CN108926535B

CN108926535B - SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂、其制备方法及用途

Info

Publication number: CN108926535B
Application number: CN201811087828.XA
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Changzhou Changji Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Changzhou Changji Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2011-02-01
Filing date: 2011-02-01
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2031-02-01
Also published as: CN102614125A; CN108926535A; CN102614125B

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种SapC‑磷脂纳米囊泡冻干制剂、其制备方法及用途。具体而言，SapC‑磷脂纳米囊泡冻干制剂的制备方法，包括下述步骤：1)制备SapC和磷脂的共同溶液：所述共同溶液含有水和有机溶剂，其中所述有机溶剂选自1‑丙醇、2‑丙醇、甲醇、叔丁醇和乙氰中的一种或多种；2)真空冷冻干燥：将步骤2)中得到的共同溶液进行真空冷冻干燥，得到SapC‑磷脂纳米囊泡冻干制剂。本发明还涉及一种SapC‑磷脂纳米囊泡注射液制剂。本发明的SapC‑磷脂纳米囊泡冻干制剂无需高温灭菌，并且粒径均匀、稳定性好。

Description

SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂、其制备方法及用途

本发明是申请号为201110034228.9的母案的分案申请，该母案的申请日为2011年02月01日，发明名称为“SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂、其制备方法及用途”。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种蛋白药物制剂，具体地，涉及一种SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂、其制备方法及用途。本发明还涉及一种SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂。

背景技术

鞘脂激活蛋白C(Saposin C，简称为SapC)是鞘脂激活蛋白家族里的成员之一，在控制溶酶体鞘脂及鞘糖脂代谢方面具有重要功能(参见Grabowski,G.A.，Gatt,S.,andHorowitz,M.(1990)Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.25，385-414；Furst，W.,and Sandhoff,K.,(1992)Biochim.Biophys.Acta 1126，1-16；Kishimoto,Y.,Kiraiwa,M.,and O’Brien,J.S.(1992)J.Lipid.Res.33，1255-1267)。进一步的研究发现，SapC是一种生物膜融合蛋白，对病理性细胞的细胞膜外层暴露的阴离子磷脂具有特殊的选择性和亲和性，在此蛋白的膜融合作用下促进了SapC对病理性细胞靶向性攻击并进一步诱导细胞调亡，因此能够抑制多种肿瘤细胞，例如神经母细胞肿瘤^[1－12]，胰腺癌^{[1－3、5－6、9、11、15]}、脑癌^{[1－3、12-14、16-20]}、肺癌^[1－3]、肝癌^[1－3]、乳腺癌^{[1－3、12、19－20]}、前列腺癌^[1－3]或白血病^{[1－3、9、11、12]}等肿瘤的细胞的生长。当SapC与一种不饱和阴离子磷脂结合反应时，蛋白质自然镶嵌于磷脂膜以形成纳米单室囊泡。

脂质囊泡是由同心脂质双分子层组成的微观囊泡，本发明中是指由两性脂质排列成以球体双分子层形式排列组成的小囊泡。在结构上，脂质体的大小形状变化不一，从长管状到球体状，其尺度范围则更在数百埃米到1毫米之间。撇开外观而言，双分子层膜一般是由封闭的同心薄层和一个可分开彼此薄层的疏水层组成的。囊泡的大小，通常直径在约20至30000nm之间。通过选择适当大小的应用于递送治疗药物的脂质体，或通过与蛋白质共价或非共价结合，可特异性地递送脂质体至某一靶组织，比如增殖的细胞群，肿瘤组织，炎症组织、感染组织以及神经系统。

一般情况下，经机械应力作用下的磷脂混合物可形成脂质囊泡。例如，目前应用于制备脂质体的方法有许多。这些包括，如它们包括溶剂透析，高压，挤压(冻融或无冻融)，逆相蒸发，简易冻融，超声处理，螯合透析，均质化处理，溶剂灌注，微乳化技术，自发形成，溶剂蒸发，高压细胞破碎技术，控制洗涤剂透析等等(参见Madden et al.,Chemistry andPhysics of Lipids,1990.Liposomes may also be formed by various processeswhich require shaking or vortexing)。

公开号为CN1735424A的中国专利申请公开了一种SapC与二油基磷脂酰丝氨酸(DOPS)组成的蛋白脂质复合纳米体(简称为SapC-DOPS纳米囊泡)。SapC-DOPS纳米囊泡是一种具有靶向性和广谱性的抗癌药物，可对诸如：胰腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、结肠癌、神经母细胞肿瘤等多种癌症进行有效治疗。另外，可特异性地靶向治疗炎症组织以及感染组织，并有助于机体免疫功能。同时，大量的动物毒理试验表明，SapC-DOPS纳米囊泡对正常细胞和组织没有显示任何急性或慢性的毒性反应。与目前国内外常用的化疗药物相比，SapC-DOPS纳米囊泡最大的优势在于安全性和靶向性。

但是，上述专利中的SapC-DOPS纳米囊泡存在以下不足：

1)大规模化灭菌的困难。需要高温灭菌，对设备的要求高。

2)脂质囊泡制备在双分子层膜的大小和数量上经常呈现非常不均匀分布，不利于大规模生产。

3)稳定性的问题。悬液中的脂质囊泡在贮存，加热以及加有不同添加剂的情况下发生聚集、融合、沉降、以及渗漏等问题。为了克服稳定性问题，脂质囊泡经常用水溶液冻干处理。但是此冻干法成本高，耗时长，并且在这样的情况下，脂质囊泡大小差异会增大，其内包的活性药物成分可能会外露。

因此，亟需制备SapC和磷脂复合物的冻干制剂，其灭菌容易、粒径均一、有利于大规模生产、并且稳定性良好。

但是，SapC是水溶性蛋白，一般用水溶液来制备冻干制剂。而磷脂是脂溶性的，一般可溶于有机溶剂中，不溶于水溶液。所以，并不容易制备SapC和磷脂复合物的冻干制剂，要克服的困难很多，例如：发现可以兼融的溶液/溶剂系统，可以使SapC和磷脂共同溶解；找到溶液/溶剂系统中合适的比例，在此比例下的溶液/溶剂系统可以用于常规的冻干操作；制备后的SapC和磷脂复合物的冻干制剂保持生物活性和物理特性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明人经过大量的实验和创造性的劳动，发现了一种溶剂体系，发明人惊奇地发现，利用此溶剂体系可以制得SapC和磷脂的共同溶液，并且合适比例的溶液/溶剂系统适用于冻干操作；制得的SapC和磷脂复合物的冻干制剂保持生物活性和物理特性。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂的制备方法，包括下述步骤：

1)制备SapC和磷脂的共同溶液：所述共同溶液含有SapC、磷脂、水和有机溶剂，其中所述有机溶剂选自1-丙醇、2-丙醇、甲醇、叔丁醇和乙氰中的一种或多种；

2)真空冷冻干燥：将步骤2)中得到的共同溶液进行真空冷冻干燥，得到SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂。

术语“共同溶液”含有SapC、磷脂、水和有机溶剂，其中所述有机溶剂选自1-丙醇、2-丙醇、甲醇、叔丁醇和乙氰中的一种或多种，并且SapC、磷脂、水和有机溶剂是互溶的，并且所述共同溶液不分相。

SapC的氨基酸序列如下：

SDVYCEVCEFLVKEVTKLIDNNKTEKEILDAFDKMCSKLPKSLSEECQEVVDTYGSSILSILLEEVSPELVCSMLHLCSG(SEQ IDNO：1)

根据本发明的任一项所述的制备方法，其中，所述磷脂选自带负电荷的磷脂，例如二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰肌醇(DOPI)和二油酰磷脂酸(DOPA)中的一种或多种。

根据本发明的任一项所述的制备方法，其中，步骤1)中水和有机溶剂的体积比水：有机溶剂为9.5：0.5至0.5：9.5；具体地，为9：1至2：8；更具体地，为9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7或2：8。

根据本发明的任一项所述的制备方法，其中，步骤1)中的所述共同溶液中，SapC的浓度为0.002－100mg/ml，磷脂的浓度为0.001－50mg/ml；具体地，SapC的浓度为0.1－10mg/ml，磷脂的浓度为0.05－5mg/ml；更具体地，SapC的浓度为0.5－5mg/ml，磷脂的浓度为0.1－2.5mg/ml。

根据本发明任一项上述的制备方法，在一个实施方案中，步骤1)中的所述共同溶液通过将SapC和磷脂加入到含有水和有机溶剂的混合溶液中得到。

根据本发明任一项上述的制备方法，在一个实施方案中，步骤1)中的所述共同溶液通过下述步骤得到：

A.制备SapC水溶液；

B.制备磷脂有机溶液：其中所用有机溶剂为选自1-丙醇、2-丙醇、甲醇、叔丁醇和乙氰中的一种或多种；也可以使用这些有机溶剂中的其中一种或多种的水溶液。

C.混合：将步骤A中制备的SapC水溶液和步骤B中制备的磷脂有机溶液相混合，得到SapC和磷脂的共同溶液。

在本发明的一个实施方案中，步骤A制得的SapC水溶液中SapC的浓度为0.1－10mg/ml，步骤B中制得的磷脂有机溶液中磷脂的浓度为0.05－5mg/ml。

在本发明的一个实施方案中，步骤A中的所述SapC水溶液含有选自无盐水、磷酸盐、乳酸盐和醋酸盐中的一种或多种，并且所述SapC水溶液的pH为4－9；可选地，将所述SapC水溶液进行除菌；可选地，所述SapC水溶液还含有药学上可接受的辅料。在本发明的一个实施方案中，SapC水溶液的pH为6.5－7.5。

在本发明的一个实施方案中，步骤A中SapC的浓度为0.5－5mg/ml。

在本发明的一个实施方案中，步骤B中磷脂的浓度为0.25－2.5mg/ml。

在本发明的一个实施方案中，所述辅料为二糖；具体地，为选自海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、半乳糖、葡萄糖和果糖中的一种或多种。

在本发明的一个实施方案中，步骤B中的磷脂选自带负电荷的磷脂，例如二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰肌醇(DOPI)和二油酰磷脂酸(DOPA)中的一种或多种。

根据本发明的任一项所述的制备方法，步骤2)中真空冷冻干燥包括冷冻、干燥、以及可选地二次干燥的步骤。具体地，包括如下步骤：

a)冷冻：开启冷凝器，以20－30℃/小时的降温速率，将步骤1)中得到的SapC和磷脂的共同溶液在(大约)－40至－45℃下进行冷冻，得到冰状制剂，并保持至少2小时；具体地，保持20－30小时；

b)干燥：开启真空器，使真空度达到1－100豪托，以3－5℃/小时的升温速率，将搁架温度升至20℃，使冰状制剂形成干燥粉剂，并保持至少8小时；

以及可选地，

c)二次干燥：以20－30℃/小时的升温速率，将搁架温度升至25－30℃，并保持至少10小时。

本发明的另一方面涉及上述任一项的制备方法制得的SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂。其中，所述纳米囊泡的直径为50－400nm，具体地，为150－250nm，更具体地，为200nm左右，例如为150－210nm、150－200nm、180-220nm、190-210nm、200-210nm或者200nm。

本发明的还一方面涉及一种SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其通过将本发明的任一项所述的SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂与无菌水或生理盐水混合制得。

在本发明的一个实施方案中，所述的SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其中，所述SapC的浓度为2－4mg/ml；具体地，为2mg/ml、3mg/ml或4mg/ml。

在本发明的一个实施方案中，所述的SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其中，所述SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂与无菌水或生理盐水混合的时间为20－30秒或少于20秒。

在本发明的一个实施方案中，所述的SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其中，所述纳米囊泡的直径为50－400nm；具体地，为150－250nm；更具体地，为200nm左右，例如例如为150－210nm、150－200nm、180-220nm、190-210nm、200-210nm或者200nm。。

在本发明的一个实施方案中，所述SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂中的纳米囊泡为单峰态、双峰态或三峰态的单室囊泡。

在本发明的一个实施方案中，所述SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂中的纳米囊泡为三维圆球、扁球或椭球形状的单室囊泡(图1)。

本发明中冷冻干化制剂在加入水溶液后(例如进行晃动混匀)可自发性形成，而无需机械的作用，由此可见该脂质囊泡及相应方法的独特性。此外，形成的冷冻干化制剂脂质囊泡群具有数年甚至更长的保质期。有鉴于此，在本发明的一些实施案例中，所属领域的技术人员可以很容易的制备基于输送或治疗的脂质囊泡，从而减少在试剂和仪器上的投资，并且还可以减少与有毒试剂的接触以及对这些试剂进行处理的成本。

此外，该注射液制剂还可包含一种或多种抗菌试剂和/或防腐剂，例如：苯甲酸钠、季铵盐、叠氮化钠、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸、棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、氯丁醇、脱氢乙酸、乙二胺、硫代甘油、苯甲酸钠、焦亚硫酸钾、山梨酸钾、亚硫酸氢钠、二氧化硫或有机汞盐。

本发明的还一方面涉及本发明任一项的SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂在制备治疗胰腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、结肠癌或神经母细胞肿瘤的药物、或者治疗炎症的药物中的用途。本发明的SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂可特异性地靶向治疗炎症组织以及感染组织,并有助于机体免疫功能。

本发明的还一方面涉及一种治疗或预防胰腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、结肠癌或神经母细胞肿瘤、或者炎症的方法。例如包括向受试者施用治疗或预防有效量的本发明的SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂或者SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂的步骤。本发明的SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂可特异性地靶向治疗炎症组织以及感染组织,并有助于机体免疫功能。

可以采用不同的给药途径进行给药，例如静脉注射、皮下注射、肌肉注射、口服或局部给药。

可以将一天的剂量在一天中一次性全部给与受试者，也可以在一天内将需要的剂量分成两个、三个、四个或更多个小剂量以合适的间隔施用。所述小剂量可以配制成单元剂量形式，例如每个单元剂量形式含有日总剂量细分适宜次数的相应量。当然，也可以以一定的时间周期施用，例如一天施用一次、两天施用一次、一周施用一次、一月施用一次、二月施用一次、三月施用一次、六月施用一次、一年施用一次、两年施用一次等。

发明的有益效果

与公开号为CN1735424A的中国专利申请中公开的SapC-DOPS纳米囊泡相比，本发明提供了一种SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂，解决了SapC-磷脂纳米囊泡稳定性不好的问题。制备方法工艺简单、方便、且冻结完全、干燥迅速、得到的药物制剂稳定性好。并且本发明的冻干制剂及其制备方法对设备的要求低，不需要昂贵的设备，并且不需要高压灭菌，只需过滤除菌，灭菌操作简单。

此外，得到的SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂中所含有的残余溶剂的量少于该冻干制剂重量的0.5－1％(w：w)。

附图说明

图1：一个单室三维球体双分子层囊泡假想模型。

图2：SapC-DOPS冻干制剂样品(样品1)。

图3：SapC-DOPS冻干制剂粉末的扫描电镜图像(样品2，20,000倍)。

图4：注射液制剂中的SapC-DOPS纳米囊泡的透射电镜图像(50,000倍)。4A：样品4；4B：样品5；4C：样品6。

图5：样品4的粒径分布图。图中近似钟形的曲线(对数正态分布曲线)为样品4的粒径分布图，曲线的中心(顶点的横坐标)为209.9nm，两条虚线的横坐标表示209±209×2.5％nm的位置。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂样品1的制备

具体步骤如下：

1)准备SapC水溶液。加入3.34克/升SapC蛋白质(长吉公司，GMP制备)和16.67克/升二糖辅料，过滤灭菌。

2)准备磷脂(DOPS)有机溶液(有机水溶液)。磷脂干粉(1克/升)溶解于80％叔丁醇(过滤灭菌)。

3)加入SapC水溶液(0.6毫升/支)于磷脂有机溶液(1.0毫升/支)，进行混合。磷脂有机溶液：SapC水溶液＝1：1(v/v)。

4)冷冻：1.6毫升/支，-40℃，6小时。

5)真空干燥：升温到25℃，6小时，干燥时间，24小时。

得到SapC：DOPS：辅料为2：1：10(重量比)的多肽蛋白－磷脂纳米囊泡冻干制剂即样品1。样品1的产品图片如图2所示。

实施例2：SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂样品2的制备

具体步骤如下：

1)准备SapC水溶液。加入3克/升SapC蛋白质(长吉公司，GMP制备)和20克/升二糖辅料，过滤灭菌。

3)加入SapC水溶液(1.0毫升/支)于磷脂有机溶液(1.0毫升/支)，进行混合。磷脂有机溶液：SapC水溶液＝0.8：1(v/v)。

4)冷冻：2.0毫升/支，-40℃，12小时。

5)真空干燥：升温到25℃，6小时，干燥时间，24小时。

得到SapC：DOPS：辅料为3：1：20(重量比)的多肽蛋白－磷脂纳米囊泡冻干制剂即样品2。

实施例3：SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂样品3的制备

具体步骤如下：

1)准备SapC水溶液。加入4克/升SapC蛋白质(长吉公司，GMP制备)和20克/升二糖辅料，过滤灭菌。

4)冷冻：2.0毫升/支，-40℃，12小时。

5)真空干燥：升温到25℃，6小时，干燥时间，24小时。

得到SapC：DOPS：辅料为6：1：30(重量比)的多肽蛋白－磷脂纳米囊泡冻干制剂即样品3。

实施例4：SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂样品4－6的制备

将实施例1－3制得的样品1－3分别进行水化，即分别加入无菌生理盐水1毫升/支，得到SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂样品4－6。

样品4－6的各成分含量如下面的表1所示。

表1：样品4－6的各成分含量

实施例5：对照样品的制备

按照授权中国专利ZL 200480001127.X中的技术方案制得对照样品。

实施例6：扫描电镜试验

试验样品：实施例2制备的样品2。

先将导电胶双面胶纸粘结在样品座上，再均匀地把实施例2制备的样品2冻干粉末样品置放在胶纸上面，清除未粘住的粉末，然后采用美国溅射离子镀膜仪(DESK IV,DentonVacuum,LLC,Moorestown,NJ)，在样品2表面镀上一层很薄的导电膜(金膜)。这样在高真空条件下(<10-4Pa)，可用扫描电子显微镜(HITACHI S-3000N,Hitachi High Tchnologies,America Inc.)对样品进行高分辨观测。

实施例2制备的样品2的扫描电镜的结果如图3所示。从图3可见，SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂样品2为均一针型形态。

实施例7：透射电镜观察实验

试验样品：实施例4制得的样品4－6。

透射电子显微影像采集自日立透射电子显微镜(Hitachi TEM)，加速电压为80kV。每一滴样品上样于一个包被了聚乙烯醇缩甲醛支持膜(200目，厚度范围在30到75nm之间，Electron Microscopy Sciences，PA)的镍网格中。在进行透射电子显微镜分析之前，该网格放置于滤纸上室温静置2小时。在高放大倍数下优化了背景，而所感兴趣的区域则在低放大倍数下进行定位(50到1000倍)。单个囊泡可以放大至50,000倍观察。应用一台双通道AMTCCD数码相机(2K×2K，16位)和合适的影像采集软件进行了透射电子显微图片的采集。结果如图4所示。

水化后的实施例SapC-磷脂纳米囊泡样品4－6均为白色透明液体，并且从图4可见，在透射电镜下，样品4(图4A)、样品5(图4B)、样品6(图4C)均呈完整圆球形的纳米囊泡，其直径尺度约为200nm。

实施例8：稳定性测试

试验样品：实施例1－4制备的样品1－6。

对照样品：按照公开号为CN1735424A的中国专利申请制备。

试验条件：静置在环境4度冰箱温度。判断不是否稳定的标准或者现象是产品是否发生如沉淀、混浊或分层等现象。

结果：冻干样品1－3在4℃冷藏条件下保持稳定性的时间均大于6个月，水化后得到的样品4－6在4℃冷藏条件下保持稳定性的时间大于14天。对照样品保持稳定性的时间小于10天。

实施例9：粒径分布测定

将实施例4制得的样品4－6，分别用PBS(pH 7.4)稀释后，采用激光粒度分析仪(Brookhaven Zeta-PALS，美国Brookhaven Instruments Co.)在24℃条件下测定，动态光散射软件数据处理，记录平均粒径及分布。

其中，实施例4制得的样品4的结果如图5所示。从图5中可见，样品4SapC-DOPS纳米囊胞的粒径分布较为均匀，平均粒径尺度为209.9纳米(接近200nm，基本上不超出150－210nm的范围)；而且粒度分散性(polydispersity)也很小，只有0.311，这说明粒径尺度基本集中在209.9nm附近。

样品5和6的粒径分布与样品4类似，平均粒径在200nm附近，基本上不超出150－210nm或者150－200nm的范围，并且粒径分布较为均匀，粒度分散性很小。

实施例10：体外药效试验

试验样品：实施例4制得的样品4－6。

对照样品1：按照公开号为CN1735424A的中国专利申请制备。

对照样品2：辅料溶媒(DOPS)。

药效测定方法：MTT法。

具体步骤如下：

1)细胞消化、计数、制成浓度为50,000个细胞/毫升的细胞悬液,96孔板中每孔加入100微升细胞悬液(每孔5,000个细胞)(所有细胞均购自ATCC)；

2)96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

3)用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100微升相应的含药培养基，同时设立阴性对照组，辅料溶媒对照组，阳性对照组；

4)96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时；

5)将96孔板进行MTT染色，λ＝490nm，测定OD值：

a.每孔加入20微升MTT(5毫克/毫升)，在培养箱继续培养4小时；

b.弃去培养基，每孔加入100微升溶解溶液(10％SDS加入0.01M HCl)溶解，37℃，5％CO₂培养箱中过夜；

c.λ＝490nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率。

结果如下面的表2所示。

表2：受试药物对肿瘤细胞体外增殖活性的影响

表2中涉及样品4－6和对照样品1的用量的单位μM均按照SapC的量计算。

从表2可见，本发明制得的样品对肿瘤细胞具有有效的抑制作用。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

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10.V.Kaimal,S.K.Holland,Z.Chu,D.D.Richardson,X.Qi,Imaging theTargeted Delivery of the Protein Saposin C to Tumors in Mice.Joint MolecularImaging Conference(September 2007)Providence,Rhode Island,USA.

11.Z.Chu,X.Qi,SapC-DOPS Nanovesicles:anticancer activity andmolecular mechanism.The World Cancer Congress(June,2008)Shanghai,China.

12.X.Qi,Novel SapC-lipid nanovesicles for targeted tumor-imaging.TheIst World Cancer Congress(June 2008)Shanghai,China.

13.Z.Chu,K.Stringer,B.Kaur,A.Chiocca,R.Takigiku,P.Correa,B.Gray,K.Y.Pak,X.Qi,Brain-Tumor Targeting and Imaging by Saposin C-AssociatedFluorescent Nanovesicles,The 2009World Molecular Imaging Congress(September2009)Montreal,Canada.

14.J.Wojton,Z.Chu,J.Hardcastle,X.Qi,B.Kaur,Enhancing therapeuticefficacy against GBM by combination treatment of oncolytic HSV-1 and SapC-DOPS,Neuroscience Poster Day(November 2009)Columbus,Ohio,USA.

15.X.Qi,Z.Chu,M.B.Palascak,R.S.Franco,K.F.Stringer,S.A.Ahmad,A NovelTargeted Biotherapeutic for Treatment of Pancreatic Cancer.36^th Annual CancerSymposium,The Society of Surgical Oncology(March 2010)St.Louis,Missouri,USA.Ann.Surg.Oncol.(2010)17(Suppl 1):S6,DOI 10.1245/s10434-009-0903-9.

16.J.Wojton,Z.Chu,J.Hardcastle,X.Qi,B.Kaur,Enhancing therapeuticefficacy against GBM by combination treatment of oncolytic HSV-1 and SapC-DOPS,Ohio State University Research Day(April 2010)Columbus,Ohio,USA.

17.X.Qi,Brain-Tumor Targeting and Therapy by Saposin C-Coupled LipidNanovesicles.The 3rd Annual World Cancer Congress(June 2010)Singapore EXPO,Singapore.

18.X.Qi,Z.Chu,,B.Kaur,A.Chiocca,B.Smith,B.Gray,K.Y.Pak,AnionicPhospholipid-Targeting Agent for Brain Tumor Imaging,The 2010 World MolecularImaging Congress(September 2010)Kyoto,Japan.

19.X.Qi,Z.Chu,M.Palascak,R.Franco,V.Kaimal,S.Holland,B.Kaur,A.Chiocca,B.Gray,K.Y.Pak,R.Takigiku,Brain Tumor-Selective Imaging and Therapyby Saposin C-Phospholipid Nanovesicles,The 2010 World Molecular ImagingCongress(September 2010)Kyoto,Japan.

20.X.Qi,Cancer-Selective Targeting and Therapy Using Saposin C-Coupled Phospholipid Nanovesicles.Nanomedicine2010(October2010)Beijing,China.

序列表

<110> 常州长吉生物技术开发有限公司

<120> SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂、其制备方法及用途

<130> IDC180224

<160> 1

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 80

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Ser Asp Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr

1 5 10 15

Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu Asp Ala Phe

20 25 30

Asp Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro Lys Ser Leu Ser Glu Glu Cys Gln

35 40 45

Glu Val Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Ile Leu Ser Ile Leu Leu Glu

50 55 60

Glu Val Ser Pro Glu Leu Val Cys Ser Met Leu His Leu Cys Ser Gly

65 70 75 80

Claims

1.一种SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂的制备方法，包括下述步骤：

1)制备SapC和磷脂的共同溶液：所述共同溶液含有SapC、磷脂、水和有机溶剂，其中所述有机溶剂选自1-丙醇和2-丙醇中的一种，或者选自1-丙醇、2-丙醇和叔丁醇中的多种；

2)真空冷冻干燥：将步骤2)中得到的共同溶液进行真空冷冻干燥，得到SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂；

其中，

所述磷脂选自二油酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰甘油和二油酰磷脂酰肌醇中的一种或多种；

步骤1)中水和有机溶剂的体积比水：有机溶剂为6：4至2：8；

步骤1)中的所述共同溶液中，SapC的浓度为0.5－5mg/ml，磷脂的浓度为0.1－2.5mg/ml。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤1)中水和有机溶剂的体积比水：有机溶剂为6：4。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤1)中水和有机溶剂的体积比水：有机溶剂为5：5。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤1)中水和有机溶剂的体积比水：有机溶剂为4：6。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤1)中水和有机溶剂的体积比水：有机溶剂为3：7。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤1)中水和有机溶剂的体积比水：有机溶剂为2：8。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤1)中的所述共同溶液通过将SapC和磷脂加入到含有水和有机溶剂的混合溶液中得到。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤1)中的所述共同溶液通过下述步骤得到：

A.制备SapC水溶液；

B.制备磷脂有机溶液：其中，所用有机溶剂为选自1-丙醇和2-丙醇中的一种，或者为选自1-丙醇、2-丙醇和叔丁醇中的多种；

9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，步骤A中制得的SapC水溶液中SapC的浓度为0.5－5mg/ml，步骤B中制得的磷脂有机溶液中磷脂的浓度为0.25－2.5mg/ml。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其中，步骤A中的所述SapC水溶液含有选自磷酸盐、乳酸盐和醋酸盐中的一种或多种，并且所述SapC水溶液的pH为4－9。

11.根据权利要求8所述的制备方法，其中，将步骤A中的所述SapC水溶液进行除菌。

12.根据权利要求8所述的制备方法，其中，步骤A中的所述SapC水溶液还含有药学上可接受的辅料。

13.根据权利要求10所述的制备方法，其中，SapC水溶液的pH为6.5－7.5。

14.根据权利要求12所述的制备方法，其中，所述辅料为二糖。

15.根据权利要求12所述的制备方法，其中，所述辅料为选自海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、半乳糖、葡萄糖和果糖中的一种或多种。

16.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤2)真空冷冻干燥包括冷冻、干燥的步骤。

17.根据权利要求16所述的制备方法，其中，还包括二次干燥的步骤。

18.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤2)真空冷冻干燥包括如下步骤：

a)冷冻：开启冷凝器，以20－30℃/小时的降温速率，将步骤1)中得到的SapC和磷脂的共同溶液在－40至－45℃下进行冷冻，得到冰状制剂，并保持至少2小时；

b)干燥：开启真空器，使真空度达到1－100豪托，以3－5℃/小时的升温速率，将搁架温度升至20℃，使冰状制剂形成干燥粉剂，并保持至少8小时。

19.根据权利要求18所述的制备方法，其中，步骤a)中，保持20－30小时。

20.根据权利要求18所述的制备方法，其中，还包括下述步骤：

21.根据权利要求1至20中任一项所述的制备方法制得的SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂。

22.一种SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其通过将权利要求21所述的SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂与无菌水或无菌生理盐水混合制得。

23.根据权利要求22所述的SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其中，所述SapC的浓度为2－4mg/ml。

24.根据权利要求22所述的SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其中，所述SapC的浓度为2mg/ml。

25.根据权利要求22所述的SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其中，所述SapC的浓度为3mg/ml。

26.根据权利要求22所述的SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其中，所述SapC的浓度为4mg/ml。

27.根据权利要求23至26中任一权利要求所述的SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其中，所述SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂与无菌水或无菌生理盐水混合的时间为20－30秒或少于20秒。

28.根据权利要求23至26中任一权利要求所述的SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其中，所述纳米囊泡的直径为50－400nm。

29.根据权利要求23至26中任一权利要求所述的SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其中，所述纳米囊泡的直径为150－250nm。

30.根据权利要求23至26中任一权利要求所述的SapC-磷脂纳米囊泡注射液制剂，其中，所述纳米囊泡的直径为200nm。

31.权利要求21所述的SapC-磷脂纳米囊泡冻干制剂在制备治疗胰腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、结肠癌或神经母细胞肿瘤的药物，或者治疗炎症、感染或神经系统疾病的药物中的用途。