JP7467512B2 - 不活性ポリペプチドｔｒｐの医薬製剤 - Google Patents
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Description
本発明は、不活性ポリペプチドＴＲＰを含む医薬製剤に関し、より詳細には、不活性ポリペプチドＴＲＰ及びリン脂質分散剤を含む医薬製剤に関する。
不活性ポリペプチド（ＴＲＰｓ：ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、骨、軟骨などの組織の形成又は再生を促進したり、或いは腎臓、肝、肺、心臓などの臓器の線維化及び硬化を解消したりできる新しいメカニズムを有する物質であり、細胞膜受容体の補助無しで細胞膜を透過可能にするＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；一つ以上のプロプロテインコンバターゼ切断部位を有し、前記プロプロテインコンバターゼにより切断されて不活性ＴＲＤ（ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を細胞内で活性化させるＦＡＤ（ｆｕｒｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；及び前記ＦＡＤのプロプロテインコンバターゼ切断によって活性化され、細胞内で組織の成長又は形成を促進したり或いは組織再生を誘導したりするＴＲＤを含有する構造を有している（大韓民国登録特許第１０－００７７５９５８号、米国特許登録第８，２６８，５９０号）。
不活性ＴＲＰは、従来に知られたｒｈＢＭＰ又はＴＧＦ－βなどのような活性タンパク質とは全く異なる構造及び特性を有している。すなわち、従来に知られたｒｈＢＭＰ類及びＴＧＦ－β類はいずれも、人体や哺乳類動物細胞に投入される前に生化学的に活性化されており、３次元構造を有している（Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２３７：２９５，１９９６；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２８７：１０３，１９９９）。
このため、従来の活性因子であるｒｈＢＭＰ類及びＴＧＦ－β類を製造するには、顕著に生産性の低いＣＨＯなどの哺乳類動物細胞組換え培養に依存しなければならないという問題があった。ＢｉｏＰｈａｒｍ社のｒｈＢＭＰ１４（ＭＰ－５２）のように、動物細胞に代えて安価の組換え大腸菌を培養して一部のｒｈＢＭＰを製造している場合があるが、この場合にも、製造しようとするＢＭＰの生化学的構造に多くの制約がある。すなわち、活性ＭＰ－５２は組換え大腸菌を用いて製造できるが、活性ｒｈＢＭＰ２、ｒｈＢＭＰ４、ｒｈＢＭＰ７などのように、骨又は軟骨の形成の促進と様々な組織の再生用に人体内に投薬できる他の活性ＢＭＰ類又は活性ＴＧＦ－β類は組換え大腸菌を用いて製造し難く、薬理的効果のためには３次又は４次構造が必要である。そのうえ、このような従来組換え成長因子は温度変化に敏感であり、室温で安定性が低いという短所がある（表１（組換え成長因子とＴＲＰとの相違点の比較）参照）。
これに対し、不活性ＴＲＰは、難溶性の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形態で存在するので、室温でも非常に高い安定性を有し、酸度変化にも非常に安定している（表１）。
しかしながら、不活性ＴＲＰを治療剤として用いるためには、ＴＲＰの難溶性による凝集及び沈殿を抑制して分散性を向上させ、また、低い細胞透過性及び高容量による投与時の細胞毒性を克服しなければならないという問題点があった。しかも、ＰＴＤを用いてタンパク質を細胞内に伝達するとき、タンパク質伝達体（ｃａｒｇｏ）のサイズが非常に制限的であり、１０ｋｄ以上のタンパク質を伝達し難い（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１２９：８９３－８９７，２０１６）。例えば、ＴＲＰではＴＲＤ及びＦＡＤがタンパク質伝達体に該当し、ＢＭＰ－２は４４．７ｋｄ、ＢＭＰ－７は４９．３ｋｄ、ＨＧＦは８３．１ｋｄであるため、ＰＴＤを用いた治療用タンパク質の細胞内への透過が非常に制限されざるを得ない。したがって、疎水性タンパク質の凝集を解決し、また、サイズの大きい伝達体の細胞内透過性を増大させるための方法を開発することにより、ＴＲＰの疾病治療効果を増大させることが可能になるであろう。
そこで、本発明者らは、不活性ＴＲＰを治療用途に使用するための新しい剤形を開発しようと鋭意努力した結果、不活性ＴＲＰを卵レシチン、大豆レシチン、トリグリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）、ＬｙｓｏＰＣ（Ｌ－α－Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）などのリン脂質分散剤と共に使用する場合に、（１）ＴＲＰの凝集が抑制され、（２）タンパク質伝達体（ｃａｒｇｏ）のサイズが大きいＴＲＰの細胞透過性が増加し、（３）細胞毒性が減少する他、（４）タンパク質の安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が増大し、さらに（５）治療効果も向上することを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、不活性ＴＲＰの凝集を抑制して分散性を確保し、タンパク質医薬品の安定性を増大させ、細胞透過性を改善することにより、治療効率を向上させることができる医薬製剤を提供することにある。
本発明の他の目的は、ＴＲＰ２及びリン脂質分散剤を含む線維化疾患治療用組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、ＴＲＰ２及びリン脂質分散剤を含む組成物を投与する段階を含む線維化疾患の治療又は予防方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、線維化疾患の治療又は予防方法のための、ＴＲＰ２及びリン脂質分散剤を含む組成物の用途を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、線維化疾患の治療又は予防用薬剤製造のための、ＴＲＰ２及びリン脂質分散剤を含む組成物の使用を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）細胞膜受容体の補助無しで細胞膜を透過可能にするＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；一つ以上のプロプロテインコンバターゼ切断部位を有し、前記プロプロテインコンバターゼにより切断されて不活性ＴＲＤ（ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を細胞内で活性化させるＦＡＤ（ｆｕｒｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；及び前記ＦＡＤのプロプロテインコンバターゼ切断によって活性化され、細胞内で組織成長又は形成を促進したり或いは組織再生を誘導するＴＲＤを含有する不活性ポリペプチドＴＲＰ；及び、（ｂ）リン脂質分散剤を含む医薬製剤を提供する。
本発明は、また、ＴＲＰ２ １００重量部に対して、リン脂質分散剤を１００～５０，０００重量部で含む線維化疾患治療用組成物を提供する。
本発明は、また、ＴＲＰ２ １００重量部に対して、リン脂質分散剤を１００～５０，０００重量部で含む組成物を投与する段階を含む線維化疾患の治療又は予防方法を提供する。
本発明は、また、線維化疾患の治療又は予防方法のためのＴＲＰ２ １００重量部に対して、リン脂質分散剤を１００～５０，０００重量部で含む組成物の用途を提供する。
本発明は、また、線維化疾患の治療又は予防用薬剤製造のためのＴＲＰ２ １００重量部に対して、リン脂質分散剤を１００～５０，０００重量部で含む組成物の使用を提供する。
特に断らない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられているものである。
本発明の不活性ポリペプチド（ＴＲＰｓ：ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、細胞膜受容体の補助無しで細胞膜を透過可能にするＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；一つ以上のプロプロテインコンバターゼ切断部位を有し、前記プロプロテインコンバターゼにより切断されて不活性ＴＲＤ（ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を細胞内で活性化させるＦＡＤ（ｆｕｒｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；及び前記ＦＡＤのプロプロテインコンバターゼ切断によって活性化され、細胞内で組織の成長又は形成を促進したり或いは組織再生を誘導するＴＲＤを含有する構造であり、骨、軟骨などの組織の形成又は再生を促進したり、或いは腎臓、肝、肺、心臓などの臓器の線維化及び硬化を解消させることができる新しいメカニズムの物質である（大韓民国登録特許第１０－００７７５９５８号、米国特許登録第８，２６８，５９０号）。
不活性ＴＲＰは、難溶性の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形態で存在し、室温でも非常に高い安定性を有し、酸度変化にも非常に安定しているが、不活性ＴＲＰを治療剤として使用するためには、ＴＲＰの難溶性による凝集及び沈殿を抑制しなければならず、低い細胞透過性、及び高容量で投与時の細胞毒性を克服しなければならないという問題点があった。
ＴＲＰは、細胞を透過して細胞質内でリフォルディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）及びプロセシングによって活性化される機序を有する物質であり、薬理効果を上げるためには、ペプチド製剤の凝集を抑制し、物理化学的均等性を確保し、ＴＲＰ２のように非常に大きい分子量（～５０ｋｄ）を有するタンパク質の細胞内透過性を増大させることが必要であった。
本発明では、不活性ＴＲＰの凝集を抑制する剤形を開発するために、様々な凝集抑制剤と分散剤を用いたＴＲＰの凝集の抑制効果を確認した結果、卵レシチン、大豆レシチン、トリグリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）、ＬｙｓｏＰＣ（Ｌ－α－Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）などのリン脂質分散剤を含有するＴＲＰ剤形が、高い凝集抑制効果を有しながら、ＴＲＰの細胞透過性を向上させ、細胞毒性を減少させる一方、ｉｎ ｖｉｖｏ効能を増加させることを確認した。
したがって、本発明は、一観点において、（ａ）細胞膜受容体の補助無しで細胞膜を透過可能にするＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；一つ以上のプロプロテインコンバターゼ切断部位を有し、前記プロプロテインコンバターゼにより切断されて不活性ＴＲＤ（ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を細胞内で活性化させるＦＡＤ（ｆｕｒｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；及び前記ＦＡＤのプロプロテインコンバターゼ切断によって活性化され、細胞内で組織成長又は形成を促進したり或いは組織再生を誘導するＴＲＤを含有する不活性ポリペプチドＴＲＰ；及び、（ｂ）リン脂質分散剤を含む医薬製剤に関する。
本発明において、前記リン脂質分散剤は、大豆レシチン、トリグリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）、ＬｙｓｏＰＣ（Ｌ－α－Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）及びクレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）からなる群から選ばれてよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記レシチンは、卵レシチン、大豆レシチン、ヒマワリ油レシチン、菜種レシチン、綿実レシチン、又は動物脂肪から抽出したレシチンなどを使用できるが、これに限定されず、好ましくは、卵レシチン又は大豆レシチンが使用でき、より好ましくは、卵レシチンを使用することができる。
本発明の一態様では、ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、動的光散乱、Ｏｔｓｕｋａ，ＥＬＳＺ－２０００Ｚｓ）と共焦点蛍光顕微鏡観察を用いてＴＲＰの凝集現象を確認した。大部分のＴＲＰ粒子は、凝集現象によって３００μｍ以上のサイズで存在し、共焦点顕微鏡上でも非常に大きい凝集体として観察された。このため、細胞内に透過される効率が低く、たいてい細胞膜の外側に存在する傾向があった（図１）。
ＴＲＰは、細胞を透過して細胞質内でリフォルディング及びプロセシングによって活性化される機序を有する物質であり、薬理効果を上げるためには、ペプチド製剤の凝集を抑制し、物理化学的均等性を確保し、ＴＲＰ２のように非常に大きい分子量（～５０ｋｄ）を有するタンパク質の細胞内透過性を増大させなければならないという必要性を確認した。
一般の細胞が１０～２０μｍのサイズを有するので、ＴＲＰを治療用途に使用するためには、５μｍ以下の均質なサイズの剤形を作ることが必須であり、患者治療用薬物学的観点では０．５μｍ以下の均質なサイズを有する剤形が好ましい。
本発明の他の態様では、既存にペプチド又は抗体を剤形化するために使用されてきた糖類やアミノ酸、硫酸アンモニウム、乳化剤を用いて、ＴＲＰ２の凝集抑制効果を確認した。既存の凝集抑制剤では、ＴＲＰ凝集抑制効果がわずかであることが確認され（表２参照）、１０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を使用した時にＴＲＰの凝集サイズが多少減る効果を確認したが、この場合にも、大部分が非常に大きいサイズで存在し、ＴＲＰは細胞内に透過されるよりは細胞膜の外部に存在した（図２）。
本発明の他の態様では、分散剤であるクレモフォール、卵レシチン、大豆レシチン、ＬｙｓｏＰＣ（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ）、グリセロールトリオレアート（Ｇｌｙｃｅｒｙｌ Ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）、ＤＯＴＡＰ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン及び大豆油を含むＴＲＰ剤形のＴＲＰ凝集抑制効果を確認し、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）乳化剤であるクレモフォール、卵レシチン、大豆レシチン、ＬｙｓｏＰＣ及びグリセロールトリオレアートがＴＲＰ２の凝集を効果的に抑制してミセル（ｍｉｃｅｌｌ）形態で維持することを確認した。しかし、既存の難溶性低分子化合物に主に使用する大豆油（ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ）は、凝集抑制効果が全くないことが確認された（表３、図２及び図３）。
本発明のさらに他の態様では、凝集抑制効果を確認したクレモフォール、卵レシチン、大豆レシチン、ＬｙｓｏＰＣ及びグリセロールトリオレアートに対して、ＴＲＰの細胞膜透過性増大効果を共焦点蛍光顕微鏡分析及び透過電子顕微鏡を用いて確認し、ＴＲＰだけを投与した細胞では、ＴＲＰがほとんど細胞膜に存在するが、乳化剤（クレモフォール、卵レシチン（ＥＬ）、大豆レシチン（ＳＬ）、ＬｙｓｏＰＣ及びグリセロールトリオレアート）が添加されたＴＲＰ２剤形では、粒子のサイズが減って概ね均質な形態を示し、細胞膜を通過して細胞質内から観察され（図４及び図５）、ＴＲＰ２剤形が凝集抑制効果による粒子サイズの減少によってＴＲＰの細胞膜透過性が非常に増大したということを確認した。このような分散剤を含有するＴＲＰ２剤形は、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）によって細胞質内部に効果的に伝達されることを確認した（図６）。
本発明のさらに他の態様では、クレモフォール又は卵レシチンを含むＴＲＰ剤形に対してＪｕｌｉＳｔａｇｅ自動細胞イメージングシステム（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて２９３Ａ細胞の細胞毒性を分析したが、分散剤を使用していない場合に、使用量（１μｇ及び５μｇ）が増加するにつれて細胞毒性を示し、卵レシチン（ＥＬ）、大豆レシチン（ＳＬ）、トリグリセリド（Ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）及びＬｙｓｏＰＣの場合は、使用量が増加しても細胞毒性を示さないことを確認した（図７）。クレモフォールでは、分散剤を使用していない場合に比べては細胞毒性が少なかったが、高容量（５μｇ）では細胞毒性を示した。したがって、卵レシチン、大豆レシチン（ＳＬ）、トリグリセリド（Ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）及びＬｙｓｏＰＣが使用に適するＴＲＰ剤形であることを確認した。
本発明のさらに他の態様では、ＴＲＰ２及び卵レシチンを含む剤形安定性を確認するために、－２０℃で凍結させた後、常温に移して静置し、時間によって凝集抑制能を維持するか否かを確認した。分散剤を含有していないＴＲＰ２の場合は、数分内に急に凝集が形成され、時間が経過するにつれて凝集塊のサイズが増加していることを確認し、卵レシチンを含有するＴＲＰ２剤形の場合は、５６日が経っても平均サイズが１５０ｎｍ以下である分散を示し、凝集抑制能が初期と同一に維持されていることを確認した（図８）。また、分散剤を含有する場合、ＴＲＰの様々な保管温度で非常に長い期間において安定している（ｓｔａｂｌｅ）ことを確認した。
本発明のさらに他の態様では、卵レシチンを様々な濃度で使用した時とＴＲＰ２の濃度を様々な濃度で使用した時に、保管条件と長期間保存による分散性が維持されることを確認した（図９及び図１０）。なお、分散剤を含むＴＲＰ２が様々な保管条件で増大した細胞内透過性が維持されることを確認した（図１１）。
本発明のさらに他の態様では、分散剤（クレモフォール、卵レシチン又は大豆レシチン）を含むＴＲＰ剤形を動物モデルに投与した時に、腹膜透析（ＰＤ，Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ Ｄｉａｌｙｓｉｓ）動物モデルにおいて、分散剤を含有するＴＲＰ２剤形のｉｎ ｖｉｖｏ効果を確認した。分散剤を含有しないＴＲＰ２に比べて、分散剤を含有する剤形が、動物モデルの腹膜線維化の抑制において、顕著に低いＥＤ５０を示すことを確認した（表５～表９、及び図１２～図１６）。
本発明の剤形は、注射用であることを特徴とし、前記卵レシチン、大豆レシチン、トリグリセリド、クレモフォールのような分散剤は、不活性ポリペプチドＴＲＰ１００重量部に対して１００～５０，０００重量部で含まれることを特徴とし、好ましくは、ＴＲＰ１００重量部に対して２００～１０，０００重量部で含まれてよく、より好ましくは、ＴＲＰ１００重量部に対して５００～５，０００重量部で含まれてよい。
本発明の不活性ＴＲＰは、ＴＲＤをコードするＤＮＡの５’の前にＦＡＤをコードする塩基配列、ＰＴＤの塩基配列、タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）のための塩基配列及び分離・精製のための４個以上のヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）をコードする塩基配列が挿入されている組換えベクター及び前記組換えベクターで形質転換されたバクテリアを培養して［ＰＴＤ－ＦＡＤ－ＴＲＤ］ポリペプチドを発現させた後、培養液に尿素溶液を加えて前記ポリペプチドの２次元及び３次元構造を除去したり或いは１次元線形構造に変形させた後、［ＰＴＤ－ＦＡＤ－ＴＲＤ］ポリペプチドを精製して製造でき、例えば、大韓民国公開特許２００６－０１０６６０６に記載された方法で製造することができる。
本発明において、前記ＴＲＤは、配列番号１～１３からなる群から選ばれるアミノ酸配列で表示されることを特徴とし得るが、細胞内で組織成長又は形成を促進したり或いは組織再生を誘導する活性を示すタンパク質である限り、その制限がない。例えば、ＢＭＰｓの他、ＴＧＦ－β遺伝子群（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）、β－ＮＧＦ（β－神経成長因子）、β－アミロイド、ＡＤＡＭｓ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｒｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｌｉｋｅ）、ＴＮＦ－α、ＭＭＰｓ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ディッコフ遺伝子（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）からなる群から選ばれるポリペプチドがそれに当たる。
本発明において、前記ＦＡＤは、配列番号１４～２６からなる群から選ばれるアミノ酸配列で表示されることを特徴とし得るが、プロプロテインコンバターゼ切断部位を有し、細胞内でプロプロテインコンバターゼにより切断されて前記ＴＲＤを活性化させる限り、その制限がない。また、前記ＰＴＤは、ＴＡＴ、ショウジョウバエ由来Ａｎｔｐペプチド、ＶＰ２２ペプチド及びｍｐｈ－１－ｂｔｍからなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明では、前記ＰＴＤとしてＴＡＴ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ：配列番号２７）を使用したが、これに限定されるものではない。例えば、ショウジョウバエ由来Ａｎｔｐペプチド、ＶＰ２２ペプチド（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８：１，Ｂｌａｃｋｂｉｒｃｈ Ｐｒｅｓｓ，２００１）、ｍｐｈ－１－ｂｔｍ（米国特許２００５／０１４７９７１）、ＰＴＤ－３、ＰＴＤ－４（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，６１，４７４－４７７）、ＴＡＴ４８－６０、ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、ポリアルギニン（ｐｏｌｙａｒｇｉｎｉｎｅ）、ＣＡＤＹ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１３，５８７－１７０２）などのようなＰＴＤを使用することもできる。また、前記タギング塩基配列でＸ－ｐｒｅｓｓのタグ（ｔａｇ）を使用したが、Ｆｌａｇ、Ｍｙｃ、Ｈａ、ＧＳＴなどを使用することもできる。
本発明に係る不活性ＴＲＰの製造方法において、前記精製段階は、前記ポリペプチドをニッケル－チタニウムビーズに結合させ、これを同一の溶液で洗浄した後、イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と高塩度緩衝溶液を用いて溶出することを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記プロプロテインコンバターゼは、フーリンであることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。例えば、ＰＣ７、ＰＣ５／６Ａ、ＰＣ５／６Ｂ、ＰＡＣＥ４、ＰＣ１／３、ＰＣ２、ＰＣ４などでよい。
本発明に係る不活性ＴＲＰは、従来の活性ＢＭＰ類が共通に有する３次元的立体規則性を有さず、それ自体では生化学的活性を有していないが、人体や哺乳類生体内に投薬される場合に、ＦＡＤのプロプロテインコンバターゼ切断部位が生体細胞内に存在するプロプロテインコンバターゼにより切断されながらＴＲＤが活性化され、前記活性化されたＴＲＤ部分が細胞外に分泌されながら期待する薬効を示すことになる。本発明に係るＴＲＰは、ＰＴＤ、ＦＡＤ及びＴＲＤが融合されているポリペプチド形態であることが好ましい。本発明に係るＴＲＰは、人体の骨、軟骨などの組織の形成又は再生を促進したり、或いは腎臓、肝、肺、心臓などの臓器の線維化及び硬化を解消させ、さらに、元の組織の再生を誘導する機能を有する。
本発明に係るＴＲＰｓは、実用的に組換え大腸菌のようなバクテリアの培養により、プロテインの生化学的構造に制約を受けない上に実用的に大量生産でき、生体に投与される前には生化学的に不活性状態を維持するので、従来に知られた類似用途の活性タンパク質（ｒｈＢＭＰ類、ＴＧＦ－β類など）に比べて、生産費用が数十分の一に止まり、分離、精製過程と取扱、保管、投薬過程が格段に簡単で便利である。
また、本発明に係る不活性ＴＲＰは、細胞膜受容体の補助無しで細胞膜を透過可能にするＰＴＤ、一つ以上のプロプロテインコンバターゼ切断部位を有し、前記プロプロテインコンバターゼにより切断されて不活性ＴＲＤを細胞内で活性化可能にさせるＦＡＤ、及び該ＦＡＤのプロプロテインコンバターゼ切断によって細胞内で活性化されて組織成長や形成又は組織再生を促進するＴＲＤを含有するポリペプチドであり、それ自体では活性を有しないが、生物体や細胞に透過された後、ほぼ全ての細胞に多量で存在するプロプロテインコンバターゼによりＦＡＤが切断されることにより、前記ＴＲＤが活性化され、活性化されたタンパク質が細胞外に分泌され、薬効を発揮する。このような、本発明に係るＴＲＰは、製造費用が高く、保管及び取扱がし難く、受容体を必須とする既存の活性ＢＭＰ類タンパク質が有する短所を全て解決することができる。
本発明に係る不活性ＴＲＰを有効成分として含有する組成物は、通常の投与方法、投与形態及び治療目的に応じて、前記有効成分を薬剤学的に許容可能な賦形剤又はマトリックスである担体と共に混合して希釈したり、或いは容器形態の担体内に封入させることが好ましい。また、他の骨欠陥治療に有益な別の薬剤と配合して使用することができる。このとき、目的とするｐＨ、等張性、安定性などを有する生理的に受容可能なタンパク質組成物の製法は、本発明の分野で従う通常の技術範囲におけるものを用いることができる。
本発明において、前記マトリックスは、生物接合性、生物分解性、機械的特性、美容的外観及び接触特性に応じて、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ハイドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリ無水物のような生物分解性及び化学的物質；骨又は皮膚コラーゲン、その他純粋タンパク質又は細胞のマトリックス成分のような生物分解性及び生物学的物質；焼結したハイドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミネート又はその他セラミックのような非生物分解性及び化学性物質；ポリ乳酸、ハイドロキシアパタイト、コラーゲン及びトリカルシウムホスフェートのような上述した物質の配合物を使用することが好ましい。ただし、これらの担体に本発明が制限されるものではない。
本発明において、賦形剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ステアリン酸マグネシウム、水、ヒドロキシ安息香酸メチル（ｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ）、ヒドロキシ安息香酸プロピル（ｐｒｏｐｙｌｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ）、タルク（ｔａｌｃ）、鉱物油などを使用することができる。
一方、本発明に係る不活性ＴＲＰを含有する組成物は、骨損傷部位に投与するために粘性型で注射したり、或いはカプセル化して使用することが好ましい。本発明に係る組成物の投与量は、使用される賦形剤やマトリックスなどの担体の種類と患者の形成された骨の重量、骨損傷部位、損傷した骨の状態、患者の年齢、性別及びダイエット、感染疑心度、投与時間及びその他臨床的要因を考慮して調節され得るので限定されないが、通常、公知された有効量は、骨の重さを考慮して適正量を連続して又は分割して投与し、骨の成長を観察しつつ追加投与を決定してもよい。
本発明のさらに他の態様では、リン脂質分散剤（クレモフォール、卵レシチン又は大豆レシチン）を含むＴＲＰ剤形を動物モデルに投与したとき、腹膜透析（ＰＤ，Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ Ｄｉａｌｙｓｉｓ）動物モデルから、分散剤を含有するＴＲＰ２剤形のｉｎ ｖｉｖｏ効果を確認した。分散剤を含有していないＴＲＰ２に比べて分散剤を含有する剤形が、動物モデルの腹膜線維化の抑制において、顕著に低いＥＤ５０を示すことを確認した（表５～表９、及び図１２～図１６）。
したがって、本発明は、他の観点において、ＴＲＰ２ １００重量部に対して、リン脂質分散剤を１００～５０，０００重量部で含む線維化疾患治療用組成物に関する。
本発明は、さらに他の観点において、ＴＲＰ２ １００重量部に対して、リン脂質分散剤を１００～５０，０００重量部で含む組成物を投与する段階を含む線維化疾患の治療又は予防方法に関する。
本発明は、さらに他の観点において、線維化疾患の治療又は予防方法のためのＴＲＰ２ １００重量部に対して、リン脂質分散剤を１００～５０，０００重量部で含む組成物の用途に関する。
本発明は、さらに他の観点において、線維化疾患の治療又は予防用薬剤の製造のためのＴＲＰ２ １００重量部に対して、リン脂質分散剤を１００～５０，０００重量部で含む組成物の使用に関する。
本発明において、前記線維化疾患は、肝線維化、筋線維化、肺線維化、腎臓線維化、心臓線維化、腹膜線維化、線維化による様々な眼科疾患などを上げることができる。このような線維化抑制効果は、慢性疾患の他にも、肝癌のような様々な癌に適用されてよい。なお、ＢＭＰ－７がＴＧＦ－ｂｅｔａ信号を抑制するので（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ２００３，９，９６４－９６８）ＰＤ１／ＰＤＬ－１抗体のような免疫関門抗癌治療剤と併せて使用することができる（Ｎａｔｕｒｅ ２０１８，５５４，５３８－５４３）。また、様々な代謝疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、炎症、高リン酸血症（ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈａｔａｍｉａ）、アルポート症候群（Ａｌｐｏｒｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のような疾患に使用されてよい。
本発明において、前記リン脂質分散剤は、レシチン、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）、トリグリセリド及びＬｙｓｏ－ＰＣ（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ）からなる群から選ばれることを特徴とし、前記レシチンは、卵レシチン又は大豆レシチンであることを特徴とし得る。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
特に、下記の実施例では、ＴＲＰを構成するＴＲＤとしてｈＢＭＰ２及びｈＢＭＰ７だけを例示するが、ｈＢＭＰ３、ｈＢＭＰ４、ｈＢＭＰ６、ｈＢＭＰ１４（ＭＰ－５２）のようなヒト由来ＢＭＰの他、ネズミ、ウシ、ブタなどのような哺乳類及びその他高等動物由来ＢＭＰも使用可能であることは、当業者には明らかであろう。ＢＭＰｓの他にも、ＴＧＦ－β遺伝子群（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）、β－ＮＧＦ（β－神経成長因子）、β－アミロイド、ＡＤＡＭｓ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｒｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ）、エクトジスプラシン－Ａ（Ｅｄａ－１）のようなＴＮＦ－α群、ＭＴ１－ＭＭＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｙｐｅ－ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）とＭＭＰ－２を含むＭＭＰｓ群、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）などのようなポリペプチドを使用することも可能であることも、当業者に明らかであろう。
また、下記の実施例では、ＴＲＰを構成するＦＡＤとしてＢＭＰのプロドメインだけを例示するが、プロプロテインコンバターゼ切断部位を有し、細胞内でプロプロテインコンバターゼにより切断されてＴＲＤを活性化させる限り、その制限がないということも当業者には明らかであろう。
また、下記の実施例では、リン脂質及び超音波を用いてＴＲＰタンパク質を噴射するが、薬物の製造に一般に用いる高圧均質器（ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）又は分散器（ｄｉｓｐｅｒｓｅｒｓ）を用いることができるということは、当業者に明らかであろう。
実施例１：ＴＲＰの凝集及び細胞透過性確認
ＴＲＰの凝集現象を確認するために、ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，動的光散乱、Ｏｔｓｕｋａ，ＥＬＳＺ－２０００Ｚｓ））と共焦点蛍光顕微鏡観察を行った。
ＴＲＰの凝集現象を確認するために、ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，動的光散乱、Ｏｔｓｕｋａ，ＥＬＳＺ－２０００Ｚｓ））と共焦点蛍光顕微鏡観察を行った。
使用したＴＲＰは、ＴＲＤとしてＢＭＰ７配列を有する下記ＴＲＰ２を使用した。
ＴＲＰ２アミノ酸配列（配列番号２８）：
形質転換大腸菌の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）から分離精製したＴＲＰ２を、ＤＬＳを用いて粒子のサイズを測定した。その結果、図１Ａに示すように、大部分のＴＲＰ粒子は凝集現象によって非常に大きくて様々な粒子サイズを示し、場合によっては３００μｍ以上のサイズで存在した。
このようなＴＲＰ２ １００ｎｇを２９３Ａ細胞に４時間処理し、細胞を１０％ホルマリンに固定し、ＴＲＰ２を観察するためにＸ－ｐｒｅｓｓ単一クローン抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｒ９１０－２５）とＡｌｅｘａ－５９４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａ３２７４４）で標識された二次抗体を用いて染色をし、共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，ＬＳＭ７００）で観察した。
その結果、図１Ｂの低倍率共焦点顕微鏡上でも非常に大きい凝集体として観察され、立体的な分布様相を調べるための多面撮影及び立体分析（Ｚ－ｓｔａｃｋｓ）を試みた。その結果、図１Ｃのように、大部分のＴＲＰ２が細胞の内部ではなく細胞膜の外部に凝集した形態で存在した。すなわち、ＴＲＰ２は細胞内に透過される効率が低く、細胞膜外側に存在する傾向があった。
ＴＲＰは、細胞を透過して細胞質内でリフォルディング及びプロセシングによって活性化される機序を有する物質であり、薬理効果を上げるためにはペプチド製剤の凝集を抑制して物理化学的均等性を確保し、ＴＲＰ２のように非常に大きい分子量（～５０ｋｄ）を有するタンパク質の細胞内透過性を増大させなければならない必要性を確認した。
実施例２：既存のペプチド及び抗体医薬品剤形を用いたＴＲＰ凝集抑制効果分析
既存にペプチドや抗体を剤形化するために使用してきた糖類やアミノ酸、硫酸アンモニウム、乳化剤を用いて、ＴＲＰ２の凝集抑制効果を確認した。
既存にペプチドや抗体を剤形化するために使用してきた糖類やアミノ酸、硫酸アンモニウム、乳化剤を用いて、ＴＲＰ２の凝集抑制効果を確認した。
このために、ＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌ濃度の組換えタンパク質ＴＲＰ２を、表２に記載の様々な分散剤の濃度で希釈して１００μｇ／ｍｌにし、室温で１時間放置した後にＤＬＳを測定した。この時、各分散剤の効果は、ＤＬＳにおいて安定した粒子の平均サイズを基準に半定量的（ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）に評価した（０，＞４ｕｍ；１＋，＜４ｕｍ；２＋，＜３ｕｍ；３＋，＜２ｕｍ；４＋，＜１ｕｍ；５＋，２５０ｎｍ）。なお、分散効果があると判断される場合に、さらにゼータ電位（Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を測定して粒子の安定性を測定した。
その結果、表３に示すように、既存の組換えタンパク質や抗体に使用する凝集抑制剤の場合、ＴＲＰ凝集抑制効果がわずかであることが確認されたし、Ｔｗｅｅｎ８０の場合、凝集効果があることが確認されたが、ゼータ電位が非常に低いため（１．６３ｍＶ）、粒子の安定性が非常に低いことを確認した。
なお、組換えタンパク質や抗体の凝集を防止するために、最も一般的な１０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を使用した場合に、ＴＲＰの凝集サイズを多少減らす効果を確認したが、この場合にも、ほとんどが非常に大きいサイズで存在し、ＴＲＰ２の主要分散剤としては使用し難いということが分かった。
実施例３：リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）乳化剤（Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）を分散剤として使用したＴＲＰ剤形の凝集抑制効果分析
乳化剤であるクレモフォールＥＬ（Ｍｅｒｃｋ，２３８４７０）、卵レシチン（ＢＯＣ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＢＳ１８Ｊ０４２１１）、大豆レシチン（ＴＣＩ，Ｌ００２３）、ＬｙｓｏＰＣ（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ）（Ａｖａｎｔｉ，８３００７１Ｐ）、グリセロールトリオレアート（Ｇｌｙｃｅｒｙｌ Ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ，Ｔ７１４０）、ＤＯＴＡＰ（Ａｖａｎｔｉ，８９０８９０Ｐ）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン（Ａｖａｎｔｉ，８８０１２８Ｐ）及び大豆油（ＣＪ第一製糖製）を含むＴＲＰ剤形のＴＲＰ凝集抑制効果を確認した。
乳化剤であるクレモフォールＥＬ（Ｍｅｒｃｋ，２３８４７０）、卵レシチン（ＢＯＣ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＢＳ１８Ｊ０４２１１）、大豆レシチン（ＴＣＩ，Ｌ００２３）、ＬｙｓｏＰＣ（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ）（Ａｖａｎｔｉ，８３００７１Ｐ）、グリセロールトリオレアート（Ｇｌｙｃｅｒｙｌ Ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ，Ｔ７１４０）、ＤＯＴＡＰ（Ａｖａｎｔｉ，８９０８９０Ｐ）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－アミン（Ａｖａｎｔｉ，８８０１２８Ｐ）及び大豆油（ＣＪ第一製糖製）を含むＴＲＰ剤形のＴＲＰ凝集抑制効果を確認した。
そのために、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ濃度である組換えタンパク質ＴＲＰ２を１０％グリセロール溶液で超音波処理し、表３に表記された様々な分散剤を分散させた後、再び弱い超音波を用いてミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）形成を誘導した。このとき、０．１％濃度の乳化剤を用いて分散乳化剤の適正濃度を確認した。ＴＲＰ２を分散させた後、１時間室温に放置して凝集を誘導し、ＤＬＳを用いて平均粒子のサイズ及び分散を確認した。なお、このような分散剤の凝集抑制効果を観察するために、走査電子顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、モデル名Ｍｅｒｌｉｎ）で観察した。
凝集抑制
その結果、表４及び図２に示すように、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）乳化剤であるクレモフォール（ＴＲＰ－Ｃｒｅ）１０％、又は０．１％の卵レシチン（ＴＲＰ２－ＥＬ）、大豆レシチン（ＴＲＰ２－ＳＬ）、ＬｙｓｏＰＣ（ＴＲＰ２－ＬｙｓｏＰＣ）及びグリセロールトリオレアート（ＴＲＰ２－Ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）を使用して分散させる場合に、ＤＬＳ上でＴＲＰ２の凝集を効果的に抑制し、平均サイズが２５０ｎｍ以下であるミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）の形態で維持し、優れた分散効果を示すことを確認した。しかし、既存の難溶性低分子化合物に主に使用する大豆油（ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ）は、凝集抑制効果がないことが確認された。
その結果、表４及び図２に示すように、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）乳化剤であるクレモフォール（ＴＲＰ－Ｃｒｅ）１０％、又は０．１％の卵レシチン（ＴＲＰ２－ＥＬ）、大豆レシチン（ＴＲＰ２－ＳＬ）、ＬｙｓｏＰＣ（ＴＲＰ２－ＬｙｓｏＰＣ）及びグリセロールトリオレアート（ＴＲＰ２－Ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）を使用して分散させる場合に、ＤＬＳ上でＴＲＰ２の凝集を効果的に抑制し、平均サイズが２５０ｎｍ以下であるミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）の形態で維持し、優れた分散効果を示すことを確認した。しかし、既存の難溶性低分子化合物に主に使用する大豆油（ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ）は、凝集抑制効果がないことが確認された。
また、図３に示すように、走査電子顕微鏡により、リン脂質乳化剤は、一定のサイズの安定した分散を直接確認することができた（ＴＲＰ２／ＴＲＰ２－ＬｙｓｏＰＣ剤形ｘ１０，０００、スケールバー１ｕｍ；その他剤形ｘ２０，０００、スケールバー２０ｎｍ）。
したがって、既存の組換えタンパク質や抗体とは違い、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）乳化剤がＴＲＰを効果的に分散させ得る凝集抑制分散剤として使用可能であることを確認した。
実施例４：分散剤を含むＴＲＰ剤形の細胞膜透過性増大効果分析
ＴＲＰは、ＢＭＰ－７の前駆体タンパク質医薬品（ｐｒｏ－ｄｒｕｇ）として開発した。したがって、ＴＲＰが効果的な薬理学的作用を示すためには、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）輸送によって細胞質内に効果的に伝達されることが非常に重要である。したがって、ＴＲＰ２の優れた分散効果を示す剤形がＴＲＰ２の細胞質内透過性を増進させることを確認しようとした。実施例３で凝集抑制効果を確認したクレモフォール、卵レシチン、大豆レシチン、ＬｙｓｏＰＣ及びグリセロールトリオレアートに対して、ＴＲＰの細胞膜透過性増大効果を共焦点蛍光顕微鏡分析を用いて確認した。そのために、卵レシチン（ＥＬ）、大豆レシチン（ＳＬ）、ＬｙｓｏＰＣ及びグリセロールトリオレアート分散剤は、０．１％の濃度となるように製造し、クレモフォール（Ｃｒｅ）は１０％を使用した。各分散剤にＴＲＰ２が１００ｕｇ／ｍｌとなるように超音波を用いて分散させ、２９３Ａ細胞に各６時間処理して固定し、実施例１のような方法でＸ－ｐｒｅｓｓ単一クローン抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｒ９１０－２５）とＡｌｅｘａ－５９４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａ３２７４４）で標識された二次抗体を用いて染色し、共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，ＬＳＭ７００）多面（ｍｕｌｔｉ－ｌａｙｅｒ）撮影及び立体分析を行った。
ＴＲＰは、ＢＭＰ－７の前駆体タンパク質医薬品（ｐｒｏ－ｄｒｕｇ）として開発した。したがって、ＴＲＰが効果的な薬理学的作用を示すためには、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）輸送によって細胞質内に効果的に伝達されることが非常に重要である。したがって、ＴＲＰ２の優れた分散効果を示す剤形がＴＲＰ２の細胞質内透過性を増進させることを確認しようとした。実施例３で凝集抑制効果を確認したクレモフォール、卵レシチン、大豆レシチン、ＬｙｓｏＰＣ及びグリセロールトリオレアートに対して、ＴＲＰの細胞膜透過性増大効果を共焦点蛍光顕微鏡分析を用いて確認した。そのために、卵レシチン（ＥＬ）、大豆レシチン（ＳＬ）、ＬｙｓｏＰＣ及びグリセロールトリオレアート分散剤は、０．１％の濃度となるように製造し、クレモフォール（Ｃｒｅ）は１０％を使用した。各分散剤にＴＲＰ２が１００ｕｇ／ｍｌとなるように超音波を用いて分散させ、２９３Ａ細胞に各６時間処理して固定し、実施例１のような方法でＸ－ｐｒｅｓｓ単一クローン抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｒ９１０－２５）とＡｌｅｘａ－５９４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａ３２７４４）で標識された二次抗体を用いて染色し、共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，ＬＳＭ７００）多面（ｍｕｌｔｉ－ｌａｙｅｒ）撮影及び立体分析を行った。
その結果、図４Ａに示すように、分散剤を使用していないＴＲＰ２は、実施例１と類似に、凝集されたタンパク質の大部分が細胞膜の外部に付着していた。２５％のグリセロールを分散剤として使用した場合、細胞質内透過が多少増加したが、殆どが細胞膜の外側に存在し、大きい効果はなかった（図４Ｂ）。しかし、実施例３で優れたタンパク質分散効果を示したリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）乳化剤である卵レシチン（ＴＲＰ２－ＥＬ）、大豆レシチン（ＴＲＰ２－ＳＬ）、グリセロールトリオレアート（ＴＲＰ２－Ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）、クレモフォール（ＴＲＰ－Ｃｒｅ）及びＬｙｓｏＰＣ（ＴＲＰ２－ＬｙｓｏＰＣ）は、細胞質内に非常に多量のタンパク質が伝達されることが確認できた（図４Ｃ～図４Ｇ）。しかし、非水溶性薬物分散のために一般に使用する大豆油は、細胞質内透過性を増加させなかった（図４Ｈ）。
また、ＴＲＰタンパク質の細胞透過性を直接確認するために、実施例１におけるようにタンパク質を２．５％酢酸ウラニル（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃２２４００）で染色し、各分散剤形を用いてタンパク質を分散させた。各分散剤形に入っている５０ｎｇのＴＲＰ２を２９３Ａ細胞に処理し、レジンに包埋して電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，ＪＥＭ１０１１）で観察した。
その結果、図５に示すように、分散剤を使用していないＴＲＰ（ＴＲＰ２）は、細胞膜外部表面に凝集した形態で存在し、分散剤形を使用した場合、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）を通じて細胞質によく伝達されたことが確認できた（赤い円で表示）。
このような結果は、クレモフォール、卵レシチン、大豆レシチン、ＬｙｓｏＰＣ及びグリセロールトリオレアートを含むＴＲＰ２剤形が、凝集抑制効果の他、ＴＲＰの細胞膜透過性を顕著に改善したことも意味する。
実施例５：分散剤を含んでいるＴＲＰ剤形のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）を用いた細胞内タンパク質伝達増大効果確認
実施例３及び実施例４から、リン脂質分散剤が凝集抑制効果の他にＴＲＰ２の細胞伝達も顕著に増大させることを確認した。なお、走査電子顕微鏡写真から、細胞質内に伝達されたＴＲＰは２層の膜構造によって囲まれていることが確認できた。このような点は、リン脂質分散剤を用いたＴＲＰ２の細胞質内への効率的伝達がエンドソーム経路を利用するであろうとの可能性を提示する。これを確認するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（励起４９４ｎｍ、放出５１９ｎｍ）タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＭＰ１０２３５）を用いて、メーカーの指示に従ってＴＲＰタンパク質に蛍光で標識した。蛍光標識されたＴＲＰは、卵レシチン（ＴＲＰ２－ＥＬ）、大豆レシチン（ＴＲＰ２－ＳＬ）、グリセロールトリオレアート（ＴＲＰ２－Ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）及びＬｙｓｏＰＣ（ＴＲＰ２－ＬｙｓｏＰＣ）を用いて、実施例４のように分散ミセルを製造した。なお、エンドソームを蛍光で確認するために、ｍＣｈｅｒｒｙ（励起５８７ｎｍ、放出６１０ｎｍ）蛍光遺伝子とエンドソームマーカーであるＲａｂ７ａ（Ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ－７ａ）遺伝子の融合発現ベクター（ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光とヒトＲａｂ７ａ遺伝子を含むｍＣｈｅｒｒｙ－Ｒａｂ７ａ発現ベクター（配列番号２９）を作製した。
実施例３及び実施例４から、リン脂質分散剤が凝集抑制効果の他にＴＲＰ２の細胞伝達も顕著に増大させることを確認した。なお、走査電子顕微鏡写真から、細胞質内に伝達されたＴＲＰは２層の膜構造によって囲まれていることが確認できた。このような点は、リン脂質分散剤を用いたＴＲＰ２の細胞質内への効率的伝達がエンドソーム経路を利用するであろうとの可能性を提示する。これを確認するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（励起４９４ｎｍ、放出５１９ｎｍ）タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＭＰ１０２３５）を用いて、メーカーの指示に従ってＴＲＰタンパク質に蛍光で標識した。蛍光標識されたＴＲＰは、卵レシチン（ＴＲＰ２－ＥＬ）、大豆レシチン（ＴＲＰ２－ＳＬ）、グリセロールトリオレアート（ＴＲＰ２－Ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）及びＬｙｓｏＰＣ（ＴＲＰ２－ＬｙｓｏＰＣ）を用いて、実施例４のように分散ミセルを製造した。なお、エンドソームを蛍光で確認するために、ｍＣｈｅｒｒｙ（励起５８７ｎｍ、放出６１０ｎｍ）蛍光遺伝子とエンドソームマーカーであるＲａｂ７ａ（Ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ－７ａ）遺伝子の融合発現ベクター（ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光とヒトＲａｂ７ａ遺伝子を含むｍＣｈｅｒｒｙ－Ｒａｂ７ａ発現ベクター（配列番号２９）を作製した。
前記作製されたｍＣｈｅｒｒｙ－Ｒａｂ７ａ発現ベクターを２９３Ａ細胞に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して発現を誘導し、４８時間後に、蛍光に標識されたＴＲＰ２ １００ｎｇを４時間処理し、共焦点顕微鏡で観察した。このとき、細胞核はＮｕｃＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮｕｃＢｌｕｅ Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｏｂｅｓ，Ｒ３７６０５）で染色した。
その結果、図６Ａに示すように、分散剤を使用していないＴＲＰ２は、非常に少ない量のＴＲＰ２が細胞質内に伝達され、しかも、それらはエンドソームマーカーであるＲａｂ７と殆ど関連がないことが分かった（スケールバー、５ｕｍ）。しかし、様々なリン脂質剤形によって分散されたＴＲＰは、実施例４と類似に、細胞質内に多い量が伝達され、Ｒａｂ７ａのような部位（ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）に存在することが分かった（図６Ｂ）。したがって、卵レシチン、大豆レシチン、グリセロールトリオレアート及びＬｙｓｏＰＣを用いたミセル分散により、既存のＴＲＰ２とは違い、エンドソームを用いてＴＲＰを細胞質内に効果的に伝達できることが分かる。
実施例６：分散剤を含んでいるＴＲＰ剤形の細胞毒成分析
実施例１及び実施例４から、非水溶性ＴＲＰタンパク質は細胞膜表面に付着して存在することが分かった。なお、実施例５から、分散剤形を用いたミセル形成は、エンドソームによって細胞質に伝達される点が分かった。このような点は、分散剤を使用していないＴＲＰを過量投与する場合に、細胞膜を破壊するため、細胞毒性があり、分散剤形を使用する場合に、エンドソーム再使用（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ）によって細胞膜損傷がない可能性を暗示する。したがって、分散剤による細胞毒性減少効果を確認するために、各ＴＲＰ剤形に対してＪｕｌｉＳｔａｇｅ自動細胞イメージングシステム（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、２９３Ａ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｒ７０５０７）に対して細胞毒性を分析した。この時、２９３Ａ細胞を２４ウェルプレートに５，０００個の細胞を敷き、１６時間の間に細胞が付着するようにした。その後、様々な形態で分散されたＴＲＰ２を様々な濃度で処理し、細胞増殖を観察し、ＪｕｌｉＳｔａｇｅに装着された実時間顕微鏡を用いて細胞毒性を分析した。
実施例１及び実施例４から、非水溶性ＴＲＰタンパク質は細胞膜表面に付着して存在することが分かった。なお、実施例５から、分散剤形を用いたミセル形成は、エンドソームによって細胞質に伝達される点が分かった。このような点は、分散剤を使用していないＴＲＰを過量投与する場合に、細胞膜を破壊するため、細胞毒性があり、分散剤形を使用する場合に、エンドソーム再使用（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ）によって細胞膜損傷がない可能性を暗示する。したがって、分散剤による細胞毒性減少効果を確認するために、各ＴＲＰ剤形に対してＪｕｌｉＳｔａｇｅ自動細胞イメージングシステム（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、２９３Ａ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｒ７０５０７）に対して細胞毒性を分析した。この時、２９３Ａ細胞を２４ウェルプレートに５，０００個の細胞を敷き、１６時間の間に細胞が付着するようにした。その後、様々な形態で分散されたＴＲＰ２を様々な濃度で処理し、細胞増殖を観察し、ＪｕｌｉＳｔａｇｅに装着された実時間顕微鏡を用いて細胞毒性を分析した。
その結果、図７Ａに示すように、分散させていないＴＲＰ２は、約２ｃｍ２の面積を有する２４ウェル細胞培養プレートで１ｕｇ以上の高容量を処理する場合に細胞毒性を示した。しかし、０．２５％の卵レシチン（ＴＲＰ２－ＥＬ）、大豆レシチン（ＴＲＰ２－ＳＬ）、グリセロールトリオレアート（ＴＲＰ２－Ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）及びＬｙｓｏＰＣ（ＴＲＰ２－ＬｙｓｏＰＣ）は、２０ｕｇを処理した場合にも細胞毒性がなかった。ただし、１０％クレモフォールに分散したＴＲＰ２は、５ｕｇ以上を処理すると、若干の毒性を示した。したがって、卵レシチン（ＴＲＰ２－ＥＬ）、大豆レシチン（ＴＲＰ２－ＳＬ）、グリセロールトリオレアート（ＴＲＰ２－Ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）及びＬｙｓｏＰＣ（ＴＲＰ２－ＬｙｓｏＰＣ）は細胞毒性を減少させることを確認した。
実施例７：卵レシチンを含むＴＲＰ剤形の安定性確認
タンパク質医薬品において、タンパク質の安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）は、再現性、許可、安全性、薬物効果に影響を及ぼす非常に重要な課題である。既存のＴＲＰ２の安定性を確認するために、－２０℃で凍結させた後、常温に移して静置し、時間によって凝集抑制能を維持するか否か確認した。その結果、表１に記述されたＴＲＰの疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）物理化学的特性による凝集効果により、非常に短時間（１０分以内）でタンパク質凝集が起きた（図８Ａ）。
タンパク質医薬品において、タンパク質の安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）は、再現性、許可、安全性、薬物効果に影響を及ぼす非常に重要な課題である。既存のＴＲＰ２の安定性を確認するために、－２０℃で凍結させた後、常温に移して静置し、時間によって凝集抑制能を維持するか否か確認した。その結果、表１に記述されたＴＲＰの疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）物理化学的特性による凝集効果により、非常に短時間（１０分以内）でタンパク質凝集が起きた（図８Ａ）。
実施例３～５に記述された分散剤形の効果の他、タンパク質の安定性に及ぼす影響を調べるために、０．１％卵レシチンにＴＲＰ２（ＴＲＰ２－ＥＬ）を分散させ、時間別にタンパク質薬物の安定性をＤＬＳで評価した。
その結果、図８Ａに示すように、卵レシチンに分散したＴＲＰ２は、５６日間以上も非常に安定した状態を維持した。
タンパク質医薬品の安定性は、保管温度に大きい影響を受ける。このような影響性を確認するために、ＴＲＰ２を０．１％の卵レシチンに１００ｕｇ／ｍｌの濃度で分散させ、様々な保管温度及び期間による安定性を確認した。
その結果、図８Ｃに示すように、－７０℃～２５℃の様々な温度及び保管期間に、平均粒子サイズが２００ｎｍ以下である非常に安定した剤形を維持することを確認した。特に、４℃冷蔵状態では１０８日以上非常に安定した形態が持続でき、卵レシチンがＴＲＰ２タンパク質凝集を抑制する分散効果が非常に持続的で且つ安定的であることを確認した。
卵レシチン他に別の分散剤のＴＲＰ２安定性を確認するために、１０％クレモフォール、０．１％大豆レシチン（ＴＲＰ２－ＳＬ）、０．５％グリセロールトリオレアート（ＴＲＰ２－Ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）及び０．５％ ＬｙｓｏＰＣ（ＴＲＰ２－ＬｙｓｏＰＣ）を用いてＴＲＰ２を分散させ、それぞれ、分散の直後（Ｄａｙ ０）、３０日、７０日の間に４℃で冷蔵保管し、粒子の安定性をＤＬＳを用いて測定した。
その結果、図８Ｄに示すように、各剤形は、卵レシチンと類似に、７０日以上非常に安定した状態を維持することが分かった。
医薬品において、様々な濃度の卵レシチンを使用する。卵レシチンの濃度による剤形の安定性を確認するために、０．５％の卵レシチンにＴＲＰ２を１００μｇ／ｍｌの濃度で分散させ、様々な保管温度と期間によるタンパク質粒子の安定性をＤＬＳを用いて測定した。
その結果、図９に示すように、０．５％の卵レシチンを使用した時にも、０．１％卵レシチンを使用した図８Ｃの結果と極めて類似に、様々な保管条件に関係なくタンパク質分散性が安定していることが分かった。
また、タンパク質医薬品投与量による凝集抑制効果を確認するために、０．１％の卵レシチンにＴＲＰ２を１００～５００μｇ／ｍｌの様々な濃度で分散させ、４℃冷蔵状態で様々な期間の間に保管し、ＴＲＰの濃度による卵レシチンの分散性を確認した。
その結果、図１０に示すように、０．１％の卵レシチンを使用する場合、４００μｇ／ｍｌの濃度でも２０日以上非常に安定した状態を維持することが分かった。しかし、５００μｇ／ｍｌ以上のＴＲＰを使用する場合には、７日後に若干の凝集が発生することが分かった。
このような分散剤による長期保管後にもＴＲＰの細胞透過性を維持するかどうか確認しようとした。そのために、０．１％の卵レシチンに分散して１０８日間冷蔵保管されたＴＲＰ２を、２９３Ａ細胞に４時間処理し、共焦点顕微鏡で観察した。
その結果、図１１Ａに示すように、卵レシチンによって分散して１０８日間保管されたＴＲＰの細胞内透過性がそのまま維持されていることが分かった。なお、様々な濃度の卵レシチンと保管温度によるＴＲＰ２タンパク質の変性の有無を確認するために、分散タンパク質（ＴＲＰ２）と細胞に処理されたＴＲＰ２（ＴＲＰ２ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）を確認した。
その結果、図１１Ｂに示すように、様々な保管温度、卵レシチンの濃度でＴＲＰ２タンパク質は全く変成しないことが分かった。
実施例８：ＴＲＰ２剤形のｉｎ ｖｉｖｏ効果確認
分散剤（クレモフォール、卵レシチン又は大豆レシチン）を含むＴＲＰ剤形を動物モデルに投与した時に、治療効果の変化を確認した。以上の実施例から、卵レシチン、クレモフォール、大豆レシチン、グリセロールトリオレアート及びＬｙｓｏＰＣのようなリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）を含むＴＲＰ２タンパク質の分散性増大、安全性（ｓａｆｅｔｙ）、細胞透過効率増大による薬物効果増進、安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を増進させるのに優れた効果があることが確認できた。このような効果による治療効果増進を確認するために、腹膜線維化モデルを使用した。
分散剤（クレモフォール、卵レシチン又は大豆レシチン）を含むＴＲＰ剤形を動物モデルに投与した時に、治療効果の変化を確認した。以上の実施例から、卵レシチン、クレモフォール、大豆レシチン、グリセロールトリオレアート及びＬｙｓｏＰＣのようなリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）を含むＴＲＰ２タンパク質の分散性増大、安全性（ｓａｆｅｔｙ）、細胞透過効率増大による薬物効果増進、安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を増進させるのに優れた効果があることが確認できた。このような効果による治療効果増進を確認するために、腹膜線維化モデルを使用した。
動物実験のために体重２５０～２８０ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの腹腔に腹膜透析用カテーテル（Ａｃｃｅｓｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒａｔ－Ｏ－Ｐｏｒｔ，７ｆｒｘ２４” ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｃａｔｈｅｔｅｒ ｗｉｔｈ ｒｏｕｎｄ ｔｉｐ）を挿入した。手術して１週後から、対照群は２０ｍｌの生理食塩水、実験群は４．２５％高濃度のブドウ糖が含まれた腹膜透析液を毎日投与した。ＴＲＰ２剤形による腹膜線維症治療効果を確認するために、様々な容量のＴＲＰ２を腹膜透析液と混合して注入した。このとき、ＴＲＰ２タンパク質治療剤は、１週に１回投与した。腹膜透析液投与４週後に各動物を犠牲させて腹膜を採り、１０％中性ホルマリンに固定してパラフィンに包埋し、マッソンのトリクロム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色により、組織学的線維化程度を調べるために、最小３０部位で線維化の厚さを測定した。
既存の分散していないＴＲＰ２を確認した時、表５及び図１２に示すように、正常対照群（ｃｏｎ）腹膜は、約３２μｍの厚さを有するが、４週間の高濃度腹膜透析液（ＰＤＦ）を投与すれば腹膜線維化によって２３０μｍ以上と厚くなることを確認した。この過程で、既存のＴＲＰ２を混合して投与した場合、５００μｇ／ｋｇの容量において線維化が約１／２程度に減少することが分かった。
クレモフォール、卵レシチン、大豆レシチンのような分散剤による治療効果を確認するために、１０％のクレモフォール、０．１％卵レシチン、０．１％の大豆レシチンにＴＲＰ２を分散させ、様々な投与量を腹膜透析液と混合して週１回投与した。
その結果、表６～表８及び図１３～図１５に示すように、分散剤を使用する場合、ＴＲＰ２による腹膜線維化抑制効果が非常に増加することが分かった。このような分散剤によるＴＲＰ２治療効果を総合すると、表９及び図１６に示すように、５０％治療効果容量（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｄｏｓｅ ５０，ＥＤ５０）が、クレモフォール、卵レシチン及び大豆レシチンを分散剤として使用した時に治療効果がそれぞれ約３７倍、約１８倍及び約８倍増加することが分かった。
本発明に係る医薬製剤を用いると、不活性ＴＲＰの凝集抑制によって分散性が抑制され、細胞透過性が増加し、細胞毒性が減少する他に、タンパク質医薬品の安定性が増大し、治療効果も向上する効果がある。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述してきたところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施の態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
Claims (7)
- 次を含む医薬製剤；
（ａ）細胞膜受容体の助け無しで細胞膜を透過可能にするＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；一つ以上のプロプロテインコンバターゼ切断部位を有し、前記プロプロテインコンバターゼにより切断されて不活性ＴＲＤ（ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を細胞内で活性化させるＦＡＤ（ｆｕｒｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；及び前記ＦＡＤのプロプロテインコンバターゼ切断によって活性化され、細胞内で組織成長又は形成を促進したり、或いは組織再生を誘導するＴＲＤ；を含有する不活性ポリペプチドＴＲＰ；及び
（ｂ）レシチン、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）及びトリグリセリドからなる群から選ばれる分散剤；
ここで、前記不活性ポリペプチドＴＲＰは、配列番号２８のアミノ酸配列で表されるＴＲＰ２であることを特徴とする。 - 前記レシチンは、卵レシチン、大豆レシチン、ヒマワリ油レシチン、菜種レシチン、綿実レシチン及び動物脂肪由来レシチンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
- プロプロテインコンバターゼは、フーリンであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
- 経口投与用又は注射用であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
- 前記分散剤は、不活性ポリペプチドＴＲＰ１００重量部に対して１００～５０，０００重量部で含まれることを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
- 配列番号２８のアミノ酸配列で表されるＴＲＰ２ １００重量部に対して、レシチン、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）及びトリグリセリドからなる群から選ばれる分散剤を１００～５０，０００重量部で含む線維化疾患治療用組成物。
- 前記レシチンは、卵レシチン又は大豆レシチンであることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
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