JP2502234B2 - リポソ―ム含有ワクチン組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は一般的に、ワクチンに関するものであり、特
に、ワクチンの有効性を増大させ、中和抗体を産生する
ための方法と組成物を目的としている。

背景 リポソームは、水溶液中で典型的にはリン脂質で成
り、脂質二重層および封入された水性空間からなる球状
小胞である。リポソームが形成される懸濁液の水層に化
学的または生化学的物質を取り込むことにより、種々の
生物学的活性物質を内側の空間に封入したリポソームを
得ることができる。リポソームは、典型的には、その産
生方法と脂質層の含量により直径約25nmから約１μｍま
でサイズが変化するため、種々の水溶性物質を運ぶベッ
セルとして用い得る。荷電した分子は一般的に脂肪二重
層を貫通しないため、また高分子は前述の層に緩慢にし
か貫通しないため、リポソーム壁は、リポソームを投与
した生物に封入物質の作用があまりに速すぎないように
作用する。

リポソームは、抗原を有するリポソームを投与するこ
とにより、動物の免疫反応を調節するために、以前から
用いられてきた。この免疫反応は、宿主内において病原
体に対し、免疫を誘発する目的か、あるいは宿主外で用
いられる抗体を産生する目的で調節し得る。例えば、イ
ムノアッセイおよび免疫学的治療において使用するため
の広汎な種類の抗原決定部位に対する抗体を調製する能
力を改善および変化させることに、興味が高まってい
る。特異的な抗原決定部位または化学構造に結合する抗
体特有の能力は、宿主内の特定部位の薬物、ラジオアイ
ソトープ、マーカーを到達させるため特に有用である。
さらに、類似構造物の中から特性構造を区別する抗体の
能力は、診断において広く用いられることとなった。

宿主外でモノクローナルまたはポリクローナル抗体を
用いるか、あるいは病原体に対して宿主を守るために免
疫反応を用いるかにかかわらず、最初の工程は、宿主の
免疫である。以下で明らかなように、免疫に用いる組成
物は、この組成物が宿主を守るために用いられるか、ま
たはモノクローナル抗体の産生に用いられるかにかかわ
らず、本明細書では「ワクチン」と呼ぶ。通常は、あら
かじめ決めたスケジュールに従って、ワクチン組成物の
免疫源の反復投与により宿主を過剰免疫する。アジュバ
ントは、免疫反応を増強するために加えられる。種々の
アジュバントには、アルミニウムおよびカルシウム塩、
乳化アジュバント、マイコバクテリアおよびコリネバク
テリア等の細菌が含まれる。

モノクローナル抗体が求められる場合、特に特定的異
所性部位に対する免疫反応を増強することが望ましい。
モノクローナル抗体の調製には、少母集団の現象を検出
する必要があるため、モノクローナル抗体産生におい
て、目的とするβ−リンパ球集団を増強するすべての方
法は重要であり得る。リポソームに抗原を結合すること
による免疫原の製造を示す米国特許第4,565,696号を参
照されたい。

以後本明細書で述べる通り、本発明は、リポソームを
含有するワクチン組成物の調製を目的としている。この
リポソーム、および詳細を以下に示す種々の他の成分
は、病原体由来のあるいは病原体関連する抗原の免疫原
性を増大するためのアジュバントとして作用する。

現在、米国で臨床使用のために承認されたアジュバン
トは、アルミニウム塩だけである（ミョウバン）。これ
らのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリオ、
狂犬病、インフルエンザを含む一部のワクチンについて
有用であるが、他のワクチン、特に、生体を守るために
細胞性免疫の刺激を必要とする場合は有用でない。ミョ
ウバンは、百日咳およびチフスワクチンの有効性を改善
することができず、アデノウィルスワクチンを若干改善
するだけであると報告されている。アルミニウム塩が有
する問題は、注射部位の肉芽腫誘発およびalum製剤のロ
ット間変動を含む。

完全フロイントアジュバント（CFA）は、強力な免疫
刺激剤であり、実験主成分として多くの抗原とともに用
いられている。CFAは、鉱物油、アルラセルArlacel A等
の乳化剤、Mycobacterium tuberculosis等のマイコバク
テリア死菌からなる。抗原水溶液をこれらの成分と混合
し、油中水型乳剤を作製する。しかし、CFAは、疼痛、
膿瘍形成、発熱を含む重篤な副作用を引き起こし、ヒト
または動物のワクチンには使用できない。この副作用
は、主に、CFAのマイコバクテリア成分に対する患者の
反応によるものである。

不完全フロイントアジュバント（IFA）は、細菌成分
を除いたCFAと類似している。米国での使用は許可され
ていないが、他の国々では、いくつかのタイプのワクチ
ンにおいてIFAが有用である。IFAは、ヒトに用いるイン
フルエンザおよびポリオワクチンおよび、狂犬病、イヌ
ジステンパー、口蹄疫を含むいくつかの動物ワクチン
に、首尾よく用いられてきた。実験により、IFAで用い
られる油および乳化剤がマウスにおいて腫瘍を形成し得
ることが示され、このことは、臨床使用には別のアジュ
バントの選択が好ましいであろうことを示している。

ムラミルジペプチド（MDP）は、マイコバクテリア細
胞壁複合体の最小単位であり、CFAにみられるアジュバ
ント活性を生じる（Ellouzら．（1974）Biochem. Bioph
ys. Res. Comm., 59:1317を参照されたい）。広汎なア
ジュバント活性および副作用を示す多くのMDP合成アナ
ログが作られている（Chedidら（1978）Rrog. Allerg
y, 25:63に概説されている）。ワクチンアジュバント
として特に有用な３つのアナログは、MDPのトレオニル
誘導体（Byarsら（1987）Vaccine, 5:223を参照）、MD
Pのn-ブチル誘導体（chedidら、（1982）Infect. and I
mmun., 35:417を参照）、およびムラミルトリペプチド
の親脂性誘導体（Gislerら、（1981）Immunomodulation
s of Microbial Products and Related Synthetic Comp
ounds,Y. Yamamura and S. Kotani編、Excerpta Medic
a,Amsterdam,p167を参照）である。これらの化合物は、
体液性および細胞性免疫を効果的に刺激し、そして低レ
ベルの毒性を示す。

１つの有望なMDPの親脂性誘導体は、N-アセチルムラ
ミル‐L-アラニル‐D-イソグルタミニル‐L-アラニン‐
2-［1,2-ジパルミトイル‐sn-グリセロ‐3-（ヒドロキ
シホスホリロキシ）］エチルアミド（MTP-PE）である。
このムラミルペプチドは、リン脂質の尾部を有し、これ
により、分子の疎水性部分と脂性環境との会合が可能と
なり、一方ムラミルペプチドペプチド部分は水性環境が
会合する。このように、MTP-PEそのものが乳化剤として
作用し、安定な水中油型エマルジョンを生じる。

本発明者の研究所において、マウスによる実験によ
り、MTP-PEは、単純ヘルペスウィルスgD抗原に対する抗
HSV gD抗体力価の刺激においてアジュバントとして有効
であることが示されており、この有効性はMTP-PEおよび
gDを水溶液よりむしろ油（IFA）に送達されることによ
り大きく改善された。IFAは臨床使用が許可されていな
いため、MTP-PEおよび抗原のための他の油送達システム
も検討した。0.008％ツイーン80を含む４％スクワレン
およびHSV gDのエマルジョンは、モルモットにおいて極
めて良い結果が得られた。この処方、MTP-PE-LO（低油
性）は、皮下注射用針を通して乳化したが、極めて不安
定であった。それにもかかわらず、MTP−PE-LOは、モル
モットにおいて高い抗体力価を示し、そして免疫したモ
ルモットのHSV感染において良好な保護作用を示した（S
anchez-Pescadorら、（1988）J. Immunology, 141;1720
1727およびTachnological Advances in Vaccine Devel
opment（1988）Laskyら、編、Alan R. Liss, Inc,p445
−469を参照されたい）。MTP-PE−LO処方は、モルモッ
トにおける酵母が産生したHIVエンベロープタンパク質
に対する免疫反応を刺激する上での有効であった。ELIS
A抗体力価、およびウィルス中和抗体力価が、MTP-PEに
より高レベルに刺激された。しかし、同じ処方をヤギお
よびヒヒ等の大動物において試験すると、この組成物は
有効でなかった。ヒトおよび他の大動物においては、抗
原分子と共にさらにアジュバント製剤を用いる方が望ま
しいことが、この予測可能性の欠除から明らかである。

次に、本発明者の実験は、代謝可能な油および乳化剤
からなるアジュバント組成物が、ここにおいて油および
乳化剤は油の小滴のすべてが実質的に、直径１ミクロン
以下である水中油型エマルジョンの形態で存在する、ワ
クチンの有効性を増加するための有用ななアジュバント
組成物であることを示した。研究は、油の小滴が有意に
より大きい油および乳化剤を含むアジュバント組成物に
比べ、前述のアジュバント組成物の優位性を示した。こ
れらのアジュバント組成は、別の特許出願の主題である
（米国特許出願第357,035号,1989年５月25日出願）。

それにもかかわらず、アジュバント製剤のさらなる改
善が、望ましい。例えば、増加した細胞性免疫反応およ
び増加した体液性免疫反応に至る免疫原性組成物が望ま
しい。

発明の要旨 従って、ワクチン、特にサブユニットワクチンの免疫
原性改善が、本発明の目的である。

また、細胞性および体液性免疫反応が活性化されるワ
クチンを提供することが、本発明の目的である。

本発明のこれらのおよびその他の目的は、抗原／リポ
ソーム成分および水中油型エマルジョンの２成分からな
るワクチン製剤を提供することにより達成される。一部
の実施例において用いられたリポソームは、後述するよ
うな適切な条件下でリポソームが生物学的膜と融合する
ことを意味するフゾジェニックリポソームとして知られ
ている。しかし、フゾジェニックリポソームである必要
ない。特に、ムラミルペプチドおよび代謝可能な油を用
いて水中油型の形態で形成された組成物が有用である。
ここで油小滴は実質的にサブミクロンサイズであり、そ
して最終ワクチン組成物を形成するためにエマルジョン
と組合されるリポソーム／抗原成分は別に形成される。

図面の簡単な説明 図１は、異なるアジュバント製剤を用いて、ヤギに抗
原gD2で免疫した後の、平均抗体力価の経日変化を示す
グラフである。

図２は、異なるenv2-3アジュバント製剤を用いて、ヤ
ギに抗原gB2で免疫した後の、平均抗体力価の経日変化
を示すグラフである。

図３は、異なるアジュバント製剤を用いて、アカゲザ
ルに抗原env203/sf2で免疫した後の、平均抗体力価の経
時変化を示すグラフである。

図４は、異なるアジュバント製剤を用いて、ウサギに
抗原gD2で免疫した後の、平均抗体力価の経日変化を示
すグラフである。

図５は、マラリア抗原および異なるアジュバントで免
疫した後、異種マラリア原虫を投与した数群のサルにお
ける、蓄積性寄生虫血症を示すグラフである。

図６は、インフルエンザワクチンおよび異なるアジュ
バントで免疫した後、インフルエンザウィルスを感染さ
せたマウスにおけるELISA抗体力価（上図）および生存
率（下図）を示す２つのグラフのセットである。

特定の実施例の説明 本発明のワクチン組成物の各成分は既知のものである
が、本発明のように組合せることはなかった。特に、こ
のようなワクチン組成物が、成分を別々に用いて得られ
た過去のレベルよりも、免疫原の効率を増大させること
は、予測を越えた驚きであった。

ワクチン組成物の各成分は、一般的におよび一部は詳
細に、好適な実施例で本明細書に記載されているが、す
べての成分は、当該技術分野で周知のものであり、リポ
ソーム、ムラミルペプチド、代謝可能な油および乳化剤
液、本明細書で用いられる用語は、これらの成分につい
て記載および確認するために、当業者において公知であ
る。

本発明の実施において、用いられたリポソームは、ホ
スファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリ
ン、およびホスファチジルコリン等のホフスファチジル
エーテルおよびエステル；ジオレオイルグリセロサクシ
ネート等のグリセリド；セレブロシド；ガングリオシ
ド；スフィンゴミエリン；コレステロール等のステロイ
ド；その他の脂質を含む広汎な脂質物質から調製され得
る。リポソーム調製の詳細な説明については、米国特許
第4,235,871;4,762,720;4,737,323;4,789,633;4,861,59
7;および4,873,089号を参照されたい。

リポソームは上記の特許に示される通り、先行技術に
おいて公知であるので、リポソーム調製法そのものは、
本発明の一部ではない。一般的に、リポソームは、エタ
ノール注入（Batzriら、Biochem. Biophys. Acta. 298
1015 （1973））、エーテル注入（Deamerら、Biochem.
Biophys. Acta. 443:629 （1976）およびSchierenら、B
iochem. Biophys. Acta. 542:137 （1978））、洗浄剤
除去（Razin、Biochem. Biophys. Acta. 265:241 （197
2））、溶媒蒸発（Matsumatoら、J. Colloid Interface
Sci. 62 149 （1977））、水乳剤におけるクロロホル
ムから有機溶媒の蒸発（REV's），（Szoka Jr.ら、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4194（1978））；核小孔
ポリカーボネート膜を介するMLV'sまたはLUV'sの押出し
（Olsonら、Biochem. Biophys. Acta. 557 9 （197
9）；リン脂質混合物の凍結および融解（Pick,Archives
of Biocem. and Biophysics. 212:186 （1981））を含
む、多くの異なる技術により作製される。

常法により、リポソームはサイズによって分類し、議
論されるリポソームのタイプを示すために、３文字の略
語を用いる。多層の小胞は通常「MLV」と称される。単
層の小さな小胞は「SUV」と称され、単層の大きな小胞
は「LUV」と称される。これらの略称名には、時々、リ
ポソームの化学成分が続くことがある。既知のリポソー
ムの名称および型の要約については、Papahadjopoulos,
Ann.N.Y.Acad.Sci.,308:1（1987）およびAnn.Repts.Me
d. Chem.,14:250（1979）を参照されたい。

生物学的活性物質（免疫原として有用な物質を含む）
を細胞へ伝達するうえで有用であると提案したりリポソ
ームの種類は、フゾジェニックリポソームとして知られ
ている物質の包含する。これらは、pH感受性リポソーム
であり、生理的条件における適切な変化に際し、凝集
し、安定でなくなり、そして生物膜と融合する。このよ
うなリポソームは、種々の生理的現象を利用するため
に、典型的にはpH感受性に、典型的には酸感受性とされ
る。例えば、エンドサイトーシスは、負に電荷したリポ
ソームが哺乳類細胞により陥入される主な経路であるこ
とが示されている。エンドサイトーシスにより、リポソ
ームがエンドソームまたはライソソームの酸性環境にお
かれる。これらのオルガネラの環境が、生体の血流中の
生理条件に比べ酸性であるため、リポソームの内容物を
細胞環境へ放出するのに、pHの変化を用いる。抗原を直
接細胞質内に放出すると、抗原のＩ型反応が起こり得、
それによって細胞媒介性免疫反応が刺激される。フゾジ
ェニックリポソームの例については、米国特許第4,789,
633および4,873,089号を参照されたい。

一般的に、フゾジェニックリポソームは、宿主の血流
中で存在pHにおいても電気的に中性であるが、エンドソ
ームまたはライソソーム中で存在pH（典型的には、pH6.
5未満）において電荷している脂質分子を用いて調製す
る。適切な脂質の例としては、ホスファチジルエタノー
ルアミン（PE）およびパルミトイルホモシステインが含
まれる。前述のフゾジェニックリポソームは、典型的に
は、二重層（すなわち、PE）の平面に対し垂直である有
効断面領域が、頭部分においては疎水部分のそれより小
さい、脂質分子を部分的に含む。さらに、フゾジェニッ
クリポソームは、前述の脂質分子（例、オレイン酸、ジ
オレオイルグリセロールサクシネート）の頭部分と水素
結合できる脂質分子も含む。水素結合が生じると、二重
層の有効表面積が縮小され、融合可能な準安定性の二重
層となる。この形態は、別の融合可能な二重層と密接に
並ぶと六角形の第II相に容易に転位し得、２つの膜が融
合する。

融合の開始は、pHにより調節し得、pHにより頭部分間
の水素結合の数が決定される（すなわち、pH感受性フゾ
ジェニックリポソーム）。あるいは、融合は、温度によ
り調節することができ；融合可能な二重層はラメラα
相、あるいは液晶状態にある必要がある。Tm以下では、
これらはゲル状であり得、あるいはラメラβ相であり
得、融合し得ない。温度をTm以上に上げると、融合を誘
導し得る。

しかし、フゾジェニックリポソームは、本発明の一部
の実施例にすぎず、リポソームは以前に多くの形態で知
られていることを強調しなければならない。フゾジェニ
ックリポソームを記載した刊行物の典型的な例について
は、 Connorら、Proc.Natl.Acad,Sci.U.S.A.（1980）81:1715
-1718;Schneiderら，Proc.Natl.Acad,Sci U.S.A.（198
0）77:442-446;Schenkmanら、Biochem.Biophys.Acta.
（1981）649:633-641;Schenkmanら，Chem.phys.Lipids
（1981）28:165-180;Blumenthalら，J.Boil.Chem.（198
3）258:349-3415;Yatvinら，Science（1980）210:1253-
1255;Duzgunesら，Biochemistry（1985）24:3091-3098;
Straubinger,Receptor-Mediated-Targeting of Drugs
（Gregoriadis編）pp.297-315,Plenum Press New York;
Straubingerら，FEBS Lett.（1985）179:148-154を参照
されたい。リポソーム、その性質およびその調製法に関
する一般的情報については、Liposome Technokogy（Gre
goriadis編）CRC Press, Boca Raton, Florida（1983）
を参照されたい。リポソーム組成物、その調製、および
免疫原として抗原を有するリポソームの使用の多くの異
なる側面を記載した刊行物リストを含む、免疫学的アジ
ュバントとしてのリポソーム使用の最近の総説について
は、Gregoriadis,Immunology Today（1990）11:89−97
を参照されたい。

本発明は、フゾジェニックリポソームおよび非フゾジ
ェニックリポソームの両者を用いて、多くのリポソーム
組成物を用いて実施した。本明細書中のこれらのおよび
他の実施例において、以下の略語を用いる。PE;ホスフ
ァチジルエタノールアミン;GS,ジオレオイルグリセロー
ルサクシネート;CHOL,コレステロール;OA,オレイン酸;P
C,ホスファチジルコリン；およびPS,ホスファチジルセ
リン。好適なフゾジェニックリポソーム組成物は、ホス
ファチジルエタノールアミンおよびジオレオイルグリセ
ロールサクシネートを8:2のモル比で含む；この組成物
をPE/GS（8:2）で略す。PE/GS/CHOL（8:2:1）も、好適
なフゾジェニックリポソーム組成物である。非フゾジェ
ニックリポソーム組成物には、PC/PS（7:3）およびPC/P
S/CHOL（7:3:1）が含まれる。

本発明の全体のワクチン製剤は、前述の通り、２つの
主成分を含む：抗原／リポソーム成分および油エマルジ
ョンである。従って、本明細書に示すリポソームは、免
疫反応を誘導するために用いられる抗原を含む第一の組
成物の形で調製され、この第一の成分は、第二の成分
（エマルジョン）と配合され本発明の組成物を形成す
る。

本明細書で用いられる抗原という用語は、動物の血流中
に外来物質が入った場合、このような動物の組織に近づ
くことにより、特定的抗体の形成を刺激し、インビボお
よびインビトロでこのような抗体と特異的に反応するす
べての物質をいう（タンパク質、タンパク質−多糖類、
タンパク質−リポ多糖、多糖類、リポ多糖、ウィルスサ
ブユニット、ウィルス本体を含む）。さらに、抗原は、
抗原レセプターを有するＴリンパ球の増殖を刺激し、そ
していわゆる細胞媒介性免疫の一連の反応を開始するた
めにリンパ球と反応し得る。

ハプテンは、この定義の範囲内に含まれる。ハプテン
は、その免疫学的特異性を決定づける抗原分子または抗
原複合体の一部分である。一般的に、ハプテンは、天然
に生ずる抗原ではペプチドまたは多糖類である。人工的
な抗原は、アルサニル酸（arsanilic acid）誘導体等の
低分子量物質であり得る。ハプテンは、インビボまたは
インビトロにおいて、ハプテンの抗原型（例えば、免疫
原物質と結合したハプテン）により誘発された抗体また
はＴリンパ球と、特異的に反応し得る。言い換えれば、
抗原決定基、抗原決定基群とハプテン基（haptenic gro
uping）である。

本発明のワクチン製剤は、抗原の有効量を用い得る。
すなわち、アジュバントと組み合わせてウィルスあるい
は他の病原体に、その後接触しても生体を保護するよう
に特異的および十分な免疫反応を生体に起こし得る抗原
量を含み得る。

抗原は、同技術分野で公知の方法により産生し得、あ
るいは市販物を購入し得る。本発明の範囲内の抗原は、
不活性化ウィルス粒子の全部、単離されたウィルスタン
パク質、およびタンパク質サブユニット（遺伝子操作技
術により産生されたタンパク等）を含む。本発明のワク
チンは、多くの病原体に対して哺乳動物を免疫するた
め、および診断用途の抗体形成を誘発するために用い得
る。

本発明のリポソーム含有組成物に取込まれる抗原の例
は、遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（CH
O）細胞から分泌された組換えタンパク質、および単純
ヘルペスウィルス由来の組換えタンパク質であるHSV rg
D2とよばれる組換えタンパク質を含む。このタンパク質
は切断される通常のアンカー領域を有し、組織培養培地
中に分泌されるグルコシル化タンパク質を与える。リポ
ソーム中に用いられるHSVgD2は、CHO培地中から純度90
％以上で精製された。HSV rgB2は、上記HSV gD2と同
様、CHO細胞中に産生される、十分にグリコシル化され
た分泌タンパクである。HIV gp120は、上記HSV gD2につ
いて記載したのと同様の方法により産生される十分にグ
リコシル化されたヒト免疫欠損ウィルスタンパク質であ
る。HIV RT6は、HIV逆転写酵素の組換え体であるが、遺
伝子操作によるSaccharomyces cerevisaeにおいて産生
される。このタンパク質は、生体内逆転写酵素のＣ末端
を欠く。HIVタンパク質、および多くの異なる市販イン
フルエンザワクチンの両者は、本発明の実施において使
用するため、リポゾーム中に取り込まれる。

血清１は、Plasmodium falciparumメロゾイトタンパ
ク質の組換え型であり、Saccharomyces cerevisaeによ
り遺伝子操作で産生される。このタンパク質は、生体内
メロゾイト抗原のＮ末端262個のアミノ酸性のみを含
む。HAタイワンは、インフルエンザA/タイワン/1/86型
（H1N1）の血球凝集素であり、市販のインフルエンザワ
クチン用に、Parke−Davisによりニワトリ卵において培
養する。合成の11個のアミノ酸からなるペプチド、H-Il
e-Tyr-Ser-Thr-Val-Ala-Ser-Ser-Leu-Val-Leu-OHは、天
然のHSV gB2において同定されたT-細胞エピトープに相
当し、（Hanke,T.ら、（1991）：J.of Virology 65:11
77-1186）、また用いられる。

本発明の組成物と共に用いるため、他の多くの抗原が
特定的に予期される。これらは、遺伝子操作されたHIV
タンパク質であるHIV-env 2-3;falc.2.3.等の種々のマ
ラリアウィルス;mero;血清N;およびvivax1,2,および３
が含まれる。gBおよびgHと呼ばれるタンパク質を含むサ
イトメガロウィルス（CMV）タンパク質も、種々のＣ型
肝炎ウィルス（HCV）タンパク質と共に予期される。こ
れらの抗原についてより詳細な記載、およびこれらのお
よび他の抗原について詳細に記載されている多くの刊行
物のリストについては、1989年５月25日に出願された米
国特許出願第357,035を参照されたい。さらに、対応す
るPCT出願PCT/US90/02954,1990年５月24日出願、「Adju
vant Formulation Comprising a Submicron Oil Drople
t Emulsion」も参照されたい。

一般的に、本発明は、ワクチン開発に適切なすべての
天然または組換えタンパク質、またはサブユニットタン
パク質、およびＢ−細胞およびＴ−細胞エピトープを包
含するペプチドとともに用い得る。非タンパク質性抗原
（例として、炭水化物、糖脂質）もまた用い得る。

本発明に採用し得る個々のおよびすべての抗原につい
て、特定のガイダンスを提供する、単回投与指示を指定
することはできない。抗原の有効量は、同技術分野にお
いて理解されているように、その持っている活性と純度
による関数であり得る。典型的な値は、本発明組成物の
種々の成分の相対量を記載する節において、論議され
る。

本発明のエマルジョン成分は、ムラミルペプチドおよ
び代謝可能な油の水中油型エマルジョンを包含する。懸
濁した油小滴はすべての適切な大きさであり得、そして
後述の通り、サブミクロンサイズの油小滴が好適ではあ
るが、必ずしも、ワクチンの有効性を高めるために実質
的なサブミクロンである必要はない。ムラミルペプチド
は、アジュバンド組成物中の免疫刺激剤として機能し、
そしてまた乳化作用を持つため、別の乳化剤を必要とし
ない。にもかかわらず、本発明のエマルジョン成分は、
好ましくは、１つあるいは以上の乳化剤を含む。

本発明の組成物には、すべての免疫反応刺激性のムラ
ミルペプチド（グリコペプチドとしても知られている）
が使用し得る。多くの好適なムラミルペプチドを、以下
に示す。

乳化剤／免疫刺激剤の配合剤の例としては、上記のSa
nchez-Pescadorらの２件の刊行物に記載されている親脂
性ムラミルペプチドがある。これらの物質は、免疫刺激
基として作用する塩基性N-アセチルムラミルペプチド
（親水性部分）を包含し、得られる化合物に界面活性作
用を与える親脂性部分も有する。このような化合物およ
び、他のタイプの両親媒性免疫刺激剤が、免疫刺激剤お
よび乳化剤として作用し、そして本発明の実施において
好ましい。さらに、両親媒性免疫刺激物質と、両親媒性
でない第二の免疫刺激物質としを併用して本発明を実施
することもできる。例として、親脂性ムラミルペプチド
と本質的に置換されていない（すなわち本質的に親水
性）ムラミルジペプチドの併用であり得る。

本発明の好適な免疫反応刺激性ムラミルペプチドは、
N-アセチルムラミル‐L-アラニル‐D-イソグルタミンの
関連化合物群および一般的誘導体であり、これらについ
ては、Ellouzら（1984）Biochem.&Biophys.Res.Comm.,5
9;1317により、M．tuberculosisにおいて、免疫学的ア
ジュバント活性を持つ最小の有効単位であると決定さ
れ、フロイントの完全アジュバントのマイコバクテリア
成分である多くのジペプチドおよびポリペプチド置換さ
れたムラミン酸誘導体がその後開発され、免疫刺激作用
を有することが見いだされた。

これらのムラミルペプチドは、多様な化合物群である
が、一般的に、以下の構造式Ｉにより表すことができ
る。

ただし、ピラン環のOH基は、水素、アルキル基、アシル
基あるいはその類似基で置換されるか、特に６位の酸素
は、窒素を含む置換基により置換され得る。２−アミノ
基は、アシル基または他のアミドである。ラクチル側鎖
は、修飾され、例えば、エチルまたはその他の２位がア
ルキル置換されたものである。ペプチド部分はジペプチ
ドまたはポリペプチドであり、さらにその誘導体でもよ
い。ピラノシル化合物のフラノシルアナログも、免疫増
強作用を有し、本発明において有用である。

本発明において使用し得るムラミルペプチドは、米国
特許第4,235,771号および第4,186,194号に記載された通
り、メソ−α、ε−ジアミノピメリン酸と結合したジサ
ッカライドおよびテトラサッカライドである。

本発明の実施において使用し得る別の免疫反応刺激性
ムラミルペプチドは、米国特許第4,094,971;4,101,536;
4,153,684;4,235,771;4,323,559;4,327,085;4,185,089;
4,082,736;4,369,178;4,314,998;4,082,735および4,18
6,194号に開示されている。これらの特許におけるムラ
ミルペプチドの開示は、ここに引用文献として、全部詳
細に記載したと同様、明細書の一部分といえる。日本国
特許J5 4079-2227、J5 4079-228、J5 41206-696に示さ
れる化合物も、本発明の実施に有用である。

これらの化合物の調製法は、開示され、同業者に周知
である。調製工程の例は、米国特許第4,082,736および
4,082,735号に記載されている。さらに、同様の調製工
程は、前のパラグラフで引用した米国特許において見出
されるであろう。

好ましいムラミルペプチドは、以下の構造式IIを有す
る。

ここで、Ｒは１〜22個の炭素原子を含む非置換または置
換アルキルラジカル、あるいは６〜10個の炭素原子を含
む非置換または置換アリルラジカルを表わし、 R¹およびR²は、同一あるいは異なる、水素または１〜
22個の炭素原子を含むアシルラジカルを表わし、 R³は、水素または１〜22個の炭素原子のアルキル基ま
たは７〜10個の炭素原子のアリル基を表わし、 R⁴は、水素または１〜７個の炭素原子をアルキル基を
表わし、ｎは、０または１であり、 ＸおよびＺは、それぞれ独立して、アラニル、バリ
ル、ロイシル、イソロイシル、α−アミノブチリル、ト
レオニル、メチオニル、システインニル、グルタミル、
グルタミニル、イソグルタミル、イソグルタミニル、ア
スパルチル、フェニルアラニル、チロシル、リシル、オ
リンチニル、アルギニル、ヒスチジル、アスパラジニ
ル、プロリル、ヒドロキシプロリル、セリル、またはグ
リシル基を表わし、 R⁵は、エステル化またはアミデート化されてもよいア
ミノ酸末端のカルボキシル基で表わし、そして Ｙは、‐NHCHR⁶CH₂CH₂CO‐を表わすが、ここでR⁶は、
エステル化またはアミデート化されてもよいカルボキシ
ル基を表わす。

エステル化またはアミデート化されてもよいカルボキ
シル基とは、カルボキシル基そのもの、または、C₁‐C₄
アルカノールでエステル化したカルボキシル基、例えば
メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、
カルバモイル基等であり、又はその窒素原子が、非置換
あるいはC₁‐C₇アルキル、特にC₁‐C₄アルキル、アリ
ル、特にフェニル、アリルアルキル、特にベンジル基で
モノ置換またはジ置換されたカルバモイル基である。こ
のカルバモイル基は、アルキリデンラジカル、例えばブ
チリデン、またはペンチリデンラジカルで置換されても
よい。さらに、カルバモイル基R₅は、窒素原子のカルバ
モイルメチル基で置換してもよい。

特に、好ましい化合物は、構造式IIにおいて、Ｒおよ
びR¹が同一又は異なる、水素あるいは１〜22個の炭素原
子を含むアシルラジカルであり、R²がメチル基で、R₃が
水素で、ＸがL-アラニル基で、ＹがD-イソグルタミニル
基、ｎが０の化合物である。

ムラミルペプチドの別の好ましい基は、構造式IIにお
いて、ＲおよびR¹が水素あるいは１〜22個の炭素原子を
含むアシル基で、R²がメチル基で、R³が水素で、R⁴がメ
チル基またはブチル基、ＸがL-バリル、L-セリル、L-ア
ラニル、L-トレオニル、L-α‐アミノブチリル基である
化合物である。

特別の例は、以下の化合物を含む。

N-アセチルムラミル‐L-α‐アミノブチリル‐D-イソ
グルタミン、 6-0-ステアロイル‐N-アセチルムラミル‐L-α‐アミ
ノブチリル‐D-イソグルタミン、 N-アセチルムラミル‐L-トリオレニル‐D-イソグルタ
ミン、 N-アセチルムラミル‐L-バリル‐D-イソグルタミン、 N-アセチルムラミル‐L-アラニル‐D-グルタミンn-ブ
チルエステル、 N-アセチル‐デスメチル‐D-ムラミル‐L-アラニル‐
D-イソグルタミン、 N-アセチルムラミル‐L-アラニル‐D-グルタミン、 N-アセチルムラミル‐L-セリル‐D-イソグルタミン、 N-アセチル（ブチルムラミル）‐L-α‐アミノブチル
‐D-イソグルタミン、 N-アセチル（ブチルムラミル）‐L-アラニル‐D-イソ
グルタミンである。

免疫刺激性ムラミルペプチドの有効量は、抗原と共に
投与した場合の抗体力価が、ムラミルペプチドを併用投
与しない場合の抗体力価より増加する作用を有する量で
ある。予測される通り、各ムラミルペプチドは、他のム
ラミルペプチドとは異なる有効用量範囲が考えられる。
従って、単回用量範囲は、本発明の範囲内で考えられる
各ムラミルペプチドにおいて、正確にあてはまるという
わけではない。しかし、一般的に、ムラミルペプチドは
ワクチン中0.001〜５％（W/V）が好ましい。より好まし
くは、0.01〜３％（W/V）である。

上記免疫刺激性ムラミルペプチドのほとんどは、本質
的に親水性である。従って、これらは、別々の乳化剤を
使用することが考えられる（前述の通り、これらは免疫
刺激剤でもある）。たまに、上記化合物が親水性を有す
ることもあり、そのような化合物は、その糖部分に脂肪
酸置換基および／またはアリル置換基、特に14〜22個の
炭素原子を含む１個以上のアシル置換基を１個以上含
む、特に、このようなアシル置換基を１個以上含む化合
物である。しかし、ペプチド部分のカルボキシレート基
または側鎖に脂質部分を結合させたムラミルペプチドに
おいても、親脂性を得ることができる。特に、末端カル
ボキシレート基を介してペプチド部分と結合する１つ以
上の脂質基を有する化合物は、好ましい化合物群を示
す。この結合は、直接14〜22個の炭素原子を含む脂肪酸
アルコールと末端カルボキシレートとの間でエステル結
合を形成させるかあるいは、二官能性結合基、例えばエ
タノールアミンを用いて、エステルまたはアミド結合を
介して脂質とカルボキシレートを結合することにより、
直接的に容易に得ることができる。本発明のこの具体例
において特に好ましいものは、リン脂質であり、容易に
結合可能な官能基を提供するリン酸基である。ジアシル
フォスフォグリセリドは、容易に結合可能なリン脂質等
を提供する。フォスファチジルエタノールアミンは容易
に結合可能な、生体内に存在する化合物であり、アミド
結合によりペプチド部分の末端カルボキシレートに容易
に結合する。他の脂質として、アシルグリセロール、フ
ォスファチジルコリン、フォスファチジルセリン、フォ
スファチジールイノシトール、フォスファチジルグリセ
ロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリンが含まれ
る。

多くの好ましい媒性免疫刺激性を複数有するペプチド
は、以下の構造式IIIに示される。

ここで、Ｒ、R¹‐R⁴、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｎは、前述の通りで
ある。Ｌはここに示した脂質部分を示す。

要約すると、分子のムラミン酸部分とペプチド部分
は、共に親水性部分を提供する。分子内には親脂性部分
もあり、一般的に、この親脂性は長鎖炭水化物、特に脂
肪酸として示される。この脂肪酸または他の炭水化物を
含有するラジカルは、糖のヒドロキシル基に結合し得、
あるいは、例えば直接ペプチド部分に存在する遊離アミ
ノ酸と脂肪酸との反応により、あるいは、例えばヒドロ
キシルアミンのような結合基を介して、ペプチドのカル
ボキシル基とリン酸基等の脂質中の官能基との間に結合
に形成することにより、分子のペプチド部分に直接結合
することができる。リン脂質部分は、特に、親脂性ムラ
ミルペプチドを形成するうえで好ましい。好ましい化合
物群には、ムラミルペプチドおよびトリペプチドが含ま
れこれらは、ヒドロキシアルキルアミン部分によりリン
脂質部分の結合している。例として、特に好ましい化合
物は、Ciba-Geigy,Ltd.,Basal,スイスにより製造され
た、N-アセチルムラミル‐L-アラニル‐D-イソグルタミ
ニル‐L-アラニン‐２［1,2-ジパルミトイル‐sn-グリ
セロ‐3-（ヒドロキシフォスフォリルオキシ）］エチル
アミド（MTP−PEと略す）である。

本発明に用いられた別の成分は、代謝可能で非毒性の
油で、その１つは好ましくは、６〜30個の炭素原子を有
するアルカン、アルケン、アルキン、および対応する酸
とアルコール、そのエーテルとエステル、さらにその混
合物を含むがこれらに限定されるわけではない。この油
は、植物性油、魚油、動物性油、または合成油で、アジ
ュバントの投与される対照となる生体内で代謝され、か
つその対象生体内で非毒性であればよい。対象物とは、
動物であり、典型的には哺乳動物、好ましくはヒトであ
る。鉱油および同様の有毒なる石油留出油は、本発明か
ら特に除く。

本発明の油成分は、長鎖アルカン、アルケル、もしく
はアルキン、またはその酸誘導体もしくはアルコール誘
導体のいずれでもよく、それらは遊離酸、塩、またはエ
ステルとして存在し得る。エステルとしては、トリグリ
セリト、および1,2-プロパンジオールまたは同様のポリ
ヒドロキシアルコールのエステルのような、モノエステ
ル、ジエステル、もしくはトリエステルとして存在し得
る。アルコールは、例えば酢酸、プロパン酸、クエン酸
等のモノまたはポリの官能酸を用いてアシル化し得る。
油であり前述した他の基準を満たしている長鎖アルコー
ル由来のエーテルもまた使用し得る。

個々のアルカン、アルケン、またはアルキン成分、お
よびその酸またはアルコール誘導体は一般に、６から30
の炭素原子を有している。これら成分は直鎖構造または
枝分れ鎖構造をしている。それは完全飽和であるか、ま
たは１つ以上の二重結合または三重結合を有し得る。モ
ノまたはポリエステル、またはエーテルベースの油の場
合は、個々の脂肪酸または脂肪アルコール成分に適用さ
れる炭素数６から30の限定は、全炭素数ではない。

人工油を含む、代謝し得る油であれば本発明に用いら
れ得るが、動物、魚、または植物源由来の油が好まし
い。油を、それが投与される宿主により代謝される必要
がある。さもなければ、その油成分は膿瘍、肉芽腫、ま
たは癌腫さえも形成し、または、それが獣医術の実務で
用いられるなら、代謝されない油が消費者の心身に害を
及ぼすかもしれないため、予防接種した鳥および動物の
肉がヒトの消費に適合し得ない。

植物油の供給源としては堅果、種および穀物が挙げら
れる。落花生油、大豆油、ヤシ油、およびオリーブ油が
最も容易に利用可能な堅果油の例である。種油としては
紅花油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油等が挙げられる。
穀物群の中では、トウモロコシ油が最も容易に利用可能
であるが、コムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テ
フ、ライコムギのような他の穀類もまた用い得られる。

植物油を得る技術は開発されており、また公知であ
る。これら、および他の同様な油の組成物は、例えばMe
rckインデックスおよび食物、栄養物、および食品工学
における供給源物質に見いだし得る。

グリセロールおよび1.2-プロパンジオールの、６から
10の炭素原子を有する脂肪酸エステルは、種油において
は自然に生じないものであるが、堅果油および種油から
得た適切な物質の加水分解、分離、およびエステル化に
より調製し得る。これらの製品はNEOBEEの商標名でPV
O International,Inc.、Chemical Specialties Divisio
n、416 Division Street、Boongon、NJ等から市販され
ている。

多くの動物源からの油は、本発明のアジュバントおよ
びワクチンに採用され得る。動物油および脂肪は、トリ
グリセリドであり、魚または植物からの油よりも高い飽
和度を有するため、体温付近では通常固体である。しか
し、脂肪酸は、遊離脂肪酸を提供する部分的または完全
なトリグリセリド鹸化により、動物脂肪から得ることが
できる。哺乳類の乳からの脂肪および油は、代謝可能で
あり、本発明の実施に用いられ得る。動物源から精油を
得るために必要である分離、精製、および鹸化等の方法
は当業者に周知である。

ほとんどの魚は容易に回収し得る代謝可能な油を含有
している。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨蝋の
ような鯨油が、本発明で用いられ得る魚油の一例であ
る。枝分れ鎖油の多くは、5-炭素イソプレン単位で生化
学的に合成され、一般にテルペノイドを称される。サメ
肝油は、スクアレン、２、６、10、15、19、23-ヘキサ
メチル‐２、６、10、14、18、22-テトラコサヘキサエ
ン（tetracosahexaene）として知られる、本発明におい
て特に好適である、枝分れ鎖の不飽和テルペノイドを含
有する。スクアレンが飽和してできるスクアランもまた
特に好適な油である。スクアランおよびスクアレンを含
む魚油は市販されており容易に入手可能であるが、また
当業者に公知の方法からも得られる。

これらのアジュバントおよびワクチン製剤の油成分は
0.5から15容積％であり、好ましくは１から12容積％で
ある。最も好ましくは１から４容積％の油が用いられ
る。

これらのアジュバント組成物の水分は一般に生理食塩
水であるが、好適な実施態様では、純水である。これら
の組成物は非経口投与されるものであるため、組成物と
体液のイオン濃度が異なるために生じる、投与後の膨れ
または組成物の急速な吸収を防ぐために、ワクチンとし
て用いられる最終緩衝溶液は、好適には、その浸透圧、
すなわち重量オスモル濃度が正常な体液と本質的に同等
であるように作られる。通常な生理的条件に適合するpH
を維持するために、生理的食塩水を緩衝剤で処理するこ
ともまた好ましい。さらにある場合には、グリコペプチ
ドのような特定の組成物成分の安定性を確保するため、
pHを特定レベルに維持する必要がある。

生理的に受容可能であればそのような緩衝液をも本発
明に用いられ得るが、リン酸緩衝溶液が好ましい。クエ
ン酸塩、酢酸塩、トリス（tris）、重炭酸塩、または炭
酸塩のような他の受容可能な緩衝液がリン酸緩衝液溶液
の代わりに用いられ得る。水成分のpHは好ましくは6.0
から8.0の間である。

しかし、アジュバントがミクロン以下の粒子からなる
水中油型エマルジョンとして調製されるなら、純水がエ
マルジョン形成時のエマルジョンの水成分として好まし
い。塩分の濃度を上昇せしめると、所望の小さい水滴サ
イズを得ることがより困難となる。最終ワクチン製剤が
アジュバントから調製される場合には、抗原物質が、所
望のワクチン組成物を提供するために、適切な重量オス
モル濃度で緩衝液に添加され得る。

これらの組成物に採用される水分の量は、組成物の値
を均一にするために必要な量である。すなわち、100％
にするに十分な水分の量が、組成物を一定容量にするた
めに上述した他の成分と混合される。

多くの乳化剤よおび懸濁剤が一般に薬学サイエンスに
おいて用いられている。これらには樹木からの樹脂、植
物性タンパク質、並びにアルギン酸塩およびセルロース
のような糖をベースにしたポリマー、等の天然誘導され
る物質が含まれる。特定のオキシポリマー、または炭素
骨格の上に水酸基または他の親水性置換基を有するポリ
マー、例えばポビドン（povidone）、ポリビニルアルコ
ール、およびグリコールエーテルをベースのモノおよび
ポリ官能化合物は、界面活性剤活性を有する。長鎖脂肪
酸由来化合物が実質的に本発明に用いられ得る乳化剤お
よび懸濁剤の第３の群を形成する。前出の界面活性剤は
どれもそれらが無毒性である限り有用である。

本発明に従い用いられ得る適切な乳化剤（界面活性剤
または洗浄剤にも当てはまる）の例としては以下が挙げ
られる： 1.ナトリウム、カリウム、アンモニウム、および高級脂
肪酸（C₁₀‐C₂₂）のアルカノールアンモニウム塩のよう
な水溶性石鹸、そして特にナトリウムおよびカリウムの
獣脂、並びにココヤシ石鹸。

2.約８から22の炭素原子、およびスルホン酸および硫酸
エステルラジカルからなる群から選択されるラジカルを
含有するアルキルラジカルをその分子構造に有する有機
物の硫酸反応産物の水溶性塩に代表され得る、アニオン
合成非石鹸洗浄剤。これらの例を以下に挙げる：獣脂ま
たはヤシ油から誘導されたナトリウムまたはカリウムア
ルキル硫酸塩；ナトリウムまたはカリウムアルキルベン
ゼンスルホン酸塩；ナトリウムアルキルグリセリルエー
テルスルホン酸塩；ナトリウムヤシ油脂肪酸モノグリセ
リドスルホン酸塩および硫酸塩;1モル以上の高級アルコ
ールおよび約１から６モルのエチレンオキシドの反応産
物の硫酸エステルのナトリウム塩またはカリウム塩;1分
子当りエチレンオキシドを１から10単位有しており、そ
してアルキルラジカルが８から12炭素原子を含有してい
る、ナトリウムまたはカリウムアルキルフェノールエチ
レンオキシドエーテルスルホン酸塩；イセチオン（iset
hionic）酸でエステル化され、水酸化ナトリウムで中和
された脂肪酸の反応産物；メチルタウリンの脂肪酸アミ
ドのナトリウム塩またはカリウム塩；およびSO₃‐スル
ホン化C₁₀‐C₂₄α‐オレフィンのナトリウム塩およびカ
リウム塩。

3.アルキレンオキシド基と有機疎水性化合物の縮合によ
り作製された非イオン合成洗浄剤。典型的疎水性基に
は、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮
合産物、アルキルフェノール、プロピレンオキシドとエ
チレンジアミンの縮合産物、８から22の炭素原子を有す
る高級アルコール、および脂肪酸のアミドが含まれる。

4.半極性特性を有する。酸化アミン、酸化ホスフィンお
よびスルホキシドのような非イオン洗浄剤。長鎖第三級
アミンオキシドの例としては、ジメチルドデシルアミン
オキシドおよびビス‐（2-ヒドロキシエチル）ドデシル
アミンが挙げられる。ホスフィンオキシドの例は、1967
年２月15日発行の米国特許第3,304,263号に記載されて
おり、ジメチルドデシルホスフィンオキシドおよびジメ
チル‐（2-ヒドロキシドデシル）ホスフィンオキシドが
挙げられる。

5.R₁‐S0-R₂の式（式中R₁およびR₂は置換された、また
は置換されていないアルキルラジカルであり、R₁は約10
から約28の炭素原子を含有し、R₂は１から３の炭素原子
を含有する）に相当するような、長鎖スルホキシド。こ
れらのスルホキシドの例としては、ドデシルメチルスル
ホキシドおよび3-ヒドロキシトリデシルメチルスルホキ
シドが挙げられる。

6.3-ドデシルアミノプロピオン酸ナトリウムおよびナト
リウム3-ドデシルアミノプロパンスルホン酸ナトリウム
のような、両性合成洗浄剤。

7.3-（N,N-ジメチル‐N-ヘキサデシルアンモニオ）プロ
パン‐1-スルホン酸ナトリウム、および3-（N,N-ジメチ
ル‐N-ヘキサデシルアンモニオ）‐2-ヒドロキシ‐プロ
パン‐1-スルホン酸ナトリウムのような両性イオン合成
洗浄剤。

さらに、以下に挙げる全てのタイプの乳化剤が本発明
の組成物に用いられ得る：（ａ）脂肪酸、ロジン酸、お
よびトール油の石鹸（すなわちアルカリ塩）；（ｂ）ア
ルキルアレーンスルホン酸塩；（ｃ）枝分れ鎖および直
鎖の両方の疎水性基、並びに第一級および第二級硫酸基
を持つ界面活性剤を含む、アルキル硫酸塩；（ｄ）脂肪
アシル化メチルタウリンおよび硫酸脂肪モノグリセリド
のような、疎水性および親水性基間の中間結合を含有す
る、硫酸塩およびスルホン酸塩；（ｅ）ポリエチレング
リコールの長鎖酸エステル、とりわけロール油エステ
ル；（ｆ）アルキルフェノールのポリエチレングリコー
ルエーテル；（ｇ）長鎖アルコールおよびメルカプタン
のポリエチレングリコールエーテル；（ｈ）脂肪アシル
ジエタノールアミド；および（ｉ）エチレンオキシドお
よびプロピレンオキシドのブロック共重合物。界面活性
剤は複数の方法で分類され得るので、ここで述べる界面
活性剤の多くのクラスが前述した界面活性剤のクラスと
重複する。

特に設計された、また生物学的状況に通常用いられ
る、乳化剤は多くある。例えば、多くの生物学的洗浄剤
（界面活性剤）がSigma Chemical Companyの1987 Catal
og of Biochemical and Organic Compoundsの310−316
頁等に挙げられている。そのような界面活性剤は４つの
基本タイプ、アニオン、カチオン、両性イオン、および
非イオンに区分される：アニオン洗浄剤の例としては、
アルギン酸、カプリル酸、コール酸、１−デカンスルホ
ン酸、デオキシコール酸、1-ドデカンスルホン酸、N-ラ
ウロイルサルコシン、およびタウロコール酸が挙げられ
る。カチオン洗浄剤としては、臭化ドデシルトリメチル
アンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ベンジルジメチ
ルヘキサデシル塩化アンモニウム、塩化セチルピリジニ
ウム、塩化メチルベンゼトニウム、および4-ピコリンド
デシル硫酸塩が挙げられる。両性洗浄剤の例としては、
3-［（3-コールアミドプロピル）‐ジメチルアンモニ
オ］‐1-プロパンスルホン酸塩（通常CHAPSと略され
る）、3-［（コールアミドプロピル）‐ジメチルアンモ
ニオ］‐2-ヒドロキシ‐1-プロパンスルホン酸（通常CH
APSOと略される）、N-ドデシル‐Ｎ、N-ジメチル‐3-ア
ンモニオ‐1-プロパンスルホン酸塩、およびリソ‐α‐
ホスファチジルコリンが挙げられる。非イオン洗浄剤の
例としては、デカノイル‐N-メチルグルカミド、ジエチ
レングリコールモノペンチルエーテル、n-ドデシルβ‐
D-グルコピラノシド、高級アルコールのエチレンオキシ
ド縮合物（例:Lubrolの商標名で販売）、脂肪酸のポリ
オキシエチレンエーテル（とりわけC₁₂‐C₂₀の脂肪
酸）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エーテル
（例:Tweenの商標名で販売）、およびソルビタン脂肪酸
エーテル（例:Spanの商標名で販売が挙げられる。

界面活性剤のとりわけ有用な群はソルビタンをベース
にした非イオンの界面活性剤である。これらの界面活性
剤は、脂肪酸の１以上の当量と反応する1,4-ソルビタン
を与える、ソルビトールを脱水することにより調製され
る。脂肪酸置換された成分は、エチレンオキシドを反応
し得、界面活性剤の第２の群を与え得る。

脂肪酸置換されたソルビタン界面活性剤は1,4-ソルビ
タンをラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレ
イン酸、または同様の長鎖脂肪酸のような脂肪酸を反応
させて、1,4-ソルビタンモノエステル、1,4-ソルビタン
セスキエステル、または1,4-ソルビタントリエステルを
与えることにより作製される。これらの界面活性剤の通
常名としては、例えばソルビタンモノラウリン酸塩、ソ
ルビタンモノパルミチン酸塩、ソルビタンモノステアリ
ン酸塩、ソルビタンモノオレイン酸塩、ソレビタンセス
キオレイン酸塩、およびソルビタントリオレイン酸塩が
挙げられる。これらの界面活性剤はSPANまたはARLACE
Lの名前で市販されており、通常種々のモノエステ
ル、ジエステル、およびトリエステル置換されたソルビ
タン間を識別する多くの文字が付けられている。

SPANおよびARLACEL界面活性剤は親水性であり、
一般に油に可溶性であるか、または分散し得る。それら
はほとんどの有機溶剤にも可溶である。水中では、それ
らは一般に不溶性であるが分散し得る。一般にこれらの
界面活性剤の親水性‐親脂性バランス（HLB）数は1.8か
ら8.6の間である。そのような界面活性剤は容易に当業
者に公知の手段で作製し得るか、または例えばICI Amer
ica's Inc.、Wilmington、DEからATLASという商標名
で市販されている。

界面活性剤の関連群はポリオキシエチレンソルビタン
モノエステルおよびポリオキシエチレンソルビタントリ
エステルを包含する。これらの物質はエチレンオキシド
を1,4-ソルビタンモノエステルまたは1,4-ソルビタント
リエステルに添加することにより調製される。ポリオキ
シエチレンの添加は親脂性のソルビタンモノエステルま
たはソルビタントリエステル界面活性剤を、一般に水に
可溶性であるかまたは分散性に、また有機溶液に種々の
度合いに可溶である、親水性界面活性剤に転化する。

これらの物質はTWEENの商標名で市販されており、
水中油型エマルジョンおよびディスパージョンを調製す
るために、または油を可溶化し、無水軟膏を水可溶性ま
たは洗浄可能にするのに有用である。TWEEN界面活性
剤は、エマルジョンの安定性を促進するために、関連す
るソルビタンモノエステルまたはソルビタントリエステ
ル界面活性剤と組み合わせ得る。TWEEN界面活性剤
は、例えば商標名ATLAS界面活性剤としてICI Americ
a's Inc.、Wilmington、DEのような、多くの製造業者か
ら市販されている。

単独で、またはSPAN、ARLACEL、およびTWEEN界
面活性剤と組み合わせて用いられ得る非イオン界面活性
剤の第３の群は、エチレンオキシドと長鎖脂肪酸との反
応により作製されるポリオキシエチレン脂肪酸である。
このタイプで最も入手が容易である界面活性剤はMYRJ
の商標名で販売されており、ステアリン酸のポリオキシ
エチレン誘導体である。MYRJ界面活性剤は親水性であ
り、TWEEN界面活性剤と同様に水中に可溶であるかま
たは分散し得る。MYRJ界面活性剤は、エマルジョンを
形成する際に、TWEEN界面活性剤またはTWEEN/SPAN
もしくはARLACEL界面活性剤の混合物とブレンドさ
れ得る。MYRJ界面活性剤は当業者に公知の方法で作製
し得るか、またはICI America's Inc.から市販されてい
る。

ポリオキシエチレンをベースにした非イオン界面活性
剤の第４の群は、ラウリル、アセチル、ステアリル、お
よびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチ
レン脂肪酸エーテルである。これらの物質はエチレンオ
キシドを高級アルコールに添加することにより上述のよ
うに調製される。これらの界面活性剤の市販名はBRIJ
である。BRIJ界面活性剤は、界面活性剤中のポリオキ
シエチレン成分の大きさによって、親水性または親脂性
であり得る。これらの化合物の調製は当業者に公知であ
る一方、それらはまた、ICI America's Inc.のような販
売元から容易に入手可能である。

本発明の実施に用いられる可能性を有する他の非イオ
ン界面活性剤としては、ポリオキシエチレン、ポリオー
ル脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、ポリ
オキシプロピレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンを
含有する密蝋誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導
体、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド、およびグリ
セロール脂肪酸エステルまたは他のポリオキシエチレン
酸アルコールまたは12-22の炭素原子の長鎖脂肪酸のエ
ーテル誘導体が挙げられる。

本発明のアジュバントおよびワクチン製剤は、多相系
にし向けられているので、HLB値が約７から16の範囲に
ある、エマルジョン形成非イオン界面活性剤を選択する
ことが好ましい。この値は、TWEEN界面活性剤のよう
な単一の非イオン界面活性剤を使用するか、または以下
のような界面活性剤をブレンドして用いることにより得
られる：ソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステ
ル、もしくはソルビタントリエステルをベースにした界
面活性剤；ソルビタンエステルポリオキシエチレン脂肪
酸；ポリオキシエチレン羊毛脂由来の界面活性剤と組み
合わせたソルビタンエステル；高HLB値のポリオキシエ
チレン脂肪エーテル界面活性剤と組み合わせたソルビタ
ンエステル界面活性剤；またはポリエチレン脂肪エーテ
ル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンソルビタン脂
肪酸。

本発明の実施においてエマルジョンを安定化する非イ
オン界面活性剤として使用するには、単一の非イオン界
面活性剤の使用がより好ましく、最も好ましいのはTWEE
N界面活性剤の使用である。TWEEN 80と称される、さも
なければpolysorbate 80またはポリオキシエチレン20ソ
ルビタンモノオレアートとして知られる界面活性剤が前
述の界面活性剤の中で最も好ましい。

適切な水中油型エマルジョンは通常、0.02％から2.5
重量％（w/w）で界面活性剤を有すると効果的である。
0.05％から１％が好ましいが、0.01から0.5％が特に好
ましい。

本発明の水中油型エマルジョンが達成される方法は本
発明の実施において重要ではない。そのようなエマルジ
ョンが得られる１つの方法は、Microfluidics、Newto
n、MAから入手可能のモデル番号110Yのような、市販さ
れている乳化器の使用である。他の市販されている乳化
器の例としては、Gaulin Model 30CD（Gaulin,Inc.、Ev
erett、MA）およびRainnie Minlab Type 8.30H（Micro
Atomizer Food and Dairy,Inc.、Hudson、WI）が挙げら
れる。これらの乳化器は、高圧で液体を小さい孔に強制
的に通すことによって得られる高せん断力の原理により
作用する。本発明の使用はそのような乳化器の使用を排
除するものでないが、それらの使用は本発明を実施する
にあたり必要とされるものでも好ましいとされるもので
もない。ミクロン以下の粒子からなる油滴が所望でない
のなら、低せん断力を生じさせる他の装置（注射針を通
しての製剤の簡潔な通過を含む）を用い得る。

油滴サイズは、油に対する洗浄剤の割合（割合を増加
すると油滴サイズが減少する）、操作圧（操作圧を増加
すると油滴サイズは減少する）、温度（温度を上昇する
と油滴サイズは減少する）を変化させること、および両
親媒性の免疫刺激剤を転化すること（そのような薬剤を
添加すると油滴サイズは減少する）により変化させ得
る。実際の油滴サイズは、特定の洗浄剤、油、および免
疫刺激剤（もし用いられるなら）、並びに選択された特
定の操作条件によって変化する。油滴サイズは、市販さ
れているCoulter Corporation製造のSub-Micron Partic
le Analyzer （Model N4MD）のようなサイジング器具を
用いることにより変化させ得る。

エマルジョン成分は、ワクチンに用いられるリポソー
ム／抗原成分と結合させる前に上述の材料から調製され
る。リポソームのリン脂質および他の成分は簡単にエマ
ルジョンに取り込まれ、乳化剤として機能するため、リ
ポソームはエマルジョン成分の存在下で調製され得な
い。

本発明のエマルジョン成分は安定であるため、リポソ
ーム／抗原およびエマルジョンは、混合、攪拌、または
振盪させるだけで結合され得る。２つの成分の混合物を
素早く小さい開口（皮下注射針のような）に通すような
他の技術によって、容易に有用なワクチン組成物が提供
される。

本発明の組成物の種々の成分は様々な割合で存在し得
る。リポソーム／抗原およびエマルジョン成分は典型的
には1:10から10:1の容積比率で用いられ得る。容易に製
造され、簡単に識別するため1:3から3:1の容積比率が好
ましく、約1:1の容積比率がさらに好ましい。しかし、
特定の抗原がリポソームに取り込まれるのは困難であ
り、またその免疫原性が低いといった場合のように、抗
原組成物が比較的多く必要とされるときのような、特定
の目的においては他の比率の方が適切である。

リポソームは一般に、最終濃度が1ml当り約0.5から50
mgの脂質にするために、脂質懸濁液1ml当り約１から100
mgの脂質で調製される。より好ましくは、リポソームは
1ml当り約３から30mgの脂質で調製され、さらに好まし
くは1ml当り約10mgの脂質で調製される。

抗原量は一般に、注入され得る最終組成物の目的の投
与量および容積を基準にして選択される。例えば、もし
10マイクログラムの抗原が目的の免疫原性反応を誘導す
ることが知られており、そしてもし1mlが免疫される動
物の注入量として正常であるなら、ワクチン組成物は本
明細書に記載したガイドラインを用いて最終ワクチン組
成物の1mlが10マイクログラムの抗原を含有するように
調製される。抗原は典型的には約１から500μg/mlの濃
度で、より一般的には10から50μg/mlの濃度で投与され
る。しかしこれはらは一般的なガイドラインにすぎず、
抗原の特定の量は前述のように免疫原性反応に基づいて
調整されねばならない。

同様の方法で、ムラミルトリペプチド（もし用いられ
るなら）の量が標準投与量および最終ワクチン組成物を
提供するように調製する。そのような標準投与量は典型
的には約１から約2500μg/mlであり、好ましくは約10か
ら250μg/mlである。

エマルジョンとの混合を確実にするため、サイズは通
常エマルジョンの粒子サイズに適合するように選択され
る。例えば、クミロン以下の粒子からなるエマルジョン
に用いられるなら、直径が200から450nMの範囲であるリ
ポソームが調製される。単層膜のリポソームが特に好ま
しい。

少なくともある抗原はそこに取り込まれることによ
り、またはリポソーム表面に結合することにより、リポ
ソームと結合する。また本発明の組成物において、リポ
ソームと結合しないで抗原が存在することも可能であ
る。この抗原はエマルジョンを最初に調製する時エマル
ジョンに存在し得る。または抗原は、典型的にリポソー
ムと結合し、そして外部にある液相を含有しているリポ
ソーム組成物から解離し得る。

本発明を一般的に説明してきたが、本発明を以下に実
施例を用いて詳細に説明することにより、より理解され
るであろう。なお以下に述べる実施例は説明のためのも
のであり、特にその旨記載しない限り本発明を限定する
ものではない。

実施例 実施例1:gD2のリポソームとの物理的結合 抗原がリポソームにより細胞へ送達されるための必要
条件である、抗原のリポソームとの結合を示すための研
究を行った。

非フゾジェニック PC/PS（7:3）よりなるリポソームをオクチルグルコシ
ド透析および逆相エバポレーション（REV）の両方によ
り調製した。100μg/mlのgD2を、安定なヨウ素化された
gD2をマーカーとして使用して追跡した。液体クロマト
グラフィーにより結合していないgD2からリポソームを
分離することにより、gD2の17％が透析リポソームと結
合し、また33％のgD2がREVリポソームと結合することが
分かった。gD2と結合したリポソームのいずれもトリプ
シン消化に対しては感応せず、これによりgD2がこのベ
シクルの外表面上には存在しないことが示された。リポ
ソーム（2mMの脂質）を0.4から2mMのTriton X-100と一
晩インキュベートした結果、Triton のレベルが高いほ
どgD2の解離は進み、これはリポソームの透過性化の向
上と一致した。この方法では残留オクチルグルコシドが
不足するため、REVリポソームの方が洗剤の透過性化に
対して幾分強い抵抗を示した。

フゾジェニック PC/PS（8:2）よりなるリポソームをオクチルグルコシ
ド透析により調製した。この脂質組成物はREVによる方
法には適合しないため、この調製方法に対してはPE/OA
（8:2）を使用した。コハク酸グリセロールをオレイン
酸に置換することにより、REVによる安定したLUVが産生
される。透析リポソームとは39％のgD2が結合し、REVリ
ポソームとは72％が結合した（表１）。結合したgD2の
うち約50％をトリプシン消化により透析リポソームから
除去し、これにより外部から接近可能にした。フゾジェ
ニック透析リポソームは、非フゾジェニックの形態より
容易にTriton によって透過性化した。オレイン酸を含
有するREVリポソームは、トリプシンまたはTriton の
いずれかにより処理されると、ほとんどの標識化gD2を
失った。これは、gD2のこれらのベシクルとの結合につ
いての有用な情報を提供することより、20モル％の脂肪
酸を含有するベシクル調製物の内因的な漏出性を示す。

gD2を予め形成したPE/GS/CHOL（8:2:2）透析リポソー
ムによりインキュベートした結果、gD2はリポソームと
は全く結合しなかった。

実施例2:RT6のリポソームとの物理的結合 実施例１に述べた方法と同様の方法で、遺伝子工学に
より得られたHIV逆転写酵素分子RT6のリポソームとの結
合を測定した。RT6は29％がPC/PS（7:3）透析リポソー
ムと、および73％がPE/GS（8:2）透析リポソームと結合
する。RT6のヨウ素標識化が低いと、トリプシンの消化
およびTriton の透過性化効果が不確かになった。

実施例3:gp120のリポソームとの物理体結合 同様の方法で、HIV gp120のPC/PS（7:3）透析リポソ
ームとの結合は８％、およびPE/GS（8:2）透析リポソー
ムとの結合は11％であることが測定され、これらはgD2
およびRT6に対して観察された結合レベルよりはるかに
低かった。ゲル濾過HPLCクロマトグラムにより、リポソ
ームフラクションと単一遺伝性gp120との間にgp120に富
んだピークが存在することが分かった。このピークは恐
らくgp120およびオクチルグルコシドの混合ミセルであ
る。トリプシンの消化およびTriton の透過性化によ
り、gp120が両方のリポソーム調製物の中に被包され、
共に外部からは接近し得ないことが示される。

gp120のフゾジェニックリポソームとの結合は、凍結
融解濾過法によりリポソームを調製することにより増強
した。抗原の結合はペレット化されたリポソームのタン
パク質分析により測定した。

gp120を、予め形成した凍結融解濾過（FTF）された、
PC/PS（7:3）またはPE/GS/CHOL（8:2:2）組成物のいず
れかのリポソームによりインキュベートすると、結合は
行われなかった。

実施例4:マラリア血清１のリポソームとの結合 マラリア血清１タンパク質のPC/PS（7:3）リポソームと
の結合については、透析リポソームでは67％、FTFリポ
ソームでは95％であった。予め形成したリポソームに添
加した血清１の75％がFTFベシクルと結合した。血清１
のPE/GS/CHOL（8:2:2）リポソームとの結合について
は、透析リポソームでは65％、FTFリポソームでは87％
であった。血清１は91％が予め形成された透析リポソー
ムと結合した。結合していないタンパク質は遠心分離に
よりリポソームから分離した。リポソームペレットのタ
ンパク質アッセイにより、抗原結合を測定した。

実施例5:インフルエンザHA台湾のリポソームとの物理的
結合 HAタイワンは69％がDPPC/DMPG（8:2）透析リポソーム
と結合した。HAタイワンは78％がPE/GS/CHOL（8:2:2）
透析リポソームと結合し、また80％が予め形成されたベ
シクルと結合した。結合は血清１に対して述べたように
測定した。

実施例6:HSV gB2ペプチドのリポソームとの物理的結合 HSV gB2ペプチドは、40％がPC/PS（7:3）FTFリポソー
ムと結合し、これは血清１に対して述べたように測定し
た。

実施例7:gB2のリポソームとの物理的結合 HSB gB2は24％が、透析により調製されたPE/GS/CHOL
（8:2:2）リポソームと結合した。gB2の結合は、リポソ
ームがFTFにより調製される場合は84％であった。タン
パク質の結合は、結合していないgB2を遠心分離により
除去し、リポソームペレットと結合したgB2を捕獲ELISA
により測定することにより決定した。

実施例8:抗原の取込みおよび細胞内局在性についてのイ
ンビトロにおける研究 本発明の組成物を使用して、抗原の細胞内での結果を
調べる研究を行った。

FITC-デキストランに負荷されたリポソームの、マウ
スおよびヒトマクロファージによる取込みを示す最初の
実験は一貫して成功であった。逆相エバポレーションに
よりおよび高圧排出により調製したリポソームは共に良
好に取り込まれる。使用した非フゾジェニック脂質組成
物は、モル比7:3のPC/PSおよび9.1のPC/ホスファチジル
グリセロールであった。フゾジェニック脂質組成物は4:
4:2のPE/CHOL/OA、または8:2のPE/OAのいずれかであっ
た。フゾジェニックリポソームを形成するためには、水
相は最初はpH10である。pH7.4でゲル濾過することによ
り外部容量を変換すると、位相差顕微鏡およびエピ蛍光
顕微鏡による検査によれば、リポソームは少なくとも２
日間は安定である。

非フゾジェニックリポソームをマクロファージにより
18時間パルスすることにより、細胞内部に明るい斑点性
蛍光が生じる。パルスチェイス実験により、リポソーム
は最初はシトゾルの周辺に存在し、次に核周囲領域に移
動するのが分かる。これはエンドソームの取込みおよび
その後のリソソームへの細胞内移動と一致する。脂質:M
TP-PEのモル比250:1でMTP-PEを二分子層に取り込んで
も、この取込み速度論に影響はない。

フゾジェニックリポソームに同様の実験を行った結
果、明るい斑点性蛍光と暗い分散性蛍光が混在した。パ
ルスチェイス実験により斑点性蛍光は完全に排除されな
かったため、エンドソーム融合の効率は100％より小さ
いことが示唆される。さらに、リポソームの滴定実験に
より融合は効力を失い得ることが示される。すなわち、
10⁴個の細胞／cm²あたり10μｇを越えるリン脂質によ
り、いくつかの暗い分散性蛍光を伴う高度に負荷された
斑点性蛍光が生じ、一方、10⁴個の細胞／cm²あたり10μ
ｇより少ないリン脂質によっては、分散性蛍光が圧倒的
であった。リン酸脂質;MTP-PEのモル比が1000:1、500:
1、および250:1のMTP-PEを取り込んだ結果、分散性およ
び斑点性蛍光は共に極めて僅かのレベルであり、この効
果が1000:1以下で最も顕著であった。遊離FITC-デキス
トランはこれらの条件下では飲用作用により取り込まれ
なかった。これは飲食作用の抑制が表面効果ではなく、
MTP-PEがシトゾルに入る結果であることを強く示唆す
る。FITC-gD2を負荷したリポソームによる予備実験によ
り、gD2がこの方法によりマクロファージに容易に送達
されることが分かる。

実施例9:マクロファージの取込み Americal Type Culture Collectionからのヒト単核細
胞状の細胞株であるU937細胞によるFITC-デキストラン
負荷リポソームの取込みを、一次マクロファージ培養物
による前述の取込み実験と比較した。未分化のU937細胞
はリポソームまたは遊離FITC-デキストランのいずれに
対しても食作用を行わなかった。細胞をフォーボル‐ミ
リスティック‐アセテートにより分化し、非フゾジェニ
ックPC/PG（8:2）リポソームにより18時間インキュベー
トする場合、エンドソームまたはリソソームへのデキス
トランの取込みを示す斑点性蛍光が得られた。フゾジェ
ニックPE/GS（8:2）リポソームによるインキュベーショ
ンにより、デキストランの細胞形質への送達を示す均一
の分散性蛍光が生じた。リポソームでのMTP-PEの取込み
は食作用に影響を与えなかった。これらの結果は実際の
マクロファージにおいて観察されるものに類似している
が、２つの細胞型の間の主要な相違点は取込みの速度で
ある。すなわち、可視量の蛍光を得るためには、分化U9
37細胞はマクロファージの約10倍の脂質を必要とする。
マクロファージによっては食作用自体が活性化シグナル
である。U937細胞は食作用により活性化され得ない。

25ng/mlのPMAにより５日間成熟させたU937細胞を、可
溶性gD2、gD2を含む非フゾジェニックPCリポソーム、お
よびgD2を含むフゾジェニックPEリポソームと一晩イン
キュベートした。分子内gD2の存在を、マウス‐α gD M
abに結合されたFITC-ヤギ‐αマウスAbの蛍光抗体法に
より評価した。

可溶性gD2はいずれのリポソーム調製物よりも蛍光レ
ベルが低く、またPEリポソームはPCリポソームより蛍光
レベルが高いことが分かった。とりわけ、細胞のインキ
ュベーションが10％の血清の存在下に行われる場合も非
存在下で行われる場合も、同じパターンの取込みが観察
されたが、蛍光度は血清の存在下の場合の方が幾分高か
った、可溶性gD2とインキュベートされた細胞は、低レ
ベルの分散性蛍光を示した。いずれのリポソーム調製物
とインキュベートされた細胞においても、潜在的に斑点
性蛍光を有するが圧倒的に分散性蛍光を示した。これら
の結果は、分散性蛍光はフゾジェニックリポソームに関
連し、斑点性蛍光は非フゾジェニックリポソームにおい
て観察された、FITC-デキストラン負荷のリポソームに
よる前述の実験とは対照をなす。gD2はpHには感応しな
いフゾジェニックタンパク質であるため、両タイプのリ
ポソームの細胞との融合を誘導し得、分散性蛍光を生じ
させる。

上記の実験により、gD2はリポソーム内容物の分子内
局在性を変更し得ることが示唆された。これを試験する
ために、U937細胞をgD2とFITC-デキストランまたはgD2
とRT6により調製されたリポソームと一晩インキュベー
トした。エピ蛍光顕微鏡検査により、PC/PSリポソーム
はFITC-デキストランおよびRT6の両方に対して斑点性パ
ターンの蛍光を生じることが分かった。PE/GSリポソー
ムの場合には、FITC-デキストランおよびRT6の両方に対
して分散性蛍光が観察された。このような状況の下で
は、gD2はリポソーム内容物の局在性を変更し得ない。

実施例10:リポソーム／エマルジョン配合物のヤギのgD2
による免疫原性 これらのデータにより、特定のエマルジョンに対して
は、抗原をエマルジョンとの混合前にリポソームと結合
させれば、より高い抗体力価が得られることが分かる。
フゾジェニックまたは非フゾジェニックリポソームによ
り引き出される抗体の力価は、エマルジョンと混合する
とほぼ等価である。

この実験において、gD2抗原と配合した、MF79/1501
（10％スクアレン（v/v）;1％Tween 80（v/v）;5％Tet
ronic 1501（ポリオキシエチレン‐ポリオキシプロピ
レンブロックポリマー）（v/v）;400μg/mlのMTP-PE）
と命名されたMTP-PEを含有する水中油のエマルジョンよ
りなる組成物を、免疫原性について試験した。次にこの
組成物をMF79/1501とフゾジェニックリポソームとの配
合物と比較した。このリポソーム‐gD2混合物を３週間
おきに３回、動物を免疫させるために使用した。表３に
示すように、この配合したエマルジョン‐リポソームに
よる免疫は高度な抗体反応を示した。２回の免疫の後、
リポソームおよびエマルジョンを与えた群は、M79/1501
エマルジョン単独の場合より約３倍高い、7258の平均力
価を示した。この反応は群内では一貫しており、標準誤
差は僅か10％であった。３度目の免疫の後、群内の全て
の動物は１個体をのぞいて力価が適度な上昇を示した。
このように、リポソームとエマルジョンとの配合は免疫
反応に著しい増加をもたらした。

実施例12:gD2のリポソームとの結合がヤギにおけるリポ
ソーム／エマルジョン配合物の免疫原性に与える効果 この実験では、以下のアジュバント： 1,MF79/121（10％スクアレン、１％ Tween 80、５％ Pl
uronic L 121、40μg/mlのMTP-PE）;2,gD2の50％がリポ
ソームと結合し、またgD2の50％がこの製剤の水相にお
いて遊離するように、LPC（PC/PS（7:3）透析リポソー
ム）と配合したMF79/121;3,100％のgD2がリポソームと
結合するようにLPCと配合したMF79/L121;の１つを用い
てヤギを25μｇのgD2および100μｇのMTP-PEで４週間お
きに３回免疫した。図１に示すように、抗体力価の増加
はリポソームと結合した抗原の増加と相関する。５体の
動物よりなる群に対する抗体力価の幾何平均を表５に示
す。向上したAb力価は、４回目の免疫後少なくとも６週
間は持続した。

実施例11:ヤギにおけるエマルジョン／リポソームのgD2
との配合物が抗体力価に与える効果 この実験では、いくつかのエマルジョン、リポソーム
／エマルジョン配合物、およびリポソーム単独と配合し
たgD2（25μｇ）によりヤギを免疫した。試験したリポ
ソーム／エマルジョン配合物は、PE/GSリポソームおよ
び2x MF59、PE/GSリポソームおよびMF79/5％ Tetronic
1501、ならびにPC/PSリポソームおよびMF79/5％ Tet
ronic 1501であった。この実験における対照群はミョ
ウバンおよび2x MF59を含有していた。すべてのMTP-PE
投与量は100μであった。リポソームエマルジョン配合
物は、約50％の抗原をリポソーム中に被包し、50％を溶
液中で遊離した。すべてのMTP-PEがリポソーム／エマル
ジョン配合物においてはエマルジョン相であった。リポ
ソーム単独の群では、MTP-PEを外部からリポソームに添
加した。動物を３週間おきに３回免疫し、各免疫の14日
後に、抗gD2抗体力価を測定した（結果を第４に示
す）。

MF79/5％ 1501とPE/GSリポソームとの配合物（フゾジ
ェニックLUV）は、MF59エマルジョン単独の場合よりは
るかに高い抗gD2力価を示した。これらの結果により、P
E/GSリポソームの2x MF59との配合物はMF79/5％ 1501と
配合したPE/GSリポソームほど良好な性能を示さないこ
とが分かる。PE/GSリポソームは2x MF59の性能を向上さ
せる。PE/GSリポソーム単独の場合は抗gD2抗体反応が非
常に弱い。PC/PSリポソームのMF79/5％ 1510との配合物
は、MF79/5％ 1501と配合したPE/GSリポソームと等しい
性能を示す（３回の免疫後の平均力価は6946対4653）。

実施例13:gB2のリポソームとの結合がヤギのリポソーム
／エマルジョン配合物の免疫原性に与える効果 この実験では、以下のアジュバント： 1,実施例12で定義したMF79/121;2,gB2の50％がリポソー
ムと結合し、50％が溶液において遊離するように、LPE
（PE/GS/CHOL（8:2:2）FTFリポソーム）と配合したMF79
/121;3,100％のgB2がリポソームと結合するようにLPEと
配合したMF79/L121;の１つを用いて、ヤギを５、25、ま
たは100μｇのgB2および100μｇのMTP-PEで４週間おき
に３回免疫した。

25μg gB2投与の群についてリポソームと抗原との結
合の効果を図２に示す。この場合も、免疫原性はリポソ
ームと抗原との結合が増加すると増加する。各動物群に
対する抗体力価の幾何平均±標準誤差を表６に示す。

実施例14:アカゲザルにおける、gp120を用いたリポソー
ム／エマルジョン配合物の免疫原性 この実験においては、３匹のアカゲザルを１群とした
複数の群を、４週間おきに３回免疫し、そして３回目の
免疫から14週間後に１回免疫感作した。実験期間を通し
て２週間毎に動物から採血した。１つの群には、gp120/
SF2を含むLPE FTFリポソームと配合したMF79/1501（10
％スクアレン、１％ Tween 80、５％ Tetronic 1501、4
00μg/ml MTP PE）を投与した。他の２つの群には、2XM
F59（10％スクアレン、１％ Tween 80、１％ Span 85、
400μg/ml MTP-PE）か、SAFエマルジョン（10％スクア
レン、５％ Pluronic L121、0.4％Tween 80、500μg/ml
MDP）か、のいずれかを投与した。図３は、MF79/150お
よびリポソームは、他の２つのエマルジョン製剤よりも
常に高値の力価をもたらしたということを示している。
表７に、実験を通じての、個々の動物を力価と各群の力
価の平均値を挙げる。

実施例15:ウサギにおける、gD2配合物製剤の免疫原性に
対する、リポソームまたはエマルジョンと組み合わせた
MTP-PEの効果 ウサギを、４週間おきに３回、10μg gD2および10μg
MTP-PEにより免疫した。この実験の、２回目の免疫後
２週間までの結果を図４および表８に示す。表８の群２
と３とを比較することにより、エマルジョンMF59（５％
スクアレン、0.5％Tween 80、0.5％Span 85、40μg/ml
MTP-PE）を、LPEと共に調製したgD2と配合することによ
っても、免疫原性が向上するということが示される。MT
P-PEを、群３におけるようにエマルジョン中に含ませる
こと、または、群４におけるようにリポソーム中に含ま
せることは、免疫原性において大幅な変化をもたらさな
かった。群６をLPEにより１回免疫し、その後、MF59に
より２回追加免疫した。群７においては、順序を逆にし
て、まず動物にMF59を投与し、その後、LPEにより２回
免疫した。明らかに、まずエマルジョンを投与し、その
後、リポソームにより追加免疫する方が、その逆よりも
高値の免疫原性をもたらす。前述のヤギgB2実験（実施
例13、表６、群８）により、動物にまずリポソームを投
与し、その後、エマルジョンで追加免疫した場合は、応
答が悪いということが確認されている。

実施例16:アオタス（Aotus）ザルにおける、マラリア血
清１の免疫原性に対する、エマルジョン／リポソーム配
合物の効果 アオタスザルを、４週間おきに３回、100μｇの血清
１により免疫した。１回目の免疫から84日後に、動物か
ら採血し、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falcipar
um）のホンデュラス株で感染させた。続いて、疾病とパ
ラサイテミアとの両方に関して、サルをモニターした。

84日目の抗体力価およびその後の疾病からの保護状況
を表９に示す。群１には、フロイントアジュバントのみ
を投与し、抗原は投与しなかった。群２には、フロイン
トアジュバントおよび血清１を投与した。群３および４
には、血清１および、それぞれ、MF59かLPEを含むMF59
かのいずれかを投与した。配合物製剤は、エマルジョン
単独の場合に比べて、Ab力価の５倍の増加をもたらし
た。両方の群において、３匹の動物のうち１匹が疾病か
ら保護された。図５は、各々の累積的パラサイテミアス
スコアーを示す。配合物を投与された群４のパラサイテ
ミアススコアーは、MF59を投与された群３の、ほとんど
10分の１であった。

実施例17:マウスインフルエンザ感染モデルにおける、
エマルジョン／リポソーム配合物の免疫原性 この実験は、異種ウイルス感染におけるアジュバント
製剤の効力をテストするために考案された。マウスを、
４週間おきに２回、９μgHA抗原および40μgMTP-PEによ
り免疫した。動物の群を表10に定義する。群１には、ア
ジュバントを含まないHAを投与した。群２には、MF59を
投与した。群３は、MF77（10％スクアレン、５％Pluron
ic L121、１％Tween 80、400μg/ml MTP-PE）により１
回免疫し、その後、MF59により２回目の免疫を行った。
群４は、MTP-PEを欠いたMF77およびMTP-PEを含むLPEを
含有する配合物製剤により１回免疫し、MF58、およびMT
P-PEを含むLPEにより２回目の免疫を行った。群５に
は、MTP-PEを含むLPEを投与した。群６は、免疫を行わ
なかった。表10の抗体力価は、ウイルス感染の直前の55
日目のものである。最高値の力力価は、配合物製剤を投
与された群４において得られた。図６は、すべての群に
関する相対的Ab力価を示す。56日目に、マウスに、イン
フルエンザA/ホンコンp/13/68（H1N1）を鼻腔から感染
させた。疾病に関して動物を毎日モニターした。毎日の
生存記録を表11に示す。感染後14日目の生存率を、図６
の下欄に示す。配合物製剤の場合は100％の生存率を示
し、次に高い生存率を示したのは90％生存率を示したMF
77であった。アジュバントを含まないHAワクチンは、免
疫しなかった群が30％の生存率であったのに対し40％の
生存率を示した。

実施例18:リポソーム／エマルジョン配合物の安定性 エマルジョン粒子とリポソームとの混合物の物理的安
定性を評価するために、FITC-デキストランを含むPE/GS
（8:2）/MTP-PE（PL/MTP-PE、20:1）透析リポソームを
調製した。外部FITC-デキストランを、ゲル濾過により
除去し、リポソームをMF79/1501（10％スクアレン/1％T
ween 80/5％Tetronic 1501/400μg/ml MTP-PE）と混合
した。光学顕微鏡による観察により、エマルジョン粒子
とリポソームのいずれもが凝集も癒着もしていないとい
うことが示された。リポソームの構造的完全性はさら
に、暗い背景に対して蛍光球体を観察することにより確
認された。４℃で３カ月貯蔵した後、外見に変化はなか
った。

実施例19:リポソームおよびエマルジョンの貯蔵 抗原を含むリポソーム（表面吸着または二分子層の一
体化することにより包含または混合される）とエマルジ
ョンとの配合物を生存能力のある薬学的物質とするため
に、安定した貯蔵条件および貯蔵形態を研究する。アジ
ュバントおよび抗原の安定性を高めるために、３つの異
なる投与形態を設計する:1）２−８℃で貯蔵可能な、２
つのバイアルまたは単一のバイアル内における、液体
の、リポソーム懸濁液−エマルジョン配合物。２）５−
10℃で貯蔵可能な、２つの別々のバイアルまたは単一の
バイアル内における、凍結した、リポソーム−エマルジ
ョン配合物。３）２−８℃または環境温度で貯蔵可能
な、２つの別々のバイアルまたは単一のバイアル内にお
ける、凍結乾燥した、リポソーム−エマルジョン。

脂質成分およびタンパク質抗原の安定性を向上させる
ために、これらの製剤に対して、少し酸性のpH（≧5.0
＝≦7.0、好ましくは6.5）を選択する。以下の糖または
ポリヒドロキシ系化合物およびアミノ酸のリストから凍
結保護剤（凍結乾燥または凍結に対する）を選択する：
デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクト
ース、スクロース、トレハロース、グリセロース、デキ
ストラン、マルトース、マルトデキストリン、グリシ
ン、アラニン、プロリン、アルギニン、およびリシン。
いくつかの製剤においては、糖およびアミノ酸の組み合
わせ、例えば、スクロース−マンニトール（スクロース
5-8％ w/v、マンニトール2.5-1％ w/v）；スクロース−
グリシン（スクロース８％ w/v、グリシン60mm）を用い
る。これらの賦形剤はまた、等張化剤としても作用し
た。すなわち生理学的重量オスモル濃度を与えた。緩衝
剤は、リン酸塩（5-50mM）、クエン酸塩、リン酸緩衝化
生理食塩水（PBS），酢酸塩、マレイン酸塩、アスコル
ビン酸塩、トロメタミン、および類似の緩衝剤から成る
群から選択される。

リポソームの場合は、凍結保護剤および緩衝剤が、
ａ）水の内部および外部に含まれるか、またはｂ）外部
から添加されるのみか、である。後者の場合は、任意の
緩衝剤または塩（例えばNaCl）が内部を浸透圧平衡に
し、外部の塩を遠心分離および洗浄の反復により除去す
る。その後、リポソームを、本発明の賦形剤混合物に懸
濁する。典型的には、エマルジョンを水中から調製し、
上記の媒体中に懸濁する。糖／アミノ酸／緩衝剤混合物
に加えて、増粘剤もまたいくつかの製剤に添加する。一
般に、これらのポリマー物質は、粒子を被覆し、ポリマ
ー物質がなければ凝集、融合、または癒着という結果に
なる接触を防止すると考えられている。使用するポリマ
ーは、ポリエチレングリコール300、400、1450、および
3150、ポリビニルピロリドン、硫酸デキストラン、カル
ボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロー
ス、およびアルギン酸を含む。ポリエチレングリコール
1450が好まれ、製剤中に１％（w/v）の濃度で含まれて
いる（典型的な成分のリストに関しては表12を参照のこ
と）。

リポソームは、最適には上記に挙げた賦形剤に加え
て、酸化防止剤として１モルパーセントのビタミンＥま
たはdl α−トコフェロールをも含んでいた。このこと
は、界面活性剤中の不飽和脂肪酸を酸化から保護し、そ
れにより、抗原の分解に触媒作用を及ぼし得る。このよ
うにして製剤されたリポソームを、異なる割合、例えば
1:10から10:1（v/v）でエマルジョンと、上記のように
混合するが、便宜上1:1（v/v）が好ましい。この混合物
は、治療用の投与量中に、適量の抗原および免疫促進剤
を含む。

所望の組成物を得るために、多くの他の技術を使用し
得る。例えば、GauthierおよびLevinson（EP0211257）
は、２段階工程でリン脂質エマルジョンを凍結乾燥させ
た：第１の段階は、スプレー凍結、すなわち、予備生成
したエマルジョンを、≦−20℃でクロロフルオロカーボ
ンまたは類似の適合溶媒に、スプレーすること、およ
び、凍結粒子（すでに凍結保護剤を含んでいた）を収集
することを包含し、第２段階は、粒子を凍結乾燥させる
ことを包含していた。得られた粉体または固形物、一般
には糖を大過剰に含んでいるが、これを再水和すること
により、0.48-0.7マイクロンの範囲の粒径を有する、水
中油型エマルジョンを生成した。この方法は、煩わし
く、ある特定の治療には適用し得ない大粒のエマルジョ
ン滴を生成する。上記特定の治療としては、例えば、粒
子が注入部位に存在し、リンパ腺または適切な解剖学上
の部位にゆっくりと流出することが求められる場合であ
る。このように、本発明の一つの局面は、さらに成長す
ることなくサイズが維持され得るというような貯蔵の利
点を提供する適切な媒体中で、小さい、１ミクロン以下
のサイズのリポソーム（≦0.4μ）およびエマルジョン
粒子を生成することである。本発明の他の局面は、ワク
チンのような意図する運用に適する、≦0.4μの平均直
径を有する粒子に容易に再構成され得る、凍結乾燥リポ
ソーム／エマルジョン配合物を調製することである。

以下に、上記に示した動物において、より高い免疫原
性を供給するワクチンとして有用な、抗原含有リポソー
ム／エマルジョン配合物の、いくつかの異なる投与形態
を実施例により説明する。

1.液体の、抗原含有リポソーム／エマルジョン配合物 スクロース−クエン酸塩（10％ w/v、10mM）または、
このセクションで述べた、抗原含有賦形剤の任意の他の
配合物中で、リポソームを調製する。透析、ダイアフィ
ルトレーションまたは遠心分離（好適には遠心分離）の
ような適切な技術により、いずれの結合していないタン
パク質をも除去する。抗原を除いてリポソームの内部と
同一の賦形剤を含む媒体中に、リポソームを懸濁する。
リポソームの別のセットにおいては（好適ではない
が）、生理食塩水（0.9％ w/v）またはPBS中で、抗原を
含む小胞を調製し、洗浄により結合していないタンパク
質を除去した後、凍結保護剤／増粘剤および緩衝剤、例
えば、スクロース、PEG 1450、またはクエン酸塩中に、
リポソームを懸濁する。典型的にはホモジナイゼーショ
ンにより水中で処理されるエマルジョンを、リポソーム
に合う賦形剤混合物により、生理的重量オスモル濃度に
調整した。小胞およびエマルジョンを等量で配合し、２
−８℃で冷蔵庫中で貯蔵する。長時間の分析により、ど
ちらの粒子（リポソームおよびエマルジョン）によって
も、リポソーム内容物の損失はなく、サイズも保持され
ていることが示される。

2.凍結した、抗原含有リポソーム／エマルジョン配合物 スクロース（８％ w/v）／マンニトール（１％ w/
v）、タンパク質抗原を含むリン酸塩10mM/PEG 1450（１
％ w/v）中でリポソーム（フソジェニックまたはそれ以
外）を調整し、ポリカーボネートフィルターを通して排
出することにより、平均粒径を0.1-0.4μに減少させ
る。過剰の抗原を、遠心分離により除去し、ペレット化
された小胞を同一の緩衝剤賦形剤混合液中に再懸濁す
る。その後、リポソームを微小流動体化エマルジョン
（≦0.4μ）と配合し、冷蔵庫中で≦−10℃まで凍結さ
せる。一晩貯蔵した後、製剤をゆっくりと環境温度まで
凍結する。あるいは、リポソームとエマルジョンとを別
々に凍結、解凍および混合するか、または、動物に投与
する前に、２−８℃のリポソームを、凍結−解凍および
配合することにより処理したエマルジョンと混合する。
両方の微粒子物質共、凍結−解凍サイクルの間、その物
理的完全性を保持する。このように、これらの物質は、
単一のバイアルまたは２つのバイアルのパッケージ内に
貯蔵されることにより、ヒトへの投与のための貯蔵上の
便宜を提供すると考えられている。単一の凍結保護剤と
して含まれる特定のサッカライド（例えばマンニトー
ル、ラクトース）は、リポソームおよびエマルジョンの
物理的構造を保持することを補助しないということがわ
かっている。しかし、グリセロース（2-20％ w/v、好適
には２％）、プロリン（0.3M）、アルギニン（0.3M）、
スクロース−マンニトール（スクロース８％ w/v、マン
ニトール１％ w/v）スクロース−glyまたはアルギニン
（スクロース８％ w/v、グリシンまたはアルギニン60m
M）、アミノ酸混合物（プロリン、グリシン、アラニ
ン；各100mM）のような凍結保護剤はすべて、凍結−解
凍工程中に適切な凍結保護を供給し、このことは、ワク
チン製剤での適用が可能であるということを示唆してい
る。内部に抗原およびPBS、生理食塩水またはリン酸塩
のような賦形剤を含み、外相に凍結保護剤／緩衝剤／
（増粘剤）を含むリポソームはまた、意図する適用のた
めに、同一の凍結保護剤配合物中でエマルジョンと混合
し得る。

3.凍結乾燥した、抗原含有リポソーム／エマルジョン配
合物 安定した貯蔵形態として、この配合物は非常に好適で
ある。なぜなら、脂質およびタンパク質に化学的不安定
性をもたらす水の大部分が排除されているからである。
さらに、一般に凍結保護剤として使用される炭水化物お
よびアミノ酸は、微生物の成長にとって良い支持媒体で
ある。以下に、乾燥ワクチン製剤を生成するための凍結
乾燥に使用される設計を記載する。

表12に挙げたような、適切な凍結保護剤／緩衝剤／
（増粘剤）に懸濁された抗原含有リポソームを、同一の
媒体中で微小流動体化エマルジョンと混合し、固形物が
崩壊する温度より低い温度で凍結乾燥することにより、
24-72時間（好適には24時間）でその賦形剤配合物を得
る。例えばスクロース10％ w/v、クエン酸塩10mMを含
む、１つの実施態様においては、１回目の乾燥を−40℃
で開始し、良好な真空（10-100ミクロン、好適には50ミ
クロン）下で温度を次第に−10℃まで上昇させる。１回
目の乾燥工程の終了後、シェルフの温度を、次第に環境
温度まで上昇させ（１時間に10-20℃）、この温度でさ
らに２−10時間（好適には４時間）、または、乾燥した
生成物中の水分レベルが1-3％にまで低下するまで、真
空中に放置する。この方式の他の改変は、リポソームお
よびエマルジョンを別々に乾燥させること、および再構
成された懸濁液を混合することを含み、それにより所望
の製剤を供給する。いずれの場合も、凍結乾燥固形物
は、容認可能な物理的外見を有し、注入可能なワクチン
製剤を供給するために容易に再構成される。

凍結乾燥された単一、または２バイアル製剤は、低水
分含有によって、脂質成分およびタンパク質抗原にとっ
て、容認可能な安定性を有する。製剤は、２−８℃また
は環境温度で貯蔵し得る。

表12 製剤⁺中に使用される低温保護剤および増粘剤の配合物 スクロース^*（10％w/v） スクロース（８％w/v）、マンニトール（１％w/v） デクストロース（５％w/v） スクロース（９％w/v）、PEG 400、1450または3350（１
％w/v） スクロース（９％w/v）、加水分解ゼラチン（１％w/v） スクロース（９％w/v）、ゼラチン（魚の皮、ウシまた
はブタ１％w/v） スクロース（９％w/v）、Povidone 10000または40000
（１％w/v） グリシン、アラニンまたはプロリン（0.3M pH6−6.5） スクロース（９％w/v）カルボキシメチルセルロース
（１％w/v）グリセロース（2-20％w/v）^＋ さらに、りん酸塩またはクエン酸塩緩衝剤が10mMの
濃度で使用され、抗原に安定性を供給する。

＊ ラクトース、トレハロース、マルトースなどの他の
糖が適切な重量で置換され、等価の生理的重量オスモル
濃度を提供する。

個々の刊行物または特許出願が、引用された部分にお
いて明確にそして個々に参考のため援用されていること
が示すされているように、本明細書において引用したす
べての刊行物および特許出願が、参考として援用されて
いる。

上記の発明を、明白な理解のために、例示および実施
例により、ある程度詳細に説明してきたが、本発明の教
示内容に鑑みて、添付の請求の範囲の意図または範囲を
逸脱することなく、変更および改変をし得るということ
が、当業者には自明である。

フロントページの続き (72)発明者 バン ネスト，ゲイリー エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94803 エル ソブランテ，サン パブ ロ ダム ロード 4890 (56)参考文献 特開 昭55−130920（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−105630（ＪＰ，Ａ)

Claims (20)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（１）リポソーム内またはリポソーム表面
   上に含まれる、免疫を刺激する量の抗原物質；および （２）該リポソームを取り囲む連続相に、ムラミルペプ
   チドおよび代謝可能な油を含む水中油型エマルジョン を含むワクチン組成物。
2. 【請求項２】前記抗原物質が前記連続相にも存在する、
   請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】前記リポソームがフゾジェニックリポソー
   ムを含む、請求項１に記載の組成物。
4. 【請求項４】前記リポソームおよび前記エマルジョン
   が、1:10から10:1の容量比で存在する、請求項１に記載
   の組成物。
5. 【請求項５】前記リポソームおよび前記エマルジョン中
   の油滴が、実質的に同一サイズの分布範囲を占有する粒
   子として存在する、請求項１に記載の組成物。
6. 【請求項６】前記エマルジョン中の油滴および前記リポ
   ソームが、すべて直径１ミクロン未満である、請求項４
   に記載の組成物。
7. 【請求項７】前記ムラミルペプチドが以下の式の化合物
   であり、 ここで、Ｒが、ＨまたはCOCH₃であり、 R¹、R²およびR³が独立してＨまたは脂質部分を示し、 R⁴が水素またはアルキルであり、 ＸおよびＺが独立して、アラニル、バリル、ロイシル、
   イソロイシル、α−アミノブチリル、トレオニル、メチ
   オニル、システイニル、グルタミル、イソグルタミル、
   グルタミニル、イソグルタミニル、アスパルチル、フェ
   ニルアラニル、チロシル、トリプトファニル、リシル、
   オルニチニル、アルギニル、ヒスチジル、アスパリンギ
   ニル、プロリル、ヒドロキシプロピル、セリル、および
   グリシルからなる群から選択されるアミノアシル部分を
   示し、 ｎが０または１であり、 Ｙが‐NHCHR⁵CH₂CH₂CO‐であり、ここでR⁵が必要に応じ
   てエステル化またはアミデート化カルボキシル基を示
   し、そして ＬがOH、NR⁶R⁷であり、ここでR⁶およびR⁷が独立してＨ
   または低級アルキル基、または脂質部分を示す、 請求項１に記載の組成物。
8. 【請求項８】前記エマルジョン中のムラミルペプチドが
   ムラミルジペプチドまたはムラミルトリペプチドであ
   る、請求項６に記載の組成物。
9. 【請求項９】前記ムラミルペプチドが、ヒドロキシアル
   キルアミン部分を介してリン脂質部分に結合しているム
   ラミルジペプチドおよびムラミルトリペプチドからなる
   群から選択される、請求項７に記載の組成物。
10. 【請求項１０】前記ムラミルペプチドが、N-アセチルム
    ラミル‐L-アラニル‐D-イソグルタミニル‐L-アラニル
    ‐2-（1,2-ジパルミトイル‐sn-グリセロ3-（ヒドロキ
    シホスホリロキシ））エチルアミドである、請求項４に
    記載の組成物。
11. 【請求項１１】前記エマルジョン中の代謝可能な油が動
    物油である、請求項５に記載の組成物。
12. 【請求項１２】前記エマルジョン中の代謝可能な油がス
    クアレンである、請求項６に記載の組成物。
13. 【請求項１３】前記組成物が別の乳化剤をさらに含む、
    請求項７に記載の組成物。
14. 【請求項１４】前記組成物が、15容量％までの前記エマ
    ルジョン中の代謝可能な油を含む、請求項８に記載の組
    成物。
15. 【請求項１５】前記別の乳化剤が、ソルビタンエステ
    ル、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリ
    オキシエチレンソルビタンジエステルもしくはポリオキ
    シエチレンソルビタントリエステル、ポリオキシエチレ
    ン脂肪酸、ポリオキシエチレン脂肪酸エーテル、および
    その組合せからなる群から選択される、請求項13に記載
    の組成物。
16. 【請求項１６】前記別の乳化剤が、ポリオキシエチレン
    ソルビタン20モノオレエート、ソルビタントリオレエー
    ト、およびその組合せからなる群から選択される、請求
    項13に記載の組成物。
17. 【請求項１７】前記組成物が、2.5重量％までの前記別
    の乳化剤を含む、請求項13に記載の組成物。
18. 【請求項１８】前記抗原物質が、ウイルス粒子またはサ
    ブユニットである、請求項１に記載の組成物。
19. 【請求項１９】前記抗原物質が、ウイルス分子抗原であ
    る、請求項１に記載の組成物。
20. 【請求項２０】前記リポソーム内に含まれるか、または
    その表面上に位置する抗原物質が、HSV rgD2、HIV gp12
    0、HIV RT6、HSV Gb-2、マラリア血清１、およびインフ
    ルエンザワクチン抗原からなる遺伝子操作されたタンパ
    ク質の群から選択される、請求項14に記載の組成物。