JP2022511307A - αコネキシンＣ末端ペプチドを用いるナノ粒子製剤およびその方法 - Google Patents

αコネキシンＣ末端ペプチドを用いるナノ粒子製剤およびその方法 Download PDF

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Abstract

TIFF2022511307000013.tif82127本開示は、ナノ粒子製剤およびαコネキシンc末端ペプチドの使用方法に関する。例えばがん治療における、その製造方法および使用方法もまた提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2018年9月12日出願の米国仮出願番号第62/730,116号に対する優先権を主張するものであって、その全てを参照により本明細書に組み込むものである。
連邦政府の資金援助を受けた研究であることの声明
本発明は、アメリカ国立衛生研究所の助成金を受け、政府支援の下に行われた(Grant No. R43 CA195937、およびGrant No. R43 CA195937)。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
電子データで提出したテキストファイルの説明
本開示において電子データで提出したテキストファイルの内容は、その全てを参照により本明細書に組み込むものである。コンピューターで読み取り可能な形式の配列表のコピー(ファイル名: FIRS_008_01WO_SeqList_ST25.txt、記録日: February September 12, 2019、ファイルサイズ: 34 kilobytes)。
技術分野
本開示は、αCT1ペプチド含有ナノ粒子製剤、ならびにαCT1含有ナノ粒子製剤によるがんおよびその他の適応症の治療に関する。
物理的および化学的変化(すなわち変性、凝集、酸化、加水分解など)に対するインビボの感受性は、ペプチドおよびタンパク質の治療法の開発を妨げてきた。生分解性ナノ粒子は、薬物ターゲティングの達成およびオフターゲットの副作用の減少に加え、持続性治療薬物投与を成功させ得る(非特許文献１～非特許文献３)。その生体適合性および生分解性により、ポリマーナノ粒子(例えばポリ(ラクト-コ-グリコール酸)(PLGA)ナノ粒子)は、様々な低分子の徐放性製剤に用いられている(非特許文献４、非特許文献５)。徐放性製剤は、特に慢性疾患(例えば非治癒性潰瘍)、ならびにその他の病気(例えば、治癒または回復に数週間以上かかり得るがん、および反復的な治療介入を必要とし得るがん)に有効である(非特許文献５)。
αCT1(aCT1またはACT1とも呼ばれる)は、合成C末端コネキシン43模倣ペプチド薬であり、現在、慢性創傷の治療の臨床試験(非特許文献６～非特許文献８)、神経膠芽腫(脳がん)の治療の動物試験(非特許文献９)が行われている。現在の治療パラダイムには、複合利用または複合投与が含まれる。
当該分野において、生体適合性かつ徐放性ペプチド-ナノ粒子製剤およびその新しい簡便な製造方法が必要である。さらに、当該分野において、静脈内投与され得る、生体適合性かつ徐放性ペプチド-ナノ粒子製剤が必要である。
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一部の実施態様において、本開示は、1以上のナノ粒子を含む組成物を提供し、ここで該ナノ粒子は、1以上の生分解性または生体適合性ポリマー、および治療上有効量のSEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。一部の実施態様において、該ペプチドは、さらに細胞内輸送配列(例えばアンテナペディア、TAT、HIV-Tat、ペネトラチン、Antp-3A(Antp変異体)、ブフォリンII、トランスポータン、MAP(モデル両親媒性ペプチド)、K-FGF、Ku70、プリオン、pVEC、Pep-1、SynB 1、Pep-7、HN-1、BGSC(ビス-グアニジウム-スペルミジン-コレステロール)およびBGTC(ビス-グアニジウム-トレン-コレステロール)からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列)を有する。一部の実施態様において、該ペプチドは、SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有する。
一部の実施態様において、1以上の生分解性または生体適合性ポリマーは、PLGAである。一部の実施態様において、1以上の生分解性または生体適合性ポリマーは、PLGAおよびPVAである。一部の実施態様において、PLGAは、約4,000～約240,000DaのMW(例えば約7,000～約17,000Da)を有する。一部の実施態様において、PVAは、約8,000～約186,000DaのMW(例えば約13,000～約23,000Da)を有する。一部の実施態様において、PVAの量は、約0.05%(w/v)%～約5%(w/v)の間である。一部の実施態様において、PLGAの量は、約2%(w/v)～約10%(w/v)の間である。一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径は、約10nm～約1000nmの間(例えば約100nm～約200nmの間)である。一部の実施態様において、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有するペプチドの平均量は、ナノ粒子組成物1mgに対し、少なくとも約500ngである。一部の実施態様において、該ナノ粒子は、ゼータ電位が約0mV～約-30mVの間であることが特徴の、表面電荷を有する。一部の実施態様において、該ナノ粒子は、約0.120～約0.350の多分散度(PDI)を有する。
一部の実施態様において、本開示は、本開示のナノ粒子組成物、および1以上の医薬的に許容される担体または賦形剤を含む医薬製剤を提供する。一部の実施態様において、該製剤は、注射用製剤の液体であり得る。一部の実施態様において、該製剤は、エアロゾル、クリーム、発泡体、エマルジョン、ゲル、液体、ローション、パッチ、粉末、固体、スプレーの形態、またはその任意の組み合わせであり得る。
一部の実施態様において、本開示は、本開示のナノ粒子組成物を含む局所用製剤を提供する。一部の実施態様において、該局所用製剤は、さらにヒドロキシエチルセルロースゲルを含む。
一部の実施態様において、本開示は、本開示のナノ粒子組成物の製造方法であって;
(a)有機溶媒に溶解した生分解性または生体適合性ポリマーを1つ以上含む第1溶液を、第1水性溶媒に溶解したSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有する第2溶液と混合し;
(b)ステップ(a)の混合物をエマルジョン化し;
(c)ステップ(b)のエマルジョンを、第2水性溶媒に溶解した生分解性または生体適合性ポリマーを1つ以上含む第2溶液に加え;
(d)有機溶媒を除去し;および
(e)適宜(d)の生成物を精製するステップ
を特徴とする方法を提供する。一部の実施態様において、上記方法はさらに、(d)または(e)の生成物を凍結および/または凍結乾燥する、(f)のステップを含む。一部の実施態様において、ステップ(a)の生分解性または生体適合性ポリマーは、PLGAである。一部の実施態様において、ステップ(c)の生分解性または生体適合性ポリマーは、さらにPVAを含む。
一部の実施態様において、本開示は、本開示のナノ粒子組成物の製造方法であって;
(a)
i. 水混和性有機溶媒に溶解したSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列および1以上の生分解性または生体適合性ポリマー;および
ii.貧溶媒を加え;
(b) 水混和性有機溶媒に溶解したSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列および1以上の生分解性または生体適合性ポリマーを、貧溶媒と共に混合してナノ粒子組成物を形成し;および
(c) (b)の生成物を適宜精製するステップ
を特徴とする方法を提供する。一部の実施態様において、上記方法はさらに、(b)または(c)の生成物を凍結および/または凍結乾燥する、(d)のステップを含む。一部の実施態様において、ステップ(a)の生分解性または生体適合性ポリマーは、PLGAである。一部の実施態様において、ステップ(a)の生分解性または生体適合性ポリマーは、さらにPVAを含む。
一部の実施態様において、本開示は、局所用製剤の製造方法であって;
a) パラベンが完全に溶解するまで、プロピレングリコール、グリセリン、メチルパラベンおよびプロピルパラベンを混合し;
b) 別の容器中、透明溶液が得られるまで精製水、EDTA、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムおよびD-マンニトールを混合し;
c) a)の溶液をb)の溶液に加え、a)の溶液の容器を精製水で濯ぎ、その濯いだ溶液を混合溶液に加え、混合溶液が視覚的に均一になるまで混合し;
d) ホモジナイザーで混合しながら、ヒドロキシエチルセルロースをc)の混合溶液に加え、ポリマーが十分に分散するまで混合し;
e) 別の容器中、精製水をSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列と共にペプチドが完全に溶解するまで混合し;
f) e)の溶液をd)の溶液に加え、e)の溶液の容器を精製水で濯ぎ、その濯いだ溶液を混合溶液に加え、混合溶液が均一になるまで混合することを特徴とする方法を提供する。
一部の実施態様において、本開示は、がんの治療が必要な患者に、治療上有効量の本開示の医薬製剤を投与することを特徴とする、がんの治療方法を提供する。一部の実施態様において、該がんは、神経膠腫(例えば神経膠芽腫)である。一部の実施態様において、該医薬製剤は、腫瘍内注射される。一部の実施態様において、上記方法は、さらに化学療法剤(例えばTMZ)の投与を含む。一部の実施態様において、上記化学療法剤は、該医薬製剤とは併用して投与されない(例えば化学療法剤は、医薬製剤とは別の日に投与される)。一部の実施態様において、本明細書に記載のペプチド-ナノ粒子組成物は、がん治療においてナノ粒子に結合していない同じペプチドと比較して、予期せぬ優れた臨床効果をもたらす。それ故、一部の実施態様において、本明細書に記載のペプチド-ナノ粒子組成物は非修飾ペプチドと比較して、神経膠腫に対して、予期せぬ優れた臨床効果をもたらす。一部の実施態様において、本明細書に記載のペプチド-ナノ粒子組成物は、がん患者に対して有意に改善された結果をもたらす、優れた薬物放出プロファイルおよび/または粒子特性を示す。一部の実施態様において、上記方法は、均一な粒子径を有し、粒子の凝集がほとんどないか、皆無であるペプチド-ナノ粒子を生成する。
一部の実施態様において、本開示は、本開示の該局所用製剤を対象に投与することを特徴とする、対象の慢性創傷の治療方法を提供し、ここで上記製剤は、慢性創傷の治療に有効な投与計画(例えば日ごとまたは週ごと)で投与される。一部の実施態様において、慢性創傷は、潰瘍(例えば下肢潰瘍)である。一部の実施態様において、慢性創傷は、静脈下腿潰瘍、糖尿病性足潰瘍、および褥瘡からなる群から選択される。一部の実施態様において、本明細書に記載のペプチド-ナノ粒子組成物は、慢性創傷に治療において、予期せぬ優れた臨床効果をもたらす。一部の実施態様において、本明細書に記載のペプチド-ナノ粒子組成物は、創傷の治療において優れた臨床効果を示し、既知の創傷治療法と比較して、優れた薬物放出プロファイルをもたらす。一部の実施態様において、本明細書に記載のペプチド-ナノ粒子組成物は、創傷治療において有意に改善された結果をもたらす粒子特性を示す。
本開示のその他の目的、特徴および長所は、次の詳細な説明から明かになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例は、好ましい実施態様を示すものである一方、この詳細な説明から本開示の精神および範囲内の様々な変更および修正が当業者に明らかであるため、説明の目的でのみ与えられると理解されるべきである。
図1は、BSAをモデル薬物として用いた、粒子径の最適化を行うための動的光散乱のピークのグラフを示す。
図2は、PLGA-NPからローダミンBを放出する割合と時間の関係を示す。
図3は、A) 抗凍結剤が使用されていない場合、凍結の有無での粒子の直径の変化、B)使用した抗凍結剤の量に応じた、凍結後の粒子の直径を示す。1%スクロース(急速凍結または緩慢凍結)または1%トレハロース(緩慢凍結)を加えた場合、粒子径は未凍結NPの大きさに近くなった。トレハロースおよびスクロースを濃度15%で加えると、粒子径は、いずれの抗凍結剤も加えずに粒子を緩慢凍結させるより大きくなった。エラーバーは、少なくとも3つのサンプルの標準偏差である。
図4は、A) ナノ粒子からのαCT1の累積放出と時間の関係を、封入された全薬物に占める割合の関数として、サンドイッチELISAアッセイで測定したグラフ、B) DLSにより測定したαCT1ナノ粒子分解中の粒子の直径(累積平均)および粒子径の均一性を表すナノ粒子の多分散度を示す。SEM画像は、1日目(CおよびD)、7日目(EおよびF)、および21日目(GおよびH)のαCT1-NPである(スケールバーは1μm(C、E、およびF)および100nm(D、F、およびH))。
図5は、A) 後の細胞実験の最適濃度を決定するために、RhB-NPの濃度を変化させた際の細胞内への取り込みを示す。イメージングは細胞を一夜インキュベートした後に行った。B) VTC-037 GSCに導入したNPからのRhBの放出を3週間かけて行った(BF: 明視野、Fluo: 蛍光、スケールバー: 200μm)。
図6は、RhB-NPを1時間インキュベート後の、37℃および4℃でのGSCへの取り込みを示す(BF: 明視野、Fluo: 蛍光、スケールバー: 200μm)。
図7は、RhB-NPの細胞内への取り込みを示す(スケールバー: 20μm)。
図8は、RhB-およびαCT1-NPの細胞内への取り込みを示す(スケールバー: 20μm)。
図9は、図式でのPLGA-NPの説明を示す。
図10は、αCT1-NPのフラッシュナノ沈殿のプロトコルを示す(Gindy, M., et al., Langmuir 2008, 24 (1), 83-90., 24 (1), 83-90のプロトコルを変更)。
図11は、A.) ダブルエマルジョンおよびB.) 4ジェットミキサーを用いるフラッシュナノ沈殿で合成したαCT1-PLGA-NPのSEM分析を示す。粒子径および形態は上記技術間で比較可能である。
図12は、A.) RhodB-NP放出速度の評価を示す。NPにおける形態の変化は時間をかけても検出されず、ローダミンBは36日間検出された。B.) ダブルエマルジョンまたはフラッシュナノ沈殿で合成したナノ粒子をPBS溶液中、1mg/mLの濃度で再分散し、αCT1放出を分析するために37℃で分解させた。フラッシュナノ沈殿では、αCT1の早期バースト放出が少なかった。
図13は、LnN229/GSCは、RhodB-NP(赤)を効率的に取り込み、細胞質への添加24時間後に検出され得ることを示す。
図14は、VTC-037(神経膠芽腫の患者から単離した初代細胞)は、RhodB-NP(red)を効率的に取り込み、21日未満の間インビトロで検出され得ることを示す(BF=明視野、Fluo=蛍光顕微鏡)。
図15は、ヒトGBM細胞は、αCT1-NPから放出されるαCT1を効率的に取り込むことを示す。αCT1は、4日未満の間インビトロで検出され得る。細胞をαCT1-NPに24時間暴露した後、培地を除去した。細胞をPBS/BSA3%/Triton0.1%で固定および透過処理した後、Biot-αCT1を検出するためのストレプトアビジンAlexa Fluor 647コンジュゲート、Cx43のCTに対する抗体(Sigma #C6219)およびヤギ抗ウサギ二次抗体とAlexa Fluor 488のコンジュゲート、および核を染色するDAPIを用いて染色した。
図16は、αCT1-NPを用いた治療は、TMZと組み合わせて用いた場合、GBM異種移植マウスモデルにおいて有意に腫瘍体積を縮小させることを示す。TMZ単体の治療では、成長を続ける腫瘍に対する効果は皆無である。
詳細な説明
αCT1は、合成C末端コネキシン43模倣ペプチド薬であり、現在、慢性創傷の治療の臨床試験(非特許文献６～非特許文献８)、神経膠芽腫(脳がん)の治療の動物試験(非特許文献９)が行われている。慢性創傷の治療において、現在の治療パラダイムには、治療のうちに複合局所投与が含まれる。徐放性αコネキシンペプチド製剤の開発は、全体の治療費用の削減および服薬遵守の向上に繋がり得る。さらに、腫瘍内または静脈内投与され得る徐放性αコネキシンペプチド製剤の開発は、様々ながん治療に対するαコネキシンペプチドの性質の適応性を向上させる。該ペプチドは、アルギン酸微粒子を用いるエレクトロスプレー法の先行研究においてカプセル化に成功しており、約24時間の適度な薬物放出プロファイルをもたらす(非特許文献１０、非特許文献１１)。αCT1の治療上の応用には脳組織の狭い細胞外間隙(神経膠芽腫治療)への運搬(非特許文献９)または静脈内投与を含み得ると仮定すると、ナノ粒子放出システムは、微粒子またはその他の、よりかさ高いものからの放出方法と比較して、好ましいドラッグデリバリー方法であり得る。本開示は、生体適合性かつ徐放性のαCT1ナノ粒子製剤、およびそのような製剤の製造方法を提供する。
上記、および本開示を通して用いられる次の用語は、特に断りが無い限り、以下に示す意味であると理解されるべきである。示されていない用語は、当業者に公知の従来の用語である。
本明細書で用いる、用語「含む」、「包含する」および「有する」は、限定されない、広い意味で用いられる。
本開示で用いられる冠詞「a」および「an」は、冠詞の文法上の目的語が1または1以上(すなわち、少なくとも1)であることをいう。例えば、「an element」は、1要素または1以上の要素を意味する。
本開示で用いられる用語「および/または」は、特に断りが無い限り、「および」または「または」のいずれかを意味する。
より簡潔な説明を提示するために、本明細書に記載の定量的な表現の一部は、用語「約」が付き、限定されていない。用語「約」が明確に用いられているか否かに関わらず、本明細書に記載のあらゆる量は、与えられた実際の値、および当業者の技術に基づいて合理的に推測され得る、与えられた値の近似値(実験条件および/または測定条件による、与えられた値の同当量および近似値を含む)もまた指すことを意図することが理解されるべきである。収量が割合で与えられる場合、その収量は、特定の化学量論的条件下で得られうる物質の最大量に対する、実際収量が与えられる物質の質量をいう。割合で与えられる濃度は、特に断りが無い限り、質量比をいう。
「患者」は、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ)、または非ヒト霊長類(例えばサル、チンパンジー、ヒヒまたはアカゲザル)である。「患者」には、ヒトおよび動物の両方が含まれる。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書にて同義で用いられ、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーをいう。該ポリマーは、直鎖または分岐鎖であってもよく、修飾アミノ酸が含まれても、非アミノ酸が途中に含まれてもよい。また、該用語には、修飾されているアミノ酸ポリマー(例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはいずれの他の操作(例えば標識成分とのコンジュゲート)も包含される。本明細書で用いる用語「アミノ酸」には、天然および/または非天然または合成アミノ酸(例えば、グリシン、およびDまたはL両方の光学異性体、およびアミノ酸類似体ならびにペプチド模倣薬)が挙げられる。
用語「有効量」または「治療有効量」が化合物に関連して用いられる場合、該用語は、所望の生物学的結果をもたらす化合物の十分量をいう。その結果、徴候、症状、または疾患の原因の減少および/または軽減、またはいずれの他の所望の生命システムの変化をもたらし得る。例えば、治療に用いるための「有効量」は、臨床的に有意な疾患の減少をもたらすのに必要な本明細書で開示の化合物を含む、組成物の量である。個々の事例における適当な「有効量」は、当業者による所定の実験を用いて決定され得る。それ故、表現「有効量」は、一般に、治療効果を有する活性物質の量をいう。
本明細書で用いる、用語「治療する」または「治療」は、用語「予防する」と同義であり、疾患の進行の遅延、疾患の進行の阻害、および/または進行する、または進行すると予想されるそれらの症状の重症度合の減少を指すことを意図する。それ故、これらの用語には、現存の病徴の改善、別の症状の予防、症状の根本的な原因の改善または予防、障害または疾患の抑制(例えば、障害または疾患の進行の阻止、障害または疾患の緩和、障害または疾患の軽減、疾患または障害によって引き起こされる病状の緩和、または疾患または障害の症状の阻止もしくは軽減)が挙げられる。
本開示で用いられる用語「障害」は、特に断りが無い限り、疾患、病状、または病気といった用語と同義で用いられる。
用語「医薬的に許容される」または「薬理学的に許容される」を用いることで、生物学的に、またはその他の点で、望ましくない物質が、あらゆる実質的に望ましくない生物学的効果を引き起こすこと、または含まれる組成物のいずれかの成分と有害な相互作用をせずに個人に投与されてもよいことを意味することを意図する。
本開示で用いられる用語「担体」は、担体、賦形剤、および希釈剤を包含し、物質、組成物またはビークル(例えば、患者のある臓器、または体の一部から、別の臓器、または別の体の一部への医薬品の運搬または送達に関与する、液体または固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル剤)を意味する。賦形剤は、所望の剤形の適合性および放出プロファイルの性質に基づいて選択されるべきである。担体物質の例には例えば、結合剤、懸濁化剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、湿潤剤、希釈剤、噴霧乾燥分散剤などが挙げられる。
用語「医薬的に適合する担体物質」には、例えば、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、カゼインナトリウム、大豆レシチン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラゲナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファ化デンプンなどが含まれ得る。例えば、Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1975を参照のこと。
本明細書で用いる用語「対象」は、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例には、以下に限らないが、哺乳綱のあらゆる動物:ヒト、非ヒト霊長類(例えばチンパンジー、およびその他の類人猿およびサル目)、飼育動物(例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、家畜動物(例えばウサギ、イヌ、およびネコ)、齧歯類を含む実験動物(例えばラット、ネズミおよびモルモット)などが挙げられる。非哺乳動物の例には、以下に限らないが、鳥類、魚類などが挙げられる。本開示のある実施態様において、哺乳動物はヒトである。
本開示で用いる用語「投与された」、「投与」、または「投与する」は、開示の化合物またはその化合物の医薬的に許容される塩または組成物を、対象に直接投与するか、または本化合物またはその化合物の医薬的に許容される塩または組成物のプロドラッグ誘導体または類似体を、対象に投与することのいずれかをいい、これにより対象者に該化合物を接触させるか、または他の方法で対象者に該化合物を暴露させることで、治療を必要とする動物を含む対象の体内で、同当量の活性化合物を形成出来る。
本明細書で用いる、用語「投与」は、物質を治療部位へ供給することを意味する。例えば、対象への治療薬および/または予防薬の投与は、対象への本開示のナノ粒子の投与を含んでもよい(例えば、局所、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下投与)。哺乳動物または哺乳動物の細胞へのナノ粒子の投与は、1以上の細胞にナノ粒子を接触させることを含んでもよい。
カプセル化とは、ナノ粒子にロード、会合、結合または付着した薬物(例えば治療上有効量のαコネキシンポリペプチド(例えば、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有するペプチド))の量を意味する。一般に、ナノ粒子の薬物カプセル化能は、薬物の出発量の割合で表される。それ故、全ての薬物がナノ粒子中にカプセル化された場合、最適なカプセル封入率100%が達成される。
本明細書で用いる、「カプセル化効率」は、ナノ粒子の調製に用いた治療薬の最初の全量に対して、ナノ粒子の一部になる治療薬の量をいう。例えば、もし最初の合計が100mgの治療薬のうち、97mgの治療薬がNP中にカプセル化されて組成物となる場合、カプセル化効率は、97%であってもよい。本明細書で用いる「カプセル化」は、完全、十分、または部分的な、封入、閉じ込め、包囲、または内包を指してもよい。
用語「%(w/v)」は、単位体積あたりの重量のパーセンテージをいい、それ故2%PLGA(w/v)は、本開示のナノ粒子を形成するために溶媒に加えられる、PLGAの初期量をいう(すなわち、溶媒100mLに加えられたPLGAは2gである)。
この研究において、ナノ粒子は様々なカプセル化の方法を用いて調製され、合成ペプチド薬αCT1の放出を制御する。
αコネキシンポリペプチド
コネキシンとは、細胞間情報伝達の機能を担うギャップ結合チャンネルのサブユニットタンパク質である(Goodenough and Paul, 2003)。ヌクレオチドの保存配列のパターンに基づいて、コネキシンタンパク質をコードする遺伝子は、αコネキシンおよびβコネキシンと呼ばれる2つのファミリーの遺伝子に分けられる。
本開示は、αコネキシンのカルボキシ末端のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有する組成物である。このαコネキシンのC末端アミノ酸配列は、本明細書において、αコネキシンカルボキシ末端またはACTポリペプチドと呼ばれてもよい。
一部の態様において、本開示の組成物は、αコネキシンのC末端に4～30個のアミノ酸が含まれるポリペプチドを包含する。例えば、該ポリペプチドは、αコネキシンC末端に、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個のアミノ酸を包含してもよい。一部の態様において、ポリペプチドは、完全長αコネキシンタンパク質を含んでいない。一部の態様において、ポリペプチドは、αコネキシンの細胞質N末端ドメインを含んでいない。一部の態様において、ポリペプチドは、αコネキシンの2つの細胞外ドメインを含んでいない。一部の態様において、ポリペプチドは、αコネキシンの4つの膜貫通ドメインを含んでいない。一部の態様において、ポリペプチドは、αコネキシンの細胞質ループドメインを含んでいない。一部の態様において、ポリペプチドは、4つの膜貫通ドメイン近位のαコネキシンの細胞質カルボキシル末端ドメインの配列の一部を含んでいない。
ポリペプチドのACT配列は、任意のαコネキシン由来であってもよい。一部の態様において、ポリペプチドのαコネキシン成分は、ヒト、マウス、ウシ、単孔類、有袋類、霊長類、齧歯類、クジラ、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、脊索動物、原索動物由来、またはその他のαコネキシンであってもよい。
一部の態様において、該ポリペプチドは、以下からなる群から選択されるコネキシンのACTを含んでもよい;マウスコネキシン47、ヒトコネキシン47、ヒトコネキシン46.6、ウシコネキシン46.6、マウスコネキシン30.2、ラットコネキシン30.2、ヒトコネキシン31.9、イヌコネキシン31.9、ヒツジコネキシン44、ウシコネキシン44、ラットコネキシン33、マウスコネキシン33、ヒトコネキシン36、マウスコネキシン36、ラットコネキシン36、イヌコネキシン36、ニワトリコネキシン36、ゼブラフィッシュコネキシン36、モロネコネキシン35、モロネコネキシン35、イモリコネキシン35、テトラオドンコネキシン36、ヒトコネキシン37、チンパンジーコネキシン37、イヌコネキシン37、キヌゲネズミコネキシン37、マウスコネキシン37、ゴールデンハムスターコネキシン37、ラットコネキシン37、マウスコネキシン39、ラットコネキシン39、ヒトコネキシン40.1、アフリカツメガエルコネキシン38、ゼブラフィッシュコネキシン39.9、ヒトコネキシン40、チンパンジーコネキシン40、イヌコネキシン40、ウシコネキシン40、マウスコネキシン40、ラットコネキシン40、キヌゲネズミコネキシン40、ニワトリコネキシン40、ヒトコネキシン43、オナガザルコネキシン43、アナウサギコネキシン43、ジリスコネキシン43、キヌゲネズミコネキシン43、ヒメキヌゲネズミコネキシン43、ラットコネキシン43、イノシシコネキシン43、ゴールデンハムスターコネキシン43、マウスコネキシン43、テンジクネズミコネキシン43、ウシコネキシン43、ハリネズミコネキシン43、ニワトリコネキシン43、アフリカツメガエルコネキシン43、アナウサギコネキシン43、コイコネキシン43、ゼブラフィッシュコネキシン43、ジャイアントダニオコネキシン43、ゼブラフィッシュコネキシン43.4、ゼブラフィッシュコネキシン44.2、ゼブラフィッシュコネキシン44.1、ヒトコネキシン45、チンパンジーコネキシン45、イヌコネキシン45、マウスコネキシン45、ウシコネキシン45、ラットコネキシン45、ニワトリコネキシン45、テトラオドンコネキシン45、ニワトリコネキシン45、ヒトコネキシン46、チンパンジーコネキシン46、マウスコネキシン46、イヌコネキシン46、ラットコネキシン46、ゴールデンハムスターコネキシン46、キヌゲネズミコネキシン46、ニワトリコネキシン56、ゼブラフィッシュコネキシン39.9、ウシコネキシン49、ヒトコネキシン50、チンパンジーコネキシン50、ラットコネキシン50、マウスコネキシン50、イヌコネキシン50、ヒツジコネキシン49、ゴールデンハムスターコネキシン50、キヌゲネズミコネキシン50、ニワトリコネキシン50、ヒトコネキシン59、またはその他のαコネキシン。αコネキシンのアミノ酸配列は当業者に既知であり、表1の受入番号で同定されるものを含む。
Figure 2022511307000002
Figure 2022511307000003
一部の態様において、本開示の組成物は、通常は、上記タンパク質のαコネキシンのカルボキシ末端への結合を仲介する、タンパク質のドメインと相互作用するポリペプチドを包含する。一部の態様において、本開示の組成物は、通常、タンパク質に競合的に結合することでαコネキシンに結合する、タンパク質の機能を阻害するポリペプチドを包含する。例えば、腎芽細胞腫過剰発現タンパク質(NOV)(Fu et al., J Biol Chem. 2004 279(35):36943-50)は、Cx43のC末端ドメインと相互作用する。NOVは、αコネキシンのカルボキシ末端と相互作用し、その他のタンパク質とさらに相互作用し、巨大分子複合体を形成する。本開示の組成物のポリペプチドは、理論に囚われることなく、分子マシンの動作を阻害し得ると考えられる(例えば、NOVとの相互作用によって、Cx43ギャップ結合チャンネルの凝集の制御に関連するペプチド)。
一部の態様において、ポリペプチドは、非αコネキシンまたは非ACTペプチドコネキシンアミノ酸で両側を保護されていてもよい。非αコネキシンの例は、高感度緑色蛍光タンパク質の239個のアミノ酸配列である。非ACTペプチドコネキシンアミノ酸の例には、以下に限らないが、ヒトCx43の20～120個のカルボキシ末端アミノ酸(SEQ ID NO:72)、ニワトリCx43の20～120個のカルボキシ末端アミノ酸(SEQ ID NO:73)、ヒトCx45の20～120個のカルボキシ末端アミノ酸(SEQ ID NO:74)、ニワトリCx45の20～120個のカルボキシ末端アミノ酸(SEQ ID NO:75)、ヒトCx37の20～120個のカルボキシ末端アミノ酸(SEQ ID NO:76)、およびラットCx33の20～120個のカルボキシ末端アミノ酸(SEQ ID NO:77)が挙げられる。
αコネキシンのカルボキシ最末端アミノ酸配列は、独特かつ不変の特徴(表2を参照)が複数ある。この保持されている配列は、ACTペプチドの特徴的な三次構造の形成能と関係し、複数の提携タンパク質と相互作用し、脂質および膜との相互作用を仲介し、DNAを含む核酸と相互作用し、膜チャネルを通過および/または阻害し、およびタンパク質切断、タンパク質架橋結合、ADPリボシル化、グリコシル化およびリン酸化のためのコンセンサスモチーフをもたらす。
一部の態様において、本開示の組成物のポリペプチドは、タイプIIのPDZ結合モチーフ(Φ-x-Φ;ここでxは、任意のアミノ酸であり、Φは、例えば、表2の太字部分のような疎水性アミノ酸である)を有する。PDZモチーフは、必ずとは限らないが、通常、細胞内カルボキシル末端の最端に存在するコンセンサス配列である。タイプI(S/T-x-Φ)、タイプII(Φ-x-Φ)、タイプIII(Ψ-x-Φ)およびタイプIV(D-x-V)の4つのPDZモチーフに分類されており、ここでxは任意のアミノ酸、Φは疎水性残基(V、I、L、A、G、W、C、M、F)、およびΨは塩基性かつ親水性残基(H、R、K)である(Songyang, Z., et al. 1997. Science 275, 73-77)。
一部の態様において、本開示の組成物のポリペプチドは、αコネキシンがPDZドメインを有するタンパク質へ結合することを阻害し得る。PDZドメインは元々、シナプス後肥厚部のタンパク質PSD95/SAP90、ショウジョウバエ腫瘍抑制遺伝子dlg-A、および密着結合タンパク質ZO-1中の保存配列の一部分として同定された。元々GLGFまたはDHRモチーフと呼ばれていたが、現在は、PDZを含む最初のの3つタンパク質(PSD95/DLG/ZO-1)を表す頭文字で知られている。この80～90個のアミノ酸配列は、現在では75以上ものタンパク質で確認されており、単一のタンパク質中に複数のコピーが発現することが特徴的である。PDZドメインは、PDZ結合モチーフで敷き詰められ得る、構造的に明確に定められた相互作用「ポケット」を有する、特異型のタンパク質相互作用モジュールである。
一部の態様において、本開示の組成物のポリペプチドは、PDZ結合モチーフの近位に、プロリン(P)および/またはグリシン(G)のヒンジ型残基;高頻出なホスホセリン(S)および/またはホスホトレオニン(T)残基;および高頻出な正電荷を持つアルギニン(R)、リシン(K)および負電荷を持つアスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)アミノ酸を有する。一部の態様において、PおよびG残基は、カルボキシ末端PDZ結合モチーフ(タイプII)に近位のクラスター化モチーフ(例えば、表2のイタリック体)中に存在する。一部の態様において、ホスホアミノ酸であるSおよびTは、クラスター化反復性モチーフ(例えば、表2の下線部)中に組み込まれる。Cx43のACTペプチド配列は、ヒトから魚類まで高い割合で保持されている(例えば、表2でヒトおよびゼブラフィッシュのCx43のACT配列を比較)。さらに、Cx45のACTペプチド配列は、ヒトから鳥類まで高い割合で保持されている(例えば、表2でヒトおよびニワトリのCx45のACT配列を比較)。また、Cx36のACTペプチド配列は、霊長類から魚類まで高い割合で保持されている(例えば、表2でチンパンジーおよびゼブラフィッシュのCx36のACT配列を比較)。
Figure 2022511307000004
一部の態様において、ポリペプチドのカルボキシル末端から約17～30番目のアミノ酸(表2)にプロリンまたはグリシン残基が保存されている。これに限らないが、例は以下である。ヒトCx43において、アミノ酸363のプロリン残基は、カルボキシル末端から19番目のアミノ酸に位置する。ニワトリCx43において、アミノ酸362のプロリン残基は、カルボキシル末端から18番目のアミノ酸に位置する。ヒトCx45において、アミノ酸377のグリシン残基は、カルボキシル末端から19番目のアミノ酸に位置する。ラットCx33において、アミノ酸258のプロリン残基は、カルボキシル末端から後ろに28番目のアミノ酸に位置する。一部の態様において、本開示の組成物のポリペプチドは、カルボキシル末端から約17～30番目のアミノ酸に位置するこの保存プロリンまたはグリシン残基に近位のアミノ酸を含まない。
一部の態様において、本開示の組成物のポリペプチドは、1、2、3、または全てのアミノ酸モチーフを含み、そのモチーフは、1)タイプIIのPDZ結合モチーフ、2)プロリン(P)および/またはグリシン(G)のヒンジ型残基、3)ホスホセリン(S)および/またはホスホトレオニン(T)残基のクラスター、および4)高頻出な正電荷を持つアルギニン(R)およびリシン(K)および負電荷を持つアスパラギン酸(D)および/またはグルタミン酸(E)からなる群から選択される。一部の態様において、ポリペプチドは、カルボキシ末端でタイプIIのPDZ結合モチーフ、PDZ結合モチーフの近位にプロリン(P)および/またはグリシン(G)のヒンジ型残基、およびヒンジ型残基の近位に正電荷を持つ残基(K、R、D、E)を有する。
一部の態様において、約50%以上、約60%以上、約70%以上、約80%以上、または約90%以上のポリペプチドのアミノ酸には、1以上のプロリン(P)、グリシン(G)、ホスホセリン(S)、ホスホトレオニン(T)、アルギニン(R)、リシン(K)、アスパラギン酸(D)、またはグルタミン酸(E)のアミノ酸残基が含まれる。アミノ酸、プロリン(P)、グリシン(G)、アルギニン(R)、リシン(K)、アスパラギン酸(D)、およびグルタミン酸(E)は、タンパク質の構造および機能の決定に重要であり得る。理論に囚われることなく、プロリンおよびグリシン残基は、タンパク質の三次構造において急ターンをもたらし、機能に必要なポリペプチドの折りたたみ構造の形成が可能になると考えられている。電荷を持つアミノ酸配列は、折りたたまれたタンパク質の表面にしばしば位置し、タンパク質-タンパク質間相互作用、タンパク質-脂質間相互作用、酵素-基質間相互作用およびタンパク質-核酸間相互作用を含む、ポリペプチドが介在する化学的相互作用に重要であり得る。一部の態様において、本開示の組成物のポリペプチドは、タイプIIのPDZ結合モチーフに近位の、プロリン(P)およびグリシン(G)、リシン(K)、アスパラギン酸(D)、および/またはグルタミン酸(E)リッチな領域を含む。
αCx37の18番目のカルボキシ最末端アミノ酸配列は、ACTペプチド構成に例外的なバリエーションを発現する。Cx37 ACT様配列は、GQKPPSRPSSSASKKQ*YV(SEQ ID NO:43)である。それ故、Cx37のカルボキシ末端の4個のアミノ酸は、タイプIIのPDZ結合ドメインに一部のみ一致する。標準的なタイプIIのPDZ結合ドメインに代わり、Cx37は、疎水性アミノ酸が期待される2か所で、中性Q*を有する。その場合Cx37は、タイプIIのPDZ結合ドメイン様配列と呼ばれ得るものを含む。それでもなお、Cx37は、PDZ結合ドメイン様配列に近位の、クラスター化セリン残基、高頻出R残基およびK残基およびPリッチな配列を有するACTペプチド配列の他の全ての態様を正確に維持しており、それ故、上記に列記した70を超えるその他のαコネキシンで、ACT様配列の全体的な保存レベルを共有している。さらに、Cx37 ACT様カルボキシ末端の機能性は、その他のαコネキシンとも共通している。
比較として、βコネキシンCx26を表2に示す。Cx26は、カルボキシル末端PDZ結合モチーフ(タイプII)を有さず、カルボキシル最末端アミノ酸にS、T、R、DまたはE残基が30%未満であり、タイプIIのPDZ結合モチーフまたはPおよびGのヒンジ型残基のクラスターを含むPDZ結合様モチーフに近位のモチーフである根拠がなく、セリンおよびトレオニンのホスホアミノ酸のクラスター化反復性モチーフである根拠がない。Cx26は、配列のカルボキシ末端付近で、次々にクラスター化された3つのリシン(K)残基を有する。しかしながら、上記に列記した70を超えるαコネキシンのうち、このカルボキシ末端の3つの繰り返しK残基ドメインの特徴を示す、αコネキシンは1つもない(Cx26はβコネキシンであり、それ故定義上ACTドメインを有さない)。
一部の態様において、本開示の組成物のポリペプチドはそのポリペプチドのバリアント、誘導体、およびフラグメントを含む。一部の態様において、ポリペプチドのバリアントは、アミノ酸修飾を含む。例えば、アミノ酸配列修飾には、以下に限らないが、アミノ酸置換、アミノ酸挿入およびアミノ酸欠損が含まれてもよい。好ましい態様において、ポリペプチドは保存的置換を含み、これは、あるアミノ酸残基を、生物学的および/または化学的に似た別の残基と置換することをいう。一部の態様において、保存的置換は、ポリペプチドの構造または機能を著しく変化させない。保存的置換の例は、表3に列記されている。一部の態様において、ポリペプチドは、置換、欠損、挿入またはその他のアミノ酸置換のいずれの組み合わせを含んでもよい。
Figure 2022511307000005
一部の態様において、保存的置換は、標準的な手順(例えば、部位特異的変異誘発またはPCR;標準的ペプチド合成方法;およびアラニンスキャニング)により生成される。保存的置換は、Ben-Bassat et al., (J. Bacterial. 169:751-7, 1987), O'Regan et al., (Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth et al., (Protein Sci. 3:240-7, 1994), Hochuli et al., (Bio/Technology 6:1321-5, 1988)、および遺伝子生物学および分子生物学の標準的な教科書にさらに詳細に記載されている。一部の態様において、ポリペプチドが1以上保存的置換された場合、ポリペプチドの生物活性の25%以下、20%以下、15%以下、10%以下または5%以下が低下する。一部の態様において、ポリペプチドは、1以上のアミノ酸置換を含む。一部の態様において、ポリペプチドは、2～10の保存的置換、4～8の保存的置換、5～7の保存的置換(例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10の保存的置換)を含む。
特定の態様において、上記ポリペプチドは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する。一部の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1の配列のうち保存的置換を1つ含む、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有し得る。一部の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1の配列のうち保存的置換を3つ含む、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有し得る。
Figure 2022511307000006
一部の態様において、本開示の組成物のポリペプチドは、少なくとも約65%、少なくとも約66%、少なくとも約67%、少なくとも約68%、少なくとも約69%、少なくとも約70%、少なくとも約71%、少なくとも約72%、少なくとも約73%、少なくとも約74%、少なくとも約75%、少なくとも約76%、少なくとも約77%、少なくとも約78%、少なくとも約79%、少なくとも約80%、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%が、αコネキシン(ACT)の規定C末端のアミノ酸配列と同一の配列を有してもよい。例えば、ポリペプチド(SEQ ID NO:4)の約66%がヒトCx43のカルボキシ末端に存在する9個のアミノ酸(SEQ ID NO:1)と同じ範囲で同一の配列を有する。
一部の態様において、本開示の組成物のポリペプチドは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:90またはSEQ ID NO:91と、少なくとも約65%、少なくとも約66%、少なくとも約67%、少なくとも約68%、少なくとも約69%、少なくとも約70%、少なくとも約71%、少なくとも約72%、少なくとも約73%、少なくとも約74%、少なくとも約75%、少なくとも約76%、少なくとも約77%、少なくとも約78%、少なくとも約79%、少なくとも約80%、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一の配列を有してもよい。
一部の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:90またはSEQ ID NO:91またはその保持バリアントまたはフラグメントのアミノ酸配列を含み得る。一部の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:90またはSEQ ID NO:91またはその保持バリアントまたはフラグメントのアミノ酸配列からなってもよい。
一部の態様において、本開示の組成物のポリペプチドは、セリン(S)および/またはトレオニン(T)リッチな配列またはモチーフを有する。一部の態様において、ポリペプチド中のセリンおよび/またはトレオニンはリン酸化されている。理論に囚われることなく、リン酸化セリンおよび/またはトレオニンリッチな配列は、ポリペプチドの機能活性を向上または低下させることで、ACTペプチドの機能を改変し得ると考えられる。
一部の態様において、N-グリコシル化(Asn-X-Thr/Ser)またはO-グリコシル化(SerまたはThr)部位が、ポリペプチドに挿入されてもよい。一部の態様において、ポリペプチド中のシステインまたはその他の不安定な残基は、除去されてもよい。一部の態様において、潜在的タンパク質分解部位(例えばArg)は、除去または置換されてもよい(例えば、塩基性残基は、除去されてもよいか、グルタミニル残基もしくはヒスチジル残基で置換されてもよい)。一部の態様において、ポリペプチドのグルタミニル残基およびアスパラギニル残基は翻訳後に対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。その他の翻訳後修飾には、以下に限らないが、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化;リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のo-アミノ基のメチル化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]);N末端アミンのアセチル化;およびC末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
一部の態様において、アミノ酸およびペプチド類似体は、本開示の組成物のポリペプチドに組み込まれてもよい。一部の態様において、ポリペプチドは、D-アミノ酸または表3に記載のアミノ酸と異なる官能性置換基を有するアミノ酸を含んでもよい。アミノ酸類似体は、標準的な技法を用いてアミノ酸類似体をポリペプチド鎖に組み込んでもよい(例えば、選択したアミノ酸をtRNA分子へ付加し、類似アミノ酸をアンバーコドンなどを利用して遺伝子組み換えを行い、部位特異的にポリペプチド鎖に挿入する(Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994);これらはすべて、少なくともアミノ酸類似体に関連する物質に関しては参照により本開示に組み込まれる))。さらに、ポリペプチドは、ペプチド類似体の天然に存在するペプチドまたは立体異性体と逆の立体異性体を含んでもよい。
一部の態様において、ポリペプチドには天然のペプチド結合ではない結合が含まれてもよい。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体の結合には、CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(シスおよびトランス)、COCH2-、-CH(OH)CH2、および-CHH2SO-が挙げられる。上記およびその他の結合は、Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468; Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979)(-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986)(-CH H2-S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982)(-CH-CH-,シスおよびトランス); Almquist et al. J Med. Chem. 23:1392-1398 (1980)(-COCH2-); Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982)(-COCH2-); Szelke et al. European Appin, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982)(-CH(OH)CH2-); Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983)(-C(OH)CH2-);およびHruby Life Sci 31:189-199 (1982)(-CH2-S-)に記載されており、各文献は参照により本開示に組み込まれる。一部の態様において、ペプチド類似体は、結合原子間で2つ以上の原子を有することができる(例えばβ-アラニン、γ-アミノ酪酸など)。
理論に囚われることなく、たいていのアミノ酸類似体およびペプチド類似体は、改良された性質または望ましい性質(例えば、より経済的な生産、より優れた化学的安定性、薬理学的性質(半減期、吸収、効果、効率など)の向上、特異性の変化(例えば生物活性の多様化)、抗原性の低下、生物学的障壁(例えば、腸、血管、血液脳関門)の優れた透過能など)を有すると考えられる。D-アミノ酸は、ペプチダーゼなどに認識されないため、D-アミノ酸はより安定なペプチドを生成するために用いられてもよい。コンセンサス配列の1以上のアミノ酸を同じ種類のD-アミノ酸で系統的に置換すること(例えば、L-リシンの代わりにD-リシン)は、より安定なペプチドを生成するために用いられてもよい。システイン残基は、2つ以上のペプチドを共に環化または結合させるために用いられ得る。理論に囚われることなく、これは、ペプチドを特定の立体構造に拘束するのに有益であり得ると考えられる。(Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)が、参照により本開示に組み込まれる。)
一部の態様において、本開示の組成物のポリペプチドは、細胞内輸送体または細胞内輸送配列を有してもよい。細胞内輸送配列は、当業者に既知または新たに発見された任意の内部輸送配列、またはその保持バリアントであり得る。理論に囚われることなく、ポリペプチドの細胞質局在化効率は、ポリペプチドと化学的にシスまたはトランス結合した細胞内輸送体によって高められると考えられる。一部の態様において、ポリペプチドは、Tat-HAペプチドまたは光照射との組み合わせで細胞に導入されてもよい。理論に囚われることなく、細胞内輸送体の効率は、光照射、またはTat-HAペプチドと細胞の同時導入によってさらに高められると考えられる。
細胞内輸送体および細胞内輸送配列の例として、以下に限らないが、アンテナペディア配列、TAT、HIV-Tat、ペネトラチン、Antp-3A(Antp変異体)、ブフォリンII、トランスポータン、MAP(モデル両親媒性ペプチド)、K-FGF、Ku70、プリオン、pVEC、Pep-1、SynB1、Pep-7、HN-1、BGSC(ビス-グアニジウム-スペルミジン-コレステロール、およびBGTC(ビス-グアニジウム-トレン-コレステロール)が挙げられる(表5を参照)。
Figure 2022511307000007
Figure 2022511307000008
本開示の組成物のポリペプチドは、さらに、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14(Bucci, M. et al. 2000. Nat. Med. 6, 1362-1367)、SEQ ID NO:15(Derossi, D., et al. 1994. Biol. Chem. 269, 10444-10450)、SEQ ID NO:16(Fischer, P. M. et al. 2000. J. Pept. Res. 55, 163-172)、SEQ ID NO:17(Frankel, A. D. & Pabo, C. O. 1988. Cell 55, 1189-1193; Green, M. & Loewenstein, P. M. 1988. Cell 55, 1179-1188)、SEQ ID NO:18(Park, C. B., et al. 2000. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-8250)、SEQ ID NO:19(Pooga, M., et al. 1998. FASEB J. 12, 67-77)、SEQ ID NO:20(Oehlke, J. et al. 1998. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-139)、SEQ ID NO:21(Lin, Y Z., et al. 1995. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258)、SEQ ID NO:22(Sawada, M., et al. 2003. Nature Cell Biol. 5, 352-357)、SEQ ID NO:23(Lundberg, P. et al. 2002. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90)、SEQ ID NO:24(Elmquist, A., et al. 2001. Exp. Cell Res. 269, 237-244)、SEQ ID NO:25(Morris, M. C., et al. 2001. Nature Biotechnol. 19, 1173-1176)、SEQ ID NO:26(Rousselle, C. et al. 2000. Mol. Pharmacol. 57, 679-686)、SEQ ID NO:27(Gao, C. et al. 2002. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-4065)、またはSEQ ID NO:28(Hong, F. D. & Clayman, G. L. 2000. Cancer Res. 60, 6551-6556)で表されるアミノ酸配列を含んでもよい。本開示の組成物のポリペプチドは、さらにBGSC(ビス-グアニジウム-スペルミジン-コレステロール)またはBGTC(ビス-グアニジウム-トレン-コレステロール)(Vigneron, J. P. et al. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 9682-9686)を含んでもよい。前述の文献は、細胞内輸送ベクターおよび配列の内容に関して、その全てを参照により本開示に組み込まれる。現在既知であるか、または後に同定される任意の他の内部輸送配列は、任意の本開示の組成物のポリペプチドと組み合わせられてもよい。
本開示の組成物のポリペプチドは、任意の細胞内輸送配列と組み合わせて任意のACT配列を含んでもよい。以下に限らないが、その組み合わせの例が表6に列記されている。本開示の組成物のポリペプチドは、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するアンテナペディア配列;SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、またはSEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含んでもよい。特定の実施態様において、ポリペプチドは、アンテナペディア配列に結合するコネキシン43の9番目のカルボキシ最末端アミノ酸、およびSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する。
Figure 2022511307000009
用語「αCT1」は、本明細書において「aCT1」または「ACT1」と同義で用いられ、SEQ ID NO:2に記載の25個のアミノ酸ポリペプチドをいう。
本開示のポリペプチドに関する更なる詳細は、米国特許第7,786,074号に記載されており、その全てが参照により本開示に組み込まれる。
ナノ粒子組成物
一部の実施態様において、本開示は、1以上のナノ粒子を含む組成物を提供し、該ナノ粒子は、1以上の生分解性または生体適合性ポリマーおよび治療上有効量の本明細書に記載のαコネキシンポリペプチドを含む。一部の実施態様において、本開示は、1以上のナノ粒子を含む組成物を提供し、該ナノ粒子は、1以上の生分解性または生体適合性ポリマーおよび治療上有効量のSEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。一部の実施態様において、ペプチドは、さらに細胞内輸送配列を有する。該細胞内輸送配列は、アンテナペディア、TAT、HIV-Tat、ペネトラチン、Antp-3A(Antp変異体)、ブフォリンII、トランスポータン、MAP(モデル両親媒性ペプチド)、K-FGF、Ku70、プリオン、pVEC、Pep-1、SynB 1、Pep-7、HN-1、BGSC(ビス-グアニジウム-スペルミジン-コレステロール)およびBGTC(ビス-グアニジウム-トレン-コレステロール)からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施態様において、ペプチドは、SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有する。
本開示のナノ粒子は、1以上の生分解性または生体適合性ポリマーを含んでもよい。本明細書で用いる用語「生分解性または生体適合性ポリマー」は、生分解性または生体適合性、または生分解性および生体適合性の両方を有するポリマーをいう。一般に生体適合性は、免疫系の少なくとも一部による物質の急性拒絶反応をいう。すなわち、対象に移植された非生体適合性物質は、対象において免疫応答を引き起こす。この免疫応答は、免疫系による物質の拒絶反応を十分に制御できず、多くの場合、物質を対象から除去しなければならない程深刻になり得る。生体適合性を決定するための1つに、インビトロでポリマーを細胞に接触させる簡易試験がある。生体適合性ポリマーは、一般に、適度な濃度(例えば、50μg/106細胞の濃度)で有意な細胞死を起こさないポリマーである。例えば、生体適合性ポリマーを、細胞(例えば、線維芽細胞または上皮性細胞)に暴露させた場合、それらの細胞に貪食されたり、またはその他の方法で取り込まれたとしても、細胞死は約20%未満であり得る。本明細書で用いる、「生分解性」ポリマーは、細胞に導入されたときに、(生分解性の)細胞機構および/または化学的処理(例えば加水分解(化学分解性))により、細胞が、細胞に対する重大な有毒作用無く再利用、または処理出来る構成要素に分解されるものである。ある実施態様において、生分解性ポリマーおよび生成物によるその分解副生成物は、生体適合性であり得る。例えば、目的のポリマーは、(例えば対象の体内の)水に接触し自発的に加水分解するものであってもよく、そのポリマーは、(例えば温度約37℃の)熱に曝されて分解してもよい。ポリマーの分解は、用いられるポリマーまたはコポリマーによって、異なる割合で起こり得る。例えばポリマーの半減期(ポリマーの50%がモノマーおよび/または非ポリマー成分に分解され得る時間)は、ポリマーによって、日、週、月、または年単位であってもよい。ポリマーは、例えば、一部の例において、(比較的低いpHを有する)リゾチームへの接触を介してなど、酵素活性または細胞機構による生分解されてもよい。一部の例において、上記ポリマーは、細胞が、細胞に対する重大な有毒作用無く再利用、または処理出来るモノマーおよび/または非ポリマー成分に分解されてもよい(例えば、ポリラクチドは、加水分解されて乳酸を形成してもよく、ポリグリコリドは、加水分解されてグリコール酸を形成してもよい)。
適切な生分解性または生体適合性ポリマーは、当業者に容易に明らかであろう。例えば、本開示の1以上の生分解性または生体適合性ポリマーとして、以下に限らないが、ポリ(カプロラクトン)(PCL)、エチレン酢酸ビニルポリマー(EVA)、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(L-乳酸)(PLLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸・グリコール酸共重合体)(PLGA)、ポリ(L-乳酸・グリコール酸共重合体)(PLLGA)、ポリ(D,L-ラクチド)(PDLA)、ポリ(L-ラクチド)(PLLA)、ポリ(D,L-ラクチド・カプロラクトン共重合体)、ポリ(D,L-ラクチド・カプロラクトン・グリコリド共重合体)、ポリ(D,L-ラクチド・PEO・D,L-ラクチド共重合体)、ポリ(D,L-ラクチド・PPO・D,L-ラクチド共重合体)、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ-L-リシン(PLL)、ヒドロキシプロピルメタクリレート(HPMA)、ポリエチレングリコール、ポリ-L-グルタミン酸、ポリ(ヒドロキシ酸)、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ(エステルアミド)、ポリアミド、ポリ(エステルエーテル)、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアルキレンオキシド(PEO)、ポリエチレンテレフタラート、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルエーテル、ポリ(酢酸ビニル)、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリシロキサン、ポリスチレン、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(イソブチルメタクリレート)、ポリ(ヘキシルメタクリレート)、ポリ(イソデシルメタクリレート)、ポリ(ラウリルメタクリレート)、ポリ(フェニルメタクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)、ポリ(オクタデシルアクリレート)、ポリジオキサノン、ポリジオキサノンコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリ(オルト)エステル、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)、ポリ(ラクチド・カプロラクトン共重合体)、トリメチレンカーボネート、ポリ(N-アクリロイルモルホリン)(PAcM)、ポリ(2-メチル-2-オキサゾリン)(PMOX)、ポリ(2-エチル-2-オキサゾリン)(PEOZ)、およびポリグリセロールが挙げられる。一部の実施態様において、1以上の生分解性または生体適合性ポリマーは、PLGAである。一部の実施態様において、1以上の生分解性または生体適合性ポリマーは、PLGAおよびPVAである。
一部の実施態様において、PLGAは、約4,000～約240,000DaのMWを有する。一部の実施態様において、PLGAは、約7,000～約17,000DaのMWを有する。例えば、PLGAは、約7,000Da、約8,000Da、約9,000Da、約10,000Da、約11,000Da、約12,000Da、約13,000Da、約14,000Da、約15,000Da、約16,000Da、または約17,000Da、その間の全ての整数および範囲を含むMWを有してもよい。一部の実施態様において、PLGAは、50:50 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、5:95 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、10:90 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、15:85 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、20:80 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、25:75 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、30:70 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、35:65 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、40:60 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、45:55 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、50:50 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、55:45 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、60:40 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、65:35 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、70:30 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、75:25 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、80:20 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、85:15 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、90:10 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。一部の実施態様において、PLGAは、95:5 乳酸:グリコール酸(酸末端)である。
一部の実施態様において、PVAは、約8,000～約186,000DaのMW、例えば約13,000～約23,000Daを有する。例えば、PVAは、約13,000Da、約14,000Da、約15,000Da、約16,000Da、約17,000Da、約18,000Da、約19,000Da、約20,000Da、約21,000Da、約22,000Da、または約23,000Da、その間の全ての整数および範囲を含むMWを有してもよい。
一部の実施態様において、PVAの量は、約0.05%(w/v)～約5%(w/v)の間である。例えば、PVAの量は、組成物中、約0.1%(w/v)、約0.2%(w/v)、約0.3%(w/v)、約0.4%(w/v)、約0.5%(w/v)、約0.6%(w/v)、約0.7%(w/v)、約0.8%(w/v)、約0.9%(w/v)、約1.0%(w/v)、約1.1%(w/v)、約1.2%(w/v)、約1.3%(w/v)、約1.4%(w/v)、約1.5%(w/v)、約1.6%(w/v)、約1.7%(w/v)、約1.8%(w/v)、約1.9%(w/v)、約2.0%(w/v)、約2.1%(w/v)、約2.2%(w/v)、約2.3%(w/v)、約2.4%(w/v)、約2.5%(w/v)、約2.6%(w/v)、約2.7%(w/v)、約2.8%(w/v)、約2.9%(w/v)、約3.0%(w/v)、約3.1%(w/v)、約3.2%(w/v)、約3.3%(w/v)、約3.4%(w/v)、約3.5%(w/v)、約3.6%(w/v)、約3.7%(w/v)、約3.8%(w/v)、約3.9%(w/v)、約4.0%(w/v)、約4.1%(w/v)、約4.2%(w/v)、約4.3%(w/v)、約4.4%(w/v)、約4.5%(w/v)、約4.6%(w/v)、約4.7%(w/v)、約4.8%(w/v)、約4.9%(w/v)、または約5.0%(w/v)、その間の全ての整数および範囲を含む量である。一部の実施態様において、PVAの量は、約0.1%(w/v)～約5%(w/v)の間の範囲であってもよい。例えば、PVAの量は、約0.1%(w/v)～約5%(w/v)の間、約0.1%(w/v)～約4%(w/v)の間、約0.1%(w/v)～約3%(w/v)の間、約0.1%(w/v)～約2%(w/v)の間、約0.1%(w/v)～約1%(w/v)の間、約0.2%(w/v)～約5%(w/v)の間、約0.2%(w/v)～約4%(w/v)の間、約0.2%(w/v)～約3%(w/v)の間、約0.2%(w/v)～約2%(w/v)の間、約0.2%(w/v)～約1%(w/v)の間、約0.3%(w/v)～約5%(w/v)の間、約0.3%(w/v)～約4%(w/v)の間、約0.3%(w/v)～約3%(w/v)の間、約0.3%(w/v)～約2%(w/v)の間、約0.3%(w/v)～約1%(w/v)の間、約0.4%(w/v)～約5%(w/v)の間、約0.4%(w/v)～約4%(w/v)の間、約0.4%(w/v)～約3%(w/v)の間、約0.4%(w/v)～約2%(w/v)の間、約0.4%(w/v)～約1%(w/v)の間、約0.5%(w/v)～約5%(w/v)の間、約0.5%(w/v)～約4%(w/v)の間、約0.5%(w/v)～約3%(w/v)の間、約0.5%(w/v)～約3%(w/v)の間、約0.5(w/v)～約2%(w/v)の間、約0.5%(w/v)～約1%(w/v)の間、約1%(w/v)～約5%(w/v)の間、約1%(w/v)～約4%(w/v)の間、約1%(w/v)～約3%(w/v)の間、約1%(w/v)～約2%(w/v)の間、約2%(w/v)～約5%(w/v)の間、約2%(w/v)～約4%(w/v)の間、約2%(w/v)～約3%(w/v)の間、約3%(w/v)～約5%(w/v)の間、または約4%(w/v)～約5%(w/v)の間の範囲であってもよい。一部の実施態様において、PVAの量は、約0.3%(w/v)～約2.5%(w/v)の間である。
一部の実施態様において、PLGAの量は、約2%(w/v)～約10%(w/v)の間である。例えば、PLGAの量は、組成物中、約2.0%(w/v)、2.1%(w/v)、約2.2%(w/v)、約2.3%(w/v)、約2.4%(w/v)、約2.5%(w/v)、約2.6%(w/v)、約2.7%(w/v)、約2.8%(w/v)、約2.9%(w/v)、約3.0%(w/v)、約3.1%(w/v)、約3.2%(w/v)、約3.3%(w/v)、約3.4%(w/v)、約3.5%(w/v)、約3.6%(w/v)、約3.7%(w/v)、約3.8%(w/v)、約3.9%(w/v)、約4.0%(w/v)、約4.1%(w/v)、約4.2%(w/v)、約4.3%(w/v)、約4.4%(w/v)、約4.5%(w/v)、約4.6%(w/v)、約4.7%(w/v)、約4.8%(w/v)、約4.9%(w/v)、約5.0%(w/v)、約5.1%(w/v)、約5.2%(w/v)、約5.3%(w/v)、約5.4%(w/v)、約5.5%(w/v)、約5.6%(w/v)、約5.7%(w/v)、約5.8%(w/v)、約5.9%(w/v)、約6.0%(w/v)、約6.1%(w/v)、約6.2%(w/v)、約6.3%(w/v)、約6.4%(w/v)、約6.5%(w/v)、約6.6%(w/v)、約6.7%(w/v)、約6.8%(w/v)、約6.9%(w/v)、約7.0%(w/v)、約7.1%(w/v)、約7.2%(w/v)、約7.3%(w/v)、約7.4%(w/v)、約7.5%(w/v)、約7.6%(w/v)、約7.7%(w/v)、約7.8%(w/v)、約7.9%(w/v)、約8.0%(w/v)、約8.1%(w/v)、約8.2%(w/v)、約8.3%(w/v)、約8.4%(w/v)、約8.5%(w/v)、約8.6%(w/v)、約8.7%(w/v)、約8.8%(w/v)、約8.9%(w/v)、約9.0%(w/v)、約9.1%(w/v)、約9.2%(w/v)、約9.3%(w/v)、約9.4%(w/v)、約9.5%(w/v)、約9.6%(w/v)、約9.7%(w/v)、約9.8%(w/v)、約9.9%(w/v)、または約10.0%(w/v)、その間の全ての整数および範囲を含む量である。一部の実施態様において、PLGAの量は、約2%(w/v)～約9%(w/v)の間、約2%(w/v)～約7%(w/v)の間、約2%(w/v)～約5%(w/v)の間、約2%(w/v)～約2%(w/v)の間、約3%(w/v)～約10%(w/v)の間、約3%(w/v)～約9%(w/v)の間、約3%(w/v)～約7%(w/v)の間、約3%(w/v)～約5%(w/v)の間、約4%(w/v)～約10%(w/v)の間、約4%(w/v)～約8%(w/v)の間、約4%(w/v)～約6%(w/v)の間、約5%(w/v)～約10%(w/v)の間、約5%(w/v)～約8%(w/v)の間、約5%(w/v)～約7%(w/v)の間、約6%(w/v)～約10%(w/v)の間、約6%(w/v)～約9%(w/v)の間、約6%(w/v)～約8%(w/v)の間、約7%(w/v)～約10%(w/v)の間、約7%(w/v)～約9%(w/v)の間、または約8%(w/v)～約10%(w/v)の間の範囲であってもよい。
一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径は、約10nm～約1000nmの間である。例えば、ナノ粒子の平均の直径は、約10nm、約20nm、約30nm、約40nm、約50nm、約60nm、約70nm、約80nm、約90nm、約100nm、約110nm、約120nm、約130nm、約140nm、約150nm、約160nm、約170nm、約180nm、約190nm、約200nm、約210nm、約220nm、約230nm、約240nm、約250nm、約260nm、約270nm、約280nm、約290nm、約300nm、約310nm、約320nm、約330nm、約340nm、約350nm、約360nm、約370nm、約380nm、約390nm、約400nm、410nm、約420nm、約430nm、約440nm、約450nm、約460nm、約470nm、約480nm、約490nm、約500nm、約510nm、約520nm、約530nm、約540nm、約550nm、約560nm、約570nm、約580nm、約590nm、約600nm、約610nm、約620nm、約630nm、約640nm、約650nm、約660nm、約670nm、約680nm、約690nm、約700nm、約710nm、約720nm、約730nm、約740nm、約750nm、約760nm、約770nm、約780nm、約790nm、約800nm、810nm、約820nm、約830nm、約840nm、約850nm、約860nm、約870nm、約880nm、約890nm、約900nm、約910nm、約920nm、約930nm、約940nm、約950nm、約960nm、約970nm、約980nm、約990nm、または約1000nm、その間の全ての整数および範囲を含む直径であってもよい。一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径は、約10nm～約1000nmの間である。例えば、ナノ粒子の平均の直径は、約10nm～約1000nm、約10nm～約800nm、約10nm～約600nm、約10nm～約400nm、約10nm～約200nm、約10nm～約50nm、約30nm～約1000nm、約30nm～約800nm、約30nm～約600nm、約30nm～約500nm、約30nm～約400nm、約30nm～約200nm、約30nm～約50nm、約50nm～約1000nm、約50nm～約800nm、約50nm～約600nm、約50nm～約400nm、約50nm～約200nm、約50nm～約100nm、約100nm～約1000nm、約100nm～約800nm、約100nm～約600nm、約100nm～約400nm、約100nm～約300nm、約100nm～約200nm、または約150nm～約200nmの間である。一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径は、約30nm～約500nmの間である。一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径は、約100nm～約300nmの間である。一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径約100nm～約200nmの間である。一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径は、約180nmである。
本開示のナノ粒子は、均一な粒子径を有し、凝集がほとんどないか、または皆無である。均一な粒子径を有し、凝集がほとんどないか、または皆無であることは、コストのかかる処理のステップ(例えば湿潤および/または乾燥製粉ステップ)が不要になるため、望ましい。例えば、一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径は、約100nm～約300nmの間である。一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径は、約100nm～約200nmの間である。一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径は、約180nmである。前述のいずれかの実施態様において、ナノ粒子の凝集はほとんどないか、または皆無であり得る。
一部の実施態様において、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有するペプチドの平均量は、ナノ粒子組成物1mgに対して少なくとも約500ngである。例えば、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有するペプチドの平均量は、ナノ粒子組成物1mgに対して少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、または2000ng、その間の全ての整数および範囲を含む量である。
一部の実施態様において、ナノ粒子は、約0mV～約-30mVの間のゼータ電位が特徴の表面電荷を有する。例えば、ナノ粒子は、約0mV、約-1mV、約-2mV、約-3mV、約-4mV、約-5mV、約-6mV、約-7mV、約-8mV、約-9mV、約-10mV、約-11mV、約-12mV、約-13mV、約-14mV、約-15mV、約-16mV、約-17mV、約-18mV、約-19mV、約-20mV、約-21mV、約-22mV、約-23mV、約-24mV、約-25mV、約-26mV、約-27mV、約-28mV、約-29mV、または約-30mVのゼータ電位が特徴の表面電荷を有してもよい。一部の実施態様において、ナノ粒子は、約-0mV～約-25mV、約0mV～約-20mV、約0mV～約-15mV、約-0mV～約-10mV、約0mV～約-5mV、約-5mV～約-30mV、約-5mV～約-25mV、約-5mV～約-20mV、約-5mV～約-15mV、約-5mV～約-10mV、約-5mV～約-8mV、約-10mV～約-30mV、約-10mV～約-25mV、約-10mV～約-20mV、約-10mV～約-15mV、約-10mV～約-12mV、約-15mV～約-30mV、約-15mV～約-25mV、約-15mV～約-20mV、約-15mV～約-18mV、約-20mV～約-30mV、約-20mV～約-25mV、約-20mV～約-23mV、約-25mV～約-30mV、または約-25mV～約-28mVの範囲のゼータ電位が特徴の表面電荷を有してもよい。一部の実施態様において、ナノ粒子は、約0.120～約0.350の多分散度(PDI)を有する。例えば、ナノ粒子は、約0.120、約0.130、約0.140、約0.150、約0.160、約0.170、約0.180、約0.190、約0.200、約0.210、約0.220、約0.230、約0.240、約0.250、約0.260、約0.270、約0.280、約0.290、約0.300、約0.310、約0.320、約0.330、約0.340、～約0.350、その間の全ての整数および範囲を含むPDIを有する。
一部の実施態様において、ナノ粒子は、(例えば、外側の層に、カプセル化効率を向上させ、高密度で均一な球面を作るために)別の添加剤を含んでもよい。例えば、一部の実施態様において、ナノ粒子は、さらにZn2+(例えばZnO)および/またはCa2+(例えばCaO)、および/またはFe3+(例えばFeCl3、Fe2(SO4)3、Fe(NO3)3)を含む。
一部の実施態様において、ナノ粒子は、約10ngペプチド/μg(粒子)以上のペプチドをロードする。一部の実施態様において、ナノ粒子は、約20ngペプチド/μg(粒子)、約30ngペプチド/μg(粒子)、約40ngペプチド/μg(粒子)、約50ngペプチド/μg(粒子)、約60ngペプチド/μg(粒子)、約70ngペプチド/μg(粒子)、約80ngペプチド/μg(粒子)、約90ngペプチド/μg(粒子)、約100ngペプチド/μg(粒子)、約125ngペプチド/μg(粒子)、約150ngペプチド/μg(粒子)、約175ngペプチド/μg(粒子)、約200ngペプチド/μg(粒子)、約250ngペプチド/μg(粒子)、約300ngペプチド/μg(粒子)、約400ngペプチド/μg(粒子)、または約500ngペプチド/μg(粒子)以上のペプチドをロードする。従って、一部の実施態様において、ナノ粒子は、約1%～約50%、または約1%～約25%、または約1%～約10%のロード容量、または約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、または約50%のロード容量を有する。
一部の実施態様において、ペプチドが、約1週間、約2週間、約3週間、約4週間、またはそれ以上かけて放出されるように、ナノ粒子は、制御されたペプチド放出プロファイルを示す。一部の実施態様において、ペプチド放出プロファイルとは、封入されたペプチドの約50%、約40%、約30%、約20%、約15%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%、または約1%が投与後24時間以内に放出されるようなものである。一部の実施態様において、封入されたペプチドの約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、約15%未満、約10%未満が最初の24時間以内に放出される。さらなる実施態様において、封入されたペプチドの残りまたは実質的に封入されたペプチドの残りの全てが、翌2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、1週間、2週間、3週間、または4週間かけて放出される。一部の実施態様において、ペプチド放出プロファイルは、実質的に次のパターンに対応する:24時間で、封入されたペプチド全体の約5%～約60%が放出され、約7日間、14日間、21日間、28日間、またはそれ以上で、封入されたペプチド全体の約50%～約100%が放出される。それ故、例えば、24時間経過時点で、封入されたペプチド全体の約60%未満が放出され、21日経過時点で、封入されたペプチド全体の約100%までが放出される。従って、一部の実施態様において、24時間経過時点で、封入されたペプチド全体の約60%、約55%、約50%、約45%、約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、または約5%未満が放出される。一部の実施態様において、14日経過時点で、封入されたペプチド全体の約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または約100%までが放出される。一部の実施態様において、21日経過時点で、封入されたペプチド全体の約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または約100%までが放出される。一部の実施態様において、28日経過時点で、封入されたペプチド全体の約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または約100%までが放出される。一部の実施態様において、初めの24時間以内に、約50%未満、または約10%、約10%未満のペプチドの最初の「バースト」放出があり、翌1、2、または3週間かけて、約50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上のペプチドが放出される。放出特性が、特定の値に合わせて調整可能であることは当業者に理解される。例えば、ある目標値は、封入されたペプチド全体を14日目までに完全に放出する(例えば約80%～100%)ナノ粒子で最適に処理されたものであってもよく、第二の目標値は、封入されたペプチド全体を28日目までに完全に放出する(例えば約80%～100%)ナノ粒子で最適に処理されたものであってもよい。それ故、一部の実施態様において、ナノ粒子は、(例えば約80%～100%)封入されたペプチド全体を7日目、8日目、9日目、10日目、11日目、12日目、13日目、14日目、15日目、16日目、17日目、18日目、19日目、20日目、21日目、22日目、23日目、24日目、25日目、26日目、27日目、28日目、29日目、30日目、または31日目までに完全に放出する。
一部の実施態様において、ナノ粒子は、種類が異なるか、または同種の安定化剤、界面活性剤、および/または乳化剤をさらに含んでもよい。適切な薬剤には、以下に限らないが、ポリソルベート、アルキルスルホコハク酸、アルキルフェノール、アルキルフェノールエトキシレート、アルキルベンゼンスルホン酸、脂肪酸、エトキシ化脂肪酸、プロポキシル化脂肪酸、脂肪酸塩、トール油、ヒマシ油、トリグリセリド、エトキシ化トリグリセリド、アルキルグルコシド、および例えば全体が参照として本明細書に組み込まれる、米国特許第6,849,581号に記載の混合物および誘導体化脂肪酸が挙げられる。適切なポリソルベートには、必ずしもこれに限らないが、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモノデカノエート、ソルビタンモノオクタデカノエート、ソルビタントリオレエートなど、およびそのエトキシ化誘導体が挙げられる。例えば、これらの薬剤は、そこに20個までのエトキシ基を有し得る。適切なポリソルベートには、必ずしもこれに限らないが、Croda International PLCから入手可能な、SPAN(登録商標) 40、SPAN 40、SPAN 60およびSPAN 80ポリソルベートが挙げられる。その他の適切な薬剤には、ステアリールアルコール、レシチン、脂肪酸アミン、エトキシ化脂肪酸アミンおよびその混合物が挙げられる。ある実施態様において、これに限らないが、1以上の薬剤が用いられている。
一部の実施態様において、凍結および/または保存に適切な組成物には、本開示のナノ粒子、および凍結に適切な溶液を含むこと(例えばスクロースおよび/またはシクロデキストリン溶液を上記ナノ粒子組成物に加える)などが検討されている。例えば、抗凍結剤は、凍結の際に粒子の凝集を避けるために働き得る。様々な適切な抗凍結剤は当業者に容易に明らかであり、以下に限らないがスクロース、トレハロース、デキストロース、またはソルビトールが挙げられる。
医薬製剤
一部の実施態様において、本開示は、本開示のナノ粒子組成物を含む医薬製剤を提供する。
本明細書に開示のナノ粒子組成物を含む医薬製剤は、ナノ粒子またはSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を、有効量提供する任意の経路で投与するために製剤化され得る。従って、該医薬組成物は、任意の適当な投与方法(例えば、局所、経口、経腸、経鼻(すなわち鼻腔内)、吸入、髄腔内、直腸、腟内、眼内、結膜下、口腔内、舌下、肺内、皮内、節内、腫瘍内、経皮、または非経口投与(皮下、経皮、静脈内、筋肉内、胸骨内、陰茎海綿体内、外尿道口内、腫瘍内、頭蓋内、脊髄内または尿道内注射または点滴など)を含む方法)用に製剤化され得る。本明細書で用いる用語「非経口」には、イオン導入投与(例えば、米国特許第7,033,598号、7,018,345号、6,970,739号)、超音波導入投与(例えば、米国特許第4,780,212号、4,767,402号、4,948,587号、5,618,275号、5,656,016号、5,722,397号、6,322,532号、6,018,678号)、熱投与(例えば、米国特許第5,885,211号、6,685,699号)、受動経皮投与(例えば、米国特許第3,598,122号、3,598,123号、4,286,592号、4,314,557号、4,379,454号、4,568,343号、5,464,387号、英国特許第2232892号明細書、米国特許第6,871,477号、6,974,588号、6,676,961号)、マイクロニードル投与(例えば、米国特許第6,908,453号、5,457,041号、5,591,139号、6,033,928号)および皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、海綿体内、髄腔内、節内、外尿道内、尿道内、腫瘍内注射または点滴技法もまた挙げられる。投与方法は、本明細書で詳細に記載されている。
一部の実施態様において、本開示は、本開示のナノ粒子組成物および1以上の医薬的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬製剤を提供する。
当業者に既知の、医薬組成物に使用するための任意の生理学的または医薬的に適切な賦形剤または担体(すなわち、活性成分の活性を妨害しない無害な物質)が、本明細書に記載の組成物に用いられてもよい。賦形剤の例として、タンパク質の安定性および完全性を維持する希釈剤および担体を含む。治療薬用途の賦形剤は公知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 21st Ed. Mack Pub. Co., Easton, Pa. (2005))に記載され、その中で詳細に記載されている。
治療薬用途の「医薬的に許容される担体」は医薬分野において公知であり、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。例えば、生理学的pHの無菌生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水が使用されてもよい。防腐剤、安定化剤、着色剤および風味剤でさえ、医薬組成物中に配合されてもよい。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびp-ヒドロキシ安息香酸エステルは、防腐剤として添加されてもよい(Id. 1449)。さらに、抗酸化剤および懸濁化剤が用いられてもよい。Id.
一部の実施態様において、1以上の医薬的に許容される担体または賦形剤は、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、着色剤(色素)、軟化剤、乳化剤、充填剤(希釈剤)、フィルム形成剤またはコーティング剤、香味剤、滑剤(流動促進剤)、滑沢剤、防腐剤、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和水からなる群から選択される。一部の実施態様において、1以上の医薬的に許容される担体または賦形剤は、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチノール、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン(トウモロコシ)、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンA、ビタミンE(α-トコフェロール)、ビタミンC、およびキシリトールからなる群から選択される。
一部の実施態様において、製剤は、注射用液体製剤であってもよい。液体医薬製剤は、例えば、1以上の次のものを含んでもよい:無菌希釈剤(例えば注射用の水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、塩化ナトリウム等張液、溶媒または懸濁溶媒として機能し得る固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の溶媒);抗菌剤;抗酸化剤;キレート剤;緩衝液および浸透圧を調節するための薬剤(例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース)。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器またはガラス製またはプラスチック製の複数回使用バイアル中に封入され得る。特定の実施態様において、生理食塩水が使用され、注射用医薬組成物は適宜無菌状態である。一部の実施態様において、希釈剤(例えば緩衝液)、抗酸化剤(例えばアスコルビン酸)、糖(例えばグルコース、スクロースまたはデキストリン)、キレート剤(例えばEDTA、およびグルタチオン)をさらに含む。
一部の実施態様において、製剤は、経口投与用に製剤化される。一部の実施態様において、賦形剤および/または結合剤が、存在してもよい。本開示の用途に適切な固体担体には、以下に限らないが、不活性物質(例えばラクトース、デンプン、グルコース、メチル-セルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、マンニトールなど)が挙げられる。固体担体はさらに、風味剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、結合剤または錠剤崩壊剤として機能する1以上の物質を含み得る。また、それはカプセル剤であり得る。散剤において、担体は、微粉化した活性化合物との混合物中の微粉化した固体であり得る。錠剤において、活性化合物は、適切な剤形において必要な圧縮特性を有する担体と混合され、所望の形状および大きさに圧縮される。散剤および錠剤は、好ましくは99%まで活性化合物を含む。適切な固体担体には、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換レジンが挙げられる。錠剤は、適宜1以上の補助成分と共に圧縮または成形により製造されてもよい。圧縮錠剤は、流動性のある形態(例えば粉末または顆粒)の活性成分を、結合剤(例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤(例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム)、界面活性剤または分散剤と適宜混合し、適切な機械で圧縮することで製造してもよい。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を、適切な機械で成形することで製造してもよい。上記錠剤は、適宜コーティングまたは切れ目を入れられてもよく、所望の放出プロファイルを供するように、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な割合で用いて、その活性成分を遅延放出または制御放出させるように製剤化され得る。錠剤は適宜、胃ではなく腸の部分で放出させるために、腸溶性コーティングが施されてもよい。
一部の実施態様において、製剤は、エアロゾル、クリーム、発泡体、エマルジョン、ゲル、液体、ローション、パッチ、粉末、固体、スプレー、またはその任意の組み合わせの形態であり得る。
一部の実施態様において、本開示は、本開示のナノ粒子組成物を含む局所用製剤を提供する。一部の実施態様において、該局所用製剤は、さらにヒドロキシエチルセルロースゲルを含む。一部の実施態様において、ヒドロキシエチルセルロースゲルは、本明細書に記載のαコネキシンペプチドを安定化させる。
本開示のナノ粒子組成物を含む医薬製剤は、局所投与用であってもよく、その場合、担体は、溶液、エマルジョン、軟膏またはゲル基剤を適宜含んでもよい。基剤には、例えば、1以上の次のものを含んでもよい:ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、希釈剤(例えば水およびアルコール)、および乳化剤および安定化剤。濃化剤は、局所投与用の医薬組成物中に存在してもよい。経皮投与用の場合、該組成物は、経皮パッチまたはイオン導入機器に含まれてもよい。
一部の実施態様において、提供される医薬的に許容される担体は、ポロキサマーである。商品名プルロニック(登録商標)で呼ばれるポロキサマーは、水中で透明熱可逆性ゲルを形成する非イオン性界面活性剤である。ポロキサマーは、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレンオキシド-ポリエチレンオキシド(PEO-PPO-PEO)のトリブロックコポリマーである。2つのポリエチレンオキシド鎖は親水性であるが、ポリプロピレン鎖は疎水性である。これらの疎水性および親水性の特徴は、水溶液中に置かれた際に発揮される。PEO-PPO-PEO鎖は疎水性中心が集合した短い鎖の形態をとり、ミセルを形成する。続いて、このミセルは、水が親水性末端付近に少量存在するだけで集合体が集まって固体(ゲル)を形成するため、ゲル化しやすい特徴を持つ。冷却すると液体になるが、加熱すると硬化する。この特徴は、冷却した場合、正確な用量測定のためにシリンジで吸引出来るため、医薬調剤において有用である。(皮膚に投与した場合)体温で加熱されると、(特に大豆レシチン/パルミチン酸イソプロピルと組み合わせた場合)理想的な粘度になり、適切な注入および接着が容易になる。プルロニック(登録商標)F127(F127)は入手しやすく、それ故上記のような医薬用途に用いられるため、一般に使用される。F127は、EO:PO:EOの比率が100:65:100であり、重量ではPEO:PPOの比が2:1である。プルロニックゲルは水溶液であり、一般に20～30%のF-127を含む。それ故、提供される組成物はF127中で投与され得る。
一部の実施態様において、該局所用製剤は、さらに緩衝剤を含む。適切な緩衝剤には、アルカリ(ナトリウムおよびカリウム)またはアルカリ土類(カルシウムおよびマグネシウム)の炭酸塩、リン酸塩、炭素水素塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、フタル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩など(例えば、ナトリウムまたはカリウムのリン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、炭酸水素塩および炭酸塩)が挙げられる。以下に限らないが、適切な緩衝剤の例として、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム/水酸化マグネシウム共沈殿、水酸化アルミニウム/重炭酸ナトリウム共沈殿、酢酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、ホウ酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、クエン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、水酸化カルシウム、乳酸カルシウム、フタル酸カルシウム、リン酸カルシウム、コハク酸カルシウム、酒石酸カルシウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、コハク酸二ナトリウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、L-アルギニン、酢酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウム、ホウ酸マグネシウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、フタル酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、コハク酸マグネシウム、酒石酸マグネシウム、酢酸カリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、ホウ酸カリウム、クエン酸カリウム、メタリン酸カリウム、フタル酸カリウム、リン酸カリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸カリウム、コハク酸カリウム、酒石酸カリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、乳酸ナトリウム、フタル酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、セスキ炭酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、合成ハイドロタルサイト、テトラピロリン酸カリウム、テトラピロリン酸ナトリウム、トリリン酸カリウム、トリリン酸ナトリウム、およびトロメタモールが挙げられる(The Merck Index, Merck & Co. Rahway, N.J. (2001)に記載のリストの一部を基にしている)。さらに、タンパク質またはタンパク質加水分解物が胃酸と反応する性能により、それらもまた本実施態様において緩衝剤として働き得る。さらに、上記に記載の緩衝剤の組み合わせまたは混合物は、本明細書に記載の医薬製剤において用いられ得る。一部の実施態様において、該緩衝剤は、リン酸緩衝液である。一部の実施態様において、該緩衝剤は、局所用製剤のpHを、約5～約7の間に維持する。例えば、緩衝剤は、局所用製剤のpHを、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.7、約6.8、約6.9、または約7の間に維持する。
製造方法
一部の実施態様において、本開示は、本開示のナノ粒子組成物の製造方法であって;
(a) 有機溶媒に溶解した1以上の生分解性または生体適合性ポリマーを含む第1溶液を、第1水性溶媒に溶解したSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有する第2溶液と混合し;
(b) ステップ(a)の混合物をエマルジョン化し;
(c) ステップ(b)のエマルジョンを、第2水性溶媒に溶解した1以上の生分解性または生体適合性ポリマーを含む第2溶液に加え;
(d) 有機溶媒を除去し;および
(e) (d)の生成物を適宜精製するステップを特徴とする方法を提供する。
一部の実施態様において、上記方法は、さらに(d)または(e)の生成物を凍結および/または凍結乾燥する、(f)のステップを含む。一部の実施態様において、ステップ(d)は、混合物から有機溶媒を除去するのに十分な時間、(c)の混合物を撹拌することが行われる。一部の実施態様において、ステップ(d)で混合物から有機溶媒を除去するのに十分な時間、(c)の混合物の撹拌が行われる場合、混合物から溶媒が(例えば蒸発により)除去されるのにかかる時間は、約15分、約30分、約45分、約1時間、約1時間15分、約1時間30分、約1時間45分、約2時間、約2時間15分、約2時間30分、約2時間45分、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約9時間、約12時間、約15時間、約18時間、約21時間、または約1日であってもよい。一部の実施態様において、混合物から有機溶媒を除去するのに十分な時間は、約1分～約10時間である。一部の実施態様において、混合物から有機溶媒を除去するのに十分な時間は、約3時間である。混合物から有機溶媒を除去するのに十分な時間は、様々な因子(例えば溶媒除去方法、温度および圧力、ならびに有機溶媒)によって変わり得る。例えば、一部の実施態様において、ステップ(d)で、混合物から有機溶媒を除去するのに十分な時間(c)の混合物の撹拌が行われ、有機溶媒が酢酸エチルである場合、混合物から(例えば蒸発により)酢酸エチルが除去されるのにかかる時間は、約15分、約30分、約45分、約1時間、約1時間15分、約1時間30分、約1時間45分、約2時間、約2時間15分、約2時間30分、約2時間45分、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約9時間、約12時間、約15時間、約18時間、約21時間、または約1日であってもよい。一部の実施態様において、混合物から酢酸エチルを除去するのに十分な時間は、約1分～約10時間である。一部の実施態様において、混合物から酢酸エチルを除去するのに十分な時間は、約3時間である。一部の実施態様において、有機溶媒の約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約100%は、ステップ(d)で除去される。一部の実施態様において、ステップ(d)は、回転蒸発により行われる。
一部の実施態様において、ステップ(a)は、ソニケーションの間に行われる。第1溶液および第2溶液を混合した後、ソニケーションを続けてもよい。例えば、第1溶液および第2溶液は、混合物をソニケーションする間に混合してもよく、混合物を、その後もある程度ソニケーションし続け得る。それ故、合計ソニケーション時間はわずか数秒～1時間以上の間で変動し得る。例えば、ソニケーション時間は、約5秒、約10秒、約15秒、約20秒、約30秒、約45秒、約1分、約2分、約3分、約4分、約5分、約6分、約7分、約8分、約9分、約10分、約15分、約20分、約25分、約30分、約35分、約40分、約45分、約50分、約55分、～約1時間であってもよい。一部の実施態様において、合計ソニケーション時間は、約2分である。一部の実施態様において、ソニケーションは、振幅40%のプローブ型ソニケーションである。
一部の実施態様において、ステップ(c)は、ボルテックスの間に行われる。本明細書で定義される「ボルテックスの間」は、エマルジョンを(例えば少しずつ)加える間に、断続的にボルテックスを行うことを意味する。例えば、ステップ(b)のエマルジョンの一部を第2溶液に加え、ここでボルテックスのステップを行い、この操作を、ステップ(b)のエマルジョンを全て加えるまで繰り返した。一部の実施態様において、ステップ(c)は、ステップ(b)のエマルジョンを、第2水性溶媒に溶解した1以上の生分解性または生体適合性ポリマーを含む第2溶液に加え、続いて混合物をボルテックスすることを含む。ステップ(b)のエマルジョンおよび第2水性溶媒に溶解した1以上の生分解性または生体適合性ポリマーを含む第2溶液が共に加えられた後、ソニケーションを続けてもよい。例えば、混合物をボルテックスする間に、ステップ(b)のエマルジョンおよび第2水性溶媒に溶解した1以上の生分解性または生体適合性ポリマーを含む第2溶液が加えられてもよく、混合物をその後もある程度ボルテックスし続けてもよい。それ故、合計ボルテックス時間は、わずか数秒～1時間以上の間で変動し得る。例えば、ボルテックス時間は、約5秒、約10秒、約15秒、約20秒、約30秒、約45秒、約1分、約2分、約3分、約4分、約5分、約6分、約7分、約8分、約9分、約10分、約15分、約20分、約25分、約30分、約35分、約40分、約45分、約50分、約55分、～約1時間であってもよい。一部の実施態様において、ステップ(c)の生成物は、ステップ(d)の前にソニケーションが行われる。一部の実施態様において、ステップ(c)の生成物は、ステップ(d)の間にソニケーションが行われる。一部の実施態様において、ステップ(c)の生成物は、ステップ(d)の前、およびその間にソニケーションが行われる。
当業者は、本開示の生成物を精製する様々な方法を理解している。例えば、一部の実施態様において、ステップ(e)の精製は、(d)の生成物の洗浄により行われる。一部の実施態様において、ステップ(e)の精製は、透析、蒸発、または連続的遠心分離により行われる。
一部の実施態様において、ステップ(c)～(f)のいずれか1つの生成物は、滅菌されている。適切な滅菌方法は、当業者に容易に明らかである。例えば、適切な滅菌技術には、以下に限らないが、加熱滅菌、化学滅菌、放射線滅菌、および濾過が挙げられる。
一部の実施態様において、ステップ(a)の生分解性または生体適合性ポリマーは、PLGAである。一部の実施態様において、ステップ(c)の生分解性または生体適合性ポリマーは、さらにPVAを含む。
様々な有機溶媒が、本開示の方法で用いられてもよく、それらは当業者に容易に明らかである。適切な有機溶媒には、以下に限らないが、メタノール、エタノール、酢酸エチル、イソプロパノール、メトキシプロパノール、ブタノール、DMSO、ジオキサン、DMF、NMP、THF、アセトン、ジクロロメタン、トルエン、または上記溶媒の2つ以上の混合物が挙げられる。一部の実施態様において、有機溶媒は酢酸エチルである。
用語「水性溶媒」は、水を主成分とし、室温で液体の組成物をいう。一部の実施態様において、第1および第2水性溶媒は、水である。
一部の実施態様において、本開示は、本開示のナノ粒子組成物の製造方法であって;
(a)
i.水混和性有機溶媒に溶解したSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列ならびに1以上の生分解性または生体適合性ポリマー;および
ii.貧溶媒
を用意し;
(b) 水混和性有機溶媒に溶解したSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列ならびに1以上の生分解性または生体適合性ポリマーを、ナノ粒子組成物が形成されるように貧溶媒と共に混合し;および
(c) (b)の生成物を適宜精製することを特徴とする方法を提供する。
一部の実施態様において、上記方法は、さらに(b)または(c)の生成物を凍結および/または凍結乾燥する、(d)のステップを含む。
一部の実施態様において、混合はジェットミキサーで行われる。例えば、ジェットミキサーは、2つのノズルを有する拘束衝突ジェット(CIJ)ミキサー、または4つまでのノズルを有するマルチインレットボルテックスミキサー(MIVM)であってもよい。それ故、一部の実施態様において、ジェットミキサーは、2ジェットミキサーである。一部の実施態様において、ジェットミキサーは、4ジェットミキサーである。一部の実施態様において、混合は、同軸乱流ジェットミキサー、Roughtonミキサー、T字型ミキサー、ボルテックスミキサーまたはミニチュア、マイクロ、または携帯CIJおよびMIVMミキサーで行われる。
様々な水混和性有機溶媒が、本開示で用いられてもよい。用語「水混和性有機溶媒」は、室温および大気圧で水と均一溶液を容易に形成する、水以外の溶媒をいう。適切な水混和性有機溶媒の例には、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド(DMSO)およびギ酸が挙げられる。一部の実施態様において、水混和性有機溶媒はDMSOである。
本明細書で用いる、用語「貧溶媒」は、ポリマーを溶解するために用いられる溶媒が貧溶媒とも混和するが、ポリマーが溶解しない溶媒をいう。一部の実施態様において、水が「貧溶媒」として用いられる。任意の特定の理論に囚われることなく、2つの溶媒が混合される場合、その操作において、溶液から、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列をとらえながらポリマーが沈殿する。
一部の実施態様において、ステップ(a)の生分解性または生体適合性ポリマーは、PLGAである。一部の実施態様において、ステップ(a)の生分解性または生体適合性ポリマーは、さらにPVAを含む。
一部の実施態様において、上記アミノ酸配列のナノ粒子カプセル化効率は、約20%以上である。例えば、上記アミノ酸配列のナノ粒子カプセル化効率は、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%以上である。
この方法は、均一な粒子径を有し、凝集がほとんどないか、または皆無であるナノ粒子を驚くほど得られる。均一な粒子径を有し、凝集がほとんどないか、または皆無であることは、コストのかかる処理のステップ(例えば湿潤および/または乾燥製粉ステップ)が不要になるため、望ましい。例えば、一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径は、約100nm～約300nmの間である。一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径は、約100nm～約200nmの間である。一部の実施態様において、ナノ粒子の平均の直径は、約180nmである。前述の実施態様のいずれかにおいて、ナノ粒子の凝集は、ほとんどないか、皆無であってもよい。一部の実施態様において、この方法は、コストのかかる処理のステップ(例えば湿潤または乾燥製粉)が不要なナノ粒子を製造する。
一部の実施態様において、本開示は、局所用製剤の製造方法であって;
a) プロピレングリコール、グリセリン、メチルパラベンおよびプロピルパラベンを、パラベンが完全に溶解するまで混合し;
b) 別の容器で、透明溶液が得られるまで、精製水、EDTA、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムおよびD-マンニトールを混合し;
c) a)の溶液をb)の溶液に加え、a)の溶液の容器を精製水で濯ぎ、その濯いだ溶液を混合溶液に加え、混合溶液が視覚的に均一になるまで混合し;
d) ホモジナイザーで混合しながら、ヒドロキシエチルセルロースをc)の混合溶液に加え、ポリマーが十分に分散するまで混合し;
e) 別の容器で、ペプチドが完全に溶解するまで、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を精製水と混合し;
f) e)の溶液をd)の溶液に加え、e)の溶液の容器を精製水で濯ぎ、その濯いだ溶液を混合溶液に加え、混合溶液が均一になるまで混合することを特徴とする方法を提供する。
治療方法
一部の実施態様において、本開示は、がんの治療が必要な患者に対して、治療上有効量の本開示の医薬製剤を患者に投与することを含む、がんの治療方法を提供する。
様々ながんは、本開示の組成物によって治療されてもよい。例えば、一部の実施態様において、がんは、神経膠腫、リンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン疾患、骨髄性白血病、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頸部の扁平上皮細胞がん、腎臓がん、肺がん(例えば小細胞肺がんおよび非小細胞性肺がん)、神経芽腫、神経膠芽腫、卵巣がん、前立腺がん、皮膚がん、肝臓がん、黒色腫、口腔、咽頭、喉頭、および肺の扁平上皮細胞がん、結腸がん、子宮頸がん、子宮頸部腫瘍、乳がん、および上皮性がん、腎臓がん、泌尿生殖器がん、肺がん、食道がん、頭頸部がん、大腸がん、造血がん、精巣がん、結腸がんおよび直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、横紋筋肉腫、脊髄腫瘍、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、多発性骨髄腫および骨巨細胞種)からなる群から選択される。一部の実施態様において、がんは、神経膠腫である。一部の実施態様において、神経膠腫は、神経膠芽腫である。
本開示の医薬製剤は、有効量のナノ粒子またはSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を提供する、任意の方法で投与されてもよい。従って、医薬製剤は、次のいずれかの経路により投与され得る:局所、経口、経腸、経鼻(すなわち、鼻腔内)、吸入、髄腔内、直腸、腟、眼内、結膜下、口腔内、舌下、肺内、皮内、節内、腫瘍内、経皮、または非経口投与(例えば、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、胸骨内、海綿体内、外尿道内、腫瘍内、頭蓋内、脊髄内または尿道内注射または点滴)。一部の実施態様において、医薬製剤は、注射により投与される。例えば、医薬製剤は、皮下、皮内、筋肉内、腫瘍内、または静脈内注射により投与される。一部の実施態様において、医薬製剤は、腫瘍内注射により投与される。
最近の研究では、ギャップ結合タンパク質コネキシン43(Cx43)が、そのカルボキシル末端(CT)を介して、GBM細胞のTMZに対する耐性を変化させることが示された(Murphy et al., Cancer Res. 76:139-49 (2016))。一部の実施態様において、本明細書に記載のαコネキシンポリペプチド-ナノ粒子製剤は、αコネキシン活性を阻害して、TMZまたはその他の化学療法剤耐性に対抗する。
それ故、一部の実施態様において、上記方法は、さらに化学療法剤(例えばTMZ)を投与することを含む。様々な化学療法剤が用いられてもよく、それらは当業者によって容易に明白であろう。適切な化学療法剤には、以下に限らないが、毒素(例えば、サポリン、リシン、アブリン、臭化エチジウム、ジフテリア毒素、および緑膿菌外毒素);タキサン類;アルキル化剤(例えば、テモゾロミド(TMZ)、窒素マスタード(例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド、メクロレタミン、メルファラン)、およびウラシルマスタード;アジリジン(例えばチオテパ);メタンスルホン酸エステル(例えばブスルファン);ニトロソウレア(例えばカルムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン);白金製剤(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、テトラプラチン、オルマプラチン、チオプラチン、サトラプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ヘプタプラチン、イプロプラチン、トランスプラチン、およびロバプラチン);生体内還元性アルキル化剤(例えば、マイトマイシン、プロカルバジン、ダカルバジンおよびアルトレタミン));DNA鎖切断剤(例えばブレオマイシン);II型トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、アムサクリン、メノガリル、アモナフィド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、N,N-ジベンジルダウノマイシン、エリプチシン、ダウノマイシン、ピラゾロアクリジン、イダルビシン、ミトキサントロン、m-AMSA、ビスアントレン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、デオキシドキソルビシン、エトポシド(VP-16)、エトポシドリン酸塩、オキサントラゾール(oxanthrazole)、ルビダゾン(rubidazone)、エピルビシン、ブレオマイシン、およびテニポシド);DNA小溝結合剤(例えば、プリカマイジン(plicamydin));代謝拮抗剤(例えば葉酸アンタゴニスト(例えばメトトレキサートおよびトリメトレキサート));ピリミジンアンタゴニスト例えばフルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、CB3717、アザシチジン、シタラビン、およびフロクスウリジン);プリンアンタゴニスト(例えばメルカプトプリン、6-チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン);アスパラギナーゼ;およびリボヌクレオチド還元酵素阻害剤(例えばヒドロキシ尿素);アントラサイクリン;およびチューブリン相互作用剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびパクリタキセル(タキソール(登録商標)))、およびその組み合わせが挙げられる。一部の実施態様において、化学療法剤は、TMZである。
一部の実施態様において、本明細書に記載のαコネキシンペプチド-ナノ粒子組成物は、別の治療法(例えば化学療法剤)で治療するために腫瘍を感作させる。一部の実施態様において、本明細書に記載のαコネキシンペプチド-ナノ粒子組成物は、別のがん治療(例えば、化学療法剤、放射線治療、または手術)の有効性を高める。それ故、一部の実施態様において、本開示は、他のがん治療の有効性を高めるために、本明細書に記載のαコネキシンペプチド-ナノ粒子組成物を別のがん治療と組み合わせて投与することによる、がん治療のための組成物および方法を提供する。例えば、一部の実施態様において、本明細書に記載のαコネキシンペプチド-ナノ粒子組成物は、腫瘍をTMZ治療に対して感作させる。一部の実施態様において、本明細書に記載のαコネキシンペプチド-ナノ粒子組成物は、腫瘍のTMZ治療に対する感受性を修復する。一部の実施態様において、本明細書に記載のαコネキシンペプチド-ナノ粒子組成物は、腫瘍のTMZ治療に対する感受性を維持する。
医薬製剤は、治療過程において複数回にわたって投与されてもよい。例えば、一部の実施態様において、医薬製剤は、(例えば腫瘍内注射で)治療過程において1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30回投与される。従って、治療は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、または60日間続き得る。一部の実施態様において、医薬製剤は、(例えば腫瘍内注射で)継続的に何日間も投与される。一部の実施態様において、医薬製剤は、(例えば腫瘍内注射で)数日置きに投与される(例えば隔日)。
一部の実施態様において、化学療法剤(例えばTMZ)が本開示の医薬製剤と併用して投与される。例えば、一部の実施態様において、化学療法剤が、本医薬製剤と同じ日に投与される。
一部の実施態様において、化学療法剤(例えばTMZ)は、本開示の医薬製剤と併用して投与されない。例えば、一部の実施態様において、化学療法剤は、医薬製剤と別の日に投与される。
一部の実施態様において、本開示は、対象に本開示の局所用製剤を投与することを含む、慢性創傷の治療方法を提供する。ここで本製剤は、慢性創傷の治療に有効な投与計画で投与される。一部の実施態様において、本製剤は、日ごとまたは週ごと投与される。一部の実施態様において、本製剤は、投与計画において0日目、3日目、1週目、2週目、3週目、4週目、5週目、6週目、7週目、8週目、9週目、10週目、11週目、および12週目に投与され、慢性創傷の症状が軽減される。さらなる実施態様において、本製剤は、過度な副作用を引き起こさない。別の実施態様において、慢性創傷は臨床的に顕著な異常が無く改善される。別の実施態様において、この方法は、標準的な治療法が用いられる場合の100%創傷閉鎖に要する時間と比較して、100%創傷閉鎖に要する時間が短縮される。他の実施態様において、標準的な治療と組み合わせて投与した場合、この方法は、標準的な治療のみでの治療と比較して、100%創傷閉鎖に要する時間が短縮される。ある実施態様において、この方法は、標準的な治療法が用いられる場合の50%創傷閉鎖に要する時間と比較して、50%創閉鎖に要する時間が短縮される。別の実施態様において、標準的な治療で治療した患者の4週間での創傷閉鎖の割合と比較して、本明細書で開示の方法および製剤で治療した患者の4週間での創傷閉鎖の割合は高い。
別の実施態様において、本方法の結果、対象における痛みの程度が減少する。さらなる実施態様において、痛みの程度は患者の自己評価で決定される。ある実施態様において、標準的な治療と比較して、本方法による12週間、11週間、10週間、9週間、8週間、7週間、6週間、5週間、4週間、3週間、または2週間での創傷閉鎖の割合の平均は向上する。ある実施態様において、本方法による12週間での創傷閉鎖の平均の割合は向上する。ある実施態様において、標準的な治療法で治療した患者の創傷部位と比較して、本方法は創傷部位を減少させる。ある実施態様において、本方法は、対象における抗αコネキシンポリペプチド抗体の生成を誘起しない。
別の実施態様において、本方法は、標準的な創傷治癒の治療法と比較して、100%完全創傷閉鎖の発生率または頻度が向上する。別の実施態様において、本方法は、標準的な治療で、1、4、12、24、36週間、またはそれ以上の期間中に十分な創傷の大きさの減少が見られなかった潰瘍を治療するために用いる。ある実施態様において、本方法は、標準的な治療で、1、4、12、24、36週間、またはそれ以上の期間中に50%未満の創傷閉鎖しか見られなかった潰瘍を治療するために用いる。ある実施態様において、本方法は、慢性創傷の創傷部位および持続特徴がある潰瘍を有する患者を治療するために用いる。ある実施態様において、本方法は、非治癒性創傷の特徴をもつ創傷がある潰瘍を有する患者を治療するために用いる。ある実施態様において、本方法は、慢性創傷の創傷部位および期間持続特徴がある潰瘍を治療するために用いる。
一部の実施態様において、本開示は、標準的な圧迫療法に加えて、本開示の局所用製剤を対象に投与することを含む、対象の慢性創傷の治療方法を提供し、ここで慢性創傷は、標準的な圧迫療法のみの治療より早い速度および/または高い頻度で治癒される。
一部の実施態様において、慢性創傷の治療に用いる製剤は、少なくとも1つのαコネキシンポリペプチドおよびヒドロキシエチルセルロースゲルを含む。さらなる実施態様において、ヒドロキシセルロースゲルは、約2%、約1.75%、約1.5%、約1.25%、約1.0%、または約0.75%の濃度で存在する。ある実施態様において、ヒドロキシセルロースゲルは、約1.25%(w/w)の濃度で存在する。
一部の実施態様において、慢性創傷とは、潰瘍である。さらなる実施態様において、慢性創傷とは、下肢潰瘍である。別の実施態様において、慢性創傷は、静脈下腿潰瘍、糖尿病性足潰瘍、および褥瘡からなる群から選択される。
一部の実施態様において、慢性創傷とは、潰瘍(例えば下肢潰瘍)である。一部の実施態様において、慢性創傷は、静脈下腿潰瘍、糖尿病性足潰瘍、および褥瘡からなる群から選択される。
本明細書に記載のあらゆる方法は、特に断りが無い限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書に記載の任意および全ての例、または例示的な文言(「例えば」など)の使用は、単に本発明をより詳しく説明する意図であり、特に断りが無い限り、本発明の範囲を限定するものではない。明細書中のいかなる文言も、任意の特許請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であると示すものとして解釈されるべきではない。
明細書で引用されるあらゆる文献(出版物、特許出願、および特許など)は、個々に、かつ具体的に参考文献として示される場合と同様の範囲で、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
以下の実施例は、本開示を説明するために示されるものであって、以下に限定すると解釈されるべきではない。これらの実施例において、特に断りが無い限り、あらゆる部分および割合は重量によって表される。実施例における略語は、以下に記載されている。
実施例1: ダブルエマルジョン溶媒の蒸発方法による、ペプチドの制御投与のためのポリ(ラクト-コ-グリコール酸)ナノ粒子
PLGAは、様々な応用のための低分子ドラッグデリバリーにおいて用いられる。(非特許文献２～非特許文献４)PLGAは、骨格エステル結合が開裂する加水分解により数週間にわたって分解し、クレブス回路を介して体内で容易に代謝され、二酸化炭素および水として排出される、生物学的に適合する副生成物;乳酸およびグリコール酸を形成するため、低分子の制御放出に有用である。(非特許文献２、非特許文献４)
多くの研究では、親水性および疎水性薬物(特に低分子)をPLGAを用いて封入することに成功していたが、最小の粒子径を保持する間のペプチドおよびタンパク質のカプセル化は、特に難易度が高い。(非特許文献１３～非特許文献１８)ナノ粒子を形成する方法は複数存在し、そのうちの1つがエマルジョン溶媒の蒸発方法である。(非特許文献１９)エマルジョン溶媒蒸発方法は、まず、ポリマーを揮発性で水と混和しない溶媒に溶解し、界面活性剤を加えた水中でエマルジョン化し、次いで溶媒を蒸発させることが含まれる。疎水性薬物は、一般に上記のような1回のエマルジョン操作で封入される(油/水)一方、親水性薬物はダブルエマルジョンの方法が用いられる(水/油/水)(非特許文献２、非特許文献１９)
ペプチドおよびタンパク質薬の効果的な治療上の投与は、迅速な分解によってインビボでの半減期が短いことからも困難である。αCT1、25アミノ酸ペプチド薬の徐放性製剤は、例えば、慢性創傷およびがんなどの長期治療を必要とする適応症において、より少ない投与回数で済むように提案された。この研究において、PLGAナノ粒子合成のダブルエマルジョン溶媒の蒸発方法を開発および最適化するために、ローダミンBをモデル薬物として用いた。これらのナノ粒子中に封入されたαCT1は、3週間にわたってインビトロ放出プロファイルの持続を示し、初めの3日間にわたる最初のバースト放出に続いて、残りの2.5週間にわたって封入された薬物の合計73%まで放出が持続することが特徴である。
さらなる包括的な調査のために、ダブルエマルジョン操作を用いてロードした薬物と、シングルエマルジョン操作のそれを比較した。
材料および方法
[全般]
購入した材料は、全てさらに精製することなく用いた。PLGA(ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド; 7000～17000MW、50:50 乳酸:グリコール酸(酸末端))、PVA(ポリビニルアルコール; 13000～23000MW、87～89%加水分解)、ローダミンB(RhB; HPLCグレード≧95%)、リン酸緩衝生理食塩粉末(PBS;脱イオン水中に溶解; 生化学研究用認証グレード、pH 7.4)、スクロース(BioUltra、分子生物学用、≧99.5%(HPLC))、トレハロース(医薬二次標準物質、認証標準物質)、およびウシ血清アルブミン(BSA;脂肪酸不含、グロブリン不含、≧99%、アガロースゲル電気泳動)をSigma Aldrichから購入した。酢酸エチル(EA; HPLCグレード)をFisher Scientificから購入した。ペプチド薬、α-コネキシンカルボキシル末端(αCT1)ペプチドをAmerican Peptide Company(現在のBachem; Sunnyvale、CA)で合成した。αCT1ペプチドは、アンテナペディア細胞内輸送配列(RQPKIWFPNRRKPWKK)と結合したコネキシン43のC末端(RPRPDDLEI)の短い配列に相当する。
[シングルエマルジョン粒子の合成]
シングルエマルジョンナノ粒子(SE-NP)の合成方法は、非特許文献１２の方法を改変した。簡潔に言うと、PLGAをEAに溶解後、0.1mgのRhBをPLGA溶液に直接加え、その溶液をボルテックスで混合し、次いで2.5w/v%のPVA/水溶液(1mL)に加えた。この溶液をプローブ型のもので2分間ソニケーションした(振幅40%)。この溶液を素早く0.3w/v%のPVA/水(50mL)に加え、次いで少なくとも3時間撹拌し、EAを蒸発させた。
SE-NPにローダミンBをロードし、シングルエマルジョン法およびダブルエマルジョン法の両者で粒子にロード出来る薬物の量を試験した。RhBは、薬物のロードにおける傾向を探るのに濃度決定が容易であるため、モデル薬物として用いられた。さらに、RhBおよびαCT1は、正の全体電荷など、類似の生理化学的特徴を有する。両分子の大きさが異なり、粒子径に差が出得るものの、ロードにおける傾向およびPLGAとの相互作用は電荷により類似しているはずである。BSAは、ペプチドの大きさを模倣するために用いられる。BSAは、αCT1よりはるかに大きいが(BSA:MW 66.5kDa、αCT1:MW 3.5kDa)、その極度の嵩高さによって、工程の改変中に粒子径の傾向が容易に示されるはずである。
[ダブルエマルジョン粒子の合成]
非特許文献１２および非特許文献１８で用いられた合成プロトコルを改変した。簡潔に言うと、αCT1(αCT1-NP)を含むダブルエマルジョン粒子(DE-NP)は室温で以下のように合成した。初めに0.025gのPLGAを1mLのEAにボルテックスで断続的に撹拌しながら30分間溶解した。次いで50μLのαCT1水溶液(2mmol)を加え、プローブ型ソニケーター(Qsonica Q55)を用いて振幅40%で2分間ソニケーションを行った。次いで最初のエマルジョンを素早く2.5w/v%のPVA/水溶液(1mL)にボルテックスで撹拌しながら滴下して加えた。次いでこの混合物を再度素早くプローブ型のもので2分間ソニケーションした(振幅40%)。得られたダブルエマルジョンを次いで0.3w/v%のPVA/水溶液(50mL)に移し、少なくとも3時間撹拌し、酢酸エチルを蒸発させた。ローダミンB-ナノ粒子またはBSA-ナノ粒子(RhB-NP、BSA-NP)に対し、αCT1溶液の代わりにローダミンBまたはBSA水溶液(2mmol)を用いて、同様のプロトコルを行った。細胞培養実験に用いられる粒子は、25mmナイロン無菌シリンジフィルター(Fisherbrand、孔径0.2μm)を用いた濾過、または全ての物質を使用前に滅菌し、無菌安全キャビネット中で粒子合成を行うことにより滅菌した。次いで粒子を遠心分離法で3回洗浄して過剰なPVAを除去し、-20℃以下で凍結し、凍結乾燥し、次いで-20℃で保管した。
[物質の解析方法]
走査電子顕微鏡(SEM)は、Nanoscale Characterization and Fabrication Laboratory(Blacksburg、VA)にて、LEO(Zeiss)電界放出形走査電子顕微鏡を用いて行った。SEM画像の解析は、ImageJ softwareを用いて行った。動的光散乱(DLS)およびゼータ電位は、Malvern Zetasizer Nano-ZSを用いて測定した。ローダミンの放出を調査するためのUV-vis吸光度は、Cary 60 UV-Vis分光光度計(Agilent Technologies)を用いて測定した。
[インビトロでのナノ粒子からの薬物放出]
凍結乾燥したナノ粒子を0.01M PBS溶液(1mg/mL)に再懸濁し、放出測定の間37℃でインキュベートした。各経過時点で、粒子を遠心分離して沈殿させ、上清を薬物含量分析のために回収した。一定濃度を維持するため、除去した上清分と同体積の新しいPBS溶液を加え、10～15分間超音波浴でソニケーションし、粒子を再分散した。分散液のサンプルをとり、動的光散乱(DLS)で分析した。粒子懸濁液の液滴を、SEMスタブ上に貼り付けれらたシリコンウェーハ部分に乗せ、後のSEMサンプルを調製した。
[細胞培養]
ヒト神経膠芽腫(GBM)細胞株SF295を、10%ウシ胎児血清(Atlas Biologicals, Inc.)、ストレプトマイシン(100μg/mL)およびペニシリン(100IU/mL)を補足した、ダルベッコ改変イーグル培地(Thermo Scientific)で培養した。前述したように(非特許文献９)、Carilion Clinicで手術を受けたGBM患者から単離したヒトGBM幹細胞(GSC)VTC-037およびLN229/GSCは、Gibco(登録商標)B-27(登録商標)サプリメント(Thermo Scientific)、線維芽細胞増殖因子(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、20ng/mL)、および上皮細胞増殖因子(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、20ng/mL)を補足した、ダルベッコ改変イーグル培地で培養した。
[酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)]
インビトロおよびインビボアッセイでペプチド追跡が可能になるように、アミノ末端ビオチンタグをαCT1配列に加えた。ビオチンタグの付いたαCT1のインビトロ放出は、OptEIAキット(BD Biosciences)を用いて、サンドイッチ結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により測定した。Nunc MaxiSorpTM96ウェルマイクロプレート(Thermo Scientific)の各ウェルを、抗C末端コネキシン43抗体(1μg/mL、Sigma-Aldrich)を含むコーティング緩衝液でコーティングし、一夜4℃でインキュベートした。次いでウェルを洗浄し、1%ウシ血清アルブミンで室温中2時間ブロッキングした。標準物質としてビオチンタグの付いたαCT1の段階希釈液およびインビトロ放出測定から異なる時間で回収したビオチンタグの付いたαCT1を含むサンプルを、対応するウェルに加え、一夜4℃でインキュベートした。次いでウェルを洗浄し、ニュートラアビジン標識HRP(1μg/mL、Thermo Scientific)を1時間室温で加えた。洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)発色基質溶液を加え、室温の暗所で10分間反応させ、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を用いてOD650の吸光度を測定した。次いで2M硫酸を加えてこの反応を止め、マイクロプレートリーダーを用いてOD450の吸光度を測定した。全ての測定は3回行った。
[細胞イメージングおよび免疫蛍光染色]
細胞を、6ウェルプレートまたは35mmガラスボトムディッシュ(Mat-Tek)に播種し、孔径0.45mmで濾過し、凍結乾燥したRhB-NPまたはαCT1-NPを、PBSに再懸濁し、異なる濃度で培地に加えた。一夜インキュベーション後、次いで細胞をPBSで5回洗浄し、新しい培地を補充し、EVOSTM FL Auto Imaging System(Thermo Scientific)を用いて、位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡により様々な時間で観察するか、または20分間4%パラホルムアルデヒドで様々な時間で固定し、3%BSAブロッキング溶液中のTriton X-100(0.1%)で2時間室温で透過処理した。免疫染色を抗C末端コネキシン43抗体(Sigma-Aldrich、1:3000)で行い、Alexa Fluor(登録商標)488標識二次抗体(Thermo Scientific、1:500)を用いて検出した。ビオチンタグの付いたαCT1を、Alexa Fluor(登録商標)647標識ストレプトアビジン(Thermo Scientific、1:500)で検出した。Alexa Fluor(登録商標)488標識小麦胚芽凝集素(WGA)(Thermo Scientific、1:500)を用いて細胞膜を染色した。Gold褪色防止剤をProLong DAPI(Thermo Scientific)と共に用いて、スライドガラスに封入した。細胞をOpterra共焦点蛍光顕微鏡(Bruker)下で脱アミノ化した。
結果
[粒子径最適化]
ローダミンBおよびαCT1を封入したPLGAナノ粒子を合成した。初めのダブルエマルジョン粒子は、最初のエマルジョン中のPLGA(0.05g)およびEA(2mL)および二次エマルジョン中の5w/v%のPVAを用いて作製した。しかしながら、滅菌のために0.2μmでの濾過が必要であるため、合成操作には粒子の大半が0.2μm未満になるまで粒子径を減少させるための最適化が必要であった。PLGA、酢酸エチル、およびPVAの量を、粒子の大きさを最適化するために変更した。また、PLGAをそのガラス転移温度(Tg)未満に保ち、NPの合体を避けるために高エネルギー超音波照射中で冷浴を行った。最後に、粒子径最適化中、αCT1がどのように粒子径を変化させ得るかを上手く模倣するために、嵩高さを利用して、BSA(2mM水溶液)を薬物模倣体として用いた。
表7に、最適化中に変更したパラメーターが記述されている。シングルエマルジョン粒子のピークの直径は、一般に200nm未満であったため、シングルエマルジョン粒子では最適化が行われていない。動的光散乱(DLS; Malvern Zetasizer Nano ZS)を用いて平均ナノ粒子直径を検出した(図1)。元々のパラメーターで作製した粒子(表7、サンプル1)は、最大の平均直径229nmを示した。エマルジョン化中のバッチサイズが小さく、外層のPVAの濃度が低い場合、最小の平均直径かつ多分散度(PDI)の低い粒子が得られた。これは、このより小さな粒子が、他のサンプルと比べて大きさがより均一であり、回収した粒子の半分以上が滅菌フィルターサイズ(0.2μm)を通過出来ることを意味する。サンプル3のパラメーターから最小の粒子およびPDIが得られたため、サンプル3のパラメーターがダブルエマルジョン粒子の合成に適用された。
Figure 2022511307000010
[シングルエマルジョンおよびダブルエマルジョン間でのRhBロード含量および効率比較]
次に、薬物ロードおよび放出の最初の見積もりを、シングルエマルジョンおよびダブルエマルジョン粒子の両方で行った。表8では、シングルエマルジョンおよびダブルエマルジョン粒子のロード含量およびカプセル化効率を比較している。式1を用いて計算した薬物含有量は、シングルエマルジョンおよびダブルエマルジョンの両方で類似していた。しかしながら、式2を用いて計算した薬物封入率は、シングルエマルジョンと比較してダブルエマルジョンの方が高かった。また、図2は、シングルエマルジョンおよびダブルエマルジョン粒子の薬物放出プロファイルを示す。シングルエマルジョンの合成法を用いて製造された粒子は、7日間にわたってより多量のローダミンをバースト放出し、ダブルエマルジョン粒子に比べてより素早く放出し終わり、7日後に94%のローダミンを放出した。
Figure 2022511307000011
ダブルエマルジョン粒子は、より高いカプセル化効率を有し、封入した物質の全てを放出するのにより長い時間を要した。徐放性αCT1製剤の開発が目標であるため、これらの結果は、さらにダブルエマルジョン粒子の評価を裏付けるものである。
Figure 2022511307000012
[抗凍結剤]
粒子を乾燥状態にしておくために、粒子の長期保存には凍結乾燥が用いられる。RhB-NPおよびαCT1-NPは、PLGAのTg未満に粒子を保ち、粒子を早く劣化させる湿気に対する暴露を可能な限り減らすために凍結保存した。凍結乾燥するために、溶液中の粒子は最初に凍結する必要がある。臨床試験に用いる前に、粒子を脱イオン水またはPBS緩衝溶液に再懸濁し、粒子が無菌キャビネット中で合成されていない場合、0.2μmで濾過して滅菌されるべきである。
凍結乾燥および再懸濁後、無菌濾過の工程の間に大部分の粒子が失われたことが分かった。凍結乾燥後、ローダミンをロードしたNPのゼータ電位(-28±2mV)は懸濁液が安定であることを示唆したが、凍結および/または乾燥の工程の間に粒子の大きさが増大した。これは、凍結により氷晶が隣接する粒子を穿刺し、本質的に合体することでより大きな粒子となったためと仮定された。凍結の間にPLGAナノ粒子を保護し、良好な結果をもたらす様々な方法が探求されてきているが、通常は単糖類や二糖類など(スクロース、トレハロース、デキストロース、ソルビトールなど)の抗凍結剤が最も一般的に用いられている。(非特許文献２０～非特許文献２３)この研究において、液体窒素での急速凍結およびトレハロースおよびスクロースの抗凍結剤の添加が粒子径増大を制限するのに用いられた。
図3は、凍結前の粒子の直径が183nmであることを示す。抗凍結剤無しでの緩慢凍結では、粒子の直径が240nmより大きくなり、急速凍結では平均215nmまでに制限された。抗凍結剤を大量に加えた場合(例えば15w/v%溶液)、粒子径は抗凍結剤無しでの緩慢凍結の大きさよりも大きい、260nmになった。一部の例において、大量(10%以上)の添加は、抗凍結剤無しで凍結した粒子の粒子径より大きくなることを示した。(非特許文献２０、非特許文献２３)この研究では、抗凍結剤を少量(特に1w/v%)で添加し、粒子径の増大を制限した。トレハロースを1w/v%で用い、急速凍結した場合、粒子径は、単に急速凍結した粒子より小さくなる。スクロースを1w/v%で用い、急速凍結または緩慢凍結のいずれかを行った場合、平均粒子径は、もとの粒子径と最も近似していた。トレハロースを1w/v%で添加し、緩慢凍結した場合、スクロースを同じ濃度で用いる方法と同様の粒子径になった。今後の実験では凍結および凍結乾燥前に1w/v%スクロースを全ての粒子懸濁液に加えた。
[αCT1-NPのロードおよび分解]
保管中のNPの大きさの変化を減少させるために、抗凍結剤パラメーターを最適化後、αCT1-NP対するロードおよび分解の研究が行われた。分析前に粒子を0.2μmのフィルターで濾過した。薬物ロード量は質量で表すと962±88ng(薬物)/mg(粒子)、割合で表すと0.0962±0.0088%であり、カプセル化効率は0.000966±0.00049%であった。誤差は、少なくとも3つのサンプルの標準偏差である。凍結乾燥後のαCT1-NPのゼータ電位は、-23mVであった。αCT1の封入量はRhB-NPの封入量の約1μg/mg(粒子)より多いように見えるが、RhB-NPおよびαCT1-NPの薬物ロード率は0.1%未満である。
図4Aは、サンドイッチELISAで測定した、21日間にわたるαCT1の累積放出を示す。放出プロファイルは、3日後までに約50%のペプチドが放出され、続いて封入された薬物全体の73%が放出されるまで18日間にわたって徐放が続くバースト効果を示した。
粒子形態および直径の変化をDLSおよびSEM測定を用いて経時観察し、ImageJ softwareで画像分析を行った。DLSを用いて測定した粒子径の直径は、SEMで測定した大きさの約2倍であった。DLSおよびSEMの両者は、7日間の経過で粒子径が186から208に増大することを示し、さらに2～3週間の間に223nmまで大きくなった。図4Bは、DLSで測定した、分解研究中の粒子の粒子径および多分散度(PDI)の経過を示す。PDIも時間が経つにつれて増加した。同様の粒子径の傾向がSEMによる測定で見られた。図4C～Hは、分解1日目、7日目、および21日目のSEM画像を示す。7日後に細孔または孔が見られ、時間が経つにつれて、その大きさや量が増加した。
[GSCおよびGBM細胞へのRhB-NPおよびαCT1-NPの取り込み]
様々な濃度でVTC-037 GSCに加えたRhB-NPは、少なくとも300μg/mLのNPが細胞プレート付着に影響せずに細胞に添加され得ることを示した(図5A)。この濃度を次いで3週間の細胞培養に用いて、RhB-NPの分解およびその細胞への影響、ならびにRhBが細胞内にどれほどの期間留まり得るかの経過を調査した(図5B)。1週間の放出で、大量のRhBが細胞内に存在する。10日目にトリプシン処理で細胞を継代した後においても、14日間および21日間RhBシグナルが細胞内で検出される。
200μg/mLのRhB-NPをVTC-037 GSCに加えた場合、37℃でインキュベートした細胞は、図5と同様のRhB-NPの取り込みを示したが、4℃でインキュベートした細胞ではRhB-NPの細胞内への取り込みが減少した(図6)。
RhB-NPを200μg/mLで加えたLN229/GSCの培地と加えていない培地中での細胞膜および核の染色では、RhB-NPが細胞質中に存在するため、NPの細胞内へ取り込みが起こるが、核からは排除されることを示す(図7)。SF295細胞の培地においてαCT1-NPを1mg/mLで加えた場合(細胞内へのNPの取り込みのポジティブコントロールとして、RhB-NPが1mg/mLで用いられる)、ビオチンタグの付いたαCT1の検出に続くαCT1-NPの取り込みにより、1日後および4日後の細胞においてαCT1が存在することを示す(図8)。
以下の実施例では、濾過による粒子の滅菌のため、粒子径を小さくするために用いる方法と同様に、ダブルエマルジョン溶媒蒸発法を用いたペプチドαCT1を封入する方法を記載している。粒子は、約21日間にわたってインビトロでペプチドを放出する。また、粒子がVTC-037 GSCに取り込まれ、細胞内におけるペプチドの存在が少なくとも4日間検出されることが示される。これは、粒子がαCT1ペプチドの制御放出に用いられてもよいことを示す。
細胞に導入可能な物質を作る際に考慮すべき要素の1つは滅菌操作である。ここで、濾過による滅菌で封入されたペプチドの放出プロファイルが変わる可能性は低いと判断し、粒子径を最適化して最小の直径にした。粒子径の最適化により、平均粒子径は直径229nmから直径143nmに縮小した。他の全ての粒子径は、平均直径が170nm未満であった。これは、最初のエマルジョンをボルテックスしながらPVA溶液に滴下したためと考えられ、より小さいバッチを用いた場合に縮小した。より小さいバッチサイズでは、最初のエマルジョンが第2外層に加えられる際に、溶液がボルテックス中に容器から飛び出すことがない。
サンプル3では、サイズ最適化の研究中の粒子の直径を最小化するための好ましい条件を示した。
シングルエマルジョンおよびダブルエマルジョンは、異なった形で薬物量を封入し得る。例えば、一般にシングルエマルジョンは疎水性薬物を高いロード率で封入するのに対し、ダブルエマルジョンは、親水性薬物を封入する空間をもたらすため、両薬物の最外層への移動は少ない。(非特許文献２５)ここで粒子中のRhBの含有量は、シングルエマルジョンおよびダブルエマルジョンの間で差が無い。実質、ほとんどRhBが封入されなかったため、ロード量の低さは、粒子への取り込みより、粒子の表面の吸着作用が大きな要因であり得る。カプセル化効率は、より多量の粒子が回収されるため、ダブルエマルジョン粒子の方がシングルエマルジョン粒子より高くなり得る。
NPの大きさ増大の経過は、PLGAが一般に中性～酸性pHでは濃度が小さくてもバルク侵食するという事実によるものであると予測された。(非特許文献２７)バルク浸食は分解速度が水の浸透速度が遅い場合に起こり、一方、表面浸食はポリマーの分解および除去速度が水の浸透速度より速い場合に起こる。表面浸食の場合、分解はポリマーマトリックスの表面に限定される。(非特許文献２７、非特許文献２８)ここでバルク浸食するPLGA-NPは、ポリマーが加水分解される最初の数日間、浸食が起こる前に水で膨潤する。(非特許文献２７、非特許文献２９)約3週間、粒子の大きさが再び増大する場合、粒子の凝集が大きさ増大の主な要因であり得る。Rescignanoらも分解が進むにつれてナノ粒子の凝集を観測した。(非特許文献３０)これは、ナノ粒子浸食中にPVA安定剤が表面から除去されるためと考えられる。洗浄サイクル後にもPLGA殻に取り込まれたと考えられるPVAが、立体的に凝集の阻害を行う。PVAは水に溶解するため、粒子が分解するとPVAも分解され、周囲の水に溶解し得る。一度立体障害が解除されると、粒子の凝集が容易になるため、大きさが増大する。NP中に孔が見られるのは、分解及び浸食の間に、ポリマーが浸食チャンネルを介して粒子から除去されるためと考えられる。(非特許文献２９、非特許文献３０)
NPを細胞に導入し、RhB-NPを加えた場合と加えない場合の両方で細胞膜および核を染色したところ、核からは排除されたが、RhB-NPは細胞質基質中で検出され、NPの細胞内への取り込みが支持された(図7)。細胞を4℃でインキュベートした場合、RhB-NPの細胞内への取り込みはほとんど起こらなかったため、エネルギー依存性エンドサイトーシスがNP取り込みの主な経路であることを示唆している。(非特許文献３１、非特許文献３２)RhB-NPならびにαCT1-NPは細胞に取り込まれる。
まとめると、PLGAナノ粒子はαCT1をうまく封入し、3週間にわたって薬物の73%をインビトロで放出した。ヒトGSCに導入された場合、RhBは最初の7日間は明確に検出され、続く14日間および21日間は最小量が検出された。RhBは、まだ粒子内に封入されているRhB分子ならびに放出されたRhB分子として検出されたと考えられた。GSCに導入されたαCT1-NPは、少なくとも4日間にわたってαCT1が細胞内に存在することを示した。しかしながら、薬物ロードおよびカプセル化効率は低く、非現実的な量のナノ粒子を使用しない限りαCT1の治療に適した用量より少なかった。実施例2では、さらに患者とってより効果的な用量に増やすための、薬物ロードの改良法についての研究を詳述している。
実施例2: フラッシュナノ沈殿によるαCT1ロードPLGAナノ粒子の製造
ダブルエマルジョン法(水/油/水エマルジョン)は欠点がある(例えばαCT1-NPのロードプロファイルのカプセル化効率が～1%)一方、シングルエマルジョン合成NPは凝集傾向を示す。そのため、この目的を拡大して、別の合成法を探求する必要がある。調査した別の方法には、i.)αCT1ではなくポリマーを効率的に溶解する間に素早く蒸発する無毒有機溶媒の最適化、ii.)ペプチドが外側水層に拡散する時間を短くするために、溶媒除去を促進する回転蒸発の利用、iii.)カプセル化効率を上げ、高密度で均一な球面を製造するために、酸化亜鉛またはカルシウムの外層への添加が挙げられる。また、臨床用輸送および製品化のための重要な長期保管および輸送を目的としたナノ粒子を保存するための凍結乾燥および凍結法も最適化された。凍結および凍結乾燥プロトコルの間にスクロースを抗凍結剤として添加することで、粒子凝集をうまく防止できた。
フラッシュナノ沈殿により、高い薬物ロード量、およびより小さく、より均一で、凝集しないナノ粒子という観点から最適なαCT1-NPが得られた。この方法には、水混和性溶媒にポリマー(PLGA)および薬物(αCT1)を溶解することが含まれる。水は「貧溶媒」として用いられる。ここでポリマーを溶解するために用いる溶媒は、貧溶媒とも混和するが、ポリマーは貧溶媒には溶解しない。2つの溶媒を混合すると、ポリマーが操作中の薬物を捉えながら溶液から沈殿する。2ジェットミキサーおよび4ジェットミキサーの両方の手段が評価された(図10)。
[αCT1-NPの大きさ、形態ならびに表面電荷の評価、およびαCT1ロード量ならびに放出効率の決定]
次の評価パラメーター:ナノ粒子径および形態(走査電子顕微鏡(SEM)を用いて調査した)、αCT1のカプセル化効率、およびαCT1およびローダミンBの効率および放出;によりαCT1が完成され、NPを制御し、臨床用開発および商業化のためのαCT1-NPのフラッシュナノ沈殿法(混合には4ジェットミキサーおよび＞1%のポリビニルアルコール(PVA)(w/v)を用いる)が確立された。
[ナノ粒子の大きさおよび形態]
混合中、4ジェットミキサーおよびPVAを用いて、フラッシュナノ沈殿で製造したナノ粒子は、その他の方法と比較して、αCT1-NPの大きさがより均一な～180nmであり、ほとんど凝集しなかった。ナノ粒子径および形態は、走査電子顕微鏡(SEM)を用いて調査した。これはナノ粒子の形態および大きさが均一に分布することで、物理化学的性質が最適化されαCT1放出に関するより一貫性のある結果が得られるため、重要である。粒子径は、動的光散乱法を用いてZetasizer Nano ZSで測定した。ロード効率および細胞内への取り込みに最適なナノ粒子径は100～300nmであり、CED送達に最適なナノ粒子径は＜150nm±40である。αCT1-NPは、目立った細孔またはひびのない滑らかな表面、および平均径100～200nmを示した(図11)。混合中にPVAを添加(0.3～2.5%)することで、より小さい粒子径が得られた。
概して、混合中、4ジェットミキサーおよびPVAを用いたフラッシュナノ沈殿は、他の方法と比較して、αCT1-NPの大きさがより均一な～180nmであり、凝集が少ないことが示された。
カプセル化効率は、分解した粒子のαCT1ペプチド含有量およびローダミンB含有量を測定することにより決定された。この目的のために、既知量の凍結乾燥したナノ粒子をDMSOに再懸濁し、溶液を50℃で30分間撹拌後、50%アセトニトリル(0.1%トリフルオロ酢酸含有)をさらに60分間加え、PLGAを分解させた。分解したPLGAを遠心分離により除去し、αCT1およびローダミンBを含む上清を、新たに開発および最適化したELISAおよび蛍光定量法を用いてそれぞれ分析した。C末端のCx43抗体(1μg/mL)を用いた、高感度かつ特異的サンドイッチELISA(＞90%)での捕捉、HRPタグの付いたニュートラアビジンでの検出は、これらの分析のために特別に開発および検証された。ナノ粒子中のαCT1の濃度は、既知の濃度のαCT1またはローダミンBで作成した検量線を用いて計算した。αCT1の薬物ロードは、4ジェットミキサーでフラッシュナノ沈殿合成された場合に最適であった(～65.7%)。混合中のPVA(＞1%)の添加は、有意にロード効率を高めた。塩化ナトリウムの添加は、薬物ロード効率に大きな影響を与えなかった。
封入されたαCT1およびローダミンBのインビトロでのNPからの放出率は、PBS溶液中、撹拌子で絶えず混合しながら37℃でインキュベートして決定された。0時間～36日間の間、一定の時間間隔で懸濁液のサンプルを回収し、新たなPBSを一定体積維持のためにナノ粒子懸濁液中に加えた。各回収サンプルを遠心分離してNPを除去し、上清中のαCT1およびローダミンBの濃度を上記に記載の通りに決定した。分解の調査では、完全なPLGA-Rhod-NPが36日間以上維持されることを示した(図12A)。ダブルエマルジョン放出によるαCT1の分析では、1日後に最初のバースト、続いて7日後に最大徐放量に達することが示された。粒子をPBS中に濃度1mg/mLで再分散し、37℃で分解した。2ジェットフラッシュナノ沈殿法は、ダブルエマルジョン粒子と比較してバースト放出が少ないことが示された。これは、溶媒除去のために用いられた24時間の透析ステップが包含されているためと考えられる(図12B)。
それ故、フラッシュナノ沈殿法は他の方法と比較して、高いαCT1封入率および良いαCT1放出速度を有する。
実施例3: αCT1-NPの細胞内への取り込み
[GBM細胞へのαCT1-NP取り込み分析]
αCT1-NPの細胞内への取り込みは、インビトロのヒトGBM細胞で評価された。細胞内のαCT1-NPの存在は、共焦点顕微鏡を用いた、i.)ローダミンB(ナノ粒子の存在)およびii.)αCT1ペプチドの検出により評価される。異なる濃度(20～300μg/mLの範囲)のローダミンBで標識されたαCT1-NPを、ヒトGBMおよび正常星状膠細胞株の培地に加えた。細胞を5回PBSで洗浄し、1～24の異なる経過時点で固定し、蛍光顕微鏡で分析した。蛍光小麦胚芽凝集素(WGA)Alexa Fluor(登録商標)488が細胞膜の染色に用いて各細胞の周囲長を同定し、DAPIを用いて核を染色した。
LN229/GSCは、24時間後にRhodB-NPの強い取り込みを示した(図13)。同様に、Carilion Clinicで手術を受けた神経膠芽腫患者から単離された培養GSC(名称VTC-037)でも、RhodB-NPの強い取り込みを1時間および24時間の時点で観測した(このデータはスペースの関係上掲載されていない)。細胞内への取り込みは、4℃の場合減少した。GBM患者由来のみGSCニューロスフェアによるRhod-NPの取り込みは、高い濃度(＞250μg/mL)で見られた。ここで細胞の単離および解離はRhod-NPに対してポジティブな細胞の約50～60%で見られた。これらの調査で、PLGA-NPはNP濃度75μg/mL以上でエンドサイトーシスによる最適なGBM細胞内への取り込みを示し、GSCニューロスフェアにも透過し得ることを確認した。興味深いことに、正常ヒト星状膠細胞は、＞500μg/mLの濃度でPLGA-NPの取り込みを示した。
インビトロのNP分解を評価するために、Rhod-NP(300μg/mL)を24時間VTC-037細胞に加え、蛍光顕微鏡で21日間観測した。細胞を10日目でトリプシン処理を行い、継代培養した。ローダミンシグナルは3週間の細胞培養、および継代培養後においても検出され、それ故PLGA-NPは21日間以上完全なままであることが示された(図14)。
αCT1は、細胞内への取り込みを促進する、アンテナペディア細胞浸透ドメインを含む。それ故、細胞外でのαCT1-NPの分解が有効になり、αCT1が細胞へ取り込まれる。Alexa Fluor(登録商標)647ストレプトアビジンを用いた染色は、細胞中のビオチンタグの付いたαCT1の存在を共焦点顕微鏡によって評価し、アンテナペディアドメインがαCT1ペプチドを内在化する効率を確認するために用いられた。αCT1-NPに1日暴露させた後、洗浄し、新しい培地を追加すると、αCT1がヒトGBM細胞中インビトロで少なくとも4日間検出され得る(図15)。C末端Cx43抗体での染色により、ポジティブなαCT1染色が確認された。
実施例4. αCT1-NPの治療への応用
TMZ治療に対して脳腫瘍を感作させるαCT1ロード生分解性粒子のインビボ治療薬が評価された。マウス脳におけるαCT1-NPの生体内分布を評価し、続いて異種移植GBMモデルにおいてTMZと組み合わせたαCT1-NPのマイクロインジェクションおよび治療効果を分析した。
[結果]
マイクロインジェクションで投与された、生分解性無菌αCT1ロードPLGAナノ粒子は、注射部位の近くで検出され、毒性を伴わないことが分かった。TMZ治療と組み合わせたαCT-NPの腫瘍内投与は、GBMマウスモデルにおいて有意に腫瘍体積を減少させる有効性を示した。
[マウス脳内のαCT1-NP分布評価]
ローダミンB(濃度1mg/mL)で標識されたビオチンタグ付きαCT1-NP(3μL)を、マイクロインジェクションポンプを用いてマウス脳内に注入した。非標識NPをネガティブコントロールとして注入した。マウスの脳を1日後および1週間後に回収した。脳を回収し、スクロースで凍結保護して凍結した後、OCTで包埋した。さらに、他の臓器(肺、心臓、および肝臓など)から得た血液および組織を別の分析のために回収した。Rhod-NPは、1日後および1週間後の注射部位に近い脳の切片で検出された(このデータはスペースの関係上掲載されていない)。処置したマウスにおいて決定的に有害な反応は観測されなかった。これは神経生体行動評価における変化も、αCT1 PLGA-NP投与に伴う神経有害性または全身有害性も認められなかったことをいう。
[異種移植GBMマウスモデルにおけるαCT1-NPの効果]
インビボでの安全性およびαCT1-NPの有効性を評価するために、GBMのマウス異種移植モデルを用いた。U87MG GBM細胞を培養し、1x106細胞をMatrigel(登録商標)マトリックス(100μL)と混合し、麻酔したSCID/beigeマウスの側腹部に23ゲージ針を用いて皮下注射した。8日後、ネズミを2つのグループ:(i)TMZのみ、および(ii)TMZ+αCT1粒子に分けた。治療レジメンは次の通りに行った。TMZ(7.5mg/kg)を腹腔内注射により投与し、グループ1および2の両方のマウスに対して、インスリン注射を8日目から隔日で行った。-80℃で保管したαCT1粒子を1倍のPBSに再溶解して、100μLずつに調製し、-20℃で保管した。粒子の1回投与量(100μL)で送達されるαCT1の濃度は、1.2mg(粒子)/kg(マウス体重)で、約8μMであった。インスリン注射を用いたグループ2のマウスに対し、腫瘍増殖部位にαCT1粒子を10日目から隔日で投与した。グループ2のマウスは、治療期間に合計6回の粒子の注射を受けた。この治療レジメンは、13日間続いた。腫瘍の大きさをノギスを用いて隔日で測定した。腫瘍体積を計算した((長さx幅2)/2)。TMZ+αCT1-NPでの治療により、有意な腫瘍体積の減少が見られた(図16)。
PLGA-NP製剤開発、および生体外モデルにおけるインビトロおよびインビボでの投与研究の結果は、GBM細胞へのαCT1の持続的かつ制御された送達のためのαCT1-NPを開発する可能性、およびαCT1-NPの治療可能性を支持するものである。
まとめると、捕捉するためのC末端のCx43抗体(1μg/mL)、および検出するためのHRPタグの付いたニュートラアビジンを用いて、高感度かつ高い特異性を有するαCT1サンドイッチELISA(＞90%)を特別に開発し、検証した。GBM患者への対流強化輸送法(CED)に必要な特性を備えた生分解性αCT1ロードポリ(ラクト-コ-グリコール酸)(PLGA)ナノ粒子(NP)を開発、最適化および検証した(直径＜150nm±40であり、αCT1放出プロファイルが制御され、持続する(＞3週間)、FDA承認済みコポリマー)。αCT1がロードされたナノ粒子(αCT1-NP)は、ヒトGBM細胞株ならびにGSCニューロスフェアにより効率的に吸収され、NPが21日以上検出され得ることが確認された。齧歯類におけるインビボの体内分布の調査では、NPの存在が、注射部位に近い脳内においてより長く、少なくとも1週間確認された。αCT1-NPの有効性がマウス異種移植GBMモデルにおいてインビボで確認された。ここでTMZと組み合わせたαCT-NPが有意にGBM腫瘍の悪化を減少させた。
本発明は、上記に示した特定の実施態様と組み合わせて説明される一方、その多くの代替法、改変法およびその他のバリエーションは当業者に明らかであろう。そのようなあらゆる代替法、改変法およびバリエーションは、本発明の精神および範囲内とすることが意図される。
本明細書で引用または参照または開示したあらゆる文献は、あらゆる目的に応じてその全てが参照として組み込まれる。

Claims (77)

1以上の生分解性または生体適合性ポリマー、および治療上有効量のSEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含むナノ粒子を、1以上包含する組成物。
該ペプチドが、さらに細胞内輸送配列を有する、請求項1の組成物。
該細胞内輸送配列が、アンテナペディア、TAT、HIV-Tat、ペネトラチン、Antp-3A(Antp変異体)、ブフォリンII、トランスポータン、MAP(モデル両親媒性ペプチド)、K-FGF、Ku70、プリオン、pVEC、Pep-1、SynB 1、Pep-7、HN-1、BGSC(ビス-グアニジウム-スペルミジン-コレステロール)およびBGTC(ビス-グアニジウム-トレン-コレステロール)からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列を有する、請求項2の組成物。
該ペプチドが、SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有する、請求項1～3のいずれか一項の組成物。
1以上の該生分解性または生体適合性ポリマーが、ポリ(カプロラクトン)(PCL)、エチレン酢酸ビニルポリマー(EVA)、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(L-乳酸)(PLLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸・グリコール酸共重合体)(PLGA)、ポリ(L-乳酸・グリコール酸共重合体)(PLLGA)、ポリ(D,L-ラクチド)(PDLA)、ポリ(L-ラクチド)(PLLA)、ポリ(D,L-ラクチド・カプロラクトン共重合体)、ポリ(D,L-ラクチド・カプロラクトン・グリコリド共重合体)、ポリ(D,L-ラクチド・PEO・D,L-ラクチド共重合体)、ポリ(D,L-ラクチド・PPO・D,L-ラクチド共重合体)、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ-L-リシン(PLL)、ヒドロキシプロピルメタクリレート(HPMA)、ポリエチレングリコール、ポリ-L-グルタミン酸、ポリ(ヒドロキシ酸)、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ(エステルアミド)、ポリアミド、ポリ(エステルエーテル)、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアルキレンオキシド(PEO)、ポリエチレンテレフタラート、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルエーテル、ポリ(酢酸ビニル)、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリシロキサン、ポリスチレン、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(イソブチルメタクリレート)、ポリ(ヘキシルメタクリレート)、ポリ(イソデシルメタクリレート)、ポリ(ラウリルメタクリレート)、ポリ(フェニルメタクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)、ポリ(オクタデシルアクリレート)、ポリジオキサノン、ポリジオキサノンコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリ(オルト)エステル、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)、ポリ(ラクチド・カプロラクトン共重合体)、トリメチレンカーボネート、ポリ(N-アクリロイルモルホリン)(PAcM)、ポリ(2-メチル-2-オキサゾリン)(PMOX)、ポリ(2-エチル-2-オキサゾリン)(PEOZ)、およびポリグリセロールからなる群から選択される、請求項1～4のいずれか一項のナノ粒子組成物。
1以上の生分解性または生体適合性ポリマーが、PLGAである、請求項5のナノ粒子組成物。
1以上の生分解性または生体適合性ポリマーが、PLGAおよびPVAである、請求項6のナノ粒子組成物。
ナノ粒子の平均の直径が、約10nm～約1000nmの間である、前述の請求項のいずれか一項のナノ粒子組成物。
ナノ粒子の平均の直径が、約30nm～約500nmの間である、請求項8のナノ粒子組成物。
ナノ粒子の平均の直径が、約100nm～約300nmの間である、請求項9のナノ粒子組成物。
ナノ粒子の平均の直径が、約100nm～約200nmの間である、請求項10のナノ粒子組成物。
ナノ粒子の平均の直径が、約180nmである、請求項11のナノ粒子組成物。
PLGAが、約7,000～約17,000DaのMWを有する、請求項6または7のナノ粒子組成物。
PLGAが、乳酸:グリコール酸(酸末端)＝50:50である、請求項6、7、または13のナノ粒子組成物。
PVAが、約13,000～約23,000DaのMWを有する、請求項7または8のナノ粒子組成物。
PVAの量が、約0.05%(w/v)～約5%(w/v)の間である、請求項7のナノ粒子組成物。
PVAの量が、約0.3%(w/v)～約2.5%(w/v)の間である、請求項8のナノ粒子組成物。
PLGAの量が、約2%(w/v)～約10%(w/v)の間である、請求項6のナノ粒子組成物。
SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有するペプチドの平均量が、ナノ粒子組成物1mgに対して少なくとも約500ngである、請求項6のナノ粒子組成物。
さらに抗凍結剤を含む、前述の請求項のいずれか一項のナノ粒子組成物。
抗凍結剤が、スクロース、トレハロース、デキストロース、またはソルビトールである、請求項20のナノ粒子組成物。
ナノ粒子が、約0mV～約-30mVの間のゼータ電位を特徴とする表面電荷を有する、前述の請求項のいずれか一項のナノ粒子組成物。
ナノ粒子が、約0.120～約0.350の多分散度(PDI)を有する、前述の請求項のいずれか一項のナノ粒子組成物。
ナノ粒子が、さらに酸化亜鉛またはカルシウムを含む、前述の請求項のいずれか一項のナノ粒子組成物。
ナノ粒子1μgに対して、ペプチドのロードが約10ng以上である、前述の請求項のいずれか一項のナノ粒子組成物。
ナノ粒子1μgに対して、ペプチドのロードが約100ng以上である、請求項25のナノ粒子組成物。
ナノ粒子が、実質的に以下:
24時間後に、封入されたペプチド全体の約5%～60%を放出し、
21日後に、封入されたペプチド全体の約50%～100%を放出する
パターンに対応する、制御されたペプチドの放出プロファイルを示す、前述の請求項のいずれかのナノ粒子組成物。
請求項1～27のいずれか一項のナノ粒子組成物および1以上の医薬的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬製剤。
該製剤が注射用液体製剤である、請求項28の医薬製剤。
1以上の医薬的に許容される担体または賦形剤が、無菌希釈剤(例えば注射の水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、塩化ナトリウム等張液)、固定油(例えばスクアレン、スクアラン、鉱油、モノオレイン酸マンニド、コレステロール、および/または溶媒または懸濁溶媒として機能し得る合成モノグリセリドまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の溶媒)、抗菌剤(例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン)、抗酸化剤(例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム)、キレート剤(例えばエチレンジアミンテトラ酢酸)、緩衝液(例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩)、および浸透圧の調整に用いる試薬(例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース)である、請求項28または29の医薬製剤。
さらに希釈剤(例えば緩衝液)、抗酸化剤(例えばアスコルビン酸)、糖(例えばグルコース、スクロースまたはデキストリン)、キレート剤(例えばEDTA、およびグルタチオン)を含む、請求項28～30のいずれか一項の医薬製剤。
1以上の医薬的に許容される担体または賦形剤が、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、着色剤(色素)、軟化剤、乳化剤、充填剤(希釈剤)、フィルム形成剤またはコーティング剤、香味剤、滑剤(流動促進剤)、滑沢剤、防腐剤、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和水からなる群から選択される、請求項28の医薬製剤。
1以上の医薬的に許容される担体または賦形剤が、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチノール、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン(トウモロコシ)、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンA、ビタミンE(αトコフェロール)、ビタミンC、およびキシリトールからなる群から選択される、請求項28または32の医薬製剤。
製剤が、エアロゾル、クリーム、発泡体、エマルジョン、ゲル、液体、ローション、パッチ、粉末、固体、スプレー、またはその任意の組み合わせの形態である、請求項28の医薬製剤。
皮下、皮内、筋肉内、腫瘍内、または静脈内注射による投与用に製剤化される、請求項28の医薬製剤。
請求項1～27のいずれか一項のナノ粒子組成物を含む、局所製剤。
さらに緩衝剤を含む、請求項36の局所製剤。
該緩衝剤が、リン酸緩衝液である、請求項37の局所製剤。
請求項1～27のナノ粒子組成物の製造方法であって、
(a) 有機溶媒に溶解した1以上の生分解性または生体適合性ポリマーを含む第1溶液を、第1水性溶媒に溶解したSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有する第2溶液と混合し;
(b) ステップ(a)の混合物をエマルジョン化し;
(c) ステップ(b)のエマルジョンを、第2水性溶媒に溶解した1以上の生分解性または生体適合性ポリマーを含む第2溶液に加え;
(d) 有機溶媒を除去し;および
(e) (d)の生成物を適宜精製する
ステップを特徴とする、方法。
(d)または(e)の生成物を凍結および/または凍結乾燥するステップ(f)をさらに含む、請求項39の方法。
ステップ(d)が、(c)の混合物から有機溶媒を除去するのに十分な時間撹拌することで行われる、請求項39または40の方法。
混合物から有機溶媒を除去するのに十分な時間が、約1分～約10時間である、請求項41の方法。
混合物から有機溶媒を除去するのに十分な時間が、約3時間である、請求項42の方法。
ステップ(d)が、回転蒸発により行われる、請求項39または請求項40の方法。
ステップ(a)が、ソニケーションする間に行われる、請求項39～44のいずれか一項の方法。
ステップ(c)が、ボルテックスする間に行われる、請求項39～44のいずれか一項の方法。
ステップ(c)の生成物が、ステップ(d)の前にソニケーションされる、請求項39～46のいずれか一項の方法。
ステップ(e)の精製が、(d)の生成物を洗浄することにより行われる、請求項39～47のいずれか一項の方法。
ステップ(c)～(f)のいずれか1つの生成物が滅菌されている、請求項39～48のいずれか一項の方法。
ステップ(a)の生分解性または生体適合性ポリマーがPLGAである、請求項39～49のいずれか一項の方法。
ステップ(c)の生分解性または生体適合性ポリマーがさらにPVAを含む、請求項39～50のいずれか一項の方法。
有機溶媒が酢酸エチルである、請求項39～51のいずれか一項の方法。
第1水性溶媒および第2水性溶媒が水である、請求項39～52のいずれか一項の方法。
請求項1～27のナノ粒子組成物の製造方法であって、
(a)i. SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列および水混和性有機溶媒に溶解した1以上の生分解性または生体適合性ポリマー;および
ii. 貧溶媒を用意し;
(b) SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列および水混和性有機溶媒に溶解した1以上の生分解性または生体適合性ポリマーを、ナノ粒子組成物が形成されるように貧溶媒と共に混合し;および
(c) (b)の生成物を適宜精製することを特徴とする、方法。
(b)または(c)の生成物を凍結および/または凍結乾燥するステップ(d)をさらに含む、請求項54の方法。
ジェットミキサーで混合が行われる、請求項54の方法。
該ジェットミキサーが、2ジェットミキサーまたは4ジェットミキサーである、請求項56の方法。
ジェットミキサーが2ジェットミキサーである、請求項57の方法。
ジェットミキサーが4ジェットミキサーである、請求項57の方法。
該水混和性有機溶媒がDMSOである、請求項39～59のいずれか一項の方法。
該貧溶媒が水である、請求項39～60のいずれか一項の方法。
ステップ(a)の生分解性または生体適合性ポリマーがPLGAである、請求項39～61のいずれか一項の方法。
ステップ(a)の生分解性または生体適合性ポリマーが、さらにPVAを含む、請求項62の方法。
該アミノ酸配列のナノ粒子カプセル化効率が約20%以上である、請求項54～63のいずれか一項の方法。
該アミノ酸配列のナノ粒子カプセル化効率が約65%以上である、請求項54～63のいずれか一項の方法。
局所用製剤の製造方法であって、
a) プロピレングリコール、グリセリン、メチルパラベンおよびプロピルパラベンを、パラベンが完全に溶解するまで混合し;
b) 別の容器中、精製水、EDTA、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムおよびD-マンニトールを透明溶液が得られるまで混合し;
c) a)の溶液をb)の溶液に加え、a)の溶液の容器を精製水で濯ぎ、その濯いだ溶液を混合溶液に加え、混合溶液が視覚的に均一になるまで混合し;
d) ホモジナイザーで混合しながら、ヒドロキシエチルセルロースをc)の混合溶液に加え、ポリマーが十分に分散するまで混合し;
e) 別の容器中、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を精製水でペプチドが完全に溶解するまで混合し;
f) e)の溶液をd)の溶液に加え、e)の溶液の容器を精製水で濯ぎ、その濯いだ溶液を混合溶液に加え、混合溶液が均一になるまで混合することを特徴とする、方法。
治療上有効量の請求項28～35の医薬製剤を、がん治療が必要な患者に対して投与することを特徴とする、がんの治療方法。
該がんが、神経膠腫、リンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン疾患、骨髄性白血病、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頸部の扁平上皮細胞がん、腎臓がん、肺がん(例えば小細胞肺がんおよび非小細胞性肺がん)、神経芽腫、神経膠芽腫、卵巣がん、前立腺がん、皮膚がん、肝臓がん、黒色腫、口腔、咽頭、喉頭、および肺の扁平上皮細胞がん、結腸がん、子宮頸がん、子宮頸部腫瘍、乳がん、および上皮性がん、腎臓がん、泌尿生殖器がん、肺がん、食道がん、頭頸部がん、大腸がん、造血がん、精巣がん、結腸がんおよび直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、横紋筋肉腫、脊髄腫瘍、および骨がん(例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、多発性骨髄腫および骨巨細胞種)からなる群から選択される、請求項67の方法。一部の実施態様において、がんは、神経膠腫である。一部の実施態様において、神経膠腫は、神経膠芽腫である。
該がんが神経膠腫である、請求項68の方法。
該神経膠腫が神経膠芽腫である、請求項69の方法。
医薬製剤を皮下、皮内、筋肉内、腫瘍内、または静脈内注射によって患者に投与する、請求項67～70のいずれか一項の方法。
医薬製剤が、腫瘍内注射により投与される、請求項71の方法。
さらに化学療法剤を投与することを特徴とする、請求項67～72のいずれか一項の方法。
化学療法剤が、サポリン、リシン、アブリン、臭化エチジウム、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、テモゾロミド(TMZ)、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、シスプラチン、カルボプラチン、テトラプラチン、オルマプラチン、チオプラチン、サトラプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ヘプタプラチン、イプロプラチン、トランスプラチン、ロバプラチン、マイトマイシン、プロカルバジン、ダカルバジン、アルトレタミン、ブレオマイシン、アムサクリン、メノガリル、アモナフィド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、N,N-ジベンジルダウノマイシン、エリプチシン、ダウノマイシン、ピラゾロアクリジン、イダルビシン、ミトキサントロン、m-AMSA、ビスアントレン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、デオキシドキソルビシン、エトポシド(VP-16)、エトポシドリン酸塩、オキサントラゾール(oxanthrazole)、ルビダゾン(rubidazone)、エピルビシン、ブレオマイシン、テニポシド、プリカマイジン(plicamydin)、メトトレキサート、トリメトレキサート、フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、CB3717、アザシチジン、シタラビン、フロクスウリジン、メルカプトプリン、6-チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン、アスパラギナーゼ、ヒドロキシ尿素、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびパクリタキセル(タキソール(登録商標))からなる群から選択される、請求項73の方法。
該化学療法剤が、本医薬製剤と併用して投与されない、請求項73または74の方法。
該化学療法剤が、本医薬製剤と異なる日に投与される、請求項75の方法。
請求項36～38の局所用製剤を、慢性創傷の治療に有効な投与計画において対象に投与することを特徴とする、対象の慢性創傷の治療方法。
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