JPS60243022A - インタ−リユ−キン療法に関する改良 - Google Patents
インタ−リユ−キン療法に関する改良Info
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- JPS60243022A JPS60243022A JP60075265A JP7526585A JPS60243022A JP S60243022 A JPS60243022 A JP S60243022A JP 60075265 A JP60075265 A JP 60075265A JP 7526585 A JP7526585 A JP 7526585A JP S60243022 A JPS60243022 A JP S60243022A
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- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2013—IL-2
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
〔産業上の利用分野〕
この発明はインターリューキン療法に関するも−のであ
る。 〔背景技術および発明の記載〕 インターリューキン−2(以下、1.L−2と記す)は
、1976年に初めて発見された天然の蛋白質因子であ
る。これは抗原またはレクチンにより活性化されたT細
胞から生産され、■細胞の増殖にとって必要不可欠な因
rである。種々の構造を有するI L −,2は、例え
ばマウス並ひにてながさる( gibbon ) 、ひ
とにさる(ape )およびひとのような霊長類等多く
の動物種から単離されてきた。ひとおよび他のIL−2
は、末梢血液リンパ球、扁桃リンパ球、ひ臓リンパ球、
1−細胞白血病およびT細胞ハイブリドーマ培養物のよ
うな種々の原料から精製されてきた。 前述したようにIL−2は゛r細胞の増殖にとって必要
不可欠な因子であり、これ自体は体内の免疫応答機構に
密接にかかわるものである。ir・−2は、治療」−1
無限の広がりをもつ潜在能力を有するものと思われる。 特tこ、I I−−−2は例えばHm瘍抗原に対する抗
原特異的T細胞を増殖させるものであり、これらT細胞
はl餓瘍の成長を抑制することができるので、腫瘍の治
療に有効である。また、1I−−2は、ガンマ−インタ
ーフェロンの産生を誘発し、ナチュラルキラー細胞を活
性化することが知られている。また、I L−2は、新
生物疾患、バクテリアまたはウィルス感染症、免疫不全
症、自己免疫疾患などのような免疫学上の疾患に対して
様々な適用性を有すると思われる〔ビー・ヘーハーマス
ター等、アドブ・イムノファーム(Adv、Immun
opharm、 ) 、1980年、507頁参照〕。 遺伝子工学の出現以前は、インターフェロンのような他
の天然の産生物と同様に、IL−2は少量でしか得られ
なかったゆ しかしながら、他の蛋白質(例、ガンマ−インターフェ
ロン)に関して以前に発表されたものと類似の方法体系
により、ひとIL−21Cついてのクローン遺伝子の構
造決定および表現がなされた〔ニス・タニグチ等、ネイ
チャー(Nature ) (1983年)302巻、
頁305〜3101およびヨーロッパ特許公開第915
39号(この2つの内容を引用して説明の一部とする)
参照〕。この特定のIL−2については、以下公知の1
L−2と称する。 ヌクレオチドの暗合化配列に基つき、ひとIL=2ポリ
ペプチドのアミノ酸配列、すなわち前記ネイチャー誌の
記事中第3a図で1〜153の番号付けされたアミノ酸
を含有する配列が推定されしたがって成熟したひとtt
−2は、21位のAlaから始まる133のアミノ酸で
構成されていることになる。 このひとIL−2の構造は、これまで当研究所および他
の研究所で確認されてきた。 また、組換え体DNA技術を用いて異なる構造のIL−
2を製造することも可能である。例えば、前述のヨーロ
ッパ特許公開、特にその23〜25頁で記載されている
ような、1個またはそれ以上のアミノ酸が欠けているか
、または他のアミノ酸と置き換えられている、ひとI
L−2ポリペプチドの修飾体は、ひとIL−2遺伝子に
対応する修飾を施して製造する。例えば、所望により、
システィン残基を、例えばシータス(Cetus)ヨー
ロッパ特許公開第109748号およびベルギー国特許
第898016号に記載されている(ここに、その内容
を引用して説明の一部とする)、例えばI L −2−
セリン−125のように、セリンのごとき他のアミノ酸
と置き換えることができる。 このようなインターリューキン類のさらに別の例がPC
T特許公開WO35100817に開示されており、こ
こに、その内容を引用して説明の一部とする。これらに
は、l L−2GIn −26、I L−2Phe−1
21およびIL2Stop121が含まれる。 さらに、てながさる、ひとにざるのような異なる原料由
来のI L−2が組換え体DNA技術により製造され、
またこれらの修飾体も同様の方法で製造される。また、
すでに述べたようにl L−2は天然原料から(比較的
少量ではあるが)単離されるものであり、例えば糖蛋白
質化において組み換え体DNA技術により製造される生
成物とは異なる。ざらに対立遺伝子変異体も生産される
。 また、I L −2類を、例えば誘導物質の存在下にお
いてひとの細胞を培養することにより製造することもで
きる。これらの例としては、デンマーク国特許出願第3
317/84号およびヨーロッパ特許公開第13235
9号に記載されているように、1L−2A−1、I T
−−2Δ−2、IL−2n−1、tr−−2r〜−2な
どが挙けられるが、これらの内容をここに引用して説明
の一部とする。 以下に用いる[インターリューキン」の語は、天然原料
から単離されるものであろうと、合成または生合成法に
より製造されるものであろうと、IL−2活性を有する
任意のポリペプチドを意味し、この明細書で既に記載さ
れているものを含むがこれに限定するわけてはない。こ
の発明によると、好ましいインターリューキンはひとI
L −2またはその修飾体であり、組換え体1) N
A 0:により製造されるものが好ましい。インター
リューキンを実際に使用する場合、例えば静脈注射によ
る注入が試みられてきた。これらの試みの結果、例えば
ひとit、2には5分間未満という非常に短い半減期し
かないことがわかった。充分長い作用期間をもたらすイ
ンターリューキンの持効性非経口的投与形態が明らかに
必要であるが、しがしなから、これまでのところインタ
ーリューキンに関する個々のガレヌス剤形についてはほ
とんど発表されなかった。 さらに、当研究所で実施した試みの結果、例えば静脈内
投与のような投与法でもなおI L −2活性を示すリ
ポソーム形態中に、インターリューキンを含有させ得る
ことか判明した。さらに、この発明のリポソームは半減
期がこれまでより長いものであり、受動的に、ひ臓、肺
、骨髄またはリンパ節中4こ働きかけるものである。 したがって、この発明はインターリューキンを含有する
リポソームを提供するものである。 この発明によるリポソームは、リポソーム形成物質にイ
ンターリューキンを封入することにより製造することが
できる。 リポソームは、完全に密閉された2層膜(2分子膜)で
あり、その中にインターリューキンと共に水相を含有し
ている。インターリューキンは氷山および/または膜体
中lこ存在し得る。これらは単一ラメラ小胞、または水
層により互いに分離された同心膜性二層構造体の少ラメ
ラ(少重層)または多ラメラ(多重層)小胞の形をとり
得る。 これらは多くの異なる方法で製造され得るが〔エフ・シ
ョカおよびデー・パパハショポウロス、[リポソームズ
・アンド・ゼア・ユーズイーズ・イン・バイオロジー・
アンド・メディシン(Liposomes and t
heir uses in biologyand m
edicine )コ、アナルズ・オブ・ザ・ニューヨ
ーク・アカテミー・オブ・サイエンシーズ(Ann、N
、 Y、Acacl、 Sci、 ) 3 Q 8巻、
1〜462頁(1978年)、およびアール・エル・ジ
ュリアノおよびディー・レイトン、ドラッグ・デリバリ
−・システムの[リポソームズ・アズ・ア・ドラッグ・
デリバリ−・システム(Li pos omesas
a drug delivery system )
J、189〜236頁、オックスフォード・ユニバーシ
ティ・インコーホレイテッド、ニューヨーク(1980
年)参照。これらの記載をここに引用して説明の一部と
する〕、この発明は特に興味ある特性を有するリポソー
ムを堤供するという点で好ましいものである。すなわち
、この発明の方法で製造されたリポソームは、例えばイ
ンターリューキン漏出に対して特に安定しているため、
この発明の方法は商業生産に好適なものである。 リポソーム類は、小胞壁を形成し得る種々の脂質から作
ることができる。好ましい脂質としては、天然レシチン
(例、卵または大豆レシチン)、合成レシチン、ケファ
リン類およびスフィンゴミエリン類のようなホスホリピ
ドが含まれる。別のものとしては、他のホスファチジル
コリン類、ホスファチジン酸、リソホスファチジルコリ
ン類、スフィンゴリピド類、ホスファチジルグリセリン
、カルシオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類および
セレブロシド類が用いられ得る。 レシチンの例には、西ドイツ国ハンブルク28在ルーカ
ス・マイヤー社市販のエピクロン(EPIKURONS
)がある。−例としては、次の成分を含有するものがあ
る:ホスホリピドとして、ホスファチジルコリン44〜
7%、ホスファチジルエタノールアミン22〜25%、
ホスファデジルイノジットO〜2%、脂肪酸として、飽
和:パルミチン酸9〜11%、ステアリン酸2〜496
、不飽和:リノール酸63〜67%、リルン酸5〜8%
、オレイン酸14〜18%。この例はエピクロン145
Vとして知られている。 また別の例には、エピクロン200として知られている
、次の成分から成るものかある:ホスファチジルコリン
95%以」二(例、95〜98%)および主として例え
ばオレイン酸10〜12%、リノール酸62〜65%、
リノール酸5〜6%というような不飽和酸並びに例えは
パルミチン酸15〜17%、ステアリン酸3〜496の
ような飽m酸、。 成分として不飽和酸を高率で含有するのが好ましい。所
望により、レシチンとして例えばステアリン酸のような
飽和酸を高率で含みホスファチジルコリンを9596ま
たはそれ以上含むもの、例ン〜ヤ・ホスフィチド・エフ
シー95(SOJAPHO5P■11TID Nc95
)または医薬用途に適した純粋な均等物、例えば西ドイ
ツ国ケルン在、ナラチルマン・ヘミ−・ゲゼルシャフト
・ミツト・ベシュレンクテル・ハフラング市販のものを
用い得る。 合成ホスホリピドは、ヒドロキシル基、分校状炭素鎖環
状誘導体、芳香族誘導体、エーテル類、アミド類、ポリ
不飽和誘導体、ハロゲン化誘導体のような変形脂肪族部
分、または炭水化物、グリコール、ホスフェート、ホス
ホネート、第四級アミン、スルフェート、スルホネート
、カルボキシ、アミン、メルカプトおよびイミダゾール
基を、例えばシミリストイル−、ジパルミトイル−また
はジステアロイル−ホスファトコリン誘導体の場合のよ
うに、含有してもよい。 所望により、最終的なリポソームにおいて、二層膜が例
えばコレステロールのごときステロイドのような他の脂
質を例えば50(モル)パーセントまで含んでいてもよ
い。 jl的なリポソームにおいてはコレステロールのような
ステロイドの存在する方が好ましい。脂質対ステロイド
の好適な重量比率は6:1〜1:1が適当である。 所望により、二層膜は、例えはジセチルホスフ工−ト、
ホスファチジン酸、タウロコール酸ナトリウム、ホスフ
ァチジルセリン(メルク、Merck)のごとき酸類の
ようなアニオン化合物または例えばステアリルアミンの
ごときアミン類のようなカチオン化合物等、混合率を増
加させるような添加物を10(モル)パーセントまでを
含有する、レシチン、ケファリンまたはスフィンゴミエ
リンを含んでいてもよい。ホスファチジルセリン(例西
ドイツ国メルク社より入手可能)を用いるのが好ましい
。 脂質が余分の賦形剤を含有する場合、例えば反応容器中
で、メチレンクロライドに入れた脂質と賦形剤の溶液を
濃縮し、脂質をインターリューキンと混合する前に容器
の表向に脂質フィルムを形成させるのが好ましい。 リポソームは、インターリューキンが破壊されるのを妨
げるような穏やかな条件下で例えば超音波処理のような
例えば照射による、公知技術により製造することかでき
る。脂質の均質混合物は、例えばクロロホルムのような
好適な有機溶媒に例えばレシチンやコレステロールのよ
うな脂質を溶かした溶液を形成することにより製造され
る。次いで反応容器中の溶液を濃縮して脂質フィルムを
化成する。 常套方法により、リポソームを単離し、滅菌することが
できる。 この発明により得られたリポソームにおいて、インター
リューキンの濃度は、水相1ミリリツトル中約5〜約5
00マイクログラム、好ましくは20〜200マイクロ
グラム/ミリリツトルである。 脂質濃度は、好ましくは水相1rnl中約1〜約200
m2、特に10〜100m7/rnlである。 次の処理に用いるリポソームの平均直径は、好ましくは
約25ナノメートルないし20ミクロン、特に好ましく
は100〜500ナノメートルである。 最終的なリポソームは、例えば−20℃〜」−5℃の低
温中で保管するのが好ましい。 貯臓性を改良するためには、この発明によるリポソーム
を例えば担体物質としてマンニトール、シュクロース、
ポリビニルピロリドンまたはゼラチンを用いて例えば凍
結乾燥することにより乾燥粉末にすればよい。その場合
工程Ab) に関して後述する凍結乾燥の場合と同じ条
件下で行なえばよい。使用する前に、滅菌水を加えてリ
ポソームを再構成する。次いで、このリポソームを、例
えば静脈注射液または注入液に適した系と混合する。 リポソームの純度は従来の分析技術で測定することがで
きる。 所望により、生成したリポソーム中に酸化防1L剤が例
えば脂質の1%以内好ましくは0.1%存在していても
よい。好ましい酸化防止剤には、ビタミンE(酢酸トコ
フェロール)、ビタミンC(パルミチン酸塩)およびB
HT (ブチル化ヒドロキシトルエン)がある。 他のインターリューキン安定剤として、例えばマンニト
ール、アラビノース、ソルビトールもしくはシュクロー
スなどの糖、または例えばひとセリン(血a)アルブミ
ンのようなアルブミンを用いることができる。これらの
安定剤は、リポソーム形成前に緩衝液中に混入すること
ができる。好ましくは、これらは生成したリポソーム中
脂質の20%モル重量以内で存在し得る。 好ましいリポソーム形成方法は、以下の工程からなる方
法a)である: Aa) 有機溶媒中の脂質とインターリューキンの溶液
を形成し、 Ab) 溶液から溶媒を除去して残留物を得、Ac)
緩衝液に残留物をけんだくし、Ad) IJポンームか
生成するまでけんだく液を攪拌、ホモジネート化し、そ
して Ae) リポソームを単離する。 工程Aa) において、「溶液」の語は、乳液のような
「プソイド(擬似)」溶液を包含する。しかしながら、
均質澄明な溶液を製造する方か好ましい。インターリュ
ーキンおよび脂質を溶解または可溶性にするならばいず
れの溶媒系でも用いることができる。この系は単一溶媒
でも複数の溶媒の混合物でもよい。また例えば15%以
下の水を含み得る。所望により界面活性剤か存在しても
よい。溶媒系は、濃縮lこより脂質から除去され得る適
当な有機溶媒を包含することができる。広節な種類にお
よぶジエチルエーテルやジイソプロピルエーテルのよう
なエーテル類、酢酸エチルのようなエステル類、メタノ
ールやE−ブタノールのようなアルコール類、およびメ
チレンクロライドやクロロホルムのようなハロゲン化炭
化水素類を用いることができる。所望により酢酸が存在
してもよい。ジエチルエーテル、メチレンクロライドま
たはt−ブタノールを用いるのか好ましい。 工程A、b) において、高度真空下の場合は
る。 〔背景技術および発明の記載〕 インターリューキン−2(以下、1.L−2と記す)は
、1976年に初めて発見された天然の蛋白質因子であ
る。これは抗原またはレクチンにより活性化されたT細
胞から生産され、■細胞の増殖にとって必要不可欠な因
rである。種々の構造を有するI L −,2は、例え
ばマウス並ひにてながさる( gibbon ) 、ひ
とにさる(ape )およびひとのような霊長類等多く
の動物種から単離されてきた。ひとおよび他のIL−2
は、末梢血液リンパ球、扁桃リンパ球、ひ臓リンパ球、
1−細胞白血病およびT細胞ハイブリドーマ培養物のよ
うな種々の原料から精製されてきた。 前述したようにIL−2は゛r細胞の増殖にとって必要
不可欠な因子であり、これ自体は体内の免疫応答機構に
密接にかかわるものである。ir・−2は、治療」−1
無限の広がりをもつ潜在能力を有するものと思われる。 特tこ、I I−−−2は例えばHm瘍抗原に対する抗
原特異的T細胞を増殖させるものであり、これらT細胞
はl餓瘍の成長を抑制することができるので、腫瘍の治
療に有効である。また、1I−−2は、ガンマ−インタ
ーフェロンの産生を誘発し、ナチュラルキラー細胞を活
性化することが知られている。また、I L−2は、新
生物疾患、バクテリアまたはウィルス感染症、免疫不全
症、自己免疫疾患などのような免疫学上の疾患に対して
様々な適用性を有すると思われる〔ビー・ヘーハーマス
ター等、アドブ・イムノファーム(Adv、Immun
opharm、 ) 、1980年、507頁参照〕。 遺伝子工学の出現以前は、インターフェロンのような他
の天然の産生物と同様に、IL−2は少量でしか得られ
なかったゆ しかしながら、他の蛋白質(例、ガンマ−インターフェ
ロン)に関して以前に発表されたものと類似の方法体系
により、ひとIL−21Cついてのクローン遺伝子の構
造決定および表現がなされた〔ニス・タニグチ等、ネイ
チャー(Nature ) (1983年)302巻、
頁305〜3101およびヨーロッパ特許公開第915
39号(この2つの内容を引用して説明の一部とする)
参照〕。この特定のIL−2については、以下公知の1
L−2と称する。 ヌクレオチドの暗合化配列に基つき、ひとIL=2ポリ
ペプチドのアミノ酸配列、すなわち前記ネイチャー誌の
記事中第3a図で1〜153の番号付けされたアミノ酸
を含有する配列が推定されしたがって成熟したひとtt
−2は、21位のAlaから始まる133のアミノ酸で
構成されていることになる。 このひとIL−2の構造は、これまで当研究所および他
の研究所で確認されてきた。 また、組換え体DNA技術を用いて異なる構造のIL−
2を製造することも可能である。例えば、前述のヨーロ
ッパ特許公開、特にその23〜25頁で記載されている
ような、1個またはそれ以上のアミノ酸が欠けているか
、または他のアミノ酸と置き換えられている、ひとI
L−2ポリペプチドの修飾体は、ひとIL−2遺伝子に
対応する修飾を施して製造する。例えば、所望により、
システィン残基を、例えばシータス(Cetus)ヨー
ロッパ特許公開第109748号およびベルギー国特許
第898016号に記載されている(ここに、その内容
を引用して説明の一部とする)、例えばI L −2−
セリン−125のように、セリンのごとき他のアミノ酸
と置き換えることができる。 このようなインターリューキン類のさらに別の例がPC
T特許公開WO35100817に開示されており、こ
こに、その内容を引用して説明の一部とする。これらに
は、l L−2GIn −26、I L−2Phe−1
21およびIL2Stop121が含まれる。 さらに、てながさる、ひとにざるのような異なる原料由
来のI L−2が組換え体DNA技術により製造され、
またこれらの修飾体も同様の方法で製造される。また、
すでに述べたようにl L−2は天然原料から(比較的
少量ではあるが)単離されるものであり、例えば糖蛋白
質化において組み換え体DNA技術により製造される生
成物とは異なる。ざらに対立遺伝子変異体も生産される
。 また、I L −2類を、例えば誘導物質の存在下にお
いてひとの細胞を培養することにより製造することもで
きる。これらの例としては、デンマーク国特許出願第3
317/84号およびヨーロッパ特許公開第13235
9号に記載されているように、1L−2A−1、I T
−−2Δ−2、IL−2n−1、tr−−2r〜−2な
どが挙けられるが、これらの内容をここに引用して説明
の一部とする。 以下に用いる[インターリューキン」の語は、天然原料
から単離されるものであろうと、合成または生合成法に
より製造されるものであろうと、IL−2活性を有する
任意のポリペプチドを意味し、この明細書で既に記載さ
れているものを含むがこれに限定するわけてはない。こ
の発明によると、好ましいインターリューキンはひとI
L −2またはその修飾体であり、組換え体1) N
A 0:により製造されるものが好ましい。インター
リューキンを実際に使用する場合、例えば静脈注射によ
る注入が試みられてきた。これらの試みの結果、例えば
ひとit、2には5分間未満という非常に短い半減期し
かないことがわかった。充分長い作用期間をもたらすイ
ンターリューキンの持効性非経口的投与形態が明らかに
必要であるが、しがしなから、これまでのところインタ
ーリューキンに関する個々のガレヌス剤形についてはほ
とんど発表されなかった。 さらに、当研究所で実施した試みの結果、例えば静脈内
投与のような投与法でもなおI L −2活性を示すリ
ポソーム形態中に、インターリューキンを含有させ得る
ことか判明した。さらに、この発明のリポソームは半減
期がこれまでより長いものであり、受動的に、ひ臓、肺
、骨髄またはリンパ節中4こ働きかけるものである。 したがって、この発明はインターリューキンを含有する
リポソームを提供するものである。 この発明によるリポソームは、リポソーム形成物質にイ
ンターリューキンを封入することにより製造することが
できる。 リポソームは、完全に密閉された2層膜(2分子膜)で
あり、その中にインターリューキンと共に水相を含有し
ている。インターリューキンは氷山および/または膜体
中lこ存在し得る。これらは単一ラメラ小胞、または水
層により互いに分離された同心膜性二層構造体の少ラメ
ラ(少重層)または多ラメラ(多重層)小胞の形をとり
得る。 これらは多くの異なる方法で製造され得るが〔エフ・シ
ョカおよびデー・パパハショポウロス、[リポソームズ
・アンド・ゼア・ユーズイーズ・イン・バイオロジー・
アンド・メディシン(Liposomes and t
heir uses in biologyand m
edicine )コ、アナルズ・オブ・ザ・ニューヨ
ーク・アカテミー・オブ・サイエンシーズ(Ann、N
、 Y、Acacl、 Sci、 ) 3 Q 8巻、
1〜462頁(1978年)、およびアール・エル・ジ
ュリアノおよびディー・レイトン、ドラッグ・デリバリ
−・システムの[リポソームズ・アズ・ア・ドラッグ・
デリバリ−・システム(Li pos omesas
a drug delivery system )
J、189〜236頁、オックスフォード・ユニバーシ
ティ・インコーホレイテッド、ニューヨーク(1980
年)参照。これらの記載をここに引用して説明の一部と
する〕、この発明は特に興味ある特性を有するリポソー
ムを堤供するという点で好ましいものである。すなわち
、この発明の方法で製造されたリポソームは、例えばイ
ンターリューキン漏出に対して特に安定しているため、
この発明の方法は商業生産に好適なものである。 リポソーム類は、小胞壁を形成し得る種々の脂質から作
ることができる。好ましい脂質としては、天然レシチン
(例、卵または大豆レシチン)、合成レシチン、ケファ
リン類およびスフィンゴミエリン類のようなホスホリピ
ドが含まれる。別のものとしては、他のホスファチジル
コリン類、ホスファチジン酸、リソホスファチジルコリ
ン類、スフィンゴリピド類、ホスファチジルグリセリン
、カルシオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類および
セレブロシド類が用いられ得る。 レシチンの例には、西ドイツ国ハンブルク28在ルーカ
ス・マイヤー社市販のエピクロン(EPIKURONS
)がある。−例としては、次の成分を含有するものがあ
る:ホスホリピドとして、ホスファチジルコリン44〜
7%、ホスファチジルエタノールアミン22〜25%、
ホスファデジルイノジットO〜2%、脂肪酸として、飽
和:パルミチン酸9〜11%、ステアリン酸2〜496
、不飽和:リノール酸63〜67%、リルン酸5〜8%
、オレイン酸14〜18%。この例はエピクロン145
Vとして知られている。 また別の例には、エピクロン200として知られている
、次の成分から成るものかある:ホスファチジルコリン
95%以」二(例、95〜98%)および主として例え
ばオレイン酸10〜12%、リノール酸62〜65%、
リノール酸5〜6%というような不飽和酸並びに例えは
パルミチン酸15〜17%、ステアリン酸3〜496の
ような飽m酸、。 成分として不飽和酸を高率で含有するのが好ましい。所
望により、レシチンとして例えばステアリン酸のような
飽和酸を高率で含みホスファチジルコリンを9596ま
たはそれ以上含むもの、例ン〜ヤ・ホスフィチド・エフ
シー95(SOJAPHO5P■11TID Nc95
)または医薬用途に適した純粋な均等物、例えば西ドイ
ツ国ケルン在、ナラチルマン・ヘミ−・ゲゼルシャフト
・ミツト・ベシュレンクテル・ハフラング市販のものを
用い得る。 合成ホスホリピドは、ヒドロキシル基、分校状炭素鎖環
状誘導体、芳香族誘導体、エーテル類、アミド類、ポリ
不飽和誘導体、ハロゲン化誘導体のような変形脂肪族部
分、または炭水化物、グリコール、ホスフェート、ホス
ホネート、第四級アミン、スルフェート、スルホネート
、カルボキシ、アミン、メルカプトおよびイミダゾール
基を、例えばシミリストイル−、ジパルミトイル−また
はジステアロイル−ホスファトコリン誘導体の場合のよ
うに、含有してもよい。 所望により、最終的なリポソームにおいて、二層膜が例
えばコレステロールのごときステロイドのような他の脂
質を例えば50(モル)パーセントまで含んでいてもよ
い。 jl的なリポソームにおいてはコレステロールのような
ステロイドの存在する方が好ましい。脂質対ステロイド
の好適な重量比率は6:1〜1:1が適当である。 所望により、二層膜は、例えはジセチルホスフ工−ト、
ホスファチジン酸、タウロコール酸ナトリウム、ホスフ
ァチジルセリン(メルク、Merck)のごとき酸類の
ようなアニオン化合物または例えばステアリルアミンの
ごときアミン類のようなカチオン化合物等、混合率を増
加させるような添加物を10(モル)パーセントまでを
含有する、レシチン、ケファリンまたはスフィンゴミエ
リンを含んでいてもよい。ホスファチジルセリン(例西
ドイツ国メルク社より入手可能)を用いるのが好ましい
。 脂質が余分の賦形剤を含有する場合、例えば反応容器中
で、メチレンクロライドに入れた脂質と賦形剤の溶液を
濃縮し、脂質をインターリューキンと混合する前に容器
の表向に脂質フィルムを形成させるのが好ましい。 リポソームは、インターリューキンが破壊されるのを妨
げるような穏やかな条件下で例えば超音波処理のような
例えば照射による、公知技術により製造することかでき
る。脂質の均質混合物は、例えばクロロホルムのような
好適な有機溶媒に例えばレシチンやコレステロールのよ
うな脂質を溶かした溶液を形成することにより製造され
る。次いで反応容器中の溶液を濃縮して脂質フィルムを
化成する。 常套方法により、リポソームを単離し、滅菌することが
できる。 この発明により得られたリポソームにおいて、インター
リューキンの濃度は、水相1ミリリツトル中約5〜約5
00マイクログラム、好ましくは20〜200マイクロ
グラム/ミリリツトルである。 脂質濃度は、好ましくは水相1rnl中約1〜約200
m2、特に10〜100m7/rnlである。 次の処理に用いるリポソームの平均直径は、好ましくは
約25ナノメートルないし20ミクロン、特に好ましく
は100〜500ナノメートルである。 最終的なリポソームは、例えば−20℃〜」−5℃の低
温中で保管するのが好ましい。 貯臓性を改良するためには、この発明によるリポソーム
を例えば担体物質としてマンニトール、シュクロース、
ポリビニルピロリドンまたはゼラチンを用いて例えば凍
結乾燥することにより乾燥粉末にすればよい。その場合
工程Ab) に関して後述する凍結乾燥の場合と同じ条
件下で行なえばよい。使用する前に、滅菌水を加えてリ
ポソームを再構成する。次いで、このリポソームを、例
えば静脈注射液または注入液に適した系と混合する。 リポソームの純度は従来の分析技術で測定することがで
きる。 所望により、生成したリポソーム中に酸化防1L剤が例
えば脂質の1%以内好ましくは0.1%存在していても
よい。好ましい酸化防止剤には、ビタミンE(酢酸トコ
フェロール)、ビタミンC(パルミチン酸塩)およびB
HT (ブチル化ヒドロキシトルエン)がある。 他のインターリューキン安定剤として、例えばマンニト
ール、アラビノース、ソルビトールもしくはシュクロー
スなどの糖、または例えばひとセリン(血a)アルブミ
ンのようなアルブミンを用いることができる。これらの
安定剤は、リポソーム形成前に緩衝液中に混入すること
ができる。好ましくは、これらは生成したリポソーム中
脂質の20%モル重量以内で存在し得る。 好ましいリポソーム形成方法は、以下の工程からなる方
法a)である: Aa) 有機溶媒中の脂質とインターリューキンの溶液
を形成し、 Ab) 溶液から溶媒を除去して残留物を得、Ac)
緩衝液に残留物をけんだくし、Ad) IJポンームか
生成するまでけんだく液を攪拌、ホモジネート化し、そ
して Ae) リポソームを単離する。 工程Aa) において、「溶液」の語は、乳液のような
「プソイド(擬似)」溶液を包含する。しかしながら、
均質澄明な溶液を製造する方か好ましい。インターリュ
ーキンおよび脂質を溶解または可溶性にするならばいず
れの溶媒系でも用いることができる。この系は単一溶媒
でも複数の溶媒の混合物でもよい。また例えば15%以
下の水を含み得る。所望により界面活性剤か存在しても
よい。溶媒系は、濃縮lこより脂質から除去され得る適
当な有機溶媒を包含することができる。広節な種類にお
よぶジエチルエーテルやジイソプロピルエーテルのよう
なエーテル類、酢酸エチルのようなエステル類、メタノ
ールやE−ブタノールのようなアルコール類、およびメ
チレンクロライドやクロロホルムのようなハロゲン化炭
化水素類を用いることができる。所望により酢酸が存在
してもよい。ジエチルエーテル、メチレンクロライドま
たはt−ブタノールを用いるのか好ましい。 工程A、b) において、高度真空下の場合は
【−ブタ
ノール、低度真空下の場合はメチレンクロライドが好ま
しいことが判明した。 工程Ab)の場合、インターリューキンの感受性に留意
しながら多くの常套手段により溶媒を除去し得る。好ま
しいものとしては、例えば10〜5゜Hl−1gの低度
真空下で濃縮するか、または例えば、0、lmmHgの
ような5 咽Hg以下の高度真空下で凍結乾燥を行う手
段がある。 この発明によると、凍結乾燥の方が特に好ましいことか
判明した。 この工程は好ましくは室温より低い温度で行ない、濃縮
される混合物が周囲より約1〜3℃低くなるように減圧
状態および温度を調整する。このような調整は従来方法
で行なえばよい。凍結乾燥の典型的プログラムは約−6
0℃で始まり、12時間かけて一15℃まで上昇させる
。次いで温度を+10℃まで上昇させたまま2時間維持
する。 工程Ac)の場合、用いる緩衝液は例えばpH4〜7(
例、5〜6.5)のりん酸緩衝液が好ましい。好ましく
は、水相は例えば300モスモル/リットル以下、特に
290モスモル/リットル以下の低浸透性である。生成
したけんたく液は、好ましくは約0.001〜約0.2
g脂質/rnlを含有する。 工程Ad)の場合、超音波照射によりホモジネート化を
もたらす。このような照射の好適な周波数は例えば30
〜8QKI(z である。通常の出力はホモジネート化
または攪拌される混合物約]〇−あたり200〜400
ワツトである。当然のことながらホモジネート化される
混合物を、金属による汚染を避けるため超音波発生器に
付随するチタニウム他の金属から離すことか好ましい。 温度は好ましくは約10〜70℃である。不飽釦脂質の
場合は室温、飽和脂質の場合は60〜70℃が好ましい
。 この段階の間に集塊をともなうリポ゛ノームの乳液が生
成する。 所望により、超に波処理後、例えば10000〜270
0Orpm の速度で高床機械的攪拌器を用いて攪拌を
してもよい。しかしながら、この作業は省いた方が好ま
しく、ホモジネート化の場合と同じ条件下で、また超音
波処理により攪拌した方がよい。 工程Ae)では、この発明のリポソームを常套技術、例
えば限外瀘過、遠心分離、イオン交換またはゲルクロマ
トグラフィー、透析などにより単離する。好ましくは例
えば011〜1ミクロンの微細孔のフィルターを通して
リポソームを沖過、滅菌することができる。所望により
、このr過を、脂質の相転移点より上の、例えば30〜
70℃の温度で行なう。好ましくはリポソームを例えば
10000〜20000gの高速遠心分離により単離す
る。 方法a)の例: 3′a)インターリューキンの親水性溶液と有機溶媒に
溶かした脂質を混合し、 a’b)濃縮により水と有機溶媒を除去し、a’ c)
pH4〜7の緩衝液に残留物を吸収させてけんだく液
を得、 a’d)けんだく液に超音波を照射してリポソームを形
成させ、そして a’e) リポソームを単離する。 方法a)の別の例: a’a)インターリューキンの親水性溶液と有機溶媒に
溶かした脂質を混合し、 λ’b)混合物を凍結乾燥L7て凍結乾燥物を得、a’
c)凍結乾燥物を緩衝ri、(PH4〜7)にけんだく
し、 a’d)リポソームおよび/または集塊が生成するまで
溶液を攪拌し、 a / e )機械的手段により混合物をホモジネート
化し、そして a’f) リポソームを単離する。 これらの方法は、方法a)と類似の方法で行なえばよい
。 一方、この発明は、次の工程からなるインターリューキ
ン含有リポソームを製造する方21)を提供する: ba)インターリューキンの水性を基礎とする溶液と脂
質の有機溶液を混合し、 bb)ある程度リポソームおよび/または集塊か形成さ
れるまで混合物を超音波処理に付し、bc)例えば、 bi)U合物から有機溶媒を除去してゲル状中間相を形
成し、そして bll)ゲル状中間相をリポソームに転化することによ
り混合物からリポソームを回収する。 工程ba)において、「溶液」の語は、乳液のような「
プソイド(擬似)」溶液を包含する。しかしながら、均
質澄明な溶液を製造するのが好ましい。脂質を溶解また
は可溶性にするものならいずれの溶媒系を用いてもよい
。この系は単一溶媒または複数の溶媒の解合物であり得
る。また例えば15%以内の水を含んでいてもよい。所
望により、界面活性剤も存在し得る。 溶媒系は、蒸発により脂質から除去される適当な有機溶
媒を含むことができる。広範な種類のジエチルエーテル
やジイソプロピルエーテルのようなエーテル類、酢酸エ
チルのようなエステル類、メタノールや第三級ブタノー
ルのようなアルコール類およびメチレンクロライドやク
ロロホルムのようなハロゲン化炭化水素類を用いること
ができる。 所望により酢酸が存在してもよい。第三級ブタノールま
たは好ましくはジエチルエーテルまたはメチレンクロラ
イドを用いるのが好ましい。 インターリューキンを水または好ましくはpH4〜7,
4(例、5〜6.5)の水性緩衝系に溶解する。 水性緩衝液は例えば300モスモル/リットル以−ド、
特に290モスモ、v/’Jットル以下の低張液が好ま
しい。得られた混合物は好ましくは1 mb当たり約0
.001〜約0.2gの脂質を含有する。 工程bb)の場合、照射は超音波により行なうことがで
きる。このような照射の周波数は例えば30〜8QkH
zであり得る。通常の出力は照射される混合物の各々1
0−に対して200〜400ワツトである。当然のこと
ながら、金属による汚染を避けるため照射される混合物
を超音波発生器のチタニウムや他の金属から離すのが好
ましい。 温度は好ましくは約10〜70℃である。不飽和脂質の
場合は室温、飽和脂質の場合は60〜70℃が好ましい
。 この段階の間に集塊をともなうリポソームの乳濁液が生
成する。 従来方法でリポソームを回収するととができ、最も収率
を良くするように処置する。 工程1)において、有機溶媒を例えば10〜600m
m l−I g の低度減圧下で除去するのが好都合で
あり、水相のほとんどはそのまま残る。例えば室温また
は例えば45℃までの僅かな加温といった低温が好まし
い。 工程11)において、得られたゲル状中間相を水または
所望により前述の緩衝液で処理してリポソームを製造す
る。 一方、この発明は次の工程からなるインターリューキン
含有リポソームを製造する方法C)を提供する: Ca)インターリューキン、pH4〜8の水性に基つく
緩衝液および有機溶媒に溶かした脂質を混合し、 cb)得られたけんだ(液に超音波を照射してリポソー
ムまたは集塊を形成し、および cc)例えば ci)例えばゲル状中間相により、混合物から溶媒を濃
縮し、および C11)ゲル状中間相をリポソームに転化することによ
り混合物からリポソームを回 収する。 工程ca)lこおいて、「溶媒」の語は、乳液のような
「プソイド」溶液を包含する。しかしなから、均質澄明
な溶液を製造するのか好ましい。脂質を溶解または可溶
化するものならいずれの溶媒系を用いてもよい。この系
は単一溶媒または複数の溶媒の混合物であり得る。また
例えば15%以下の水を含んでいてもよい。所望により
、異聞活性剤が存在してもよい。溶媒系は、濃縮により
脂質から除去され得る任意の適当な有機溶媒を含み得る
。 広範な種頓のジエチルエーテルやジイソプロピルエーテ
ルのようなエーテル類、酢酸エチルのようなエステル類
、メタノールや第三級ブクノールのようなアルコール類
およびメチレンクロライドやクロロホルムのようなハロ
ゲン化炭化水素類を用いることができる。所望により酢
酸が存在してもよい。ジエチルエーテル、メチレンクロ
ライドまたは第三級ブタノールを用いるのが好ましい。 粉末形態のインターリューキンを用いることができ、例
えばその粒径は、直径60ミクロンの最大粒径を有する
ものが好都合である。 工程ca)の場合、用いる緩衝液は例えばpi−i3N
4.4、特に4〜7、特に5〜6.5のりん酸緩衝液が
好ましい。好ましくは水相は例えば300モスモル/リ
ットル以下、特に290モスモル/リットル以下の低張
液である。生成したけんたく液は好ましくは1rn!当
たり約0.001〜約0.2gの脂質を含有する。 工程cl))の場合、超音波により照射を行なうことが
できる。このような照射の好適な周波数は例えば30〜
80kHzである。通常出力は照射される混合物約10
1nlに対して200〜400ワツトである。当然のこ
とながら、金属による汚染を避けるため照射される混合
物を超音波発生器のチタニウムや他の金属から遠ざける
のが好まし温度は好ましくは約10〜70℃である。不
飽和脂質の場合は室温、飽和脂質の場合は60〜70℃
が好ましい。 この段階の間に集塊をともなうリポソームの乳液が生成
する。 従来方法によりリポソームを回収ずれはよいが、リポソ
ームの収率を最高にするような処置をとるべきである。 工程ci)において、例えば10〜600mmHgの圧
力で例えば水流ポンプを用いて低度減圧下に有機溶媒を
除去するのが好便であり、一方はとんどの水相はそのま
ま残る。例えば室温または例えば45℃以下の僅かな加
温といった低温が好ましい。 工程C11)tこおいて、生成したゲル状中間相を水ま
たは所望により前述の緩衝液で処理してリポソームを製
造する。 けんだく液が生成し得る。所望によりさらに濃縮して有
機溶媒および酸リポソーム形成物の残留痕跡を除去する
。 この発明によるリポソームを、さらに例えば工程ae)
の方法のように従来技術により単離する。 リポソームの純度は従来技術により測定することができ
る。 リポソーム中のインターリューキンの混入状態を測定す
るために、予備精製の粗製混合物を希釈し、例えば3〜
24時間遠心分離を行ない、上清液中のインターリュー
キンの量を測定する。欠に残留したインターリューキン
をリポソーム沈澱物にとり込む。 さらに、後の実施例で記載するように、標準的高速液体
クロマトグラフィー技術により精製リポソーム中のイン
ターリューキン混入量を測定することができる。 また、投与後の本発明によるリポソームの分布を例えば
動物試験における従来の薬物動力学技術により追跡する
ことができる。よう素−125とインターリューキンを
反応させるか、または例えば硫黄35により放射能で標
識付けしたアミノ酸からインターリューキンを製造する
ことにより、放射性インターリューキンを生成する。例
えば炭素−14により放射能で標識付けした脂質から製
造されたリポソーム中にこのインターリューキンを混入
し、マウスに注入する。1時間後マウスを殺し、例えば
ひ臓のような各々の脂管に存在する放射能の量と型を測
定する。 この発明のリポソームは、インターリューキンについて
公知の、様々な適用形態に使用され得る。 これらの適用として、培養および他の試験管内実験にお
ける動物細胞の成長促進用途があり、また種々の状態を
処置するための治療用途もある。 バイオアッセイ試験として徒述する一試験τ(才、マワ
スーT = IJ 7バ球#I胞系列(に ’I’ I
−L細胞ジ増殖のインターリューキン濃度依存刺激作用
に基づいてインターリューキンバイオアッセイを行なう
〔ニス・ギリスら、ジャーナル・オブ・イムノロジー(
J、I+nmunol 、 ) 1978年、120巻
、頁2027〜2032参照〕。 インターリューキン依存細胞培養のT細胞を洗浄してI
L−2を除去し、この発明によるリポソームで処理し、
I L−2不含有培地でインキユベートシた。次いで試
験細胞を常套的な系列希釈試験(希釈培地RPMI −
1640,10%うし胎仔血清を追加)に付した。24
時間にわたるインキュベーション後、リポソーム濃度の
増加に対応する細胞増殖状態を測定した。各希釈液につ
いて2.105の細胞を用いた。。 増殖は〔3H〕−チミジンの混和または光度測定MTT
試験により測定する(MTT = 3’ (’4.5−
ジメチルチアゾールー2−イル)−2,5−ジフェニル
テトラゾリンプロミド〕。生きている細胞の黄色MTT
を対応する暗青色ホルマザンに変換し、これを酸性イソ
プI7バノール;ご溶解後分光化学的に測定する。 最大増殖率の50%を示すサンプルの希釈液を測定する
。この発明によるリポソームの活性は、純粋なインター
リューキンの活性の約1,2〜20倍以下である。前記
試験において1,30g/ml より太き(宿性を有す
るリポソームを用いるのが好ましい。 また、■−リンパ球細胞が低下したマウス、例えばヌー
ドマウスにおけるIL−2活性の標準的生体内試験によ
り、活性を確認することができる。 一つの試験では、90■/kg のシクロスポリンAを
毎日投与してこのようなマウスを製造し、これをひつじ
赤血球(SRC)で免疫処置すると、シャーンプラーク
細胞形成アッセイによりひ臓中の特異的抗体細胞(PF
C)の数が減少する(80〜97%)。抗原を静脈注入
した後、マウスを数群に分け(1群当たり動物6〜7匹
)、5日間にわたり1日2回皮下注射または好ましくは
静脈内注射により約2〜5マイクログラムのI L −
2を含有する用量のIL−2製剤を与える。シャーン試
験によりひ臓中の特異的抗体細胞の数を測定して動物の
免疫回復を測定した。この発明のリポソームの活性は、
封入されていないインターリューキンと同じオーダーを
有する。 この発明のリポソームは、例えば本明細訂の冒頭で述べ
たようなインターリューキンに認められる免疫調整特性
に基づく特に興味ある治療用途、特に、重度複合免疫不
全症候群(SCIDS)、後天的免疫不全症候群(AI
DS)、老齢による免疫不全症状および先天的免疫不全
症のような免疫不全に起因する状態の処置用途に用いる
のが好ましい。しかしながら、またインターリューキン
は、サイトメガロウィルス感染症およびヘルペスウィル
ス感染症のような種々のウィルス性疾患の処置、ならび
に結核やハンセン氏病のようなバクテリア感染症の処置
における抗真菌剤として用いることができる。これらの
治療用途に必要なリポソームの用量は、処置される状態
、症状の重さ、混入されたインターリューキンの効力や
量などの公知の要因により異なる。 しかしながら、0.1μg〜30μg/kg 体重の範
囲のインターリューキンの1日用量を例えば人間の患者
のような哺乳動物に投与すると、一般に満足すべき結果
が得られる。一般ζこ好適な無菌媒体を用いた静脈内投
与が好ましい。 インターリューキンは、培養におけるT細胞成長促進能
力に基づく広範な種類の個別用途を有するが、その中に
は診断法および補助的治療処置における適用がある。診
断法上の用途は、尺度として細胞中における放射性チミ
ジンの取り込みを用い、インターリューキン添加後の試
験管内における一f IJンパ球成長の程度を測定する
ことにより、ある種の病気の存在を検出するという公知
の能力に基つく。抗腫瘍処置のような補助的治療処置を
行なう場合、インターリューキンは、患者または他の融
和性ドナーから得た”[’ IJンパ球の成長を試験管
内で促進するのに用いることができ、次いて得られた増
殖リンパ球を患者に再注入し、闘病を補助することにな
る。一般に、培養および他の試験管内実験においてT細
胞の成長を助けるのに用いるインターリューキンの量は
、その活性およびその系におけるひとインターリューキ
ンとの比較に関する文献から決定され、日常的な研空に
より、特定な状況に対して最も有効に用いられる。 以下、実施例によりこの発明を説明する。 以後用いられている「レシチン」の語は大豆レシチンを
指す。 特記しない限り、超音波放射は50K)Izおよび35
0Wで行なう。 工程A 実施例A1 リポソームの製造 2”QのひとLL−2を酢酸1mA’に溶かす。精製レ
シチン1グラムを別に第3ブタノール5mgに溶かす。 2つの溶液を一緒に混合し、−30℃で凍結乾燥して5
凍結乾燥物を得る。この凍結乾燥物を、0.05M%酸
緩衝液(115)に10ReにfXるまて吸収させ、け
んだ〈液をつくる。 けんだく液に5分間浴中て超音波を照射する。 つぎにけんだく液を窒素気流1約1500 Orpmの
速度で高速撹拌器〔タイプ・ポリトロン・タイ7 (T
ype Po1ytron Type)10−30 〕
を用0て15分間ホモジネート化する。次にリポソーム
溶液を、レシチンの相転移点よりも高い温度、例えば2
0℃で滅菌フィルター(0,2ミクロン月こ抑圧する。 次に得られたリポソーム溶液を凍結乾燥する。 所望により、高速撹拌段階を省いてもよく、また照射を
15分間続けてもよく、および/またはリポソームを遠
心分離により単離してもよい。 リポソームの分析 従来の逆相高速液体クロマ1グラフイー(1−I PL
C) 技術を用いてこの発明のリポソームを分析する
。 米国フローリー・ラボラトリーズ・インコーホレイテッ
ド市販の広い孔(約300オングストローム〕の球状c
=、B炭化水素支持材、10ミクロン〔例、カラム 技
P300アクアポア(Aqua−pore) 20 X
4.6 mrn 〕 を用いるのか好ましい。 好ましい溶シW剤系は、0,1%トリフルオロ酢酸含有
水/アセトニトリル勾配系であり、例えは次の2つの溶
離剤形を用いる: 系A250%アセトニトリル、l−120(+0.1チ
ドリフルオロ酢酸9 系8170%アセトニトリル、1(20(+0.1饅ト
リフルオロ酢酸)。 模範的な流速は3rILe/分で、10分間にわたり1
00パーセント系A〜100パーセント系Bの勾配を有
する。このような好ましい条件丁、ひとIL−2は約7
.5分の保持時間で溶離し、インクIJニーキンの量は
常法によるピークの集積によって得られる。 1−I P L Cの前に、この発明のリポソームを以
下のように予備処理する: リ P!(2,5〜4の酢酸緩衝液による希釈、その後
、リポソーム物質はインターリューキンを放出しなから
1−t p r−cカラム上で分解する。 n) リポソームに混入されたインターリューキンから
リポソーム賦形剤を徹底的な除去、ホスホリピドを除去
するための例えば水およびメタノール/メチレンクロラ
イドの使用1次いで得られたインターリューキン含有水
溶液の注入。 Fi) カラム切替技術により、この発明のリポソーム
に混入されたインターリューキンからリポソーム賦形剤
をカチオン型イオン交換剤上で分離する。その後インタ
ーリューキンをカチオン型イオン交換剤から逆相カラム
へ溶出して常法によりクロマトグラフィーに付す。好ま
しいカチオン型イオン交換剤カラムは30 X 4.6
mm の大きさを有し、10μmの支持物を詰めこん
だものである(米国ブローリー・ラボラトリーズ・イン
コーホレイテッド市販のSC×10)。 リポソームは、ひとjL−2の約50%を含有している
ことが見い出されている。 活性および用途 リポソームは、前述のバイオアッセイ試験の場合のひと
IL−2それ自体と同じ活性オーダーを示すことがわか
る。 実施例A2 リポソーム(v3)の製造 0.5■のひとIL−2を酢酸1me+ご溶解する。 レシチン(エピクロン(EPIKURON )145
V ) 500〜を別に【−ブタノール50mgに溶解
する。この2つの溶液を一緒に混合し、約16時間にわ
たり一15℃で凍結乾燥して、凍結乾燥物を得る。この
凍結乾燥物を0.05Mりん酸緩衝液(pi(6,5)
に吸収させてIon/!とし、けんだ〈液を得る。 このけんだ〈液に室温(約20℃)で5分間浴槽内で超
音波を照射する。次いでけんだく液を室温において約1
500Orpmの速度で高速撹拌器(タイプ・ポリトロ
ン PT15)を用いて10分間ホモジネート化する。 リポソームを4時間4℃、150000gで遠心分離に
より単離する。 実施例A3 リポソームの製造 超音波放射および室温の代わりに70℃の温度で高速撹
拌ホモジネート化を行ない、実施例A2を繰り返す。こ
こで用いるレシチンは、ソーヤ(大豆〕ホスファチドN
C95Hであった。遠心分離時間は2時間であった。 実施例A4 リポソームの製造 0、51ngのひとIL−2、レシチン(エピクロン(
EPIKURON)145 V ) 450 ’?およ
びホスファチジルセリン50■を【−ブタノール10m
eと一緒に混合し、室温で10分間照射して溶液を生成
する。これを約18時間−40℃で凍結乾燥し、凍結乾
燥物を形成する。 この凍結乾燥物を、10rul!となるまて0.05M
りん酸緩衝液(p H6,’3 )に吸収させてけんだ
く液を得る。室温(20℃)で10分間浴槽中てこのけ
んだ〈液に超音波を照射し、次いで10分間実施例2の
場合と同様ホモジネート化する。リポソームを4°C1
1’ 50000 !で、4時間遠心分離して単離する
。 実施例A5 リポソームの製造 レシチン450■とホスファチジルセリン50■の代わ
りにレシチン5oovtを用いて実施例へ4を繰り返す
。 実施例A6 リポソームの製造 レシチン450”?とホスファチジルセリン50〜の代
わりにレシチン425叩とコレステリンフ5m9を用い
て実施例A4を繰り返す。 実施例A7 リポソームの製造 高速撹拌工程を除き、実施例A2を繰り返す。 超音波照射を15分間続ける。 実施例A8 リポソームの製造 高速撹拌工程を除き、実施例A3〜6をそれぞれ繰り返
す。 リポソームの分析 上清液 遠心分離後の上清液を前述の逆相高速液体クロマトグラ
フィー技術により分析すると、10%以下の純粋ひとI
L−2を含有していた。 生物学的活性 リポソームを、前述の試験(ニス・ギルスら〕にしたが
い、IL−2依存CTLL−(i6)細胞における3〔
H〕−チミジンの混入に基づく系列希釈試験により分析
する。24時間後に104の細胞の最大成長の50%を
もたらすI L −2の濃度を製造後直ちに測定する(
値A、’ try/me)。この試験においてリポソー
ム形成のための出発原料として用いるひとIL−2それ
自体は0.2μfj/meの値を示した。 結果 実施例 A’(ng/mI) A2(ng/inl)A
4(ng/IT1す8A2 0.2 0.7 3.2 A3 9.5 8.4 nt A4 0.7 nt nt A5 2.6 nt n1 A6 1,6 nt nt A7”” l、Q n ((+ L 注9 ×:4℃の温度で4週間の貯蔵 ××:R初+7) I L−2チャージ0.8”Vml
活性nt=試験されていない 上記生体内試験において、前記試験で試験管内活性1.
7 ngAL13を有する実施例A2の貯蔵バッチのリ
ポソームについて以下の結果が得られた。 免疫された非低 −167,000100%下マウス(
対照9 低下マウス −28,00017% IL−2物質 5 111.000 66%リポソーム
5 96.700 58%IL−2物質 2 96.
700 58%リポソーム 2 87.100 52%
実施例9 リポソームの製造 0.5■のひとI L−2を酢# 1 mlに溶かし、
この溶液をメチレンクロライド50m1に溶かしたレジ
チア500”?(−r−ピクロ:/(EPIKURON
)145V)の溶液に加える。 混合物を1時間10〜50mmH9の減圧下30℃の温
度で、次いで3時間50℃の温度で回転エバポレータに
入れて濃縮し、脂質フィルムを得る。 このフィルムをpf15におけるりん酸緩衝液(0,0
2M ) 10nteに分散する。次いて、分散液を超
跨波浴槽に入れ、室温(20℃って30分間照射すると
、リポソームが生成する。 リポソームを4時間40℃、1.5000 f/で遠心
分離により単離する。 実施例AIO リポソームの製造 超音波放射処理を室温ではなく70℃の温度で行なって
実施例9を繰り返す。ここで用いるレシチンはソーヤ・
ホスファチツク(Soja phosphat −’C
)NC95s−1であった。遠心分離を2時間行なう。 リポソームの分析 実施例A4と同様にして分析を行なう。 結果 実施例 A’ (ng/mQ A 2(ngAn、aA
9 0.8 0.9 AIO2,53,5 方法B 実施例B1 リポソームの製造 レシチン100mPをメチレンクロライド5mgに溶か
し、丸底フラスコに入れる。0.’2”9のひと工L−
2,20〜のL−システィンおよび0.05Mりん酸緩
衝液(P I−15) 1 mliからなる水溶液を加
える。混合物を20℃で5分間超音波浴槽内で乳化する
(周波数80KI−1z)。 次いて乳液(予備形成リポソームおよび集塊をある程度
會有している〕を減圧下(20〜30mrnHり20℃
で濃縮し、得られたゲルを2rueの緩衝液に加え、混
合物をゆっくり撹拌する。水性リポソームけんだ〈液が
生成する。 次の工程にしたがい、リポソームを非混合活性剤から分
離する; a)遠心分離(5分、20°、5000G)。非混合活
性剤が上清液に残留。リボソーi沈澱物を再けんだくす
る。 b)ゲルカラムクロマトグラフィー〔バイオゲ/l/
(Biogel ) A 1.5または一1=7アデツ
クス(s−epHadex ) G 50を用いる〕。 リポソーム含有% 溶出液を限外濾過または0.マ塩水に対する透析により
濃縮する。 得られたリポソームけんだ〈液を凍結乾燥する。 分析 リポソームは、約50〜90チのひとIL−2を含有し
ていることがわかる。 活性および実用匹 リポソームは、前述のバイオアッセイ試験におけるひと
IL−2そのものと同じ活性オーダーを示すことがわか
る。 実施例B2 リポソームの製造 5001ngのレシチン(エピクロン145v)をメチ
レンクロライド200 trteに溶かし、丸底フラス
コに入tLルo O,5”P(7)ひとIL−2,10
0mWのし一システィンおよび0.05Mのりん酸緩衝
液(p)15 )10neを加える。 混合物を室温(20℃)で10分間、超音波浴槽中で乳
化する。次に得られた乳液(予備形成リポソームおよび
集塊をある程度含有しているりを減圧下(20〜30鰭
Hダ)10分間35℃で濃縮して得られたゲルに緩衝液
10m1を加える。混合物を室温で30分間撹拌する。 リポソームを、4時間、4℃、150000gで遠心分
離により単離する。 実施例B3 リポソームの製造 実施例B2と同様に行なうが、ただし10分間35℃で
はなく5分間80℃で濃縮する。ここで用いるレシチン
はソーヤ・ホスフェートNB951−1であった。4時
間ではなく2時間遠心分離を行なった。 実施例B4およびB5 リポソームの製造 実施例2および3と同様にして行なうが、ただしL−シ
スティンは存在させない。 リポソームの分析 上清液 遠心分離後の上清液を前述の逆相高速液体クロマトグラ
フィー技術により分析する。10%以下の原形ひとIL
−2を含有する。 生物学的活性 前述の試験(ニス・ギルスら)にしたがい、IL−2依
存CI−IL−(16)細胞中の3 [I−1)−チミ
ジンの混入に基づく系列希釈試験により、リポソームを
分析する。24時間後に104 の細胞の最大成長の5
0%をもたらすIL−2の濃度を、製造直後(値A0、
”Vral! )および4℃で貯蔵2週間後(値A2.
ng/rrte)に測定する。この試験において、ひ
とIL−2物質自体は0.2 ngAeの値を示した。 結果 実施例 A’ (ngAul) A2CngAne)B
2 0.8 2.4 B3 20.0 35.0 方法C 実施例C1 リポソームの製造 精製レシチン50マイクロモルおよびコレステロール5
0マイクロモルをクロロホルム20meに溶かし、窒素
気流下回転エバポレータで濃縮する。 残留物をジエチルエーテル5m/?に吸収させる。 600マイクログラムのひとIL−2(例えば粒径5〜
50ミクロンの粉末で)を加える。この溶液に、0.0
5モルのりん酸緩衝液1.5鮮を加える。 次に混合物を5分間5℃で超音波ブローベを用いて照射
し、ホモジネート化物を得る。生成した乳液を2段階に
分けて回転エバポレータで濃縮する。第1段階では圧力
は約400トールHgであり、粘稠性ゲルが生じるまで
そのままにしておく。 このゲルを0.0.5 Mりん酸緩衝1(p14s)1
.5rrteで処理し、軽く容器ごと振ると、水性けん
だ〈液が得られる。次いてこの水性けんだ〈液を室温お
よび常圧で15分間第2濃縮段階に進め、リポソームの
不透明けんだく液を得る。 有機溶媒の最終痕跡を除去するために、イオン交換カラ
ム(セファデックス650)上で限外r濾過を行なう。 リポソームの分析 リポソームは、約50〜90チのびとI L −2を混
入していることがわかる。 活性および実用性 リポソームは、前述のバイオアッセイ試験におけるひと
IL−2自体と同じ活性オーダーを示すことがわかる。 実施例C2 リポソームの製造 500m7のレシチン(エピクロン(EPII(UkO
N) 145 V ) オ、Jヒ’o、5myノ0トI
L−2をメチレンクロライド20al!に溶かす。0
05モルのりん酸緩衝液10罰を加える。 次に混合物を室温(約20℃って5分間、超音波浴槽内
で照射する。得られた乳液を、粘稠性ゲルが生じるまで
、10分間35℃で回転エバポレータに入れて濃縮する
。次に0.05Mりん酸緩衝液(PH5)10m、eを
加え、室温で30分間容器を回転する。 4時間4℃、150000gで遠心分離を行ない、リポ
ソームを単離する。 実施例C3 リポソームの製造 実施例C2を繰り返して濃縮するか、ただし35℃で1
0分間ではなく80℃で5分間続ける。 レシチンとしてソーヤ・ホスファティックNC9514
を用いた。2時間遠心分離を行なった。 リポソームの分析 −L清液 遠心分離後の上清液を、前述の逆相高速液体クロマトグ
ラフィー技術により分析する。10%以上の原形ひとI
L−2を言有する。 生物学的活性 前述の試験(ニス・ギルスら)にしたが0、lL −’
2依存CHLL−(’16 )細胞における3〔H〕−
チミジンの混入に基づく系列希釈試験によりリポソーム
を分析する。 24時間後に10 の細胞の最大成長の50%をもたら
すIL−2の濃度を、製造直後(値A0゜ngAne)
および4℃で貯蔵2週間後(値A2. ng鷹つに測定
する。この試験では、ひとI L −2物質自体はo、
2 ngAueの値を示した。 結果 実施例 AoC,ng/me) ;j’(ng/me)
C21,22,9 C312,5120,0 方法A、BまたはCに関する任意の1JIJ記実施例に
おいて、ひとIl、、−2をI I−−2−セリン12
5、IL−2A−1、IT、2 A−2,IL−2B−
1,IL−2B−2+IL−2Gln 26゜IL−2
pHe−121またはll−−25top121と置き
換えることができる、 特許出願人 サンド・アクチェンゲゼルシャフト代 理
人 弁理士 青 山 葆 はか】名第1頁の続き 優先権主張 [相]19844月9日0イギ1、[相]
198拝4月9日[相]イギー 〇198稗4月9日[相]イギI。 61M8月10日[相]イギー 〇1優体竿9月19日[相]イギ1」 01康4年9月19日[相]イギリ ;ス(GB)[相]8409126 [ス(GB)[株]8409127 □ス(GB)[相]8409128 ス(GB)[相]8420381 ス(G B )o8423700 ス(GB)[相]8423701 手続補正書(、イ、 昭和60年4月 特許庁長官 殿 1事件の表示 乙。−1っf249 2、発明の名称 ・ インターリューキン療法に関する改良 3補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 スイヌ国バーゼルc番地の表示なし)名称 サン
ド・アクチェンゲゼルシャフト4代理人 住所 大阪府大阪市東区本町2−10 本町ビル内氏名
弁理士(6214)青 山 葆 はか 1名5補正命
令の日付:自発 6、補正の対象:明細書の特許請求の範囲の欄7、補正
の内容:別紙の通り。 特許請求の範囲 (1) インターリューキン含有リポソーム。 (2) インターリューキンがひとIL−2である、特
許請求の範囲第1項記載のリポソーム。 (3) インターリューキンがIL−2−セリン125
である、特許請求の範囲第1項記載のリポソーム。 (4) インターリューキンかIL−2A−1、IL−
2A−2、IL−28−1またはIL−2B−2である
、特許請求の範囲第1項記載のリポソーム。 (5) インターリューキンかIL−2GIn−26、
IL−2Phe −121またはIL−2Stop−1
21である、特許請求の範囲第1項記載のリポソーム。 (6)特許請求の範囲第1〜5項のいずれか1項に記載
のインターリューキン含有リポソームを静派内注入によ
り投与するこ・とからなる、インターリューキン処置を
必要とする対象に対するインターリューキン投与の改良
法。 (7) a)有機溶媒中の脂質とインターリューキンの溶液を形
成し、 b)溶液から溶媒を除去して残留物を得、C)残留物を
緩衝液に懸濁し、 d)リポソームが生成するまで懸濁液を攪拌、ホモジネ
ート化し、および e)リポソームを単離する ことからなる、インターリューキン含有リポソー(8) a)インターリューキンの水溶液と脂質の有機溶液とを
混合し、 b)リポソームおよび/または集塊が形成するまで混合
液に超音波放射線を照射し、 C)混合液からリポソームを回収する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 (9) a)インターリューキン、pH4〜8の水性に基づ(緩
衝液および有機溶媒に溶かした脂質を混合し、 b)生成懸濁液を超音波処理してリポソームまたはその
集塊を形成し、 C)混合物からリポソームを回収する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 αl 緩衝液がpH4〜7のものである、特許請求の範
囲第9項記載の方法。 ■ i)混合物から溶媒を蒸発させてゲル状中間相を形成し
、そして l)ゲル状中間相をリポソームに転化させることにより
リポソームを特徴する特許請求の範囲第9項記載の方法
。 ■ 1)混合物から溶媒を蒸発させてゲル状巾中間相を形成
し、 −)ゲル状中間相をリポソームに゛転化させることによ
りリポソームを特徴する特許請求の範囲第8項記載の方
法。 3 a)インターリューキンの親水性溶液を有機溶媒に溶か
した脂質と混合し、 b)水および有機溶媒を蒸発留去し、 c) pH4〜7の緩衝液に残留物を吸収させて懸濁液
を形成し、 d)懸濁液に超音波を照射してリポソームを形成し、詔
よび e)リポソームを単離する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 114) λ)インターリューキンの親水性溶液を有機溶媒に溶か
した脂質と混合し、 b) 111合物を凍結乾燥して凍結乾燥物を得、C)
凍結乾燥混合物を緩衝剤溶液(pH4〜7)に懸濁し、 d)リポソームおよび/または集塊が生成するまで溶液
を攪拌し、 e)混合物を機械的手段でホモジネート化し、および、 f)リポソームを単離する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 (15)実質的に実施例のいずれか1つにつl、>て後
述する、インターリューキン含有リポソームの製造方法
。 (16)特許請求の範囲第6〜15項のし)ずれ力)1
項に記載の方法により製造されるリポソーム。
ノール、低度真空下の場合はメチレンクロライドが好ま
しいことが判明した。 工程Ab)の場合、インターリューキンの感受性に留意
しながら多くの常套手段により溶媒を除去し得る。好ま
しいものとしては、例えば10〜5゜Hl−1gの低度
真空下で濃縮するか、または例えば、0、lmmHgの
ような5 咽Hg以下の高度真空下で凍結乾燥を行う手
段がある。 この発明によると、凍結乾燥の方が特に好ましいことか
判明した。 この工程は好ましくは室温より低い温度で行ない、濃縮
される混合物が周囲より約1〜3℃低くなるように減圧
状態および温度を調整する。このような調整は従来方法
で行なえばよい。凍結乾燥の典型的プログラムは約−6
0℃で始まり、12時間かけて一15℃まで上昇させる
。次いで温度を+10℃まで上昇させたまま2時間維持
する。 工程Ac)の場合、用いる緩衝液は例えばpH4〜7(
例、5〜6.5)のりん酸緩衝液が好ましい。好ましく
は、水相は例えば300モスモル/リットル以下、特に
290モスモル/リットル以下の低浸透性である。生成
したけんたく液は、好ましくは約0.001〜約0.2
g脂質/rnlを含有する。 工程Ad)の場合、超音波照射によりホモジネート化を
もたらす。このような照射の好適な周波数は例えば30
〜8QKI(z である。通常の出力はホモジネート化
または攪拌される混合物約]〇−あたり200〜400
ワツトである。当然のことながらホモジネート化される
混合物を、金属による汚染を避けるため超音波発生器に
付随するチタニウム他の金属から離すことか好ましい。 温度は好ましくは約10〜70℃である。不飽釦脂質の
場合は室温、飽和脂質の場合は60〜70℃が好ましい
。 この段階の間に集塊をともなうリポ゛ノームの乳液が生
成する。 所望により、超に波処理後、例えば10000〜270
0Orpm の速度で高床機械的攪拌器を用いて攪拌を
してもよい。しかしながら、この作業は省いた方が好ま
しく、ホモジネート化の場合と同じ条件下で、また超音
波処理により攪拌した方がよい。 工程Ae)では、この発明のリポソームを常套技術、例
えば限外瀘過、遠心分離、イオン交換またはゲルクロマ
トグラフィー、透析などにより単離する。好ましくは例
えば011〜1ミクロンの微細孔のフィルターを通して
リポソームを沖過、滅菌することができる。所望により
、このr過を、脂質の相転移点より上の、例えば30〜
70℃の温度で行なう。好ましくはリポソームを例えば
10000〜20000gの高速遠心分離により単離す
る。 方法a)の例: 3′a)インターリューキンの親水性溶液と有機溶媒に
溶かした脂質を混合し、 a’b)濃縮により水と有機溶媒を除去し、a’ c)
pH4〜7の緩衝液に残留物を吸収させてけんだく液
を得、 a’d)けんだく液に超音波を照射してリポソームを形
成させ、そして a’e) リポソームを単離する。 方法a)の別の例: a’a)インターリューキンの親水性溶液と有機溶媒に
溶かした脂質を混合し、 λ’b)混合物を凍結乾燥L7て凍結乾燥物を得、a’
c)凍結乾燥物を緩衝ri、(PH4〜7)にけんだく
し、 a’d)リポソームおよび/または集塊が生成するまで
溶液を攪拌し、 a / e )機械的手段により混合物をホモジネート
化し、そして a’f) リポソームを単離する。 これらの方法は、方法a)と類似の方法で行なえばよい
。 一方、この発明は、次の工程からなるインターリューキ
ン含有リポソームを製造する方21)を提供する: ba)インターリューキンの水性を基礎とする溶液と脂
質の有機溶液を混合し、 bb)ある程度リポソームおよび/または集塊か形成さ
れるまで混合物を超音波処理に付し、bc)例えば、 bi)U合物から有機溶媒を除去してゲル状中間相を形
成し、そして bll)ゲル状中間相をリポソームに転化することによ
り混合物からリポソームを回収する。 工程ba)において、「溶液」の語は、乳液のような「
プソイド(擬似)」溶液を包含する。しかしながら、均
質澄明な溶液を製造するのが好ましい。脂質を溶解また
は可溶性にするものならいずれの溶媒系を用いてもよい
。この系は単一溶媒または複数の溶媒の解合物であり得
る。また例えば15%以内の水を含んでいてもよい。所
望により、界面活性剤も存在し得る。 溶媒系は、蒸発により脂質から除去される適当な有機溶
媒を含むことができる。広範な種類のジエチルエーテル
やジイソプロピルエーテルのようなエーテル類、酢酸エ
チルのようなエステル類、メタノールや第三級ブタノー
ルのようなアルコール類およびメチレンクロライドやク
ロロホルムのようなハロゲン化炭化水素類を用いること
ができる。 所望により酢酸が存在してもよい。第三級ブタノールま
たは好ましくはジエチルエーテルまたはメチレンクロラ
イドを用いるのが好ましい。 インターリューキンを水または好ましくはpH4〜7,
4(例、5〜6.5)の水性緩衝系に溶解する。 水性緩衝液は例えば300モスモル/リットル以−ド、
特に290モスモ、v/’Jットル以下の低張液が好ま
しい。得られた混合物は好ましくは1 mb当たり約0
.001〜約0.2gの脂質を含有する。 工程bb)の場合、照射は超音波により行なうことがで
きる。このような照射の周波数は例えば30〜8QkH
zであり得る。通常の出力は照射される混合物の各々1
0−に対して200〜400ワツトである。当然のこと
ながら、金属による汚染を避けるため照射される混合物
を超音波発生器のチタニウムや他の金属から離すのが好
ましい。 温度は好ましくは約10〜70℃である。不飽和脂質の
場合は室温、飽和脂質の場合は60〜70℃が好ましい
。 この段階の間に集塊をともなうリポソームの乳濁液が生
成する。 従来方法でリポソームを回収するととができ、最も収率
を良くするように処置する。 工程1)において、有機溶媒を例えば10〜600m
m l−I g の低度減圧下で除去するのが好都合で
あり、水相のほとんどはそのまま残る。例えば室温また
は例えば45℃までの僅かな加温といった低温が好まし
い。 工程11)において、得られたゲル状中間相を水または
所望により前述の緩衝液で処理してリポソームを製造す
る。 一方、この発明は次の工程からなるインターリューキン
含有リポソームを製造する方法C)を提供する: Ca)インターリューキン、pH4〜8の水性に基つく
緩衝液および有機溶媒に溶かした脂質を混合し、 cb)得られたけんだ(液に超音波を照射してリポソー
ムまたは集塊を形成し、および cc)例えば ci)例えばゲル状中間相により、混合物から溶媒を濃
縮し、および C11)ゲル状中間相をリポソームに転化することによ
り混合物からリポソームを回 収する。 工程ca)lこおいて、「溶媒」の語は、乳液のような
「プソイド」溶液を包含する。しかしなから、均質澄明
な溶液を製造するのか好ましい。脂質を溶解または可溶
化するものならいずれの溶媒系を用いてもよい。この系
は単一溶媒または複数の溶媒の混合物であり得る。また
例えば15%以下の水を含んでいてもよい。所望により
、異聞活性剤が存在してもよい。溶媒系は、濃縮により
脂質から除去され得る任意の適当な有機溶媒を含み得る
。 広範な種頓のジエチルエーテルやジイソプロピルエーテ
ルのようなエーテル類、酢酸エチルのようなエステル類
、メタノールや第三級ブクノールのようなアルコール類
およびメチレンクロライドやクロロホルムのようなハロ
ゲン化炭化水素類を用いることができる。所望により酢
酸が存在してもよい。ジエチルエーテル、メチレンクロ
ライドまたは第三級ブタノールを用いるのが好ましい。 粉末形態のインターリューキンを用いることができ、例
えばその粒径は、直径60ミクロンの最大粒径を有する
ものが好都合である。 工程ca)の場合、用いる緩衝液は例えばpi−i3N
4.4、特に4〜7、特に5〜6.5のりん酸緩衝液が
好ましい。好ましくは水相は例えば300モスモル/リ
ットル以下、特に290モスモル/リットル以下の低張
液である。生成したけんたく液は好ましくは1rn!当
たり約0.001〜約0.2gの脂質を含有する。 工程cl))の場合、超音波により照射を行なうことが
できる。このような照射の好適な周波数は例えば30〜
80kHzである。通常出力は照射される混合物約10
1nlに対して200〜400ワツトである。当然のこ
とながら、金属による汚染を避けるため照射される混合
物を超音波発生器のチタニウムや他の金属から遠ざける
のが好まし温度は好ましくは約10〜70℃である。不
飽和脂質の場合は室温、飽和脂質の場合は60〜70℃
が好ましい。 この段階の間に集塊をともなうリポソームの乳液が生成
する。 従来方法によりリポソームを回収ずれはよいが、リポソ
ームの収率を最高にするような処置をとるべきである。 工程ci)において、例えば10〜600mmHgの圧
力で例えば水流ポンプを用いて低度減圧下に有機溶媒を
除去するのが好便であり、一方はとんどの水相はそのま
ま残る。例えば室温または例えば45℃以下の僅かな加
温といった低温が好ましい。 工程C11)tこおいて、生成したゲル状中間相を水ま
たは所望により前述の緩衝液で処理してリポソームを製
造する。 けんだく液が生成し得る。所望によりさらに濃縮して有
機溶媒および酸リポソーム形成物の残留痕跡を除去する
。 この発明によるリポソームを、さらに例えば工程ae)
の方法のように従来技術により単離する。 リポソームの純度は従来技術により測定することができ
る。 リポソーム中のインターリューキンの混入状態を測定す
るために、予備精製の粗製混合物を希釈し、例えば3〜
24時間遠心分離を行ない、上清液中のインターリュー
キンの量を測定する。欠に残留したインターリューキン
をリポソーム沈澱物にとり込む。 さらに、後の実施例で記載するように、標準的高速液体
クロマトグラフィー技術により精製リポソーム中のイン
ターリューキン混入量を測定することができる。 また、投与後の本発明によるリポソームの分布を例えば
動物試験における従来の薬物動力学技術により追跡する
ことができる。よう素−125とインターリューキンを
反応させるか、または例えば硫黄35により放射能で標
識付けしたアミノ酸からインターリューキンを製造する
ことにより、放射性インターリューキンを生成する。例
えば炭素−14により放射能で標識付けした脂質から製
造されたリポソーム中にこのインターリューキンを混入
し、マウスに注入する。1時間後マウスを殺し、例えば
ひ臓のような各々の脂管に存在する放射能の量と型を測
定する。 この発明のリポソームは、インターリューキンについて
公知の、様々な適用形態に使用され得る。 これらの適用として、培養および他の試験管内実験にお
ける動物細胞の成長促進用途があり、また種々の状態を
処置するための治療用途もある。 バイオアッセイ試験として徒述する一試験τ(才、マワ
スーT = IJ 7バ球#I胞系列(に ’I’ I
−L細胞ジ増殖のインターリューキン濃度依存刺激作用
に基づいてインターリューキンバイオアッセイを行なう
〔ニス・ギリスら、ジャーナル・オブ・イムノロジー(
J、I+nmunol 、 ) 1978年、120巻
、頁2027〜2032参照〕。 インターリューキン依存細胞培養のT細胞を洗浄してI
L−2を除去し、この発明によるリポソームで処理し、
I L−2不含有培地でインキユベートシた。次いで試
験細胞を常套的な系列希釈試験(希釈培地RPMI −
1640,10%うし胎仔血清を追加)に付した。24
時間にわたるインキュベーション後、リポソーム濃度の
増加に対応する細胞増殖状態を測定した。各希釈液につ
いて2.105の細胞を用いた。。 増殖は〔3H〕−チミジンの混和または光度測定MTT
試験により測定する(MTT = 3’ (’4.5−
ジメチルチアゾールー2−イル)−2,5−ジフェニル
テトラゾリンプロミド〕。生きている細胞の黄色MTT
を対応する暗青色ホルマザンに変換し、これを酸性イソ
プI7バノール;ご溶解後分光化学的に測定する。 最大増殖率の50%を示すサンプルの希釈液を測定する
。この発明によるリポソームの活性は、純粋なインター
リューキンの活性の約1,2〜20倍以下である。前記
試験において1,30g/ml より太き(宿性を有す
るリポソームを用いるのが好ましい。 また、■−リンパ球細胞が低下したマウス、例えばヌー
ドマウスにおけるIL−2活性の標準的生体内試験によ
り、活性を確認することができる。 一つの試験では、90■/kg のシクロスポリンAを
毎日投与してこのようなマウスを製造し、これをひつじ
赤血球(SRC)で免疫処置すると、シャーンプラーク
細胞形成アッセイによりひ臓中の特異的抗体細胞(PF
C)の数が減少する(80〜97%)。抗原を静脈注入
した後、マウスを数群に分け(1群当たり動物6〜7匹
)、5日間にわたり1日2回皮下注射または好ましくは
静脈内注射により約2〜5マイクログラムのI L −
2を含有する用量のIL−2製剤を与える。シャーン試
験によりひ臓中の特異的抗体細胞の数を測定して動物の
免疫回復を測定した。この発明のリポソームの活性は、
封入されていないインターリューキンと同じオーダーを
有する。 この発明のリポソームは、例えば本明細訂の冒頭で述べ
たようなインターリューキンに認められる免疫調整特性
に基づく特に興味ある治療用途、特に、重度複合免疫不
全症候群(SCIDS)、後天的免疫不全症候群(AI
DS)、老齢による免疫不全症状および先天的免疫不全
症のような免疫不全に起因する状態の処置用途に用いる
のが好ましい。しかしながら、またインターリューキン
は、サイトメガロウィルス感染症およびヘルペスウィル
ス感染症のような種々のウィルス性疾患の処置、ならび
に結核やハンセン氏病のようなバクテリア感染症の処置
における抗真菌剤として用いることができる。これらの
治療用途に必要なリポソームの用量は、処置される状態
、症状の重さ、混入されたインターリューキンの効力や
量などの公知の要因により異なる。 しかしながら、0.1μg〜30μg/kg 体重の範
囲のインターリューキンの1日用量を例えば人間の患者
のような哺乳動物に投与すると、一般に満足すべき結果
が得られる。一般ζこ好適な無菌媒体を用いた静脈内投
与が好ましい。 インターリューキンは、培養におけるT細胞成長促進能
力に基づく広範な種類の個別用途を有するが、その中に
は診断法および補助的治療処置における適用がある。診
断法上の用途は、尺度として細胞中における放射性チミ
ジンの取り込みを用い、インターリューキン添加後の試
験管内における一f IJンパ球成長の程度を測定する
ことにより、ある種の病気の存在を検出するという公知
の能力に基つく。抗腫瘍処置のような補助的治療処置を
行なう場合、インターリューキンは、患者または他の融
和性ドナーから得た”[’ IJンパ球の成長を試験管
内で促進するのに用いることができ、次いて得られた増
殖リンパ球を患者に再注入し、闘病を補助することにな
る。一般に、培養および他の試験管内実験においてT細
胞の成長を助けるのに用いるインターリューキンの量は
、その活性およびその系におけるひとインターリューキ
ンとの比較に関する文献から決定され、日常的な研空に
より、特定な状況に対して最も有効に用いられる。 以下、実施例によりこの発明を説明する。 以後用いられている「レシチン」の語は大豆レシチンを
指す。 特記しない限り、超音波放射は50K)Izおよび35
0Wで行なう。 工程A 実施例A1 リポソームの製造 2”QのひとLL−2を酢酸1mA’に溶かす。精製レ
シチン1グラムを別に第3ブタノール5mgに溶かす。 2つの溶液を一緒に混合し、−30℃で凍結乾燥して5
凍結乾燥物を得る。この凍結乾燥物を、0.05M%酸
緩衝液(115)に10ReにfXるまて吸収させ、け
んだ〈液をつくる。 けんだく液に5分間浴中て超音波を照射する。 つぎにけんだく液を窒素気流1約1500 Orpmの
速度で高速撹拌器〔タイプ・ポリトロン・タイ7 (T
ype Po1ytron Type)10−30 〕
を用0て15分間ホモジネート化する。次にリポソーム
溶液を、レシチンの相転移点よりも高い温度、例えば2
0℃で滅菌フィルター(0,2ミクロン月こ抑圧する。 次に得られたリポソーム溶液を凍結乾燥する。 所望により、高速撹拌段階を省いてもよく、また照射を
15分間続けてもよく、および/またはリポソームを遠
心分離により単離してもよい。 リポソームの分析 従来の逆相高速液体クロマ1グラフイー(1−I PL
C) 技術を用いてこの発明のリポソームを分析する
。 米国フローリー・ラボラトリーズ・インコーホレイテッ
ド市販の広い孔(約300オングストローム〕の球状c
=、B炭化水素支持材、10ミクロン〔例、カラム 技
P300アクアポア(Aqua−pore) 20 X
4.6 mrn 〕 を用いるのか好ましい。 好ましい溶シW剤系は、0,1%トリフルオロ酢酸含有
水/アセトニトリル勾配系であり、例えは次の2つの溶
離剤形を用いる: 系A250%アセトニトリル、l−120(+0.1チ
ドリフルオロ酢酸9 系8170%アセトニトリル、1(20(+0.1饅ト
リフルオロ酢酸)。 模範的な流速は3rILe/分で、10分間にわたり1
00パーセント系A〜100パーセント系Bの勾配を有
する。このような好ましい条件丁、ひとIL−2は約7
.5分の保持時間で溶離し、インクIJニーキンの量は
常法によるピークの集積によって得られる。 1−I P L Cの前に、この発明のリポソームを以
下のように予備処理する: リ P!(2,5〜4の酢酸緩衝液による希釈、その後
、リポソーム物質はインターリューキンを放出しなから
1−t p r−cカラム上で分解する。 n) リポソームに混入されたインターリューキンから
リポソーム賦形剤を徹底的な除去、ホスホリピドを除去
するための例えば水およびメタノール/メチレンクロラ
イドの使用1次いで得られたインターリューキン含有水
溶液の注入。 Fi) カラム切替技術により、この発明のリポソーム
に混入されたインターリューキンからリポソーム賦形剤
をカチオン型イオン交換剤上で分離する。その後インタ
ーリューキンをカチオン型イオン交換剤から逆相カラム
へ溶出して常法によりクロマトグラフィーに付す。好ま
しいカチオン型イオン交換剤カラムは30 X 4.6
mm の大きさを有し、10μmの支持物を詰めこん
だものである(米国ブローリー・ラボラトリーズ・イン
コーホレイテッド市販のSC×10)。 リポソームは、ひとjL−2の約50%を含有している
ことが見い出されている。 活性および用途 リポソームは、前述のバイオアッセイ試験の場合のひと
IL−2それ自体と同じ活性オーダーを示すことがわか
る。 実施例A2 リポソーム(v3)の製造 0.5■のひとIL−2を酢酸1me+ご溶解する。 レシチン(エピクロン(EPIKURON )145
V ) 500〜を別に【−ブタノール50mgに溶解
する。この2つの溶液を一緒に混合し、約16時間にわ
たり一15℃で凍結乾燥して、凍結乾燥物を得る。この
凍結乾燥物を0.05Mりん酸緩衝液(pi(6,5)
に吸収させてIon/!とし、けんだ〈液を得る。 このけんだ〈液に室温(約20℃)で5分間浴槽内で超
音波を照射する。次いでけんだく液を室温において約1
500Orpmの速度で高速撹拌器(タイプ・ポリトロ
ン PT15)を用いて10分間ホモジネート化する。 リポソームを4時間4℃、150000gで遠心分離に
より単離する。 実施例A3 リポソームの製造 超音波放射および室温の代わりに70℃の温度で高速撹
拌ホモジネート化を行ない、実施例A2を繰り返す。こ
こで用いるレシチンは、ソーヤ(大豆〕ホスファチドN
C95Hであった。遠心分離時間は2時間であった。 実施例A4 リポソームの製造 0、51ngのひとIL−2、レシチン(エピクロン(
EPIKURON)145 V ) 450 ’?およ
びホスファチジルセリン50■を【−ブタノール10m
eと一緒に混合し、室温で10分間照射して溶液を生成
する。これを約18時間−40℃で凍結乾燥し、凍結乾
燥物を形成する。 この凍結乾燥物を、10rul!となるまて0.05M
りん酸緩衝液(p H6,’3 )に吸収させてけんだ
く液を得る。室温(20℃)で10分間浴槽中てこのけ
んだ〈液に超音波を照射し、次いで10分間実施例2の
場合と同様ホモジネート化する。リポソームを4°C1
1’ 50000 !で、4時間遠心分離して単離する
。 実施例A5 リポソームの製造 レシチン450■とホスファチジルセリン50■の代わ
りにレシチン5oovtを用いて実施例へ4を繰り返す
。 実施例A6 リポソームの製造 レシチン450”?とホスファチジルセリン50〜の代
わりにレシチン425叩とコレステリンフ5m9を用い
て実施例A4を繰り返す。 実施例A7 リポソームの製造 高速撹拌工程を除き、実施例A2を繰り返す。 超音波照射を15分間続ける。 実施例A8 リポソームの製造 高速撹拌工程を除き、実施例A3〜6をそれぞれ繰り返
す。 リポソームの分析 上清液 遠心分離後の上清液を前述の逆相高速液体クロマトグラ
フィー技術により分析すると、10%以下の純粋ひとI
L−2を含有していた。 生物学的活性 リポソームを、前述の試験(ニス・ギルスら〕にしたが
い、IL−2依存CTLL−(i6)細胞における3〔
H〕−チミジンの混入に基づく系列希釈試験により分析
する。24時間後に104の細胞の最大成長の50%を
もたらすI L −2の濃度を製造後直ちに測定する(
値A、’ try/me)。この試験においてリポソー
ム形成のための出発原料として用いるひとIL−2それ
自体は0.2μfj/meの値を示した。 結果 実施例 A’(ng/mI) A2(ng/inl)A
4(ng/IT1す8A2 0.2 0.7 3.2 A3 9.5 8.4 nt A4 0.7 nt nt A5 2.6 nt n1 A6 1,6 nt nt A7”” l、Q n ((+ L 注9 ×:4℃の温度で4週間の貯蔵 ××:R初+7) I L−2チャージ0.8”Vml
活性nt=試験されていない 上記生体内試験において、前記試験で試験管内活性1.
7 ngAL13を有する実施例A2の貯蔵バッチのリ
ポソームについて以下の結果が得られた。 免疫された非低 −167,000100%下マウス(
対照9 低下マウス −28,00017% IL−2物質 5 111.000 66%リポソーム
5 96.700 58%IL−2物質 2 96.
700 58%リポソーム 2 87.100 52%
実施例9 リポソームの製造 0.5■のひとI L−2を酢# 1 mlに溶かし、
この溶液をメチレンクロライド50m1に溶かしたレジ
チア500”?(−r−ピクロ:/(EPIKURON
)145V)の溶液に加える。 混合物を1時間10〜50mmH9の減圧下30℃の温
度で、次いで3時間50℃の温度で回転エバポレータに
入れて濃縮し、脂質フィルムを得る。 このフィルムをpf15におけるりん酸緩衝液(0,0
2M ) 10nteに分散する。次いて、分散液を超
跨波浴槽に入れ、室温(20℃って30分間照射すると
、リポソームが生成する。 リポソームを4時間40℃、1.5000 f/で遠心
分離により単離する。 実施例AIO リポソームの製造 超音波放射処理を室温ではなく70℃の温度で行なって
実施例9を繰り返す。ここで用いるレシチンはソーヤ・
ホスファチツク(Soja phosphat −’C
)NC95s−1であった。遠心分離を2時間行なう。 リポソームの分析 実施例A4と同様にして分析を行なう。 結果 実施例 A’ (ng/mQ A 2(ngAn、aA
9 0.8 0.9 AIO2,53,5 方法B 実施例B1 リポソームの製造 レシチン100mPをメチレンクロライド5mgに溶か
し、丸底フラスコに入れる。0.’2”9のひと工L−
2,20〜のL−システィンおよび0.05Mりん酸緩
衝液(P I−15) 1 mliからなる水溶液を加
える。混合物を20℃で5分間超音波浴槽内で乳化する
(周波数80KI−1z)。 次いて乳液(予備形成リポソームおよび集塊をある程度
會有している〕を減圧下(20〜30mrnHり20℃
で濃縮し、得られたゲルを2rueの緩衝液に加え、混
合物をゆっくり撹拌する。水性リポソームけんだ〈液が
生成する。 次の工程にしたがい、リポソームを非混合活性剤から分
離する; a)遠心分離(5分、20°、5000G)。非混合活
性剤が上清液に残留。リボソーi沈澱物を再けんだくす
る。 b)ゲルカラムクロマトグラフィー〔バイオゲ/l/
(Biogel ) A 1.5または一1=7アデツ
クス(s−epHadex ) G 50を用いる〕。 リポソーム含有% 溶出液を限外濾過または0.マ塩水に対する透析により
濃縮する。 得られたリポソームけんだ〈液を凍結乾燥する。 分析 リポソームは、約50〜90チのひとIL−2を含有し
ていることがわかる。 活性および実用匹 リポソームは、前述のバイオアッセイ試験におけるひと
IL−2そのものと同じ活性オーダーを示すことがわか
る。 実施例B2 リポソームの製造 5001ngのレシチン(エピクロン145v)をメチ
レンクロライド200 trteに溶かし、丸底フラス
コに入tLルo O,5”P(7)ひとIL−2,10
0mWのし一システィンおよび0.05Mのりん酸緩衝
液(p)15 )10neを加える。 混合物を室温(20℃)で10分間、超音波浴槽中で乳
化する。次に得られた乳液(予備形成リポソームおよび
集塊をある程度含有しているりを減圧下(20〜30鰭
Hダ)10分間35℃で濃縮して得られたゲルに緩衝液
10m1を加える。混合物を室温で30分間撹拌する。 リポソームを、4時間、4℃、150000gで遠心分
離により単離する。 実施例B3 リポソームの製造 実施例B2と同様に行なうが、ただし10分間35℃で
はなく5分間80℃で濃縮する。ここで用いるレシチン
はソーヤ・ホスフェートNB951−1であった。4時
間ではなく2時間遠心分離を行なった。 実施例B4およびB5 リポソームの製造 実施例2および3と同様にして行なうが、ただしL−シ
スティンは存在させない。 リポソームの分析 上清液 遠心分離後の上清液を前述の逆相高速液体クロマトグラ
フィー技術により分析する。10%以下の原形ひとIL
−2を含有する。 生物学的活性 前述の試験(ニス・ギルスら)にしたがい、IL−2依
存CI−IL−(16)細胞中の3 [I−1)−チミ
ジンの混入に基づく系列希釈試験により、リポソームを
分析する。24時間後に104 の細胞の最大成長の5
0%をもたらすIL−2の濃度を、製造直後(値A0、
”Vral! )および4℃で貯蔵2週間後(値A2.
ng/rrte)に測定する。この試験において、ひ
とIL−2物質自体は0.2 ngAeの値を示した。 結果 実施例 A’ (ngAul) A2CngAne)B
2 0.8 2.4 B3 20.0 35.0 方法C 実施例C1 リポソームの製造 精製レシチン50マイクロモルおよびコレステロール5
0マイクロモルをクロロホルム20meに溶かし、窒素
気流下回転エバポレータで濃縮する。 残留物をジエチルエーテル5m/?に吸収させる。 600マイクログラムのひとIL−2(例えば粒径5〜
50ミクロンの粉末で)を加える。この溶液に、0.0
5モルのりん酸緩衝液1.5鮮を加える。 次に混合物を5分間5℃で超音波ブローベを用いて照射
し、ホモジネート化物を得る。生成した乳液を2段階に
分けて回転エバポレータで濃縮する。第1段階では圧力
は約400トールHgであり、粘稠性ゲルが生じるまで
そのままにしておく。 このゲルを0.0.5 Mりん酸緩衝1(p14s)1
.5rrteで処理し、軽く容器ごと振ると、水性けん
だ〈液が得られる。次いてこの水性けんだ〈液を室温お
よび常圧で15分間第2濃縮段階に進め、リポソームの
不透明けんだく液を得る。 有機溶媒の最終痕跡を除去するために、イオン交換カラ
ム(セファデックス650)上で限外r濾過を行なう。 リポソームの分析 リポソームは、約50〜90チのびとI L −2を混
入していることがわかる。 活性および実用性 リポソームは、前述のバイオアッセイ試験におけるひと
IL−2自体と同じ活性オーダーを示すことがわかる。 実施例C2 リポソームの製造 500m7のレシチン(エピクロン(EPII(UkO
N) 145 V ) オ、Jヒ’o、5myノ0トI
L−2をメチレンクロライド20al!に溶かす。0
05モルのりん酸緩衝液10罰を加える。 次に混合物を室温(約20℃って5分間、超音波浴槽内
で照射する。得られた乳液を、粘稠性ゲルが生じるまで
、10分間35℃で回転エバポレータに入れて濃縮する
。次に0.05Mりん酸緩衝液(PH5)10m、eを
加え、室温で30分間容器を回転する。 4時間4℃、150000gで遠心分離を行ない、リポ
ソームを単離する。 実施例C3 リポソームの製造 実施例C2を繰り返して濃縮するか、ただし35℃で1
0分間ではなく80℃で5分間続ける。 レシチンとしてソーヤ・ホスファティックNC9514
を用いた。2時間遠心分離を行なった。 リポソームの分析 −L清液 遠心分離後の上清液を、前述の逆相高速液体クロマトグ
ラフィー技術により分析する。10%以上の原形ひとI
L−2を言有する。 生物学的活性 前述の試験(ニス・ギルスら)にしたが0、lL −’
2依存CHLL−(’16 )細胞における3〔H〕−
チミジンの混入に基づく系列希釈試験によりリポソーム
を分析する。 24時間後に10 の細胞の最大成長の50%をもたら
すIL−2の濃度を、製造直後(値A0゜ngAne)
および4℃で貯蔵2週間後(値A2. ng鷹つに測定
する。この試験では、ひとI L −2物質自体はo、
2 ngAueの値を示した。 結果 実施例 AoC,ng/me) ;j’(ng/me)
C21,22,9 C312,5120,0 方法A、BまたはCに関する任意の1JIJ記実施例に
おいて、ひとIl、、−2をI I−−2−セリン12
5、IL−2A−1、IT、2 A−2,IL−2B−
1,IL−2B−2+IL−2Gln 26゜IL−2
pHe−121またはll−−25top121と置き
換えることができる、 特許出願人 サンド・アクチェンゲゼルシャフト代 理
人 弁理士 青 山 葆 はか】名第1頁の続き 優先権主張 [相]19844月9日0イギ1、[相]
198拝4月9日[相]イギー 〇198稗4月9日[相]イギI。 61M8月10日[相]イギー 〇1優体竿9月19日[相]イギ1」 01康4年9月19日[相]イギリ ;ス(GB)[相]8409126 [ス(GB)[株]8409127 □ス(GB)[相]8409128 ス(GB)[相]8420381 ス(G B )o8423700 ス(GB)[相]8423701 手続補正書(、イ、 昭和60年4月 特許庁長官 殿 1事件の表示 乙。−1っf249 2、発明の名称 ・ インターリューキン療法に関する改良 3補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 スイヌ国バーゼルc番地の表示なし)名称 サン
ド・アクチェンゲゼルシャフト4代理人 住所 大阪府大阪市東区本町2−10 本町ビル内氏名
弁理士(6214)青 山 葆 はか 1名5補正命
令の日付:自発 6、補正の対象:明細書の特許請求の範囲の欄7、補正
の内容:別紙の通り。 特許請求の範囲 (1) インターリューキン含有リポソーム。 (2) インターリューキンがひとIL−2である、特
許請求の範囲第1項記載のリポソーム。 (3) インターリューキンがIL−2−セリン125
である、特許請求の範囲第1項記載のリポソーム。 (4) インターリューキンかIL−2A−1、IL−
2A−2、IL−28−1またはIL−2B−2である
、特許請求の範囲第1項記載のリポソーム。 (5) インターリューキンかIL−2GIn−26、
IL−2Phe −121またはIL−2Stop−1
21である、特許請求の範囲第1項記載のリポソーム。 (6)特許請求の範囲第1〜5項のいずれか1項に記載
のインターリューキン含有リポソームを静派内注入によ
り投与するこ・とからなる、インターリューキン処置を
必要とする対象に対するインターリューキン投与の改良
法。 (7) a)有機溶媒中の脂質とインターリューキンの溶液を形
成し、 b)溶液から溶媒を除去して残留物を得、C)残留物を
緩衝液に懸濁し、 d)リポソームが生成するまで懸濁液を攪拌、ホモジネ
ート化し、および e)リポソームを単離する ことからなる、インターリューキン含有リポソー(8) a)インターリューキンの水溶液と脂質の有機溶液とを
混合し、 b)リポソームおよび/または集塊が形成するまで混合
液に超音波放射線を照射し、 C)混合液からリポソームを回収する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 (9) a)インターリューキン、pH4〜8の水性に基づ(緩
衝液および有機溶媒に溶かした脂質を混合し、 b)生成懸濁液を超音波処理してリポソームまたはその
集塊を形成し、 C)混合物からリポソームを回収する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 αl 緩衝液がpH4〜7のものである、特許請求の範
囲第9項記載の方法。 ■ i)混合物から溶媒を蒸発させてゲル状中間相を形成し
、そして l)ゲル状中間相をリポソームに転化させることにより
リポソームを特徴する特許請求の範囲第9項記載の方法
。 ■ 1)混合物から溶媒を蒸発させてゲル状巾中間相を形成
し、 −)ゲル状中間相をリポソームに゛転化させることによ
りリポソームを特徴する特許請求の範囲第8項記載の方
法。 3 a)インターリューキンの親水性溶液を有機溶媒に溶か
した脂質と混合し、 b)水および有機溶媒を蒸発留去し、 c) pH4〜7の緩衝液に残留物を吸収させて懸濁液
を形成し、 d)懸濁液に超音波を照射してリポソームを形成し、詔
よび e)リポソームを単離する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 114) λ)インターリューキンの親水性溶液を有機溶媒に溶か
した脂質と混合し、 b) 111合物を凍結乾燥して凍結乾燥物を得、C)
凍結乾燥混合物を緩衝剤溶液(pH4〜7)に懸濁し、 d)リポソームおよび/または集塊が生成するまで溶液
を攪拌し、 e)混合物を機械的手段でホモジネート化し、および、 f)リポソームを単離する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 (15)実質的に実施例のいずれか1つにつl、>て後
述する、インターリューキン含有リポソームの製造方法
。 (16)特許請求の範囲第6〜15項のし)ずれ力)1
項に記載の方法により製造されるリポソーム。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1) インターリューキン含有リポソーム。 (2) インターリューキンがひとIL−2である、特
許請求の範囲第1項記載のリポソーム。 (3) インターリューキンがIL−2−セリン125
である、特許請求の範囲第1項記載のリポソーム。 (4) インターリューキンがIL−2A−1、IL−
2A−2、ll−−2B−1またはIL−2B−2であ
る、特許請求の範囲第1項記載のリポソーム。 (5) インターリューキンがIL−2GIn−26、
IL−2Phc −121または1t−2Stop−1
21である、特許請求の範囲第1項記載のリポソーム。 (6)特許請求の範囲第1〜5項のいずれか1項に記載
のインターリューキン含有リポソームを静脈内注入によ
り投与することからなる、インターリューキン処置を必
要とする対象1こ対するインターリューキン投与の改良
法1゜ (7)有機溶媒中の脂質とインターリューキンの溶液を
用いる方法であって、 a)有機溶媒中の脂質とインターリューキンの溶液を形
成し、 b)溶液から溶媒を除去して残留物を得、C)残留物を
緩衝液に懸濁し、 d)リポソームが生成するまで懸濁液を攪拌、ホモジネ
ート化し、および e)リポソームを単離する ことからなる方法。 (8) a)インターリューキンの水溶液と脂質の有践溶液とを
混合し、 b)IJポソームおよび/または集塊が形成するまで混
合液に超音、波放射線を照射し、C) ffi合液から
リポソームを回収することからなる、インターリューキ
ン含有リボン−ムの製造方法。 (9) a)インターリューキン、pH4〜8の水性に基づく緩
衝液および有機溶媒に溶かした脂質を混合し、 b)生成懸濁液を超音波処理してリポソームまたはその
集塊を形成し、 C> a合物からリポソームを回収することからなる、
インターリューキン含有リポソームの製造方法。 (10)緩衝液がpH4〜7のものである、特許請求の
範囲第9項記載の方法。 (11) 1)混合物から溶媒を蒸発させてゲル状中間相を形成し
、そして 11)ゲル状中間相をリポソームに転化させることによ
りリポソームを特徴する特許請求の範囲第9項記載の方
法。 (12) 1)混合物から溶媒を蒸発させてゲル状中中間相を形成
し、 11)ゲル状中間相をリポソームに転化させることによ
りリポソームを特徴する特許請求の範囲第8項記載の方
法2 (131 a)インターリューキンの親水性溶液を有機溶媒に溶か
した脂質と混合し、 b)水および有機溶媒を蒸発留去し、 c)pH4〜7の緩衝液に残留物を吸収させて懸濁液を
形成し、 d)懸濁液に超音波を照射してリポソームを形成し:お
よび e)リポソームを単離する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 (14) a)インターリューキンの親水性溶液を有機溶媒に溶か
した脂質と混合し、 b)混合物を凍結乾燥して凍結乾燥物を得、C)凍結乾
燥混合物を緩衝剤溶液(pH4〜7)に懸濁し、 d)リポソームおよび/または集塊が生成するまで溶液
を攪拌し、 e)混合物を機械的手段でホモジネート化し、および、 f)リポソームを単離する。 ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 05ノ 実質的に実施例のいずれか1つtこついて後述
する、インターリューキン含有リポソームの製造方法。 (16) 特許請求の範囲第6〜15項のいずれか1項
に記載の方法により製造されるリポソーム。
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