JPH08512056A

JPH08512056A - リポソームの製造法

Info

Publication number: JPH08512056A
Application number: JP7503613A
Authority: JP
Inventors: フー，チャン・シー
Original assignee: ジェネンテク・インコーポレイテッド
Priority date: 1993-06-30
Filing date: 1994-06-29
Publication date: 1996-12-17
Also published as: DE69407292T2; EP0706374B1; EP0706374A1; AU689786B2; WO1995001164A1; AU7215194A; DE69407292D1; US5653996A; CA2163860A1

Abstract

(57)【要約】二重層形成性物質および場合によりさらなる分子を含む溶液の水性表面上でのエアロゾル化を利用したリポソームの製造法を提供する。該エアロゾル化は振動数発生振動ノズルを通して噴霧する霧である。

Description

【発明の詳細な説明】リポソームの製造法発明の背景Ｉ．本発明の分野本発明は、リポソームの製造法、および特定の利用に適したリポソームの製造に関する。 II．背景および関連分野の説明リポソームは、種々のタイプの脂質、リン脂質および２次的な親油性成分から主に構成される小さい、球状の小胞である。生体膜の脂質配列と同様に、これら成分は二重層形態で普通配列する。典型的に、成分脂質または脂質様分子の極性末端を周囲溶液（通常、水性溶液）に接触させ、該脂質または脂質様分子の非極性疎水性末端を別の脂質または脂質様分子の非極性疎水性末端と接触させる。得られる二重層膜はある大きさ、疎水性度、形、および正味の電荷の分子を選択的に透過させ得る。殆どのリポソームは性質が脂質または脂質様であるが、Uster等の出願［ＷＯ９２／０３１２３号（１９９２年３月５日公開）］には、脂質またはコレステロールのいずれかを伴う界面活性剤を含んでなる、リポソーム別の二重層配合物が記載されている。リポソームは多くの治療、診断、産業および商業に利用されている。リポソームは水に容易に溶解しない分子の輸送に、または直接的な時間を合わせた放出が所望される場合に用いる。多くの化学化合物に対する選択的透過性のため、リポソームは薬物および生体物質の輸送ビヒクルとして有用である。輸送すべき化合物をリポソーム内部に備えることができ、そこでは該化合物は外環境から保護されている。また、輸送の標的とされる化合物が親油性であるかまたは化学的に脂質と結合しているなら、それらをリポソームの脂質二重層中に組み込むことができる。標的部位に到達した時、リポソームを崩壊するか（例えば、胃腸管において酵素により）、または細胞膜と融合することができる。リポソームの崩壊またはリポソームと細胞膜の融合は化合物の放出をもたらす。数種のリポソーム製造法が知られている。一般に使用される方法の一般的総説については、Szoka等，Ann．Rev．Biophys．Bioeng.，９：４６７−５０８（１９８０年）を参照。これら製造法のうちより一般的なものでは、１）脂質を含有する溶液の超音波処理（時には次いで蒸発／凍結乾燥および再水和する）［例えば、Stryer，Biochemistry，pp.２９０−２９１（Freeman & Co.，ＮＹ，１９８８年）、およびOhsawa等，Chem．Pharm．Bull.，３２：２４４２（１９８４年）を参照］、２）脂質溶液のホモジナイゼーション（時には高圧または高剪断力で）［例えば、米国特許第４,７４３,４４９号（１９８８年５月１０日登録）、および米国特許第４，７５３,７８８号（１９８８年６月２８日登録）を参照］、３）小胞形成脂質の乾燥フィルムの水和および時には超音波処理（ここで、脂質フィルムは有機溶媒に溶解した脂質溶液の蒸発によって調製する）［例えば、米国特許第４,４５２,７４７号（１９８４年６月５日登録）、米国特許第４,８９５,７１９号（１９９０年１月２３日登録）、および米国特許第４，９４６，７８７号（１９９０年８月７日登録）を参照］、４）凍結乾燥または蒸発および再水和［例えば、米国特許第４,８９７,３５５号（１９９０年１月３０日登録）、ＥＰ２６７,０５０号（１９８８年１１月５日公開）、米国特許第４,７７６,９９１号（１９８８年１０月１１日登録）、ＥＰ１７２,００７号（１９８６年２月１９日公開）、および豪州特許出願ＡＵ−Ａ−４８７１３／８５号（１９８６年４月２４日公開）を参照］、５）溶媒注入または脂質溶液の水性媒質への注入もしくはその逆［例えば、Batzri等，Biochim．Biophys．Acta.，２９８：１０１５−１０１９（１９７３年）、米国特許第４,９２１,７５７号（１９９０年５月１日登録）、米国特許第４,７８１,８７１号（１９８８年１１月１日登録）、ＷＯ８７／０２３９６号（１９８８年３月２４日公開）、および米国特許第４, ８９５,４５２号（１９９０年１月２３日登録）を参照］、６）噴霧乾燥［例えば、豪州特許出願ＡＵ−Ａ−４８７１３／８５号（１９８６年４月２４日公開）、および米国特許第４,８３０,８５８（１９８９年５月１６日登録）を参照］、７）濾過［例えば、ＷＯ８５／０１１６１号を参照］、８）逆相蒸発［例えば、Szoka等，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ，７５：４１９１− ４１９９（１９７８年）を参照］、および上記方法の組合せ［例えば、Pick，Ar ch．Biochem．Biophys. ，２１２：１８６−１９４（１９８１）、およびKasahar a等，J．Biol．Chem.，２５２：７３８４−７３９０（１９７７年）を参照］。また、脂質溶液を噴霧してリポソームを形成する方法についても知られているが、これら方法は圧力下での噴霧を通常必要とし、これは非能率的であり、リポソーム成分溶液の損失に帰着する。米国特許第４,５０８，７０３号（１９８５年４月２日登録）において、脂質を適当な溶媒に溶解し、溶媒の沸点よりも高温に加熱された気体を含有する封じたチェンバー中へ噴霧器または噴霧ノズルを通してこの溶液を噴霧することによるリポソームの製造が開示されている。溶媒を蒸発させ、脂質粒子およびリポソームを形成し、乾燥混合物として回収する。次いで、この乾燥リポソームおよび脂質粒子を水性媒質中で水和することができる。ＰＣＴ出願ＷＯ８９／１１８５０号（１９８９年１２月１４日公開）において、脂質二重層中に捕捉されたか、または二重層の成分と結合した、さらに適切に言えば球状の二重層によって作られた空間内に捕捉されている物質をさらに有するリポソームを形成するための方法が教示されている。この出願において、非加圧ヘアスプレー、殺虫剤等を他の表面に当てるために一般に用いられるような、トリガーポンプまたは噴霧器中に物質を注入することにより、エアロゾル化を用い得ることが教示されている。この出願によると、（脂質および物質の）調製した溶液を噴霧すると、該溶液がノズルから出ると該溶液は空気と混合し、揮発性溶媒が蒸発する。英国特許出願ＧＢ２,１４５,１０７Ａ号（１９８５年３月２０日公開）において、リポソームを含有するエアロゾルスプレーの製造が教示されている。このリポソームを圧力下で水性溶液および脂質混合物を混合し、なお圧力下でこの混合物をノズルまたは他のアレンジメントに通して、リポソーム含有エアロゾルスプレーを製造する。ＷＯ８７／０７５０２号（１９８７年１２月１７日公開）において、１またはそれ以上の揮発性液体推進剤、プロペラントに溶解した１またはそれ以上の膜脂質、および１またはそれ以上の生物学的に活性な化合物を含有する溶液を圧力下で噴霧することによる、プローリポソームエアロゾルの形成が開示されている。ＥＰ３５７,７７３号（１９９０年３月１４日公開）において、脂質を有機溶媒に溶解し、溶媒を蒸発させ、水性溶液を乾燥脂質フィルムに加え、溶液を超音波処理して脂質の均一な懸濁液を製造し、不活性ガスを溶液に注入して溶液を加圧し、そしてノズルを通して加圧した溶液を輸送してリポソームを形成することによる、リポソームの製造法が開示されている。ＥＰ１９０,９２６号（１９８６年８月１３日公開）において、最初に脂質を有機溶媒と混合し、水を加え、次いでこの溶液を加圧し、そしてノズルに通してエアロゾルスプレーを製造することによる脂質の形成が教示されている。米国特許第５,１９２,５２８号において、肺の症状または疾患を治療するために治療投与量の薬物を肺に輸送するための方法が教示されている。気道の選択された領域に粒子が沈着するのを有利にはこぶエアロゾル粒子サイズを生成する条件下で、リポソーム捕捉形態の滴を含有するリポソームの水性懸濁液をエアロゾル化する。これらの条件は、水性リポソーム懸濁液を噴霧器に入れ、圧縮した空気を噴霧器に供給する圧搾空気噴霧器の使用を伴う。圧搾空気は規定されたサイズの口を有するノズルを通してリポソーム懸濁液を押し出す。次いでこのエアロゾルを、大きいエアロゾル粒子を捕らえ小さいエアロゾル粒子を通す調節壁にあてる。またこの特許により、担体流体を粉砕して水性粒子の細かい霧にする超音波エネルギーを用いてリポソームの水性懸濁液をエアロゾル化するのに適した非特定の装置を使用することが示唆される。ＥＰ３３５,１３３号（１９８９年１０月４日公開）において、肺界面活性剤タンパク質および関連する脂質を含んでなるリン脂質／ペプチド混合物と共に、患者に輸送すべき薬物をリン脂質／ペプチド混合物に組み込むことが開示されている。界面活性剤は空気−水界面の表面張力に影響を及ぼす化合物である。それ自体で界面活性剤は肺の生体膜のような液体界面を越える気体の輸送の速度を変えることができる。界面活性剤の重要なクラスのうちの１つは、肺胞上に存在し、細胞膜を越えてこれら細胞内への酸素の輸送を促進するのに役立つ肺界面活性剤である。肺界面活性剤は種々の脂質および少なくとも３個の異なるタンパク質（ＳＰ− Ａ、ＳＰ−Ｂ、およびＳＰ−Ｃと呼ばれる）のコンプレックスである。文献には、ＤＰＰＣを伴うものを含む種々の肺界面活性剤タンパク質調製物が包含される。通常、調製物は５つのタイプに分類され得る。これらには、１）天然ヒト界面活性剤（ヒト羊膜液体から精製）［Merritt等，N．Engl．J．Med．３１５：７８７（１９８６年）］、２）半合成界面活性剤（ＤＰＰＣおよび高密度リポタンパク質を混合することにより調製）［Halliday等，Lancet１：４７６（１９８４年）］、３）動物肺界面活性剤（全肺または洗浄流体の有機抽出により単離）［Fu jiwara（同上）；Enhorning等，Pediatrics７６：１４５（1９８５年）；Kwong 等，Pediatrics７６：５８５（１９８５年）］、および４）界面活性剤脂質と再構成された精製ヒト界面活性剤アポタンパク質（天然源から精製されたかまたは組換えＤＮＡ技術により得られたＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、および／またはＳＰ−Ｃ［Jobe等，Am．Rev．Resp．Dis．１３６：１０３２（１９８７年）およびGlasse r等，J．Biol．Chem．２６３：１０３２６（１９８８年）を参照］）［Revak等，J．Clin．Invest．８１：８２６（１９８７年）］が含まれる。シリーズ８７００−１２０ノズルを含むＳＯＮＯ−ＴＥＫ Corporation（Poug hkeepsie，ＮＹ）によって製作されたもののような超音波噴霧ノズルが市販されており、これは圧力を使用せずに液体を噴霧する。このＳＯＮＯ−ＴＥＫノズルは、タンパク質、抗体、シリコン、潤滑剤、診断用および消毒用物質を伴う医薬製品の被覆、ならびに薬物封入に適当であると製造業者により示唆される。また、例えば米国特許第４,３０１,９６８号（１９８１年１１月２４日登録）を参照すると、溶液を一様に噴霧し、噴霧器を通る溶液の流量を変化させることができる超音波噴霧器が開示されている。米国特許第４,３３７,８９６号（１９８２年７月６日登録）において、前以て決定した円錐角を有する円錐形噴霧パターンおよび溶液の均一な散布パターンを得ることのできる噴霧界面を有する超音波燃料噴霧器が開示されている。上記の引用した文献の多くはリポソームの製造法を開示しているが、該方法は多工程であり、従って扱いにくく労働集約的であるか、または脂質および／もしくは他の二重層形成性物質の浪費に帰着するか、またはリポソームとの結合もしくはリポソーム中に組み込まれることが所望されるパッセンジャー分子もしくは活性物質の低い割合での組込みを有する。従って、大規模での使用に適当な経済的かつ効率の良いリポソームの製造法を提供することが本発明の目的である。該目的および他の目的は当業者にとって明白であるだろう。本発明の要旨本発明の目的に従い、二重層形成性物質（例えば、脂質、界面活性剤、または脂質様二重層形成性物質）、および場合によりパッセンジャー分子よりなる第１溶液を調製し、加圧することなく第１溶液を第２溶液の界面上または下に噴霧することによりリポソーム懸濁液を形成することを含んでなるリポソームの製造法を提供する。いずれの特定の作用機構に限定されることなく、緩衝液に溶媒を抽出し希釈する際、二重層形成性物質（およびある程度のパッセンジャー分子）は不溶性になり、リポソームを即座に形成すると信じられている。リポソームの形成に次いで、例えば限外濾過によって懸濁液を濃縮することができる。本発明の好ましい態様において、Filtron膜モジュールからなる接線流出積重（tangential flow stack）が用いられる。所望のリポソームの濃縮が行われた後、必要なら例えば新鮮な緩衝液でのダイア濾過(diafiltration)によって残留溶媒を除去することができる。使用のための懸濁液を調製するか、またはリポソームをバイアルもしくは他の容器に導入し凍結乾燥させるかもしくは保存用に準備することにより、濃縮リポソーム懸濁液をさらに処理することができる。長期保存のために、生成物を凍結乾燥し、凍結分子が動かない温度でかつ任意の相転移以下の温度で保持することが現在好ましい。好ましい態様の１つにおいて、第１溶液はイソプロピルアルコールのような有機溶媒に溶解した脂質からなり、第２溶液は水性である。別の好ましい態様において、第１溶液の二重層形成性物質には天然肺界面活性剤に存在する脂質および／またはタンパク質が含まれ、製造したリポソームは呼吸障害を患っているまたは患う危険のある患者のための治療用に使用される。本発明の方法において、第１溶液を超音波振動数で振動するノズルを通して噴霧し、第１溶液を噴霧する間に大気圧以上に第１溶液の加圧を必要としない方法を用いる。図面の簡単な説明図１は、本発明の新規な方法の模式的な例を説明する。本発明の詳細な説明本発明は、治療用、診断用、化粧用物質の輸送に使用するためのリポソームの新規で有用な製造法を記載する。本発明は、大規模におけるリポソームの経済的かつ効率の良い製造法を提供する。Ｉ．リポソーム組成物の製造Ａ．典型的には、リポソーム成分は、閉鎖ラメラ二重層相を形成することができる両親媒性物質（本明細書中「二重層形成性物質」と称する）および、輸送されるべき、または標的輸送に有用である、または延長された半減期のようなリポソームに有用な性質を与えるさらなる物質、および溶媒である。成分の混合物を用いることができる。１．本発明における使用に適当な脂質および脂質様成分には、リン脂質、リン脂質混合物、極性脂質、中性脂質、脂肪酸、およびそれらの誘導体が含まれる。好ましい脂質は、脂質転移温度より高い温度で水中に単独で分散する場合、脂質エマルジョン相中にあるという特徴を有する。幾つかの態様において、脂質は約１２個以上の炭素の１本鎖脂肪族脂質であり、飽和または不飽和のいずれかであるか、または他の方法で置換され得る。適当な脂質にはエステル、アルコールおよび以下の脂肪酸の酸形態が含まれる：ステアリン酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、および他の１本鎖脂肪族酸。さらに候補としてエステル、アルコールならびにレチノール類の酸形態、特にレチノールおよびレチノイン酸が含まれる。特に好ましい脂質にはホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、および合成的に製造されたかまたは種々の天然源から誘導されたそれらの誘導体が含まれる。幾つかの態様において、リポソームはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の組込みによるか、または合成リン脂質のＰＥＧヘッドグループ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）にコンジュゲートしたＰＥＧ）によって立体的に安定化される［例えば、the method of Papahadjopoulos等，Proc. Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ８８：１１４６０−１１４６４（１９９１年）を参照］。２．界面活性剤は、本発明の使用に適当な二重層形成性物質であり、典型的に Tween、Triton、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウレル硫酸ナトリウム、またはナトリウムオクチルグリコシドのような良好な混和性を有する界面活性剤である。好ましい界面活性剤は、界面活性剤の相転移温度以上で水溶液に加える場合ミセルを形成し、１またはそれ以上の脂肪族鎖からなる。これらの脂肪族鎖は飽和、不飽和、または他の方法で置換されていてよく（例えば、エトキシル化）、典型的には脂肪族鎖は約１２個以上の炭素を含む。さらに適当な界面活性剤には以下のものが含まれる：ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−スルホベータイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、またはセチル− ベータイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノールアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアルアミドプロピル−ベータイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアルアミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−、またはジナトリウムメチルオレイル− タウレート；およびＭＯＮＡＱＵＡＴシリーズ（Mona Industries，Inc.，Pater son，New Jersey）。 Uster等の出願［ＷＯ９２／０３１２３号（１９９２年３月５日公開）］において、脂質またはコレステロールのいずれかを伴う界面活性剤を含んでなるリポソーム別の二重層製剤が開示されている。３．ステロールおよびステロールエステルもまた本発明における使用に適当であり、コレステロール、コレスタノール、硫酸コレステロールならびに他のコレステロール類似体および誘導体を含む。４．２本鎖グリセロリン脂質もまた本発明のリポソームに組み込むことができる。５．さらなる物質が本発明のリポソームと結合するかまたはそれに組み込まれるのが望ましい。これらさらなる物質は、本明細書中において「パッセンジャー分子」と称され、リポソームに可溶性であり、球状二重層内に形成された空間に保持されるか、または形成された二重層内に保持されるかもしくは該二重層と結合することを意図された物質である。パッセンジャー分子の取込みは、パッセンジャー分子の溶液と前以て形成されたリポソーム懸濁液と混合し、パッセンジャー分子がリポソーム二重層中へ挿入されるまでインキュベートすることにより容易に達成される。または、パッセンジャー分子をリポソームの製造において用いる二重層形成性物質と混合する。または、パッセンジャー分子およびリポソームを下記のような通常の薬理学的に許容され得るビヒクル中に製剤化する。抗菌剤、抗ウイルス剤（例えば、フルオロウラシル、ヨードウリジン、トリフルオロウリジン、ビダラビン、アジドチミジン、リバビリン、ホスホノホメート、ホスホノアセテート、およびアシクロビル）、抗炎症剤（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、および非ステロイド系抗炎症剤）、抗癌薬物（例えば、シスープラチンまたは５−フルオロウラシル）、抗寄生生物剤、抗アレルギーおよび抗喘息剤（例えば、アレルゲン、クロモリン、セメチジン、ナファゾリン、ロドキサミド、エフェドリンおよびフェニルエフィン）、染料、蛍光化合物、放射性同位元素標識（例えば、ヨウ素、レニウム、トリチウム、α粒子放射性同位元素）、放射線不透過性化合物、ビタミン、ミネラル、プラスミド、ベクター、ウイルス粒子、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ヌクレオチド、炭水化物（例えば、天然または合成の単糖類および多糖類ならびに糖類）、受容体、成長因子、ホルモン、神経伝達物質、抗腫瘍性抗生物質、成長因子、毒素、鎮痛薬、麻酔薬、麻薬、触媒、酵素、ならびに他の生物学的に活性な無機および有機分子のようなパッセンジャー分子は、利用できる基質の種類の例である。パッセンジャー分子が親油性であることが最も好ましいが、親水性物質もまた二重層（即ち、極性ヘッドグループ）との結合を形成することができるなら有用であり得る。このリストは広範囲であるが、決して限定的であることを意図せず、単に例示である。本明細書中に用いられる用語「細胞毒素部分」は、細胞毒性放射性薬品としての放射性同位元素、および細胞毒性薬物または細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素のような毒素、またはこのような毒素の酵素的に活性なフラグメントを含むことが意図されている。使用される酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosaから）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰII、およびＰＡＰ −Ｓ）、モモルディカチャランティア阻害物質、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリス阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンである。本発明はリポソーム中に含まれるか、またはリポソームにコンジュゲートした細胞毒性部分を含む。リポソームおよびこのような細胞毒性部分のコンジュゲートを、種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて調製する。このような試薬の例には、ＳＰＤＰ、ＩＴ、ジメチルアジピミデートHclのようなイミドエステルの二官能性誘導体、ジスクシンイミジルスベレートのような活性エステル、グルタルアルデヒドのようなアルデヒド、ビス(ｐ−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミンのようなビス−アジド化合物、ビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル) −エチレンジアミンのようなビス−ジアゾニウム誘導体、トリレン２,６−ジイソシアネートのようなジイソシアネート、および１,５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼンのようなビス−活性フルオリン化合物が挙げられる。毒素の溶解する部分はリポソームに結合することができる。特に好ましい毒素はリシンＡ鎖である。最も有利にリシンＡ鎖は脱グリコシル化されるか、またはオリゴ糖類なしで製造されて、不適切なクリアランス機構（例えば、肝臓）によってそのクリアランスを減少させ、組換え法により製造される。別の態様において、Ｂ鎖のガラクトース結合特性がブロックされ得るなら（「ブロックされたリシン」）、全リシン（Ａ鎖＋Ｂ鎖）をリポソームに組み込むか、またはリポソームにコンジュゲートする。パッセンジャー分子としての使用に適当であるか、またはリポソームに結合しているリシン免疫毒素の有利な調製法がVitetta等［Science ２３８：１０９８（１９８７年）］によって記載されている。さらなる態様において、毒素コンジュゲートをFabまたはＦ(ab')₂フラグメントを用いて調製する。それらのサイズが比較的小さいため、これらフラグメントはより良く組織に浸透して感染細胞に到達し得る。これらコンジュゲートをパッセンジャー分子として用いるか、またはリポソームに結合させることができる。別の態様において、fusogenicリポソームを細胞毒性薬物で満たし、ＨＩＶ抗原をその表面で提示するＴ細胞のような感染細胞に特異的に結合する抗体でリポソームを被覆する。用語「生物学的に活性な分子」は、投与する生物に影響を及ぼす天然または合成化合物として本明細書中で定義される。生物学的に有用なポリペプチドの代表的な例には、とりわけ、核タンパク質、糖タンパク質、およびリポタンパク質が含まれる。本発明に従い製造されるリポソームはまた、遺伝子治療のための核酸を輸送するか、機能する置換遺伝子を適切に提供するか、または新しいかもしくは高められた遺伝子機能を導入するために用いられる。多くのタンパク質クラスは、この方法における使用に適当であり、これらには抗体、酵素、ホルモン的に活性なポリペプチド、リンホカイン、モノカインおよびサイトカインのような免疫モジュレーター、成長調節および刺激タンパク質、血液タンパク質、ならびにウイルス、細菌および寄生生物のワクチンのための抗原が含まれる。適当なタンパク質の具体的な例には、α−、β−、およびγ−インターフェロン、腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β、プラスミノーゲンアクチベーター（例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター）、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼ、リラキシン、免疫グロブリン、ＣＤ４、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、ＤＮアーゼ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＮＦ、アクチビン、インヒビン、ＥＧＦ、ＩＧＦ、エンケファリナーゼ、血液凝固因子（例えば、因子VIIIおよび組織因子ならびにそのフラグメントまたはアミノ酸配列変異体およびそれに対する抗体）が含まれる。この方法に用い得る他の生物学的に活性な分子の例には、ステロイド、脂質、合成および天然薬物、抗腫瘍性抗生物質（例えば、ドキソルビシン）核酸、およびアミノ酸が含まれる。好ましい態様の１つにおいて、生物学的に活性な分子はＤＰＰＣ、ＰＯＰＧ、または肺界面活性剤のＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、および／またはＳＰ−Ｃタンパク質として知られる１またはそれ以上のタンパク質のような天然肺界面活性剤の成分を含んでなる。この界面活性剤は二重層の一部であり、それともまたはさらにリポソーム内に存在することができる。肺界面活性剤を既知の方法により合成ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、卵または合成ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、および精製界面活性剤アポタンパク質（ＳＰ−Ｂおよび／またはＳＰ−Ｃおよび／またはＳＰ−Ａ）から調製することができる。精製界面活性剤アポタンパク質を、公知のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を用いる組換え法また直接合成によって得る［Glasser等，Proc．Natl．Acad．Sci．Ｕ.Ｓ.Ａ．８４：４００７（１９８７年）；Jacobs等，J．Biol．Chem．２６２：９８０８（１９８７年）；Floros等，J．Biol．Chem．２６１：９０２９（１９８６年）；White等，Nature ３１７：３６１（１９８５年）；Whitsett等，Pediatr． Res．１９：５０１（１９８５年）；Warr等，Proc．Natl． Acad．Sci．Ｕ.Ｓ.A．８４：７９１５（１９８７年）；Hawgood等，Proc．Natl ．Acad．Sci．Ｕ.Ｓ.Ａ．８４：６６（１９８７年）；G1asser等，J．Bio1．C hem．２６３：９（１９８８年）；G1asser等，（同上）J．Biol．Chem．２６３：１０３２６（１９８８年）；およびJobe等，Am．Rev．Resp．Dis．１３６：１０３２（１９８７年）］。望ましくは、界面活性剤アポタンパク質を界面活性剤脂質と再構成する［Revak，同上］。ヘアスプレー、着色料、染料等のような化粧品または化粧品成分はリポソームへの組み込みに適当である。マウスウォッシュ、のどスプレー、防腐スプレー等に用いる医薬品もまた本発明の実施において使用するのに適している。治療用または診断用に投与するための薬物または他の物質を、本発明に従ってリポソームに組み込むかまたはリポソームと結合させ、患者体内の部位を特に標的とすることができる。好ましい態様において、治療用および診断用物質を、該物質を含んでなるかまたは結合したリポソームを、モノクローナル抗体または免疫グロブリンフラグメント（Fab’フラグメントのような）、受容体、癒着分子、リガンドまたは他の標的部分に結合させることにより、患者に投与するのが有効である。さらに他の態様において、リポソームは糖リン脂質結合ポリペプチドを組み込むかまたは結合する。この態様の一例において、ＧＰＩシグナルドメインと呼ばれる（ここで、ＧＰＩはグリコホスファチジルイノシトールの略語である）、m ＤＡＦ（崩壊促進因子）への糖リン脂質膜アンカーアタッチメントを特定するカルボキシ末端ドメイン、または糖リン脂質によって固定される他のタンパク質からの機能的に同等のドメインを、ＧＰＩシグナルドメインの源と異質であるタンパク質または該タンパク質のマルチマー、例えば、ホルモン、抗原（特に感染生物）、アレルゲン、免疫グロブリン、酵素、受容体等（gp１２０、ＣＤ４、プラスミノーゲン・アクチベーターを含む）に融合する［例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０１０４１（１９８９年２月９日公開）を参照］。パッセンジャー分子の組み合わせが望ましい。例えば、特に好ましい態様において、毒素薬物を内部に包含しており、さらにＧＰＩ結合ＣＤ４を含んでなるかまたは結合するリポソームは、その表面上でgp１２０を発現するＨＩＶ感染細胞を標的とする。リガンドまたは抗体への同様のＧＰＩ融合を、リガンドまたは抗体に特異的に結合する抗原または受容体を有する癌細胞に対する毒性物質を含むリポソームを標的とするために用いることができる。放射性同位元素または毒素と抗体様標的ドメインの組み合わせは、標的部分および生物学的に活性な分子の他の組み合わせ、および治療用パッセンジャー分子の組み合わせと同様に本発明に包含される。６．二重層形成性物質およびいずれのパッセンジャー分子をも可溶化するために溶媒を利用する。適当な溶媒を、両親媒性物質およびパッセンジャー分子の両方を可溶化できるものから選択する。一般に、最も好ましい溶媒は、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、クロロホルム、アセトン、塩化メチレンまたはプロピルグリコール等のような低分子量の炭化水素である。さらに、該溶媒はリポソームについて意図された特定の使用に適当でなければならない。リポソームをインビボで使用するなら、該溶媒はその利用において毒性の原因となることなく利用され、一般に薬学的に許容されることができ、容易に混和しなければならない。商業過程においてかまたは殺虫剤用のような他の利用において、溶媒の毒性は重要なものではないが、その揮発性も選択因子である。塩化メチレンは、多くの方法において有用である溶媒の例である。溶媒の混合物は幾つかの状況において適当である。好ましい態様において、アルコール、およびより好ましくはイソプロピルアルコールのような短鎖アルコールが適切な溶媒として働く。Ｂ．本発明に従うリポソーム製造はスプレー技術を用いて、溶媒および二重層形成性物質（および幾つかのパッセンジャー分子）の第１溶液を第２溶液、しばしば緩衝液の表面上に噴霧することにより、直接リポソームを形成する。どんな特定の作用機構にも制限されることなく、溶媒が緩衝液中に抽出され希釈されるに従い、二重層形成性物質（およびある程度のパッセンジャー分子）は不溶性となり、即座にリポソームを形成すると信じられている。二重層形成性物質および任意のパッセンジャー分子の有機溶媒のような溶媒中での溶解度は用いられる成分に依存して変化し、また温度によって異なるであろう。幾つかの脂質、例えばジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）は室温およびそれ以下の温度で完全に不溶性である：該状況においては、噴霧過程中室温以上の温度、例えば約４５〜７５℃で第１溶液を保持する。本方法において用いる成分の可溶性の最適化を所定の実験によって決定するであろう。脂質成分の融点以上または以下での噴霧は、パッセンジャー分子が脂質二重層内に封入されるか別の様式で脂質に組み込まれるかどうかに影響し、本発明のいずれの特定の適用に対する適当な温度条件の決定はルーチンであろうと、さらに現在信じられている。脂質の酸化を防止するために、リポソーム成分を含んでなる溶液は、窒素のような不活性ガスの一定の気流下で保持して、乾燥窒素雰囲気をつくる。本発明の好ましい態様において、第１溶液はイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）中に、ＤＰＰＣ、パルミチン酸、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、肺界面活性剤タンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）を含んでなる。この第１溶液をコハク酸、コハク酸二ナトリウム六水和物、および精製水を含んでなる第２の、緩衝溶液（約pＨ６.５）上に噴霧する。この態様において、第１溶液を混合し噴霧するために約５５〜６５℃に加熱する。二重層形成性物質およびパッセンジャー分子を別の溶液として調製し、次いで混合し、場合により撹拌する。噴霧方法の装置を図１に示したものと同様の様式で組み立てるが、示した部品の異なる配置または異なる同等の部品を用いてもよい。第１溶液を貯蔵器中に導入する。フィルターをこの貯蔵器の出口に備え、連結手段を貯蔵器と噴霧チェンバーに備えられたノズルとの間に備える。幾つかの好ましい態様においては、噴霧ノズルと直接接触しないレベルで、第２溶液を噴霧チェンバーに導入する。ある態様においては、例えば約１Ｌ／分での嬬動ポンプ等によって噴霧チェンバーと混合チェンバー間で第２溶液を循環させる。噴霧チェンバー（およびいずれかの混合チェンバー）中の溶液を、ある態様においては約２００rpmで撹拌するのが好ましく、第１溶液の温度と同様の温度まで加熱してもよい。別の態様において、ノズルを第２溶液に浸し、例えば限外濾過および／もしくはダイア濾過によってか、または噴霧チェンバーの上部を真空により引き抜くことによって、有機または他の第１溶液溶媒を除去する。この別の方法は、第１溶液溶媒が水に混合し得ない場合、形成されたリポソーム間のサイズの一致性を促進するのに有利である。全ての溶液および装置を準備する際、ノズルには必要な動力供給を与える。貯蔵器中の不活性ガスおよびまたは第１溶液のレベルを、第１溶液がノズルに流動し始めるよう調節する。この流動を調節してノズルからの均一の噴霧パターンを得る。所望の量の第１溶液が噴霧されるまで（典型的に全体量）流動させ続ける。二重層形成性溶液を噴霧してリポソームを形成するために用いられ得る、種々の市販ノズルまたは同様の装置がある。本発明によると、作動に高圧を必要としないノズルが適当である。好ましい態様において、超音波の高振動数を用いて霧スプレー（一般に、超微細かつ低速力）を形成する噴霧ノズルが利用できる。このような好ましいノズルは、ノズルに呼び水する必要性を減少または無くすので、溶液の浪費を減少させる。適当な超音波噴霧ノズルはＳＯＮＯ−ＴＥＫ Corpo ration（Poughkeepsie，ＮＹ）により作製される（例えば、シリーズ８７００− １２０ノズル）。液体を振動ノズルチップと接触させると噴霧が起こる。超音波エネルギーが液体の表面張力を超えるとき微滴が形成される。滴のサイズの分布は、噴霧される液体の密度、表面張力、およびノズルの振動数によって決定され、振動数は与えられたサイズのノズルに対して滴の直径の範囲を決めることにおいてキーとなる因子である。ノズルの噴霧振動数、ノズルの細孔、および他のノズルの特性を選択して、適当な流動および所望のサイズの粒子を得る。特定の機構理論に限定されることを意図することなく、一般にノズルが作動する際の振動数は噴霧される粒子のサイズを確立する傾向があり、形成されるリポソームのサイズに関係する。振動数が大きくなればなるほど、典型的にはスプレー中の滴は小さくなり、故に最後に形成されるリポソームは一般に小さくなる。高振動数ノズルは典型的には、比較的小さいノズルサイズを必要とし、低流動容量およびより小さいスプレー粒子をもたらす。低振動数ノズルは典型的には、大きいノズルサイズを必要とし、高流動容量および大きいスプレー粒子をもたらす。ノズルの特性に加えて、温度ならびに第１および第２溶液の処方（使用する溶媒および任意のパッセンジャー分子の特徴を含む）もまたノズルスプレーから回収されるリポソームのサイズに影響を及ぼす。ノズル流動容量は、本発明の実施において考慮すべき重要なことである。好ましい態様の１つにおいて、直径０.０５２の細孔に対して０／５gph（０.５ml／秒）のノズル流動容量を有するＳＯＮＯ−ＴＥＫシリーズ８７００−１２０ノズルを用いる。このノズルを組み入れたシステムは、約０.２Ｌ／時間の第１溶液を処理することができた。他の好ましい態様において、低振動数で作動して５倍以上の容量、好ましくは７倍の容量（１.４Ｌ／時間）を有するノズルを利用する。幾つかの他の態様において、１個以上のノズルを用いる。得られた第１溶液および第２溶液の混合物を主混合槽に集めることができる。さらなる処理を直ちに開始するか、またはこの槽を保存するか、また貯蔵のために溶液を別の容器（但し、幾つかの医薬関係の適用においては滅菌している）に移すことができる。室温またはそれ以下で貯蔵することができる。医薬関係の生成物については、さらに処理する前に約５℃で約１週間かそれ以下の貯蔵を勧める。Ｃ．リポソーム形成（懸濁液）に次いでリポソームの回収を開始する。リポソーム懸濁液を幾つかの利用のためにさらに処理することなく用いることができる。他の利用については、第２溶液からリポソームを回収するのが望ましい。これをリポソームの濾過またはクロマトグラフィー分離のような種々の既知の方法によって達成することができる。好ましい態様において、限外濾過を用いて、例えばFiltron１００ＫＤ膜モジュールからなる接線流動積重を用いてリポソームを濃縮する。所望のリポソーム濃度に達した後、所望なら新鮮な緩衝液でのダイア濾過によって残留溶媒を洗い流すことができる。特に好ましい態様においては、必要に応じポンプおよび接続ラインを有するフィルター膜系を水で洗い流し、滅菌のためにその場で蒸気をあてる（またはオートクレーブにかける）。次に、この系を余分の第２溶液または必要に応じ他の緩衝液で短時間、約０〜３０分間、および好ましくは１０〜１５分間洗い流す。リポソーム懸濁液をフィルター系を通して、一般に約１〜５（好ましくは２）Ｌ／分の好ましい速度で循環させ、約５分間続ける。次に、この系が約８psiトランスメンブラン圧に加圧されるまで、この流動を濃縮ラインで制限する。この方法を所望の最終濃縮量に達するまで続ける。好ましい態様において、濃縮物をまた６倍の新鮮な第２溶液でダイア濾過する。濾過系は空気で加圧することによって流出させるのが好都合である。この濃縮リポソーム懸濁液を集める。所望なら、最終懸濁液量を測定し、特定の利用のために所望なら更に濃縮するかまたは希釈することができる。Ｄ．リポソームのサイズ分け。特定の作用理論に限定されることなく、血液または組織からのリポソームの除去速度は粒子のサイズならびに含有する特定の成分に依存する。幾つかの態様において、直径が約５０〜１００nmかまたはそれ以上であるリポソームを治療投与用に選択する。他の態様において、他の理由のためにより小さいサイズが有利であるか、またはより速い除去が所望され、そしてリポソームは直径が５００nm未満のものが選択される。リポソームのサイズはその安定性にも関係し、幾つかの態様において、例えば、より大きいサイズのリポソームは、より小さいリポソームと比較して、比較的不安定であり得、選択基準はこの性質を利用することができる。例えば、比較的大きいサイズで比較的不安定なリポソームは肺における製薬の投与に有用であり、不安定性はリポソーム成分の速やかな拡散に帰着する。どの特定の適用、治療用、診断用、商業用、産業用、または化粧用のいずれもに対するリポソームのサイズは、所望の特徴に従って選択されるであろう。リポソーム懸濁液をサイズ分けして、最適の性質を有する選択的サイズ分布を得る。リポソームのサイズおよびサイズ不均一性を減少させるために、数種の技術を利用できる。浴または探針音波処理のいずれかによってリポソーム懸濁液を音波処理することにより、約０.０５ミクロン未満のサイズまで漸進的にサイズを減少させる。典型的なホモジナイゼーション法において、選択されるリポソームサイズが観察されるまでリポソームを標準的なエマルジョンホモジナイザーに通して再循環させる。両方の方法において、通常のレーザー・ビーム粒子サイズ識別法により粒子サイズ分布をモニターすることができる。小孔のポリカーボネート膜に通してのリポソームの押し出しは、膜の孔サイズに依り、比較的良く定義されたサイズ分布にリポソームのサイズを減少させるのに有効な方法である。典型的には、所望のリポソームサイズ分布を得るまで懸濁液を膜に通して数回循環させる。このようなフィルターの１つは０.４５μmAcro discフィルター（Gelmar Sciences，Inc.，Ann Arbor，ＭＩ）である。リポソームを連続的に孔が小さくなる膜に通して押し出して、リポソームサイズを段階的に減少させる。遠心および分子ふるいクロマトグラフィーは、１μmまたはそれ未満の選択された閾値以下の粒子サイズを有するリポソーム懸濁液を得るのに利用できる他の方法である。これら２つの方法の両方ともが、より大きい粒子をより小さい粒子に変換するよりむしろ、より大きいリポソームの優先的除去を伴う。リポソーム収量はそれに対応して減少する。既知の方法、例えばレーザー干渉を用いるBrinkman２０１０の使用、およびレーザー光線散乱を用いるNicomp２００の使用により粒子サイズを測定することができる。Brinkman２０１０は５〜１００μmの範囲で粒子集団を分析することができ、一方Nicomp２００は５〜５０００nmの範囲で分析できる。１００〜１０００nmをカバーする別の方法はＦＡＣＳ分析機を必要とする。Ｅ．非結合パッセンジャー分子および二重層形成性物質の除去は、遊離物質に対する捕捉パッセンジャー分子を有するリポソームの比率を増加させるのに望ましい。リポソーム懸濁液から遊離物質を除去するために数種の方法を利用できる。サイズ分けしたリポソーム懸濁液を高速遠心によってペレットにし、上清中に遊離物質および非常に小さいリポソームを残すことができる。別の方法は限外濾過により懸濁液を濃縮し、次いで濃縮したリポソームを置換媒質に再懸濁することよりなる。または、ゲル濾過を用いてより大きいリポソーム粒子を溶質分子から分離することができる。また、遊離物質をイオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティー・クロマトグラフィーを用いて除去し、遊離形態であるがリポソーム結合形態ではない遊離物質を結合させることができる。上記の限外濾過／ダイア濾過法の間、望ましくない成分をある程度除去することができる。Ｆ．滅菌はインビボまたはインビトロでの使用のために設計されたリポソームについての重要な処理の考慮すべきことであろう。所望なら、噴霧ノズル、フィルター、管類、噴霧チェンバー、混合槽、送り溶液貯蔵器、および部品等をオートクレーブにかけるかまたは他の方法で滅菌することができる。混合槽または他の部品を、アルコール溶液（例えば、７０重量％ＩＰＡ）でとじ込みドレンすることにより、および／またはスチームの導入等により、消毒することができる。濃縮リポソーム懸濁液を、上記のように懸濁液を製剤化するか、またはバイアルもしくは他の容器に充填し貯蔵のために凍結乾燥させること等によって、さらに処理することができる。生成物のビンまたは他の容器を滅菌することができる。長期貯蔵の間、凍結乾燥生成物を凍結分子が不動である温度以下、および相転移の温度以下で保存するのが現在好ましい。凍結乾燥サイクルは典型的に、標準的方法に従い、数時間の凍結サイクル（約 −５５℃で）、次いで１またはそれ以上の乾燥サイクルを伴う。II．製剤化および使用本発明は、種々の製剤に、ならびに種々の診断的、商業的、化粧的、産業的、および治療的使用のために用い得るリポソームの新規な製造法を提供する。治療的使用のために、リポソームを、必要とされる共因子と一緒に薬学的に許容し得る、無菌の、等張の製剤中に入れ、場合により当分野で周知の標準的方法によって投与する。この製剤は液体であるのが好ましく、普通非リン酸緩衝液（ pＨ６.８〜７.６）を含有する生理的塩溶液であるか、または凍結乾燥粉末であってよい。リポソームを、Tween２０もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような薬理学的に許容し得る洗剤か、または血清アルブミンと共に製剤化することができる。治療投与のリポソームは、パッセンジャー分子を結合しているリポソームとパッセンジャー分子から遊離したリポソームを含んでなり、この組み合わせはパッセンジャー分子の分布または輸送を有益に変更し得ることが想像される。本発明のリポソームを治療用リポソーム投与に適用する例として、例えば生まれつきの物質代謝異常におけるような、重要な酵素活性の欠如によって特徴付けられる疾患に罹患している患者を、リン脂質アンカー（ＧＰＩ）ドメインに融合した問題の酵素を含んでなるリポソームの注入によって治療する。必要とされる代謝産物の合成および細胞への輸送の動力学は、単に代謝物質を注入することより改良される。このリポソームを、例えば、脳細胞の代謝異常を扱うために脳脊髄液中に注入するか、または他の組織もしくは器官系特異的疾患を標的とするのに最適であるよう必要に応じリンパ系もしくは血流中に注入する。治療に用いられるリポソーム組成物は製剤化され、投与量は治療すべき疾患、個々の患者の症状、単離したポリペプチドの輸送部位、投与法および医師に既知の他の因子を考慮しながら、良い医療プラクティスと合致した様式で確立されるであろう。生理学的に許容し得る担体、即ち使用する濃度および用量が受容者にとって非毒性である担体またはアジュバントと共に、所望の純度でリポソームを混合することによって、投与用にリポソームを調製する。幾つかの態様において、アジュバントをパッセンジャー分子と共にリポソーム中に組み込む。アジュバントおよび担体は、本質的に標的抗原と免疫エピトープを共有しないが、標的抗原への免疫反応を剌激する物質である。通常、これはパッセンジャー分子を緩衝液、低分子量ポリペプチド（約１０残基未満）、タンパク質、アミノ酸、グルコースまたはデキストランを含む炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、および他の賦形剤と混合することを必然的に伴う。マイコバクテリアの抽出物のような種々の毒性細菌物質および腫瘍壊死因子およびγ−インターフェロンのようなサイトカインを有する際、フロイントアジュバント（鉱油エマルジョン）は通常この目的のために用いられている［米国特許第４,９６３,３５４号（１９９０年１０月１６日登録）に記載］。抗原であるパッセンジャー分子を、リポソーム内のか製剤中のリポソームに付随するかのいずれかのアジュバントと共に投与するのが望ましいが、最初の接種がアジュバントと共に輸送される場所において、抗原を伴うブースターはアジュバントを必要としないかもしれない。担体はアジュバントとして作用することが多いが、担体が抗原を凝集させる水不溶性巨大分子の微粒子構造を含んでなるという点でアジュバントと一般に区別される。典型的な担体には水酸化アルミニウム、ラテックス粒子、ベントナイトおよびリポソームが含まれる。サポニン誘導体もまた好ましいアジュバントである。（筋肉内または皮下）注射は本発明のリポソームの治療的投与のための主な経路であろうことが想像され、静脈内輸送、またはカテーテルもしくは他の外科用チューブを通しての輸送もまた用いられる。別の経路には錠剤等、液体製剤用の市販の噴霧器、および凍結乾燥またはエアロゾル化リポソームの吸入剤が含まれる。液体製剤は粉末製剤からの再構成後に利用することができる。本発明のリポソームを、血液を含む幾つかの組織に置いた除放性製剤または他の微粒子デリバリーシステムによって投与することもできる。除放性担体の適当な例には、成形品（例えば、坐剤）の形態の半透性ポリマーマトリックス、またはマイクロカプセルが含まれる。移植可能なまたはマイクロカプセル化した除放性マトリックスには、ポリラクチド［米国特許第３,７７３,９１９号、ＥＰ５８ ,４８１号］、Ｌ−グルタミン酸およびγ一エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー［U．Sidman等，Biopolymers ２２（１）：５４７−５５６（１９８５）］、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレンビニルアセテート［R．Langer等，J．Biomed．Mater．Res. １５：１６７−２７７（１９８１）およびR．Langer，Chem．Tech．１２：９８−１０５（１９８２）］が含まれる。コラーゲン、ポリリシン、ポリ乳酸、ポリメチルアクリレート、ポリウレタン、ポリグリコール酸、ヒドロキシプロピルセルロース、寒天およびアガロースのような薬学的に許容し得るポリマーもまた、本発明のリポソームに適当な担体である。架橋しおよび／またはゲル形態のこれらポリマーの製造法は周知であり、該方法をリポソームを組み込むよう容易に改変できる。寒天、コラーゲン、およびポリウレタンのようなポリマーの多くは、選択された割合でマトリックスを通っておよびマトリックス外へリポソームを移動させることのできる透過性架橋構造に製剤化できる。このタイプのマトリックスは、体腔における薬物輸送にか（ここで、マトリックスは長期間にわたりその場で留どまることができる）、または目の使用に（ここで、移植片は透明な水晶体の形をとることができる）適している。ポリラクテートのような他のポリマー組成物を、延長されたポリマー分解期間にわたり捕捉リポソームを徐々に放出する生分解性固体として製剤化することができる。該マトリックスは口または胃中でのリポソーム放出に適している。ポリリシンのような幾つかのポリマー組成物を、リポソーム懸濁液中で重合させて、個々のリポソームの周囲にポリマーの殻を形成し、例えば、胃中での速やかな分解からリポソームを保護するであろう被覆を形成することができる。本発明の幾つかの態様において、リポソームは、脂質含有量が約３０モル％以上のコレステロールである小さい（約２００〜８００Å）一枚膜型のリポソームであり、その選択された割合はパッセンジャー分子の漏出の最適速度に調節されている。投与されるリポソームまたはパッセンジャー分子の投与量は、医師の技術内で満足されるなら、使用するリポソームおよびパッセンジャー分子の性質、例えばその結合活性およびインビボにおける血漿半減期、製剤中のリポソームおよびパッセンジャー分子の濃度、投与経路、投薬部位および割合、かかわる患者の臨床耐性、患者の罹患している病理症状等に依存するであろう。一般に、１回の投与につき患者１人につき約０.５×１０^-8〜５×１０^-9モルのパッセンジャー分子の投与量が好ましいが、投与量は必ずパッセンジャー分子の性質に依存する。一連の連続投与の間、異なる投与量を使用してもよい。診断用目的のためのインビトロでの使用について、リポソームを少なくとも約１０nＭの濃度で細胞培養培地に加えるのが典型的であろう。インビトロでの使用のための投与様式および製剤は限定的ではない。培養培地または灌流媒質に適合する水性製剤を通常用いるであろう。細胞毒性は常法によって判読できる。局所的に適用される際、リポソーム組成物は種々の局所的医薬品（例えば、抗細菌または抗真菌物質）およびステロイドの制御放出を提供することができ、脂質に湿気を持たせる源として働くこともできる。リポソームのペーストまたはフォーム製剤は、比較的良好な貯蔵安定性および高い薬物能力という利点を提供する。リポソームペーストまたはフォームは、熱傷または破壊された皮膚、目の組織、および体腔に適用するのに適しており、ここで物質の高い粘性が適用部位での物質の維持を助ける。ペーストまたはフォーム製剤用の濃縮物を、リポソーム懸濁物質の継続再循環を伴う限外濾過によって形成するのが好ましい。本発明によるリポソームペースト製剤は、さらに処理することなく局所的に使用するのに適している。リポソームフォームを、シェービングクリームまたはヘアースタイリングムースのような化粧用フォームに用いられるように、通常の２チェンバーのプロペラント装置を用いて製造することができる。１つのチェンバー中に含有される重いリポソーム懸濁液を、第２のチェンバー中に含有されるプロペラントガスと混合し、ガス化させた混合物またはフォームをプロペラント放出圧力の下で排出ノズルを通して放出する。米国特許第３,３２６,４１６号において、リポソームフォーム生成における使用のために容易に改造できる２チェンバープロペラントフォーム装置が記載されている。リポソームに存在する二重層形成性物質の親水性部分にある程度依存して、リポソームは正味の陰性もしくは陽性の電荷を有するか、または電荷的に中性であることができる。例えば、リン酸基または硫酸基を含有する脂質で形成されたリポソームは典型的には陰性であり、アミノ基を含有する脂質からのは典型的には陽性であり、ポリエチレンオキシ基またはグリコールを含有する脂質は典型的には正味の電荷を有さないであろう。低いイオン強度の条件下で、水性懸濁液中の電荷したリポソームは互いに反発し、その結果、リポソームはリポソーム懸濁液に粘性コンシステンシー、即ちゲル様コンシステンシーを与える溶液中で整列するようになる。これは陰性界面活性剤で製剤化される本発明のリポソームの場合である。電荷したリポソーム懸濁液の粘性を、限外濾過によって増加させることができる。エアロゾル化リポソームまたはリポソームスプレーは、鼻孔もしくは口粘膜にリポソームを適用するか、または気道中に輸送するのに好都合なビヒクルである。１つの態様において、リポソームを希薄な水性懸濁液として製剤化し、通常のポンプまたは圧搾噴霧ビンから噴霧する。または、リポソームを、加圧密閉容器システムにおいて炭化フッ素プロペラント溶媒と共に用いるために製剤化する。リポソームはまた霧状化装置と共に用いるのが望ましい。リポソームのエアゾル輸送は、肺の症状または疾患を治療するために脂質およびパッセンジャー分子を肺へ輸送するのに特に適している。例えば、肺界面活性剤脂質および肺界面活性剤結合タンパク質は、エアロゾル化リポソームによって、幼児または呼吸困難を有するかもしくはその危険のある他の患者に輸送するのに望ましい。気道の選択された領域での粒子沈澱を支持するエアロゾルの粒子サイズを産生する条件下でリポソームをエアロゾル化することができる［例えばRadhakrishnan，米国特許第５,１９２,５２８号を参照］。具体的な問題または場合に対する本発明の技術の適用は、本明細書に含まれる教示に照らして当業者の能力内にあるだろうことが理解される。以下に示される本発明の生成物ならびにそれらの単離、使用、および製造の代表的な方法を以下に示すが、本発明を限定すると解釈すべきではない。本明細書中の全ての文献の引用が本明細書の一部を構成することは表明する。実施例肺界面活性剤方法の概略肺界面活性剤脂質および肺界面活性剤タンパク質（ＳＰ−Ｃ）を含んでなるリポソームを産生するための方法を開発した。Ｉ．リポソーム製造Ａ．スクシネート緩衝液（第２溶液）の調製：１．調製すべき緩衝液の量は、処理すべきＳＰ−Ｃの量に基づいた。最初のリポソーム形成において必要とされる再循環するスクシネート緩衝液の体積（mｌ）を決定するために、第１溶液（ＳＰ−Ｃバルク）に含まれるべきＳＰ−Ｃの重量（mg）を２０倍した。ダイア濾過に必要とされる緩衝液の体積を、洗浄すべき最終リポソーム濃縮物の６倍の体積であると概算した。０.０２Ｍスクシネート緩衝液（pＨ＝６.５）を得るために、溶液ＩＬにつき０.０００６４moｌのコハク酸および０.０１９３６moｌのコハク酸二ナトリウムを溶解した。２．緩衝液再循環槽を必要とされる量の緩衝液で充たし、６５℃まで撹拌しながら穏やかに加熱した。Ｂ．ＳＰ−Ｃバルク溶液の希釈：１．脂質と混合する前に、ＳＰ−Ｃバルク溶液をＳＰ−Ｃの濃度を０.４５mg ／mlに調節した。オリジナルのバルクに等しい組成のＩＰＡ／Ｈ₂Ｏ（イソプロピルアルコールおよび水）溶液で希釈した。２．希釈ＳＰ−Ｃ溶液を脂質に加える前に室温に温めた。Ｃ．脂質溶液の調製：１．以下の重量比式に従って脂質を計量した；１４ＤＰＰＣ：６ＰＯＰＧ：２ＰＡ：１ＳＰ−Ｃ。乾燥不活性雰囲気下で全ての計量を行って、水吸収および酸化の可能性を最小限にした。２．次いで脂質を十分に温めた試薬グレードのＩＰＡに溶解して、２３.３mg/ ml ＤＰＰＣ、１０.０mg/ml ＰＯＰＧ、および３.３mg/ml ＰＡである最終溶液を得た。脂質の溶解を温度≧４８℃で完結させ、Ｎ₂雰囲気下で行った。これらの工程で用いたまちまちな量のパルミチン酸（ＰＡ）を必ずしも勧めなかった。Ｄ．ＳＰ−Ｃ脂質噴霧溶液：１．室温のＳＰ−Ｃ溶液を温め撹拌している脂質溶液に徐々に加えた。脂質の沈澱を避けるため注意して徐々にタンパク質を加えた。２．撹拌およびＮ₂ブランケットの両方を維持しながら、ＳＰ−Ｃ脂質混合物を６５℃まで穏やかに加熱した。Ｅ．リポソーム形成／噴霧工程：１．再循環緩衝液およびＳＰ−Ｃ脂質溶液の両方が６５℃に達したら、噴霧工程を開始させた。最初の工程において、緩衝液槽およびスピナーフラスコの間で緩衝液を循環をさせ始めた。流入および流出量を平衡化させて、フラスコ中に一定レベルの緩衝液を維持した（約８００ml）。２．再循環割合を平衡化させた際、超音波のズルへの動力供給を活動させ６〜６.５Ｗに合わせた。３．ＳＰ−Ｃ脂質溶液を約３.０ml／秒の割合で噴霧ノズルに汲み上げた。この時点で、緩衝液流量を再調節して、スピナーフラスコ中溶液のレベルを８００ mlに維持した。４．第２溶液上への第１溶液の噴霧を完了したら、全溶液を緩衝液槽に集め、室温に冷却した。どのような必要な一晩越えまたは他の貯蔵も、冷却し２〜８℃ で貯蔵することにより行った。Ｆ．限外濾過およびダイア濾過：１．リポソーム溶液の限外濾過／ダイア濾過を接線流動濾過により行った。最初に、このフィルターおよび組み立て部品を滅菌スクシネート液で洗浄して、オートクレーブにかける間生じたいかなるを残骸をも除去した。清浄したら、膜が完全であり組み立て部品に漏れがないことを保証するために、濾過システムを完全性試験にかけた。２．リポソーム溶液の限外濾過を３０倍濃縮に達するまで行った。３．リポソーム濃縮物を６倍の緩衝液で洗浄した。Ｇ．凍結乾燥：１．ガラスバイアル（１０ml）を５mlのリポソーム濃縮物で満たした。満たしたものの標的組成物は、バイアルにつき１５０mgのリン脂質および７.５mgのＳＰ−Ｃである。２．凍結乾燥サイクルは：ａ．５〜−５５℃、２時間で凍結ｂ．−５５℃、４時間凍結ｃ．−５５〜−１５℃、４時間、７０μmＨg Ｎ₂で一次乾燥傾斜ｄ．−１５℃、７０μmＨg Ｎ₂、２４時間、７０μmＨg Ｎ₂で一次乾燥ｅ．−１５〜＋２５℃、４時間、７０μmＨg Ｎ₂で二次乾燥傾斜ｆ．＋２５℃、７０μmＨg Ｎ₂、１５時間二次乾燥ｇ．７００mmＨg Ｎ₂で停止このサイクルを用いて製造した生成物は首尾一貫して白色から僅かに灰色がかった白色の固体ケーキであった。注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）を用いてこの生成物の再構成することにより、安定なリポソーム懸濁液を得た。 II．リポソーム分析凍結乾燥後のリポソーム懸濁液の分析を数種行った。乾燥した凍結乾燥ケーキ中の残留水分を測定した。次に、この生成物を水または生理的食塩水のいずれかに再懸濁した。次いで粒子サイズ分析を行い（下記）、次に熱量分析を行った（データは示さず）。さらなる実験において（示さず）、リポソームの界面活性剤特性を表面平衡（張力）検定で測定し、良い結果を得た。Ａ．残留水分：上記の標準的な凍結乾燥サイクルによって製造した凍結乾燥ＳＰ−Ｃリポソームケーキについて、残留水分は平均２.５〜３％の範囲であった。より低いシェルフ温度および高いチェンバー圧力で行った、別のサイクル（−２４℃、３２０ μmＨg、１４時間一次乾燥）により、４％の範囲の水分を有するケーキを得た。両方のサイクルで得られたリポソーム生成物は、インビボおよびインビトロの両方での界面活性剤機能試験において良好な結果を示した。−２５℃の生成温度を有する別のサイクルより最初の一次乾燥の間、−３３℃のより低い生成温度であるが、より長い（１２時間）上記の選択された凍結乾燥サイクルは、より保存性があると考えられる。Ｂ．粒子サイズ分析：ＳＷＦＩ水を用いる凍結乾燥ＳＰ−Ｃリポソームケーキの再構成から安定なリポソーム懸濁液を得た。レーザー干渉を用いるBrinkman２０１０による、およびレーザー光線散乱を用いるNicomp２００による２つの方法で、リポソーム粒子サイズを測定した。Brinkman２０１０は５〜１００μmの範囲における粒子集合を分析でき、一方Nicomp２００は５〜５０００nmの範囲において分析できる。 Brinkmanからは、数、面積および体積または重量（長円面）平均粒子サイズについての結果を得る。数平均結果は、１μmで切り捨てした分布を示すので、これは疑わしい値の分布である。重量平均結果は、懸濁液が凍結乾燥されているか否かに依存して２０〜５０μmの範囲に分布を示す。光学顕微鏡によって観察した際、ここでの粒子は主に凝集していた。凍結乾燥したバッチはより小さい２０ μmの範囲にあり、界面活性剤機能試験において、同じバッチの非凍結乾燥物質と比較してより優れた界面活性を示した。 Nicomp２００からは、正規分布のモデルを用いて２つの主なサイズ集合を分析した。リポソーム懸濁液は非正規であるようだが、この方法から量的結果を得るのにほぼ十分であった。ここで得られた結果は、電子顕微鏡およびCoulter計数技術を用いる肺界面活性剤の初期の研究と一致し、また同様のサイズ範囲で２つの集合が見いだされた。第１の分布は５０nmの範囲にあり、第２の分布は２μm の範囲にあった。より大きい集合は非凍結乾燥試料には存在せず、それらのより低い生物学的活性への手掛かりであるかもしれない。噴霧工程においてノズル振動数および温度を変化させて生成したリポソームのサイズ分析を、以下の表１に示す。

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）適当な溶媒中に二重層形成性物質を含んでなる第１溶液を調製し；ｂ）振動数発生振動ノズルを通して第１溶液を噴霧し第２溶液と接触させて、該第２溶液中にリポソーム懸濁液を形成し；そしてｃ）非リポソーム成分物質からリポソームを分離することを含んでなるリポソームの製造法。２．該方法を圧力下またはほぼ大気圧下で行う請求項１に記載の方法。３．該二重層形成性物質が界面活性剤を含んでなる請求項１に記載の方法。４．該第１溶液が有機溶媒をさらに含んでなる請求項１に記載の方法。５．該第１溶液がパッセンジャー分子をさらに含んでなる請求項１に記載の方法。６．該第２溶液が薬学的に許容し得る緩衝液である請求項１に記載の方法。７．該薬学的に許容し得る緩衝液がスクシネートである請求項６に記載の方法。８．該第１溶液および該第２溶液を温度２０〜８０℃に保つ請求項１に記載の方法。９．該パッセンジャー分子が以下のものからなる群から選択される請求項５に記載の方法：抗菌剤、抗ウイルス剤（例えば、フルオロウラシル、ヨードウリジン、トリフルオロウリジン、ビダラビン、アジドチミジン、リバビリン、ホスホノホメート、ホスホノアセテート、およびアシクロビル）、抗炎症剤（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、および非ステロイド系抗炎症剤）、抗癌薬物（例えば、シス−プラチンまたは５−フルオロウラシル）、抗寄生生物剤、抗アレルギーおよび抗喘息剤（例えば、アレルゲン、クロモリン、セメチジン、ナファゾリン、ロドキサミド、エフェドリンおよびフェニルエフィネフィリン）、染料、蛍光性化合物、放射性同位元素標識（例えば、ヨウ素、レニウム、トリチウム、α粒子放射性同位元素）、放射線不透過性化合物、ビタミン、ミネラル、プラスミド、ベクター、ウイルス粒子、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ヌクレオチド、炭水化物（例えば、天然または合成の単糖類および多糖類ならびに糖類）、受容体、成長因子、癒着分子、インテグリン、ホルモン、神経伝達物質、抗腫瘍性抗生物質、成長因子、毒素［例えば、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aerugi nosa から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、Aleu rites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰII、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカチャランティア阻害物質、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリス阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン］、鎮痛薬、麻酔薬、麻薬、触媒、酵素、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン様分子および同フラグメント（例えば、抗体ＦａｂおよびＦａｂ’分子）、ならびに他の生物学的に活性な無機および有機分子（例えば、抗体、酵素、ホルモン的活性ポリペプチド、免疫調節剤（例えば、リンホカイン、モノカインおよびサイトカイン）、成長調節および刺激タンパク質、血液タンパク質、ウイルス、細菌および寄生生物ワクチンに対する抗原、ステロイド、脂質、合成および天然薬物、抗腫瘍性抗生物質（例えば、ドキソルビシン）、核酸、アミノ酸、α−、β−、およびγ−インターフェロン、腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β、プラスミノーゲンアクチベーター（例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター）、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼ、リラキシン、ＣＤ４、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、ＤＮアーゼ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＮＦ、アクチビン、インヒビン、ＥＧＦ、ＩＧＦ、エンケファリナーゼ、血液凝固因子（例えば、因子VIIIおよび組織因子ならびにそのフラグメントまたはアミノ酸配列変異体およびそれに対する抗体）、天然肺界面活性剤の成分（例えば、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＧ）または肺界面活性剤のＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、および／またはＳＰ−Ｃタンパク質として知られる１またはそれ以上のタンパク質）、化粧品または化粧品成分（例えば、ヘアスプレー、着色料、染料等）。１０．パッセンジャー分子が肺界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ｃを含んでなる請求項９に記載の方法。１１．リポソームを濾過によって成分物質から分離する請求項１に記載の方法。１２．回収したリポソーム、第２溶液、または第１溶液の１またはそれ以上を滅菌する工程をさらに含んでなる請求項１に記載の方法。１３．該滅菌を加熱または滅菌濾過によって達成する請求項１２に記載の方法。１４．第１溶液を第２溶液の表面上に噴霧する請求項１に記載の方法。１５．第１溶液を第２溶液の表面下に噴霧する請求項１に記載の方法。１６．ａ）適当な溶媒中に二重層形成性物質を含んでなる第１溶液を調製し；ｂ）振動数発生振動ノズルを通して第１溶液を噴霧し第２溶液と接触させて、該第２溶液中にリポソーム懸濁液を形成し；そしてｃ）非リポソーム成分物質からリポソームを分離するという工程を含んでなる方法によって形成されたリポソーム。１７．以下のものからなる群から選択されるさらなるパッセンジャー分子を含んでなる請求項１６に記載のリポソーム：抗菌剤、抗ウイルス剤（例えば、フルオロウラシル、ヨードウリジン、トリフルオロウリジン、ビダラビン、アジドチミジン、リバビリン、ホスホノホメート、ホスホノアセテート、およびアシクロビル）、抗炎症剤（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、および非ステロイド系抗炎症剤）、抗癌薬物（例えば、シス−プラチンまたは５−フルオロウラシル）、抗寄生生物剤、抗アレルギーおよび抗喘息剤（例えば、アレルゲン、クロモリン、セメチジン、ナファゾリン、ロドキサミド、エフェドリンおよびフェニルエフィネフィリン）、染料、蛍光性化合物、放射性同位元素標識（例えば、ヨウ素、レニウム、トリチウム、α粒子放射性同位元素）、放射線不透過性化合物、ビタミン、ミネラル、プラスミド、ベクター、ウイルス粒子、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ヌクレオチド、炭水化物（例えば、天然または合成の単糖類および多糖類ならびに糖類）、受容体、成長因子、癒着分子、インテグリン、ホルモン、神経伝達物質、抗腫瘍性抗生物質、成長因子、毒素［例えば、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosaから）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ）ＰＡＰII、およびＰＡＰ −Ｓ）、モモルディカチャランティア阻害物質、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリス阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン］、鎮痛薬、麻酔薬、麻薬、触媒、酵素、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン様分子および同フラグメント（例えば、抗体ＦａｂおよびＦａｂ’分子）、ならびに他の生物学的に活性な無機および有機分子（例えば、抗体、酵素、ホルモン的活性ポリペプチド、免疫調節剤（例えば、リンホカイン、モノカインおよびサイトカイン）、成長調節および刺激タンパク質、血液タンパク質、ウイルス、細菌および寄生生物ワクチンに対する抗原、ステロイド、脂質、合成および天然薬物、抗腫瘍性抗生物質（例えば、ドキソルビシン）、核酸、アミノ酸、α−、β−、およびγ−インターフェロン、腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β、プラスミノーゲンアクチベーター（例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター）、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼ、リラキシン、ＣＤ４、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、ＤＮアーゼ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＮＦ、アクチビン、インヒビン、ＥＧＦ、ＩＧＦ、エンケファリナーゼ、血液凝固因子（例えば、因子VIIIおよび組織因子ならびにそのフラグメントまたはアミノ酸配列変異体およびそれに対する抗体）、天然肺界面活性剤の成分（例えば、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＧ、または肺界面活性剤のＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、および／またはＳＰ−Ｃタンパク質として知られる１またはそれ以上のタンパク質）、化粧品または化粧品成分（例えば、ヘアスプレー、着色料、染料等）。１８．ゲル、ペースト、またはフォームからなる群から選択された製剤中の請求項１６に記載のリポソーム。１９．薬学的に許容し得る担体中の請求項１６に記載のリポソーム。