prevenir lesões por radiação em um indivíduo em risco de tal dano, caracterizado por compreender administrar no indivíduo uma composição contendo um polipeptídeo isolado compreendendo carboxi terminal-mais 4 a 30 aminoácidos contíguos de uma alfa Conexina.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por administrar a composição antes da exposição do indivíduo à radiação.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por administrar a composição no indivíduo após a exposição à radiação, onde o método inibe a progressão da lesão por radiação.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por administrar a composição topicamente no indivíduo.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter na composição um gel de hidroxietilcelulose.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por apresentar o gel de hidroxietilcelulose em uma concentração de cerca de 1,25% (p/p).
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por administrar a composição no indivíduo por via parenteral.
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por administrar a composição no indivíduo por uma via intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular.
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por administrar a composição no indivíduo por aplicação aerossolizada.
10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por administrar a composição no indivíduo em uma dose de cerca de 10 pm a cerca de 2.000 pm.

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    2/4
11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por administrar a composição no indivíduo em uma dose de cerca de 100 pm a cerca de 200 pm.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por administrar a composição no indivíduo em uma dose de cerca de 1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg.
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por administrar no indivíduo uma composição que compreende o polipeptídeo topicamente e administrar uma composição que compreende o polipeptídeo sistemicamente.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por selecionar a lesão por radiação a partir do grupo que consiste em lesão cutânea (CRI), síndrome de radiação aguda (ARS), dano à radiação combinado, queimaduras de radiação, dermatite por radiação, lesão por radiação ao sistema nervoso ou cérebro, pneumonite por radiação, entente induzida por radiação, ou uma combinação dos mesmos.
15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a lesão por radiação compreender CRI e ARS.
16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a lesão de dermatite por radiação ser um resultado de uma intervenção médica.
17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a intervenção médica ser uma terapia para tratamento de câncer.
18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a terapia para tratamento de câncer ser a radioterapia.
19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a lesão por radiação resultar da exposição a uma fonte de radiação selecionada a partir do grupo que consiste em armas de destruição de massa (WMD), explosões nucleares e bombas sujas.

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20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o dano à radiação resultar da exposição a uma bomba suja.
21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dano à radiação resultar da exposição a uma fonte de radiação selecionada a partir do grupo que consiste em uma máquina para diagnóstico, do sol, ou de um leito de bronzeamento.
22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a lesão por radiação ocorrer em um tecido selecionado do grupo que consiste em pele, coração, osso, cérebro, medula espinhal, córnea, retina e nervo periférico.
23. 23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o dano por radiação ocorrer sobre a pele.
24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por diminuir a pontuação média da pele em pelo menos cerca de 30% na presença do polipeptídeo em comparação com um controle.
25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo impedir a captação de radionuclídeos.
26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo consistir no carbóxi terminal-mais, 5 a 19 aminoácidos contíguos da alfa Conexina.
27. 27. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a alfa Conexina ser a Conexina 37, Conexina 40, Conexina 43, ou Conexina 45.
28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5.
29. 29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

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30. 30. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo compreender adicionalmente uma sequência de intemalização celular.
31. 31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a sequência de intemalização celular compreender uma sequência de aminoácidos de uma proteína selecionada a partir de um grupo que consiste em Antenapedia, TAT, HIV-tat, Penetratina, Antp-3 a (Mutante Antp), buforina II, Transportan, MAP (peptídeo anfipático modelo), K-FGF, Ku70, Prion, pVEC, Pep-1, syb 1, Pep-7, HN-1, BGSC (Bis-GuanidínioEspermidina-colesterol) e BGTC (Bis-guanidínio-Tren-Colesterol).
32. 32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a sequência de intemalização celular ser a Antenapedia, e compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.
33. 33. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.
34. 34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.
35. 35. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição compreender SEQ ID NO: 91.
36. 36. Método de prevenção de lesões por radiação em um indivíduo em risco de tal dano, caracterizado por compreender administrar no indivíduo uma composição contendo um polipeptídeo isolado compreendendo o carboxiterminal-mais 4 a 30 aminoácidos contíguos de uma alfa Conexina.