ES2174957T5 - Proteinas purificadas de envoltura de virus de la hepatitis c para uso diagnostico y terapeutico. - Google Patents

Proteinas purificadas de envoltura de virus de la hepatitis c para uso diagnostico y terapeutico.

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ES2174957T5 ES95930434T ES95930434T ES2174957T5 ES 2174957 T5 ES2174957 T5 ES 2174957T5 ES 95930434 T ES95930434 T ES 95930434T ES 95930434 T ES95930434 T ES 95930434T ES 2174957 T5 ES2174957 T5 ES 2174957T5
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA PURIFICAR PROTEINAS UNICAS U OLIGOMERICAS QUE ENVUELVEN EL HCV RECOMBINANTE SELECCIONADAS DEL GRUPO QUE CONSTA DE E1 Y/O E2 Y/O E1/E2, CARACTERIZADAS PORQUE AL LISAR LAS CELULAS TRANSFORMADAS ANFITRIONAS PARA AISLAR LA PROTEINA RECOMBINANTEMENTE EXPRESADA, SE LLEVA A CABO UNA DISOCIACION DE UNION DE DISULFURO O PASO DE REDUCCION CON UN AGENTE DE DISOCIACION DE UNION DE DISULFURO. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UNA COMPOSICION AISLADA MEDIANTE DICHO METODO. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A LA APLICACION TERAPEUTICA Y DIAGNOSTICA DE ESTAS COMPOSICIONES. ADEMAS, LA INVENCION SE REFIERE AL USO DE LA PROTEINA HCV E1 Y PEPTIDOS PARA PRONOSTICAR Y REALIZAR UN SEGUIMIENTO DE LA EFICACIA CLINICA Y/O EL RESULTADO DEL TRATAMIENTO DE HCV.

Description

Proteínas purificadas de envoltura de virus de la hepatitis C para uso diagnóstico y terapéutico.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a los campos generales de expresión de la proteína recombinante, a la purificación de proteínas recombinantes, de péptidos sintéticos, diagnóstico de la infección por HCV, al tratamiento profiláctico contra la infección por HCV y al pronóstico/seguimiento de la eficacia clínica del tratamiento de un individuo con hepatitis crónica, o al pronóstico/seguimiento de la enfermedad natural.
Más particularmente, la presente invención se refiere a los procedimientos de purificación para las proteínas de la envoltura del virus de la hepatitis C, a la utilización en el diagnóstico, a la profilaxis o a la terapia de las proteínas de la envoltura del HCV purificadas según los procedimientos descritos en la presente invención, a la utilización de proteínas oligoméricas de la envoltura E1 y/o E2 y/o E1/E2 individuales o específicas, en el análisis para el seguimiento de la enfermedad, y/o en el diagnóstico de la enfermedad, y/o en el tratamiento de la enfermedad.
Antecedentes de la invención
La proteína purificada de la células lisadas según los procedimientos descritos en la presente invención reacciona con el 95% aproximadamente de los sueros del paciente. Esta reactividad es similar a la reactividad con la E2 segregada por las células CHO (Spaote et al., 1992). Sin embargo, la forma de E2 expresada intracelularmente puede parecer más exactamente la proteína de la envoltura vírica natural porque contiene motivos de carbohidrato ricos en manosa, mientras la proteína E2 segregada por las células CHO se modifica además con los grupos de azúcar de la galactosa y el ácido siálico. Cuando la mitad amonoterminal de E2 se expresa en el sistema de baculovirus, sólo se pueden detectar aproximadamente del 13 al 21% de los sueros de varios grupos de pacientes (Inoue y otros, 1992). Después de la expresión del E2 de E. coli, la reactividad de los sueros de HCV fue incluso más baja y varió desde el 14 (Yokosuka y otros, 1992) al 17% (Mita y otros, 1992).
Aproximadamente el 75% de los sueros de HCV (y el 95% de los pacientes crónicos) son positivos anti-E1 utilizando la proteína E1 recombinante de la presente invención expresada en la vacuna, en marcado contraste con los resultados de Kohara y otros (1992) y Hsu y otros (1993). Kohara y otros utilizaron la proteína E1 expresada en vacuna y detectaron anticuerpos anti-E1 en 7 al 23% de los pacientes, mientras Hsu y otros sólo detectaron 14/50 (28%) sueros utilizando E1 expresada en baculovirus. Ralston y otros (1993, J. Virology 67:6753) describen la caracterización de los complejos de glucoproteína de la envoltura del HCV expresados por el virus de la viruela recombinante. El documento WO 92/08734 describe la expresión de las asialoglucoproteínas del HCV, que se juntan cuando se purifican. Nishihara y otros (1993, Gene 129: 207) describe la secreción y purificación de la glucoproteína NS1 del HCV por las células de insecto infectadas por baculovirus recombinante.
Estos resultados demuestran que para conseguir una alta reactividad de las proteínas de la envoltura con el suero del paciente humano se necesita, no sólo un buen sistema de expresión sino también un buen protocolo de purificación. Éste se puede conseguir utilizando el sistema de expresión propio y/o los protocolos de purificación de la presente invención que garantizan la conservación de la duplicación natural de la proteína y de los protocolos de purificación de la presente invención que garantizan la eliminación de las proteínas contaminantes y que evitan la conformación, y de este modo la reactividad de las proteínas de la envoltura de HCV. Las cantidades de proteína de la envoltura de HCV purificada necesarias para los análisis de detección del diagnóstico son del orden de gramos por año. Para vacunas, se necesitarían incluso grandes cantidades de proteína de la envoltura. Por consiguiente, el sistema de virus de la viruela se puede utilizar para seleccionar las mejores construcciones de la expresión y para el aumento a escala, y se puede conseguir la expresión a gran escala y purificación de las proteínas oligoméricas de la envoltura únicas o específicas que contienen carbohidratos ricos en manosa cuando se expresan a partir de varias cepas de levadura. En el caso de la hepatitis B por ejemplo, la fabricación de HbsAg a partir de células de mamíferos fue mucho más costosa comparada con las vacunas de la hepatitis B procedentes de levadura.
Objetivos de la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo procedimiento de purificación para las proteínas E1 y E2 y/o E1/E2 expresadas recombinantemente de modo que dichas proteínas recombinantes sean utilizables directamente para el diagnóstico y como vacunas, como proteínas recombinantes oligoméricas únicas o específicas exentas de contaminantes en lugar de agregados.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones que comprenden glucoproteínas E1 y/o E2 y/o E1/E2 recombinantes (oligoméricas únicas o específicas) que comprenden epítopos conformacionales de los campos E1 y/o E2 del HCV.
Es además un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para la producción y purificación de las proteínas E1 y/o E2 y/o E1/E2 del HCV recombinante.
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Es además un objetivo de la presente invención proporcionar utilizaciones de diagnóstico e inmunógenas de las proteínas E1 y/o E2 y/o E1/E2 del HCV recombinante de la presente invención, además de proporcionar maletines para utilización en el diagnóstico, vacunas o productos terapéuticos que comprenden cualquiera de las proteínas E1 y/o E2 y/o E1/E2 del HCV recombinante de la presente invención.
Es además un objetivo de la presente invención proporcionar una nueva utilización de las proteínas E1, E2 y/o E1/E2, o de sus partes adecuadas, para seguimiento/pronóstico de la respuesta al tratamiento de los pacientes (p. ej. con interferón) que padecen la infección por el HCV.
Es también un objetivo de la presente invención proporcionar la utilización de las proteínas E1, E2 y/o E1/E2 de la presente invención en pruebas de anticuerpo de detección y confirmatorias de HCV.
Es también un objetivo de la presente invención proporcionar equipos para seguimiento/pronóstico de la respuesta al tratamiento (p. ej. con interferón) de los pacientes que padecen la infección por HCV o seguimiento/pronóstico del resultado de la enfermedad.
Todos los objetivos de la presente invención se consideran que se han satisfecho mediante las formas de realización expuestas más adelante.
Definiciones
Las definiciones siguientes sirven para ilustrar los diferentes términos y expresiones utilizados en la presente invención.
El término "proteína de la envoltura única del virus de la hepatitis C" se refiere a un polipéptido o a su análogo (p. ej. mimótopos) que contienen una secuencia de aminoácido (y/o análogos de aminoácido) que definen por lo menos un epítopo del HCV de ambas regiones de E1 o E2.
Estas proteínas de la envoltura única en el amplio sentido de la palabra pueden estar en forma monómera u homo-oligomérica de proteínas de la envoltura expresadas recombinantemente. Típicamente, las secuencias que definen el epítopo corresponden a la secuencia de aminoácido de ambas regiones E1 o E2 del HCV (idénticamente o vía sustitución de análogos de los residuos de aminoácidos naturales que no destruyen el epítopo). En general, la secuencia que define al epítopo será de 3 aminoácidos de longitud, más típicamente, de 5 ó más aminoácidos de longitud, más típicamente de 8 ó más aminoácidos de longitud, e incluso más típicamente de 10 ó más aminoácidos de longitud. Con respecto a los epítopos conformacionales, la longitud de la secuencia que define al epítopo puede estar sometida a amplias variaciones, ya que se cree que estos epítopos se forman por la forma tridimensional del antígeno (p. ej. plegado). De este modo, los aminoácidos que definen el epítopo pueden ser relativamente pocos en número, pero dispersados ámpliamente a lo largo de la longitud de la molécula siendo llevados dentro de la conformación del epítopo vía plegamiento. Las partes del antígeno entre los residuos que definen el epítopo pueden no ser críticas para la estructura conformacional del epítopo. Por ejemplo, la eliminación o sustitución de estas secuencias que intervienen puede no afectar al epítopo conformacional con tal que se mantengan las secuencias críticas para la conformación del epítopo (p. ej. cisteínas implicadas en el enlace disulfuro, sitios de glucosilación, etc.). Un epítopo conformacional puede también estar formado por 2 ó más zonas esenciales de subunidades de un homooligómero o heterooligómero.
Los antígenos del HCV de la presente invención comprenden epítopos conformacionales de los dominios(de la envoltura) de E1 y/o E2 del HCV. El dominio de E1, que se cree que corresponde a la proteína de la envoltura vírica, es apreciado actualmente para tender un puente entre los aminoácidos 192-383 de la poliproteína del HCV (Hijikata y otros, 1991). En la expresión en un sistema (glucosilado) de mamífero, se cree que tiene un peso molecular aproximado de 35 kDa, determinado vía SDS-PAGE. La proteína E2, denominada anteriormente NS1, se cree que tiende un puente entre los aminoácidos 384-809 ó 384-746 (Grakoui y otros, 1993) de la poliproteína del HCV y ser además una proteína de envoltura. En la expresión en un sistema de vacuna (glicosilado), se cree que tiene un peso molecular de gel aparente de 72 kDa. Se entiende que estos puntos finales de la proteína son aproximaciones (p. ej. el extremo terminal carboxi de E2 debería descansar en alguna parte en la zona de los aminoácidos 730-820, p. ej. acabando en los aminoácidos 730, 735, 740, 742, 744, 745, preferentemente 746, 747, 748, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 809, 810, 820).La proteína E2 puede también estar expresada junto con la E1, P7 (aa 747-809), NS2 (aa 810-1026), NS4A (aa 1658-1711) o NS4B (aminoácido 1712-1972). La expresión junto con estas otras proteínas del HCV puede ser importante para obtener el correcto plegado de la proteína.
Se entiende así mismo que los aislados utilizados en la sección de ejemplos de la presente invención no pretenden limitar el alcance de la invención y que cualquier cepa aislada del HCV del tipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o cualquier otro nuevo genotipo de HCV es una fuente adecuada de secuencia de E1 y/o E2 para la práctica de la presente invención.
Los antígenos de E1 y E2 utilizados en la presente invención pueden ser proteínas víricas completas, sus versiones sustancialmente completas, o sus fragmentos funcionales (p. ej. fragmentos cuya secuencia esencial no ha desaparecido para la formación o la conservación de un epítopo). Además, los antígenos del HCV de la presente invención pueden también comprender otras secuencias que no bloquean o evitan la formación del epítopo conformacional en cuestión. La presencia o ausencia de un epítopo conformacional se puede determinar fácilmente mediante la identificación del antígeno en cuestión con un anticuerpo (suero policlonal o monoclonal para la conformación del epítopo) y comparando su reactividad con la de una versión desnaturalizada del antígeno que conserva sólo epítopos lineales (si existen). En dicha identificación que utiliza anticuerpos policlonales, puede ser ventajoso adsorber el suero policlonal en primer lugar con el antígeno desnaturalizado y observar si mantiene los anticuerpos para el antígeno en
cuestión.
Los antígenos del HCV de la presente invención se pueden preparar por cualquier procedimiento recombinante que proporcione el epítopo en cuestión. Por ejemplo, la expresión intracelular recombinante en células de mamíferos o insectos es un procedimiento preferido para proporcionar antígenos de E1 y/o E2 glucosilados en conformación "natural" como en el caso de los antígenos naturales del HCV. Las células de levadura y las cepas de levadura mutantes (p. ej. el mutante mnn 9 (Kniskern y otros, 1994) o los mutantes de glucosilación procedentes mediante selección por resistencia al vanadato (Ballou y otros, 1991)) pueden ser teóricamente aconsejables para la producción de azúcares segregados de tipo rico en manosa; mientras que las proteínas segregadas por las células de los mamíferos pueden contener modificaciones que incluyen la galactosa o los ácido siálicos que pueden ser indeseables para determinadas aplicaciones en diagnóstico o en vacunas. Sin embargo, también puede ser posible y suficiente para determinadas aplicaciones, como se sabe para las proteínas, expresar el antígeno en otros huéspedes recombinantes (tal como E. coli) y renaturalizar la proteína después de la recuperación.
El término "polipéptido de fusión" quiere decir un polipéptido en el que el/los antígeno(s) HCV forman parte de una única cadena de aminoácidos contínua, que no tiene lugar en la naturaleza. Los antígenos del HCV pueden estar conectados directamente uno con otro mediante enlaces péptido o estar separados por secuencias de aminoácidos intermedias. Los polipéptidos de fusión pueden contener así mismo secuencias de aminoácidos exógenas al HCV.
El término "fase sólida" quiere decir un cuerpo sólido al que los antígenos del HCV individuales o el polipéptido de fusión contenido en los antígenos del HCV se unen covalentemente o por medios no covalentes tal como la adsorción hidrófoba.
El término "muestra biológica" quiere decir un fluido o tejido de un mamífero particular (p. ej. un antropoide, un hombre) que contiene habitualmente anticuerpos producidos por el individuo, más particularmente anticuerpos contra el HCV. El fluido o tejido puede además contener antígeno del HCV. Dichos componentes son conocidos en esta materia e incluyen, sin limitación, sangre, plasma, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, linfa, secreciones de los tractos respiratorio, intestinal o genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos blancos y mielomas. Los componentes corporales comprenden líquidos biológicos. El término "líquido biológico" se refiere a un fluido obtenido de un organismo. Algunos fluidos biológicos se utilizan como fuente de otros productos, tales como los factores de coagulación (p. ej. Factor VIII; C), albúmina el suero, hormona del crecimiento y similares, en tales casos es importante que la fuente de fluido biológico esté exenta de contaminación por virus tal como el HCV.
El término "inmunológicamente reactivo" significa que el antígeno en cuestión reaccionará específicamente con anticuerpos anti-HCV presentes en el componente corporal procedentes de un individuo infectado por HCV.
El término "complejo inmunitario" significa la combinación formada cuando un anticuerpo se une a un epítopo en un antígeno.
"E1" según se utiliza en esta memoria se refiere a una proteína o polipéptido expresados en los primeros 400 aminoácidos de una poliproteína del HCV, algunas veces se refiere a la proteína E, ENV o S. En su forma natural es una glucoproteína de 35 kDa que se halla en estrecha relación con las membranas. En las cepas de HVC más naturales, la proteína E1 está codificada en la poliproteína vírica que sigue a la proteína C (nuclear). La proteína E1 se extiende desde aproximadamente el aminoácido (aa) 192 hasta aproximadamente aa 383 de la poliproteína completa.
El término "E1" según se utiliza en esta memoria incluye además análogos y formas truncadas que interreaccionan inmunológicamente con la E1 natural, y comprenden proteínas E1 de los genotipos 1, 2, 3, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o de cualquier otro tipo o subtipo del HCV recién identificado.
"E2" según se utiliza en esta memoria se refiere a una proteína o polipéptido expresados en los primeros 900 aminoácidos de una poliproteína del HCV, algunas veces se refiere a la proteína NS1. En su forma natural es una glucoproteína de 72 kDa que se halla en estrecha relación con las membranas. En las cepas de HCV más naturales, la proteína E2 está codificada en la poliproteína vírica que sigue a la proteína E1. La proteína E2 se extiende desde aproximadamente la posición del aminoácido 384 hasta la posición del aminoácido 746, otra forma de E2 se extiende hasta la posición del aminoácido 809. El término "E2" según se utiliza en esta memoria incluye además análogos y formas truncadas que interreaccionan inmunológicamente con la E2 natural. Inserciones o codones múltiples entre el codón 383 y 384, por ejemplo, así como eliminaciones de los aminoácidos 384 a 387 han sido comunicadas por Kato y otros (1992).
"E1/E2" tal como se utiliza en esta memoria se refiere a una forma oligomérica de proteínas de la envoltura que contienen por lo menos un componente de E1 y por lo menos un componente de E2.
El término proteínas de la envoltura E1 y/o E2 y/o E1/E2 "oligoméricas específicas" se refiere a todas las formas oligoméricas posibles de las proteínas de la envoltura E1 y/o E2 que no son agregados. Las proteínas de la envoltura oligoméricas específicas E1 y/o E2 se refieren además a unas proteínas de la envoltura homo-oligoméricas E1 o E2 (véase más adelante).
El término proteínas de la envoltura E1 y/o E2 y/o E1/E2 "oligoméricas individuales o específicas" se refiere a proteínas E1 o E2 monómeras (individuales en el estricto sentido de la palabra) así como a proteínas expresadas recombinantemente E1 y/o E2 y/o E1/E2 oligoméricas específicas. Estas proteínas de la envoltura oligoméricas específicas o individuales pueden además estar definidas por la fórmula siguiente (E1)_{x} (E2)_{y} en la que x puede ser un número entre 0 y 100, e y puede ser un número entre 0 y 100, con la condición de que x e y no sean ambos 0. Con x = 1 e y = 0 dichas proteínas de la envoltura comprenden la E1 monomérica.
El término "homo-oligómero" según se utiliza en esta memoria se refiere a un complejo de E1 y/o E2 que contiene más de un monómero de E1 o E2, p. ej. dímeros E1/E1, trímeros E1/E1/E1 o tetrámeros E1/E1/E1/E1 y dímeros E2/E2, trímeros E2/E2/E2 o tetrámeros E2/E2/E2/E2, pentámeros y hexámeros de E1, pentámeros y hexámeros de E2 o cualesquiera homo-oligómeros de E1 o E2 de orden mayor son todos "homo-oligómeros" dentro del alcance de esta definición. Los oligómeros pueden contener uno, dos o diversos monómeros diferentes de E1 o E2 obtenidos a partir de diferentes tipos o subtipos de virus de hepatitis C incluyendo por ejemplo a los descritos en la solicitud internacional publicada como WO 94/25601 y la solicitud europea nº 94870166.9 ambas por los presentes solicitantes. Dichos oligómeros mixtos son todavía homo-oligómeros dentro del alcance de esta invención, y pueden permitir más diagnóstico, profilaxis o tratamiento universal del HCV.
El término "purificada" aplicado a las proteínas en esta memoria se refiere a una composición en la que la proteína deseada se compone por lo menos del 35% del componente de proteína total en la composición. La proteína deseada se compone preferentemente por lo menos del 40%, más preferentemente por lo menos de aproximadamente el 50%, más preferentemente por lo menos de aproximadamente el 60%, todavía más preferentemente por lo menos de aproximadamente el 70%, aún más preferentemente por lo menos de aproximadamente el 80%, aún más preferentemente por lo menos de aproximadamente el 90%, y lo más preferentemente por lo menos de aproximadamente el 95% del componente de proteína total. La composición puede contener otros compuestos tales como carbohidratos, sales, lípidos, disolventes o similares, sin que afecte a la determinación del porcentaje de pureza según se utiliza en esta memoria. Una proteína del HCV "aislada" quiere decir una composición de la proteína del HCV que es por lo menos 35% pura.
El término "proteínas esencialmente purificadas" se refiere a las proteínas purificadas tal como se pueden utilizar para procedimientos de diagnóstico in vitro y como compuesto terapéutico. Estas proteínas están exentas sustancialmente de proteínas celulares, de proteínas procedentes de vectores o de otros componentes víricos del HCV. Estas proteínas se purifican generalmente hasta homogeneidad (por lo menos 80% puras, preferentemente el 90%, más preferentemente el 95%, más preferentemente el 97%, más preferentemente el 98%, más preferentemente el 99%, aún más preferentemente el 99,5% y más preferentemente las proteínas contaminantes deberían ser indetectables por procedimientos convencionales como SDS-PAGE y tinción de la plata.
El término " expresado recombinantemente" utilizada en el contexto de la presente invención se refiere al hecho de que las proteínas de la presente invención se producen mediante procedimientos de expresión recombinante en procariotas o eucariotas superiores o inferiores como se trata en detalle más adelante.
El término "eucariota inferior" se refiere a células huésped tales como levaduras, hongos y similares. Los eucariotas inferiores son generalmente (pero no necesariamente) unicelulares. Los eucariotas inferiores preferidos son levaduras, particularmente especies dentro de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia (p.ej. Pichia pastoris), Hansenula, (p. ej. Hansenula polymorpha), Yarowia, Schwaniomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces y similares. Saccharomyces cerevisiae, S. carisbergensis y K. lactis son los huéspedes de levadura utilizados más corrientemente y son huéspedes de hongos apropiados.
El término "procariotas" se refiere a huéspedes tales como E. coli, Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis o Streptomyces. Así mismo estos huéspedes se contemplan dentro de la presente invención.
El término "eucariótica superior" se refiere a las células huésped procedentes de animales superiores tales como mamíferos, reptiles, insectos y similares. Las células huésped de eucariótica superior preferidas actualmente proceden del hamster chino (p. ej. CHO), mono (p. ej. COS y células Vero), riñón de hamster pequeño (BHK), riñón de cerdo (PK15), células 13 de riñón de conejo (RK13), la línea celular 143 B del osteosarcoma humano, la línea celular HeLa y las líneas celulares del hepatoma humano como Hep G2 y las lineas celulares de insecto (p. ej. Spodoptera frugiperda). Las células huésped se pueden suministrar en suspensión o en cultivos en matraz, cultivos de tejido, cultivos de órgano y similares. Por otra parte las células huésped pueden ser también animales transgénicos.
El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto; de este modo, péptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido. El término tampoco se refiere a o excluye modificaciones post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glucosaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Incluidos dentro de la definición están, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, PNA, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, además de otras modificaciones conocidas en esta materia, que tienen lugar ambos en la naturaleza y fuera de la naturaleza.
El término "polinucleótido o ácido nucleico recombinante" quiere decir un polinucleótido o un ácido nucleico del cADN genómico, de origen sintético o semisintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está relacionado con todo o parte de un polinucleótido con el que está relacionado en la naturaleza, (2) está unido a un polinucleótido diferente del que se une en la naturaleza, o (3) no tiene lugar en la naturaleza.
El término "células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares", y otros de dichos términos que indican microorganismos o líneas celulares de eucariotas superiores cultivados como entidades unicelulares se refieren a células que pueden ser o han sido, utilizadas como receptoras de un vector recombinante u otro polinucleótido de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que se ha transferido. Se entiende que la progenie de una única célula paterna puede no ser necesariamente totalmente idéntica en morfología o en el ADN genómico o total complemetario según el padre original, debido a mutación natural, accidental o deliberada.
El término "replicón" es cualquier elemento genético, p. ej. un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc., que se comporta como una unidad autónoma de replicación del polinucleótido dentro de una célula; es decir, capaz de replicación bajo su propio control.
El término "vector" es un replicón que comprende además secuencias que proporcionan replicación y/o expresión de un marco de lectura abierto deseado.
El término "secuencia de control" se refiere a las secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias de codificación a las que están ligados. La naturaleza de dichas secuencias de control se diferencia dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control comprenden generalmente el iniciador, el sitio de unión ribosómico y los terminadores; en los eucariotas, generalmente dichas secuencias de control comprenden iniciadores, terminadores y, en algunos casos, aumentadores. El término "secuencias de control" quiere decir incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia sea necesaria para la expresión, y puede también incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, las secuencias destacadas que gobiernan la secreción.
El término "iniciador" es una secuencia de nucleótido que se compone de secuencias de consenso que permiten la unión de la ARN polimerasa la plantilla del ADN, de tal modo que la producción de mARN se inicia en el sitio de iniciación de transcripción normal para el gen estructural adyacente.
La expresión "operativamente ligada" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera deseada. Una secuencia de control "operativamente ligada" a una secuencia de codificación está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se consigue en condiciones compatibles con la secuencia de control.
Un "marco de lectura abierto" (ORF) es una zona de la secuencia del polinucleótido que codifica un polipéptido y no contiene codones de terminación; esta zona puede representar una parte de una secuencia de codificación o una secuencia de codificación total.
Una "secuencia de codificación" es una secuencia de polinucleótido que está transcrita en el mARN y/o traducida en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación se determinan mediante un codón de iniciación de traducción en el terminal 5' y un codón de terminación de traducción en el terminal 3'. Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita al mARN, ADN (cADN inclusive) y secuencias de polinucleótido recombinante.
Según se utiliza en esta memoria, "epítopo" o "determinante antigénico" significa una secuencia de aminoácidos que es inmunoreactiva. Generalmente un epítopo consta de por lo menos 3 ó 4 aminoácidos, y más generalmente, consta por lo menos de 5 ó 6 aminoácidos, algunas veces el epítopo consta de aproximadamente 7 a 8, o incluso aproximadamente 10 aminoácidos. Según se utiliza en esta memoria, un epítopo de un polipéptido designado indica epítopos con la misma secuencia de aminoácidos que el epítopo en el polipéptido designado y sus equivalentes inmunológicos. Dichos equivalentes también comprenden cepa, subtipo (= genotipo), o variantes específicas de tipo (grupo), p. ej. de las secuencias conocidas actualmente o de las cepas que pertenecen a genotipos 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 2a, 2b, 2c, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k, 4l, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a, 8b, 9a, 9b, 10a, o cualquier otro (sub)tipo de HCV recientemente definido. Se ha de entender que los aminoácidos que constituyen el epítopo necesitan formar parte de una secuencia lineal, pero pueden estar entremezclados con cualquier número de aminoácidos, formando así un epítopo conformacional.
El término "inmunógeno" se refiere a la capacidad de una sustancia para producir una respuesta humoral y/o celular, si está sola o cuando se une a un portador, en presencia o ausencia de un adyuvante. "Neutralización" se refiere a una respuesta inmunitaria que bloquea la ineficacia, parcial o totalmente, de un agente infeccioso. Una "vacuna" es una composición inmunógena capaz de obtener protección parcial o completa frente a HCV. Una vacuna puede también ser útil para el tratamiento de individuos, en cuyo caso se denomina vacuna terapéutica.
El término "terapéutico" se refiere a una composición capaz de tratar la infección por HCV.
El término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de epítopo que lleva polipéptido suficiente para producir una respuesta inmunógena en el individuo al que se administra o para inmunorreaccionar detectablemente de otra forma en su sistema deseado (p. ej., inmunoanálisis). Preferentemente, la cantidad eficaz es suficiente para efectuar el tratamiento, definido anteriormente. La cantidad exacta necesaria variará según la aplicación. Para aplicaciones en vacuna o para la generación de antisuero/anticuerpos policlonales, por ejemplo, la cantidad eficaz puede variar dependiendo de las especies, edad y condición general del individuo, la gravedad de la enfermedad que esta siendo tratada, el polipéptido particular seleccionado y su modo de administración, etc. Se cree también que las cantidades eficaces se hallan dentro de un intervalo no crítico, relativamente grande. Una cantidad eficaz apropiada se puede determinar fácilmente utilizando sólo experimentación de rutina. Los intervalos preferidos de las proteínas de la envoltura oligoméricas individuales o específicas E1 y/o E2 y/o E1/E2 para la profilaxis de la enfermedad por HCV son 0,01 a 100 \mug/dosis, preferentemente 0,1 a 50 \mug/dosis. Pueden ser necesarias varias dosis por individuo para conseguir una respuesta inmunitaria suficiente y protección posterior contra la enfermedad por HCV.
Descripción detallada de la invención
Más particularmente, la presente invención contempla un procedimiento para la purificación de las proteínas de la envoltura oligoméricas individuales o específicas del HCV recombinante seleccionadas de entre el grupo que consta de E1 y/o E2 y/o E1/E2, caracterizado porque
i)
se lleva a cabo una escisión del enlace disulfuro o una etapa de reducción con un agente de escisión del enlace disulfuro sobre la proteína expresada recombinantemente; y
ii)
se evita la reformación de los puentes disulfuros mediante un agente de unión o bloqueo del grupo SH o se provoca mediante un pH inferior a 6.
La esencia de estas proteínas de la envoltura "oligoméricas individuales o específicas" producidas mediante el procedimiento de la invención es que están exentas de proteínas contaminantes y que no están unidas por el enlace disulfuro con contaminantes.
Las proteínas según la presente invención se expresan recombinantemente en células eucarióticas inferiores o superiores o en procariotas. Las proteínas recombinantes de la presente invención están preferentemente glucosiladas y pueden contener híbrido del tipo rico en manosa, o complejas glucosilaciones. Preferentemente dichas proteínas se expresan en líneas celulares de mamíferos como se trata en detalle en la sección de Ejemplos, o en dicha levadura como en cepas de levadura mutantes, también como se detalla en la sección de Ejemplos.
Las proteínas según la presente invención pueden ser segregadas o expresadas dentro de los componentes de la célula, tal como el ER o el aparato de Golgi. Preferentemente, sin embargo, las proteínas de la presente invención llevan glucosilaciones del tipo rico en manosa y se conservan en el ER o en el aparato de Golgi de las células de los mamíferos o se conservan en o se segregan por células de levadura, se segregan preferentemente por cepas mutantes de levadura tal como la mutante mnn9 (Kniskern y otros, 1994), o por mutantes que se han seleccionado por medio de resistencia al vanadato (Ballou y otros, 1991).
En expresión de las proteínas de la envoltura del HCV, los presentes inventores podrían demostrar que alguno de los grupos tiol libres de cisteínas no implicadas en puentes disulfuro intra o intermoleculares, reacciona con cisteínas del huésped o con proteínas derivadas del sistema de expresión (p. ej. vacunas) o de otras proteínas de la envoltura del HCV (individuales u oligoméricas) y forman puentes intermoleculares específicos. Esto da como resultado la formación de "agregados" de proteínas de la envoltura del HCV junto con proteínas contaminantes. Se demostró además en el documento nº WO 92/08734 que los "agregados" se obtuvieron después de purificación, pero no se describió qué interacciones de proteína estuvieron implicadas. En la solicitud de patente nº WO 92/08734, la proteína E1/E2 recombinante expresada con el sistema de virus de la viruela se purificaron parcialmente como agregados y sólamente se halló una pureza del 70%, obteniéndose agregados purificados no útiles con fines de diagnóstico, profilácticos o terapéuticos.
Por consiguiente, el objetivo principal de la presente invención reside en la separación de proteínas de la envoltura del HCV oligoméricas individuales o específicas de las proteínas contaminantes, y en utilizar las proteínas purificadas (>95% puras) con fines de diagnóstico, profilácticos o terapéuticos. Para estos fines, la presente invención ha sido capaz de proporcionar pruebas de que los complejos de proteína agregados ("agregados") están formados sobre la base de puentes disulfuro e interacciones proteína-proteína no covalentes. La presente invención proporciona un medio para escindir selectivamente los enlaces disulfuro en condiciones específicas y para separar las proteínas escindidas de las proteínas contaminantes que interfieren en gran medida con las aplicaciones de diagnóstico, profilácticas y terapéuticas. Los grupos tiol libres pueden estar bloqueados (reversible o irreversiblemente) para evitar la nueva formación de puentes disulfuros, o se pueden dejar para oxidar y oligomerizar con otras proteínas de la envoltura (véase la definición de homo-oligómero). Se debe entender que dichos oligómeros de proteína son diferentes esencialmente de los "agregados" descritos en los documentos nº WO 92/08734 y nº WO 94/01778, ya que la cantidad de proteínas contaminantes es indetectable.
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Dicha escisión del enlace disulfuro se puede también conseguir mediante:
(1) Oxidación con ácido perfórmico mediante ácido cisteico, en cuyo caso los residuos de cisteína se modifican dentro del ácido cisteico (Moore y otros, 1963).
(2) Sulfitolisis (R-S-S-R \rightarrow 2R-SO_{3}) por ejemplo mediante sulfito (SO^{2-}_{3}) junto con un oxidante apropiado tal como Cu^{2+} en cuyo caso la cisteína se convierte en S-sulfocisteína (Bailey y Cole, 1959).
(3) Reducción mediante mercaptanos, tal como ditiotreitol (DTT), \beta-mercapto-etanol, cisteína, glutatión rojo,
\varepsilon-mercapto-etilamina, o ácido tioglicólico, de los que DTT y \beta-mercapto-etanol se utilizan frecuentemente (Cleland, 1964), es el procedimiento preferido de esta invención porque el procedimiento se puede llevar a cabo en medio acuoso y porque la cisteína permanece inalterada.
(4) Reducción mediante una fosfina (p. ej. Bu_{3}P) (Ruegg y Rudinger, 1977).
Todos estos compuestos, así pues, deben ser considerados como agentes o medios para escindir enlaces disulfuros según la presente invención.
Dicha etapa de escisión (o reducción) del enlace disulfuro de la presente invención es preferentemente una etapa de escisión (o reducción) del enlace disulfuro (realizada bajo condiciones de escisión o reducción parcial).
Un agente preferido de escisión o reducción) del enlace disulfuro según la presente invención es ditiotreitol (DTT). La reducción parcial se obtiene utilizando una baja concentración de dicho agente reductor, es decir, para DTT por ejemplo,en el intervalo de concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mM, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 20 mM, preferentemente de aproximadamente 0,5 a 10 mM, preferentemente más de 1 mM, más de 2 mM o más de 5 mM, más preferentemente aproximadamente 1,5 mM, aproximadamente 2,0 mM, aproximadamente 2,5 mM, aproximadamente 5 mM o aproximadamente 7,5 mM.
Dicha etapa de escisión del enlace disulfuro se puede realizar también en presencia de un detergente adecuado (como ejemplo de un medio para la escisión de enlaces disulfuro o en combinación con un agente de escisión) capaz de disociar las proteínas expresadas, tales como DecylPEG, EMPIGEN-BB, NP-40, colato de sodio, Triton X-100.
Dicha etapa de reducción o escisión (preferentemente una etapa de reducción o escisión parcial) se realiza preferentemente en presencia de (con) un detergente. Un detergente preferido según la presente invención es Empigen-BB. La cantidad de detergente utilizado es del orden de 1 al 10%, preferentemente más del 3%, más preferentemente aproximadamente 3,5% de un detergente tal como Empigen-BB.
Un procedimiento particularmente preferido para conseguir la escisión del enlace disulfuro emplea una combinación de un agente clásico de escisión del enlace disulfuro como la detallada anteriormente y un detergente (también como la detallada anteriormente). Según se contempla en la sección de Ejemplos, la combinación particular de una baja concentración de DTT (1,5 a 7,5 mM) y aproximadamente 3,5% de Empigen-BB ha demostrado ser una combinación particularmente preferida de agente reductor y detergente para la purificación de las proteínas E1 y E2 expresadas recombinantemente. En cromatografía por filtración en gel, dicha reducción parcial se demuestra que da como resultado la producción de proteína E1 posiblemente dimérica y la separación de esta proteína E1 de las proteínas contaminantes que provocan falsa reactividad en su utilización en inmunoanálisis.
Sin embargo, se ha de entender que cualquier otra combinación de cualquier otro agente reductor conocido en la materia con cualquier detergente u otro medio conocido en la materia para hacer más accesible la cisteína, está así mismo dentro del alcance de la presente invención, de modo que dicha combinación alcanza el mismo objetivo de escisión del puente disulfuro como la combinación preferida a título de ejemplo en la presente invención.
Aparte de la reducción de los enlaces disulfuro, un medio de escisión del enlace disulfuro según la presente invención puede comprender además cualesquiera de los agentes de intercambio de puentes disulfuro (agente competitivo que sea orgánico o proteínico, véase por ejemplo Creighton, 1988) conocidos en la materia que permiten que tengan lugar el siguiente tipo de reacción:
R_{1} S-S R_{2} + R_{3} SH \rightarrow R_{1} S-S R_{3} + R_{2} SH
\bullet
R_{1}, R_{2}: compuestos de agregados de proteína
\bullet
R_{3} SH: agente competitivo (orgánico, proteínico).
El término "agente de intercambio de puentes disulfuro" se ha de interpretar que comprende los agentes de re-formación del enlace disulfuro así como de bloqueo del enlace disulfuro.
La presente invención se refiere así mismo a procedimientos de purificación o aislamiento de proteínas de la envoltura oligoméricas individuales o específicas del HCV como se expuso anteriormente, además de incluir la utilización de cualquier reactivo de bloqueo o de unión del grupo SH conocido en la materia, tales como los seleccionados de la lista siguiente:
-
Glutatión
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5,5'-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) o bis-(3-carboxi-4-nitrofenil)-disulfuro (DTNB o reactivo de Ellman)/Ellman, 1959)
-
N-etilmaleimida (NEM; Benesch y otros, 1956)
-
N-(4-dimetilamino-3,5-dinitrofenil)maleimida o maleimida de Tuppy que da color a la proteína
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p-cloromercuribenzoato (Grassetti y otros, 1969)
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4-vinilpiridina (Friedman y Krull, 1969) se puede liberar después de la reacción por hidrólisis ácida
-
acrilonitrilo, se puede liberar después de la reacción por hidrólisis ácida (Weil y Seibles, 1961)
-
NEM-biotina (p. ej. obtenida a partir de Sigma B1267)
-
2,2'-ditiopiridina (Grassetti y Murray, 1967)
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4,4'-ditiopiridina (Grassetti y Murray, 1967)
-
ácido 6-6'-ditiodinicontínico (DTDNA; Brown y Cunnigham, 1970)
-
2-2'-ditiobis-(5'-nitropiridina) (DTNP; patente US 3597160) u otros compuestos de ditiobis (derivado heterocíclico) (Grassetti y Murray, 1969).
Un examen de las publicaciones citadas demuestra que con frecuencia diferentes reactivos para grupos sulfhidrilo van a reaccionar con una porción de grupos diversos de tiol de la misma molécula de proteína o de enzima. Se puede concluir que esta variación en reactividad de los grupos tiol es debida al medio estérico de estos grupos, tal como la configuración de la molécula y los grupos circundantes de los átomos y sus cargas, así como el tamaño, la configuración y la carga de la molécula o ión reactivos. Frecuentemente la presencia de concentraciones adecuadas desnaturalizantes tal como el dodecilsulfato de sodio, urea o cloruro de guanidina producirán suficiente desdoblamiento de la molécula de proteína para permitir igual acceso a todos los reactivos para los grupos tiol. Variando la concentración de desnaturalizante, se puede controlar el grado de desdoblamiento y de esta forma se pueden poner de manifiesto los grupos tiol con diferentes grados de reactividad. Aunque hasta la fecha la mayoría de los trabajos publicados se han hecho con p-cloromercuribenzoato, N-etilmaleimida y DTNB, es probable que otros reactivos desarrollados más recientemente puedan demostrar utilidad igualmente. A causa de sus estructuras cambiantes, parece probable, de hecho, que puedan responder de forma diferente a cambios en el medio estérico de los grupos tiol.
Por otra parte, las condiciones tales como pH inferior a pH 6 para evitar la oxidación de los grupos SH libres y evitar de este modo la formación de grandes agregados intermoleculares sobre la expresión recombinante y la purificación de proteínas (de la envoltura) E1 y E2 están también dentro del alcance de la presente invención.
Un reactivo de bloqueo del grupo SH preferido según la presente invención es la N-etilmaleimida (NEM). Dicho reactivo de bloqueo del grupo SH se puede administrar durante la lisis de las células huéspedes recombinantes y después del proceso de reducción parcial mencionado anteriormente o después de cualquier otro proceso para escindir puentes disulfuro. Dicho reactivo de bloqueo del grupo SH se puede modificar también con cualquier grupo capaz de proporcionar un marcador detectable y/o cualquier grupo que ayude a la inmovilización de dicha proteína recombinante hasta un sustrato sólido, p. ej. NEM biotinilada.
Los procedimientos para la escisión de los puentes de cisteína y el bloqueo de las cisteínas libres han sido descritos también por Darbre (1987), Means y Feeney (1971) y por Wong (1993).
Un procedimiento para purificar proteínas E1 y/o E2 y/o E1/E2 recombinantes oligoméricas individuales o específicas según la presente invención como se definió anteriormente se caracteriza además comprendiendo las siguientes etapas:
-
lisado de células huésped que expresan E1 y/o E2 y/o E1/E2 recombinantes, preferentemente en presencia de un agente bloqueante de un grupo SH, tal como N-etilmaleimida (NEM), y si es posible un detergente adecuado, preferentemente Empigen-BB,
-
recuperación de dicha proteína de la envoltura del HCV mediante purificación por afinidad, por ejemplo mediante cromatografía en lectina, tal como cromatografía en lectil-lectina, o cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales específicos anti-E1 y/o anti-E2, seguido de,
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reducción o escisión de enlaces disulfuro con un agente de escisión de enlace disulfuro, tal como DTT, preferentemente además en presencia de un agente bloqueante del grupo SH, tal como NEM o Biotin-NEM, y,
-
recuperación de las proteínas de la envoltura E1 y/o E2 y/o E1/E2 reducidas del HCV, por ejemplo mediante filtración en gel (cromatografía por exclusión de tamaño o tamizado molecular) y si es posible también por cromatografía Ni^{2+}-IMAC adicional y etapa de desalado.
Se ha de entender que las etapas de recuperación mencionadas anteriormente se pueden realizar utilizando cualquier otra técnica adecuada conocida por el experto en la materia.
Los sistemas de cromatografía en lectina preferidos comprenden cromatografía en aglutinina de Galanthus nivalis (GNA), o cromatografía en aglutinina de Lens culinaris (LCA) (lentil) lectina como se ilustra en la sección de Ejemplos. Otras lectinas útiles comprenden las que reconocen azúcares del tipo rico en manosa, tal como aglutinina de Narcissus pseudonarcissus (NPA), aglutinina de Pisum sativum (PSA) o aglutinina de Allium ursinum (AUA).
Preferentemente dicho procedimiento se utiliza para purificar proteínas de la envoltura de HCV oligoméricas individuales o específicas producidas intracelularmente como se detalló anteriormente.
Para los oligómeros E1 o E2 o E1/E2 segregados, las lectinas son los azúcares complejos preferidos que se unen a las lectinas, tal como la aglutinina I de Ricinus commums (RCA I).
La presente invención contempla más en particular E1 y una proteína de la envoltura del HCV aislada, obtenible mediante cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, que es por lo menos 80% pura, o 90% pura o 95% pura, caracterizada por la ausencia de agregados.
La presente invención se refiere más particularmente a la purificación o al aislamiento de las proteínas recombinantes de la envoltura que se expresan en las células recombinantes del mamífero, tal como en una vacuna.
La presente invención se refiere además a la purificación o al aislamiento de las proteínas recombinantes de la envoltura que se expresan en las células recombinantes de levadura.
La presente invención se refiere igualmente a la purificación o al aislamiento de las proteínas recombinantes de la envoltura que se expresan en las células (procarióticas) recombinantes de las bacterias.
Está comprendido así mismo dentro del alcance de la presente invención un procedimiento para producir proteínas purificadas E1 y/o E2 y/o E1/E2 de la envoltura oligoméricas individuales o específicas recombinantes del HCV, en las que se sustituyen los residuos de cisteína implicados en la formación de agregados al nivel de la secuencia del ácido nucleico por otros residuos, de tal manera que se evita la formación del agregado.
Un procedimiento preferido para el aislamiento o la purificación de las proteínas de la envoltura del HCV según se definió anteriormente se caracteriza además por comprender por lo menos las siguientes etapas:
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crecimiento de la célula huésped según se definió anteriormente transformada por un vector recombinante según la presente invención o por un vector recombinante conocido que expresa las proteínas E1 y/o E2 y/o E1/E2 de la envoltura en un medio de cultivo adecuado,
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producción de la expresión de dicha secuencia del vector según se definió anteriormente en condiciones adecuadas, y,
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lisis de dichas células huésped transformadas, preferentemente en presencia de un agente bloqueante de un grupo SH, tal como N-etilmaleimida (NEM), y si es posible de un detergente adecuado, preferentemente Empigen-BB,
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recuperación de dicha proteína de la envoltura del HCV mediante purificación por afinidad tal como cromatografía en lectina o cromatografía por inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales específicos anti-E1 y/o anti-E2, siendo dicha lectina preferentemente lentil-lectina o GNA, seguida de,
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incubación del eluido de la etapa anterior con un medio de escisión del enlace disulfuro, tal como DTT, preferentemente seguida de incubación con un agente bloqueante del grupo SH, tal como NEM o Biotin-NEM, y,
-
aislamiento de proteínas E1 y/o E2 y/o E1/E2 oligoméricas individuales o específicas del HCV tal como mediante filtración en gel y si es posible además mediante una cromatografía Ni^{2+}-IMAC posterior seguida de una etapa de desalado.
Como resultado del procedimiento mencionado anteriormente, las proteínas E1 y/o E2 y/o E1/E2 se pueden producir de forma que eluyan de modo distinto de los grandes agregados que contienen componentes procedentes del vector y/o componentes celulares en el volumen vacío de la columna de filtración en gel o de la columna IMAC como se ilustra en la sección de Ejemplos. La etapa de escisión del puente disulfuro elimina también ventajosamente la falsa reactividad debida a la presencia del huésped y/o a las proteínas procedentes del sistema de expresión. La presencia de NEM y un detergente adecuado durante la lisis de las células puede evitar ya parcial o incluso completamente la agregación entre las proteínas de la envoltura del HCV y los contaminantes.
La cromatografía Ni^{2+}-IMAC seguida de una etapa de desalado se utiliza preferentemente para construcciones que llevan una (His)_{6} como describe Jenknecht y otros, 1991 y Hochuli y otros, 1988.
La presente invención también se refiere a una composición que comprende proteínas del HCV recombinantes E1 y/o E2 y/o E1/E2 purificadas según el procedimiento de la presente invención o una composición que comprende por lo menos uno de los péptidos como se especificó anteriormente para su utilización como medicamento.
La presente invención se refiere más particularmente a una composición que comprende por lo menos uno de los péptidos de la envoltura especificados anteriormente o una composición recombinante de la proteína de la envoltura según se definió anteriormente, para la utilización como vacuna para la inmunización de mamíferos, preferentemente humanos, contra HCV, que comprende la administración de una cantidad suficiente de la composición, si es posible acompañada por adyuvante(s) farmacéuticamente aceptable(s), para producir una respuesta inmunitaria.
Más particularmente, la presente invención se refiere a la utilización de cualquiera de las composiciones según se describieron anteriormente en esta memoria para la preparación de una vacuna según se describió anteriormente.
Además, la presente invención se refiere a una composición de una vacuna para la inmunización de mamíferos, preferentemente humanos, contra HCV, que comprende proteínas oligoméricas individuales o específicas del HCV procedentes de la zona de E1 y/o E2 según se describió anteriormente.
Las composiciones inmunógenas se pueden preparar según los procedimientos conocidos en la materia. Las presentes composiciones comprenden una cantidad inmunógena de proteínas recombinantes E1 y/o E2 y/o E1/E2 oligoméricas individuales o específicas según se definió anteriormente, combinadas generalmente con un excipiente farmacéuticamente aceptable, comprendiendo preferentemente además un adyuvante.
Las proteínas de la envoltura oligoméricas individuales o específicas de la presente invención, E1 y/o E2 y/o E1/E2, se espera que proporcionen un antígeno de la vacuna particularmente útil, ya que la formación de anticuerpos en E1 o E2 puede ser más deseable que en otra proteína de la envoltura, y ya que la proteína E2 es inter-reactiva entre los tipos de HCV y la proteína E1 es de tipo específico. Pueden ser particularmente ventajosas las mezclas que comprenden la proteína E2 de tipo 1 y las proteínas E1 procedentes de diversos genotipos. Pueden también ser particularmente útiles las mezclas que contienen un exceso molar de E1 frente a E2 o de E2 frente a E1. Se pueden administrar a animales composiciones inmunógenas para provocar la producción de anticuerpos, o para proporcionar una fuente de anticuerpos o para producir inmunidad protectora en los animales.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden cualquier excipiente que no provoque por sí mismo la producción de potentes anticuerpos en el individuo que recibe la composición. Excipientes adecuados son típicamente grandes macromoléculas, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas inactivas de virus. Dichos excipientes son bien conocidos por los expertos en la materia.
Los adyuvantes preferidos para aumentar la eficacia de las composiciones comprenden, pero no se limitan a: hidróxido de aluminio (alum), N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) como se encuentra en la patente U.S. nº 4.606.918, N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitol-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y el esqueleto de la pared celular (MPL+TDL+CWS) en una emulsión al 2% de escualeno/Tween 80. Cualquiera de los tres componentes MPL, TDL, CWS también se puede utilizar solo o combinados de 2 en 2. Además, se pueden utilizar adyuvantes tales como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o SAF-1 (Syntex). Además, se puede utilizar el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA) para aplicaciones en no-humanos y con fines de investigación.
Las composiciones inmunógenas contendrán típicamente vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Además, se pueden incluir en dichos vehículos, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras de pH, conservantes, y similares.
Típicamente, las composiciones inmunógenas se preparan como inyectables, o como soluciones líquidas o suspensiones: formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de que se pueda preparar también la inyección. La preparación también puede estar emulsionada o encapsulada en liposomas para el efecto adyuvante aumentado. Las proteínas E1 y E2 también pueden estar incorporadas a complejos estimulantes inmunitarios junto con saponinas, por ejemplo Quil A (ISCOMS).
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Las composiciones inmunitarias utilizadas como vacunas comprenden, según se necesite, una "cantidad suficiente" o "una cantidad inmunológicamente eficaz" de las proteínas de la envoltura de la presente invención, así como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente. "Cantidad inmunológicamente eficaz", significa que la administración de una cantidad a un individuo, en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento, según se definió anteriormente. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a ser tratado, del grupo taxonómico del individuo a ser tratado (p. ej. primates no-humanos, primates, etc.), de la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección deseada, de la formulación de la vacuna, de la valoración del tratamiento del doctor de la situación médica, de la cepa de HCV infectante, y de otros factores importantes. Es de esperar que la cantidad disminuya en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante pruebas de rutina. Generalmente, la cantidad variará desde 0,01 a 1000 \mug/dosis, más particularmente desde 0,1 a 100 \mug/dosis.
Las proteínas de la envoltura oligoméricas individuales o específicas pueden también servir como excipientes de la vacuna al presentar homólogos (p.ej. epítopos de linfocito T o epítopo de linfocito B del núcleo, de las zonas NS2, NS3, NS4 O NS5) o haptenos heterólogos (no HCV), de la misma manera que en el antígeno de superficie de la Hepatitis B (véase la solicitud de la patente europea nº 1 74.444). En esta utilización, las proteínas de la envoltura proporcionan un excipiente inmunógeno capaz de estimular una respuesta inmunitaria en los haptenos o en los antígenos conjugados en el agregado. El antígeno puede estar conjugado por procedimientos químicos convencionales o puede estar clonado en el gen que codifica E1 y/o E2 en una posición que corresponde a una zona hidrófila de la proteína. Dichas zonas hidrófilas comprenden la zona V (que abarca las posiciones de los aminoácidos 191 a 202), la zona V2 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 213 a 223), la zona V3 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 230 a 242), la zona V4 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 230 a 242), la zona V5 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 294 a 303) y la zona V6 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 329 a 336). Otra posición útil para la inserción de haptenos es la zona hidrófoba (que abarca aproximadamente las posiciones de los aminoácidos 264 a 293). En la presente invención se demuestra que esta zona se puede eliminar sin afectar la reactividad de la proteína E1 eliminada con antisueros. Por lo tanto, los haptenos se pueden insertar en el sitio de la
eliminación.
Las composiciones inmunógenas se administran convencionalmente por vía parenteral, típicamente mediante inyección, por vía subcutánea o intramuscular, por ejemplo. Otras formulaciones adecuadas por otros procedimientos de administración comprenden las formulaciones orales y los supositorios. El tratamiento a dosis puede ser un programa de una sola dosis o un programa de dosis múltiple. La vacuna se puede administrar junto con otros agentes inmunoregulatorios.
La presente invención se refiere además a una composición que comprende péptidos o polipéptidos según se describió anteriormente, para la detección in vitro de anticuerpos de HCV presentes en una muestra biológica.
La presente invención se refiere además a la utilización de una composición según se describió anteriormente para la preparación de un equipo de inmunoanálisis para la detección de anticuerpos del HCV presentes en una muestra biológica.
La presente invención se refiere además a un procedimiento para el diagnóstico in vitro de anticuerpos del HCV presentes en una muestra biológica, que comprende por lo menos las siguientes etapas:
(i)
puesta en contacto de dicha muestra biológica con una composición que comprende cualesquiera de los péptidos o proteínas de la envoltura, como se definió anteriormente, preferentemente en una forma inmovilizada en condiciones apropiadas que permitan la formación de un inmunocomplejo, en el que dicho péptido o proteína puede ser un péptido o una proteína biotinilados que está unido covalentemente a un sustrato sólido mediante complejos de estreptavidina o de avidina.
(ii)
separación de los compuestos no unidos
(iii)
incubación de inmunocomplejos formados con anticuerpos heterólogos, con dichos anticuerpos heterólogos que se han conjugado en un marcador detectable en condiciones apropiadas,
(iv)
detección de la presencia de dichos inmunocomplejos visualmente o mecánicamente (p. ej. mediante densitometría, fluorimetría o colorimetría).
Por otra parte, la presente invención también se refiere a los formatos de inmunoanálisis de competencia en los que la proteína E1 y/o E2 y/o E1/E2 oligomérica individual o específica producida recombinantemente, proteínas como las expuestas anteriormente se utilizan en combinación con péptidos E1 y/o E2 para competir con los anticuerpos presentes en una muestra biológica.
La presente invención se refiere además a un equipo para la determinación de la presencia de anticuerpos del HCV, en una muestra biológica, que comprende:
-
una composición de péptido o proteína, por lo menos, como se determinó anteriormente, si es posible en combinación con otros polipéptidos o péptidos del HCV u otros tipos del HCV, estando dichos péptidos o proteínas preferentemente inmovilizados sobre un sustrato sólido, más preferentemente en distintos micropocillos de la misma placa ELISA, y aún más preferentemente en una y la misma tira de membrana,
-
un tampón o componentes necesarios para la producción de un tampón que permita la reacción de unión entre estos polipéptidos o péptidos y los anticuerpos contra el HCV presente en la muestra biológica,
-
medios para detectar los inmunocomplejos formados en la reacción de unión anterior,
-
si es posible comprendiendo además la detección automatizada y el dispositivo de interpretación para la deducción de los genotipos del HCV presentes en la muestra del modelo de unión observado.
Los procedimientos de inmunoanálisis según la presente invención utiliza antígenos oligoméricos individuales o específicos de los dominios de E1 y/o E2 que conservan epítopos lineales (en el caso de péptidos) o conformacionales (proteínas oligoméricas individuales o específicas) reconocidas por anticuerpos en los sueros de individuos infectados por el HCV. Está dentro del alcance de la invención utilizar, por ejemplo, antígenos oligoméricos individuales o específicos, antígeno dímeros, así como combinaciones de antígenos oligoméricos individuales o específicos. Los antígenos E1 y E2 del HCV de la presente invención se pueden emplear prácticamente en cualquier formato de análisis que emplee un antígeno conocido para detectar anticuerpos. Desde luego, se debería evitar o adaptar un formato que desnaturalice el epítopo conformacional del HCV. Una característica común de todos estos análisis es que el antígeno entra en contacto con el componente corporal susceptible de contener anticuerpos del HCV en condiciones que permiten al antígeno unirse a dicho cualquier anticuerpo presente en el componente. Dichas condiciones serán típicamente la temperatura fisiológica, el pH y la fuerza iónica utilizando un exceso de antígeno. La incubación del antígeno con la muestra se sigue mediante la identificación de los inmunocomplejos comprendidos en el antígeno.
El diseño del inmunoanálisis está sometido a una gran cantidad de variación, y se conocen muchos formatos en la materia. Los protocolos pueden utilizar, por ejemplo, soportes sólidos o inmunoprecipitación. La mayoría de los análisis implican la utilización de anticuerpos o polipéptidos marcados; los marcadores pueden ser, por ejemplo, moléculas enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o coloreadas. Los análisis que amplifican las señales del inmunocomplejo son así mismo conocidas; ejemplos de las cuales son los análisis que utilizan biotina y avidina o estreptavidina e inmunoanálisis con enzima marcada y mediada, tal como el análisis ELISA.
El inmunoanálisis puede estar, sin limitación, en un formato heterogéneo u homogéneo, y ser de tipo estándar o de competencia. En un formato heterogéneo, está unido típicamente a una matriz o soporte sólido para facilitar la separación de la muestra del polipéptido después de la incubación. Ejemplos de soportes sólidos que se pueden utilizar son la nitrocelulosa (p. ej., en forma de membrana o pocillo de microvaloración), cloruro de polivinilo (p. ej., en láminas o pocillos de microvaloración), látex de poliestireno (p. ej., en lechos o placas de microvaloración, fluoruro de polivinilidina (conocido como Immunolon^{TM}), papel diazotizado, membranas de nylon, lechos activados y lechos de Proteína A. Por ejemplo, placas de microvalorador Dynatech Immunolon^{TM} 1 o Immunolon^{TM} 2 o lechos de poliestireno de 0,25 pulg. (Precision Plastic Ball) se pueden utilizar en un formato heterogéneo. El soporte sólido que contiene los polipéptidos antigénicos se lava de forma típica después de separarlo de la muestra de prueba y antes de la detección de los anticuerpos unidos. Ambos formatos, estándar y de competencia, son conocidos en la materia.
En un formato homogéneo, la muestra de prueba se incuba con la combinación de los antígenos en solución. Por ejemplo, puede estar en condiciones que precipite cualesquiera de los complejos antígeno-anticuerpo que se forman. Ambos formatos, estándar y de competencia, son conocidos en la materia para estos análisis.
En un formato estándar, se controla directamente la cantidad de anticuerpos de HCV en los complejos antígeno-anticuerpo. Esto se puede llevar a cabo determinando si se unen los anticuerpos con marcador antixenogénico (p. ej. anti-humano) que reconocen un epítopo en los anticuerpos anti-HCV, debido a la formación del complejo. En un formato de competencia, la cantidad de anticuerpos de HCV en la muestra se deduce mediante seguimiento del efecto de la competencia sobre el ligante de una cantidad conocida de anticuerpo marcado (u otro ligando de competencia) en el complejo.
Los complejos formados que comprenden el anticuerpo anti-HCV (o en el caso de análisis de competencia, la cantidad de anticuerpo de competencia) se detectan por cualquiera de las numerosas técnicas conocidas, que dependen del formato. Por ejemplo, se pueden detectar anticuerpos del HCV no marcados en el complejo utilizando un conjugado de Ig antixenogénica acomplejado con un marcador (p. ej. un marcador de enzima).
En el formato del análisis de inmunoprecipitación o de aglutinación la reacción entre los antígenos del HCV y los anticuerpos forman una red que precipita en la solución o suspensión y forma una capa visible o película de precipitado. Si ningún anticuerpo anti-HCV está presente en la muestra de prueba, no se forma ningún precipitado visible.
Existen actualmente tres tipos de específicos de análisis de aglutinación de partículas (PA). Estos análisis se utilizan para la detección de anticuerpos en diversos antígenos cuando recubren a un soporte. Un tipo de este análisis es el análisis de hemaglutinación que utiliza glóbulos rojos (RBCs) que se sensibilizan adsorbiendo pasivamente el antígeno (o anticuerpo) en el RBC. La adición de anticuerpos específicos de antígeno presente en el componente corporal, si existe, produce el recubrimiento de los RBCs con el antígeno purificado para aglutinar.
Para eliminar las reacciones potenciales no especificas en el análisis de hemoaglutinación, se pueden utilizar dos excipientes artificiales en lugar de RBC en la PA. Las más corrientes de estas partículas son las de látex. Sin embargo, las partículas de gelatina también se pueden utilizar. Los análisis que utilizan cualquiera de estos excipientes se basan en la aglutinación pasiva de las partículas recubiertas con antígenos purificados.
Los antígenos de E1 y/o E2 y/o E1/E2 oligoméricos individuales o específicos del HCV de la presente invención comprendidos en epítopos conformacionales se empaquetarán típicamente en forma de un equipo para utilización en este inmunoanálisis. El equipo contendrá normalmente en compartimentos separados el antígeno del HCV natural, formulaciones del anticuerpo de control (positivo y/o negativo), anticuerpo marcado cuando el formato de análisis requiere el mismo y los reactivos que generan la señal (p. ej. sustrato de enzima) si el marcador no genera una señal directamente. El antígeno del HCV natural puede estar ya unido a una matriz sólida o por reactivos para la unión a la matriz. Las instrucciones (p. ej. escritas, cinta magnetofónica, CD-ROM, etc.) para realizar el análisis se incluirán generalmente en el equipo.
Los inmunoanálisis que utilizan el antígeno del HCV natural son útiles en la identificación de la sangre para la preparación de una irrigación a partir de la cual falta el HCV infeccioso. El procedimiento para la preparación del riego sanguíneo comprende las siguientes etapas. La reacción de un componente del anticuerpo, preferentemente sangre o un componente de sangre, del individuo donador de sangre con proteínas E1 y/o E2 de la presente invención para permitir una reacción inmunológica entre anticuerpos del HCV, si existen, y el antígeno del HCV. Al detectar si los complejos anticuerpo del anti-HCV-antígeno del HCV se forman como resultado de la reacción. La sangre que contribuye al riego sanguíneo es de donantes que no presentan anticuerpos en los antígenos del HCV natural, E1 ó E2.
En los casos de una reactividad positiva para el antígeno del HCV, es preferible repetir el inmunoanálisis para reducir la posibilidad de falsos positivos. Por ejemplo, en la identificación a gran escala de sangre para la producción de productos sanguíneos (p. ej. transfusión de sangre, plasma, Factor VIII, inmunoglobulina, etc.) las pruebas "de identificación" están formateadas típicamente para aumentar la sensibilidad (para asegurar que no pasa la sangre contaminada) a expensas de la especificidad; es decir, aumenta la cantidad de falsos positivos. De este modo, es típico aplazar solamente para la prueba adicional a aquellos donantes que son "reactivos repetidamente"; es decir, positivos en dos o más ensayos de inmunoanálisis en la muestra del donante. Sin embargo, para confirmación del positivo del HCV, las pruebas de "confirmación" se formatean típicamente para aumentar la especificidad (para asegurar que ninguna muestra de falso positivo se confirma) a expensas de la sensibilidad. Por consiguiente, el procedimiento de purificación descrito en la presente invención para E1 y E2 será muy ventajoso por incluir las proteínas de la envoltura oligoméricas individuales o específicas en los análisis de diagnóstico del HCV.
La fase sólida seleccionada puede comprender lechos poliméricos o de vidrio, nitrocelulosa, micropartículas, micropocillos de plato de reacción, tubos de ensayo y lechos magnéticos. El compuesto que genera la señal puede comprender una enzina, un compuesto luminiscente, un cromógeno, un elemento radioactivo y un compuesto quimioluminiscente. Ejemplos de enzimas comprenden la fosfatasa alcalina, peroxidasa del rábano picante y la beta-galactosidasa. Ejemplos de compuestos intensificadores comprenden biotina, antibiotina y avidina. Ejemplos de compuestos intensificadores que unen componentes comprenden biotina, antibiotina y avidina. Para bloquear los efectos de las sustancias del pseudo-factor reumatoide, la muestra de la prueba se somete a las condiciones suficientes para bloquear el efecto de de las sustancias del pseudo-factor reumatoide. Estas condiciones comprenden el poner en contacto la muestra de la prueba con 8 cantidades de IgG antihumana para formar una mezcla, e incubando la mezcla durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar un producto de mezcla de reacción sustancialmente exento de la sustancia del pseudo-factor reumatoide.
La presente invención contempla además la utilización de proteínas E1, o partes de ellas, más particularmente proteínas E1 oligoméricas individuales o específicas como se definieron anteriormente, para control in vitro de la enfermedad por HCV o para pronóstico de la respuesta al tratamiento (por ejemplo con interferón) de pacientes que sufren infección por HCV que comprende:
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la incubación de una muestra biológica de un paciente con infección por hepatitis C con una proteína E1 o una parte adecuada de ésta, en condiciones que permiten la formación de un complejo inmunológico,
-
la separación de los componentes no ligados,
-
el cálculo de los valores anti-E1 presentes en dicha muestra (por ejemplo al inicio de o durante el curso de la terapia (de interferón)),
-
seguimiento del curso natural de la enfermedad por HCV, o el pronóstico de la respuesta al tratamiento de dicho paciente sobre la base de la cantidad de valores anti-E1 hallados en dicha muestra al inicio del tratamiento o durante el curso del tratamiento.
Los pacientes que presentan una disminución de 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, o preferentemente más de 20 veces de los valores anti-E1 iniciales se podría concluir que responden a largo plazo, en continuo a la terapia para HCV, más particularmente a la terapia para interferón. En la sección de Ejemplos se ilustra, que un análisis de anti-E1 puede ser muy útil para pronosticar a largo plazo la respuesta al tratamiento de IFN o al tratamiento de la enfermedad del virus de la hepatitis C, en general.
La presente invención también se refiere a un equipo para seguimiento de la enfermedad por HCV o para pronosticar la respuesta al tratamiento (por ejemplo para interferón) de pacientes que sufren de infección por HCV que comprende:
-
por lo menos una proteína E1, más particularmente una proteína E1 como se definió anteriormente,
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un tampón o los componentes necesarios para producir el tampón capaz de la reacción de enlace entre estas proteínas o péptidos y los anticuerpos anti-E1 presentes en la muestra biológica,
-
medios para detectar los inmunocomplejos formados en la reacción de enlace anterior,
-
si es posible además un mecanismo de detección e interpretación automatizado para deducir una disminución de valores anti-E1 durante la evolución del tratamiento.
Se debe comprender también que la proteína E2 según la presente invención se puede utilizar en cierto grado para controlar/diagnosticar el tratamiento del HCV, como se indicó anteriormente para las proteína E1, debido a que además disminuyen los niveles de anti-E2 en comparación con los anticuerpos para los demás antígenos de HCV. Se debe comprender, sin embargo, que debe ser posible determinar ciertos epítopos en la zona E2 que serían además adecuados para la utilización en una prueba de control/pronóstico de la enfermedad por HCV. La presente invención se refiere además a una prueba de serotipia para la detección de uno o más tipos serológicos del presente HCV en una muestra biológica, más particularmente para la detección de anticuerpos de diferentes tipos de HCV a detectar, combinados en un formato de análisis, que comprende por lo menos las etapas siguientes:
(i)
puesta en contacto de la muestra biológica para analizar la presencia de uno o más tipos serológicos, con por lo menos una de las composiciones de proteína E1 y/o E2 y/o E1/E2 preferentemente en forma inmovilizada en condiciones apropiadas que permitan la formación de un inmunocomplejo,
(ii)
separación de los compuestos no unidos,
(iii)
incubación de inmunocomplejos formados con anticuerpos heterólogos, estando dichos anticuerpos heterólogos conjugados en un marcador detectable en condiciones apropiadas,
(iv)
detección de la presencia de dichos inmunocomplejos visualmente o mecánicamente (p. ej. mediante densitometría, fluorimetría, colorimetría) y deduciendo la presencia de uno o más tipos serológicos de HCV presentes del modelo de enlace observado.
Se ha de entender que las composiciones de proteínas o de péptidos utilizadas en este procedimiento son proteínas de la envoltura de tipo específico expresadas recombinantemente o péptidos de tipo específico.
La presente invención además se refiere a un equipo para serotipar uno o más tipos serológicos del presente HCV en una muestra biológica, más particularmente para identificar los anticuerpos para estos tipos serológicos del HCV que comprenden:
-
por lo menos una proteína de E1 y/o E2 y/o E1/E2, como se definió anteriormente,
-
un tampón o los componentes necesarios para producir el tampón que permita la reacción de enlace entre estas proteínas o péptidos y los anticuerpos anti-E1 presentes en una muestra biológica,
-
medios para la detección del inmunocomplejo formado en la reacción de enlace anterior,
-
si es posible además un mecanismo de interpretación y detección automatizado para detectar la presencia de uno o más tipos serológicos presentes a partir del modelo de enlace observado.
La presente invención también se refiere a la utilización de una composición de péptido o proteína como se definió anteriormente, para la inmovilización en un sustrato sólido e incorporación en el análisis de hibridación en fase inversa, preferentemente para inmovilización como líneas paralelas sobre soporte sólido tal como una tira de membrana, para determinar la presencia o el genotipo del HCV según un procedimiento definido anteriormente. La combinación con otros antígenos de tipo específico de otras zonas de poliproteína del HCV se encuentra también dentro del alcance de la presente invención.
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Leyendas de las figuras y de las tablas
Figura 1:
Mapa de restricción del plásmido pgpt ATA 18
Figura 2:
Mapa de restricción del plásmido pgs ATA 18
Figura 3:
Mapa de restricción del plásmido pMS 66
Figura 4:
Mapa de restricción del plásmido pv HCV-11A
Figura 5:
Niveles de anti-E1 en pacientes que no responden al tratamiento con IFN
Figura 6:
Niveles de anti-E1 en pacientes que responden al tratamiento con IFN
Figura 7:
Niveles de anti-E1 en pacientes con respuesta completa al tratamiento con IFN
Figura 8:
Niveles de anti-E1 en pacientes con respuesta incompleta al tratamiento con IFN
Figura 9:
Niveles de anti-E2 en pacientes que no responden al tratamiento con IFN
Figura 10:
Niveles de anti-E2 en pacientes que responden al tratamiento con IFN
Figura 11:
Niveles de anti-E2 en pacientes que responden parcialmente al tratamiento con IFN
Figura 12:
Niveles de anti-E2 en pacientes que responden totalmente al tratamiento con IFN
Figura 13:
Reactividad de anti-E1 humana en competencia con péptidos
Figura 14:
Reactividad de competencia de los anticuerpos de anti-E1 monoclonales con péptidos
Figura 15:
Niveles de anti-E1 (epítopo 1) en los pacientes que no responden al tratamiento con IFN
Figura 16:
Niveles de anti-E1 (epítopo 1) en los pacientes que responden al tratamiento con IFN
Figura 17:
Niveles de anti-E1 (epítopo 2) en los pacientes que no responden al tratamiento con IFN
Figura 18:
Niveles de anti-E1 (epítopo 2) en los pacientes que responden al tratamiento con IFN
Figura 19:
Competencia de reactividad de anticuerpos monoclonales de anti-E2 con péptidos
Figura 20:
Reactividad del anti-E2 humana en competencia con péptidos
Figura 21:
Secuencias del ácido nucleico de la presente invención. Las secuencias del ácido nucleico que codifican una proteína E1 o E2 según la presente invención se pueden traducir (SEC ID nº 3 al 13, 21 al 31, 35 y 41 al 49 se traducen en un marco de lectura que se inicia en el residuo número 1, SEC ID n^{os} 37 al 39 se traducen en un marco de lectura que se inicia en el residuo número 2), en las secuencias de aminoácidos de las respectivas proteínas E1 o E2 como se muestra en el listado de secuencias.
Figura 22:
Resultados de ELISA obtenidos a partir de fracciones eluídas de cromatografía de lentil lectina de 4 purificaciones de E1 diferentes de lisados de células infectadas con vvHCV39 (tipo 1b), vvHCV40 (tipo 1b), vvHCV62 (tipo 3a) y vvHCV63 (tipo 5a).
Figura 23:
Perfiles de elución obtenidos a partir de la cromatografía de lentil lectina de 4 construcciones diferentes de E1 sobre la base de los valores como se muestra en la Figura 22.
Figura 24:
Resultados de ELISA obtenidos a partir de fracciones después de la cromatografía de filtración en gel de 4 purificaciones diferentes de E1 de lisados de células infectadas con vvHCV39 (tipo 1b), vvHCV40 (tipo 1b), vvHCV62 (tipo 3a) y vvHCV63 (tipo 5a).
Figura 25:
Perfiles obtenidos a partir de purificaciones de proteínas de E1 del tipo 1b (1), tipo 3a (2) y tipo 5a (3) (a partir de células de RK13 infectadas con vvHCV39, vvHCV62 y vvHCV63, respectivamente; purificadas en lentil lectina y reducidas como en el ejemplo 5.2 - 5.3) y un estándar (4). Los picos indicados con "1", "2" y "3", representan los picos de la proteína E1 pura (véase la Figura 24, reactividad de E1 principalmente en las fracciones 26 a la 30).
Figura 26:
Mancha de la plata de una SDS-PAGE según se describió en el ejemplo 4 de un lisado en bruto de vvHCV40 (tipo 1b) de E1 (entrada 1), grupo 1 de la filtración en gel de vvHCV40 que representan las fracciones 10 a 17 como se muestra en la Figura 25 (entrada 2), grupo 2 de la filtración en gel de vvHCV40 que representan las fracciones 18 a 25 como se muestra en la Figura 25 (entrada 3) y grupo de E1 (fracciones 26 a 30) (entrada 4).
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Figura 27:
Mancha de fosfatasa alcalina de estreptavidina de las fracciones de la filtración en gel de las construcciones 39 de E1 (tipo 1b) y 62 (tipo 3a). Las proteínas fueron marcadas con NEM-biotina. Entrada 1: inicio de la construcción 39 de la filtración en gel, entrada 2: construcción 29 de la fracción 26, entrada 3: construcción 39 de la fracción 27, entrada 4: construcción 39 de la fracción 28, entrada 5: construcción 39 de la fracción 29, entrada 6: construcción 39 de la fracción 30, entrada 7: construcción 39 de la fracción 31, entrada 8: registro de peso molecular, entrada 9: inicio de la construcción 62 de la filtración en gel, entrada 10: construcción 62 de la fracción 26, entrada 11: construcción 62 de la fracción 27, entrada 12: construcción 62 de la fracción 28, entrada 13: construcción 62 de la fracción 29, entrada 14: construcción 62 de la fracción 30 y entrada 15: construcción 62 de la fracción 31.
Figura 28:
Mancha de la plata de un gel SDS-PAGE de las fracciones de filtración en gel de vvHCV-39 (E1s, tipo 1b) y vvHCV-62 (E1s, tipo 3a) realizada en idénticas condiciones que en la Figura 26. Entrada 1: inicio de la construcción 39 de la filtración en gel, entrada 2: construcción 39 de la fracción 26, entrada 3: construcción 39 de la fracción 27, entrada 4: construcción 39 de la fracción 28, entrada 5: construcción 39 de la fracción 29, entrada 6: construcción 39 de la fracción 30, entrada 7: construcción 39 de la fracción 31, entrada 8: registro de peso molecular, entrada 9: inicio de la construcción 62 de la filtración en gel, entrada 10 construcción 62 de la fracción 26, entrada 11: construcción 62 de la fracción 27, entrada 12: construcción 62 de la fracción 28, entrada 13: construcción 62 de la fracción 29, entrada 14: construcción 62 de la fracción 30 y entrada 15: construcción 62 de la fracción 31.
Figura 29:
Análisis de transferencia Western con anticuerpo 5E1A10 monoclonal de ratón de anti-E1 que da una panorámica completa del procedimiento de purificación. Entrada 1: lisado en bruto, Entrada 2: flujo a través de cromatografía en lentil, Entrada 3: lavado con Empigen BB después de cromatografía en lentil, entrada 4: eluido de cromatografía de lentil, entrada 5: flujo a través de y durante la concentración del eluido de lentil, entrada 6: Grupo de E1 después de la cromatografía de exclusión de tamaño (filtración en gel).
Figura 30:
Perfil OD_{280} (línea continua) de la cromatografía en lentil lectina de la proteína E2 de las células RK13 infectadas con vvHCV44. La línea de puntos representa la reactividad de E2 detectada mediante ELISA (como en el ejemplo 6).
Figura 31A:
Perfil OD_{280} (línea continua) de la cromatografía de filtración en gel en lentil lectina del grupo de la proteína E2 de las células RK13 infectadas con vvHCV44 en que el grupo E2 se aplica inmediatamente en la columna de filtración en gel (condiciones no reductoras). La línea de puntos representa la reactividad de E2 detectada mediante ELISA (como en el ejemplo 6).
Figura 31B:
Perfil OD_{280} (línea continua) de la cromatografía de filtración en gel en lentil lectina del grupo de la proteína E2 de las células RK13 infectadas con vvHCV44 en que el grupo E2 se redujo y se bloqueó según el ejemplo 5.3 (condiciones reductoras). La línea de puntos representa la reactividad de E2 detectada mediante ELISA (como en el ejemplo 6).
Figura 32:
Cromatografía de Ni^{2+}-IMAC y reactividad ELISA de la proteína E2 expresada a partir de vvHCV44 después de la filtración en gel en condiciones reductoras como se muestra en la Figura 31B.
Figura 33:
Mancha de la plata de un SDS-PAGE de 0,5 \mug proteína E2 purificada recuperada mediante la etapa de elución de imidazol 200 mM (entrada 2) y lavado con imidazol 30 mM (entrada 1) de la cromatografía de Ni^{2+}-IMAC según se muestra en la Figura 32.
Figura 34:
Perfiles OD de una etapa de desalado de la proteína E2 purificada, recuperada mediante imidazol 200 mM según se muestra en la Figura 33, destinada a separar el imidazol.
Figura 35A:
Niveles de anticuerpo para los diferentes antígenos de HCV (Núcleo 1, Núcleo 2, E2HCVR, NS3) para NR y LTR seguidos durante el tratamiento y a lo largo de un periodo de 6 a 12 meses después del tratamiento determinados mediante el procedimiento LIAscan. Los valores medios se indican mediante las curvas con los cuadrados en blanco.
Figura 35B:
Niveles de anticuerpo para los diferentes antígenos de HCV (NS4, NS5, E1 y E2) para NR y LTR seguidos durante el tratamiento y a lo largo de un periodo de 6 a 12 meses después del tratamiento determinados mediante el procedimiento LIAscan. Los valores medios se indican mediante las curvas con los cuadrados en blanco.
Figura 36:
Niveles medios de anticuerpo E1 (E1Ab) y anticuerpo E2 (E2Ab) en los grupos LTR y NR.
Figura 37:
Niveles medios de anticuerpo E1 (E1Ab) para los pacientes que no responden (NR) y los que responden a largo plazo (LTR) para el tipo 1b y el tipo 3a.
Figura 38:
Posiciones de mapa relativas de los anticuerpos monoclonales anti-E2.
Figura 39:
Desglucosilación parcial de la proteína E1 de la envoltura del HCV. Lisados de las células RK13 infectadas por vvHCV10A se incubaron con diferentes concentraciones de glucosidasas según las instrucciones del fabricante. Panel derecho: Glicopeptidasa F (PNGasa F). Panel izquierdo: Endoglucosidasa H (Endo H).
Figura 40:
Desglucosilación parcial de las proteínas E2 de la envoltura del HCV. Los lisados de (E2) infectado por vvHCV64A y de las células RK13 (E2s) infectado por vvHCV41, se incubaron con diferentes concentraciones de Glucopeptidasa F (PNGasa F) según las instrucciones del fabricante.
Figura 41:
Mutagénesis in vitro de la glucoproteína E1 del HCV. Mapa de las secuencias mutadas y creación de nuevos sitios de restricción.
Figura 42A:
Mutagénesis in vitro de la glucoproteína E1 del HCV (parte 1). Primera etapa de amplificación de PCR.
Figura 42B:
Mutagénesis in vitro de la glucoproteína E1 del HCV (parte 2). Extensión del solapamiento y PCR anidado.
Figura 43:
Mutagénesis in vitro de las glucoproteínas E1 del HCV. Mapa de fragmentos mutados de PCR (GLY-nº y OVR-nº) sintetizados durante la primera etapa de amplificación.
Figura 44A:
Análisis de mutantes de la glucoproteína E1 mediante transferencia Western expresada en células HeLa (izquierda) y RK13 (derecha). Entrada 1: VV tipo natural (virus de vacuna), Entrada 2: proteína E1 original (vvHCV-10A), Entrada 3: Gly-1 mutante de E1 (vvHCV-81), Entrada 4: Gly-2 mutante de E1 (vvHCV-82), Entrada 5: Gly-3 mutante de E1 (vvHCV-83), Entrada 6: Gly-4 mutante de E1 (vvHCV-84), Entrada 7: Gly-5 mutante de E1 (vvHCV-85), Entrada 8: Gly-6 mutante de E1 (vvHCV-86).
Figura 44B:
Análisis de virus de vacuna mutante de glucosilación de E1 mediante amplificación/restricción de PCR. Entrada 1: E1 (vvHCV-10A), BspE I, Entrada 2: E1.GLY-1 (vvHCV-81), BspE I, Entrada 4: E1 (vvHCV-10A), Sac I, Entrada 5: E1.GLY-2 (vvHCV-82), Sac I, Entrada 7: E1 (vvHCV-10A), Sac I, Entrada 8: E1.GLY-3 (vvHCV-83), Sac I, Entrada 10: E1 (vvHCV-10A), Stu I, Entrada 11: E1.GLY-4 (vvHCV-84), Stu I, Entrada 13: E1 (vvHCV-10A), Sma I, Entrada 14: E1.GLY-5 (vvHCV-85), Sma I, Entrada 16: E1 (vvHCV-10A), Stu I, Entrada 17: E1.GLY-6 (vvHCV-86), Stu I, Entrada 3-6-9-12-15: Registro del peso molecular inferior, pBluescript SK+, Msp I.
Figura 45:
Electroforesis en gel de poliacrilamida de SDS de E2 recombinante expresada en S. cerevisae. Los inóculos se desarrollaron en medio selectivo de leucina durante 72 hrs y se diluyeron a 1/15 en un medio completo. Después de 10 días de cultivo a 28ºC, se tomaron muestras del medio. El equivalente de 200 \mul de cultivo sobrenadante, concentrado mediante speedvac, se cargó en el gel. Se analizaron dos transformantes independientes.
Figura 46:
Electroforesis en gel de poliacrilamida de SDS de E2 recombinante expresada en una glucosilación del mutante S. cerevisae deficiente. Los inóculos se desarrollaron en medio selectivo de leucina durante 72 hrs y se diluyeron a 1/15 en un medio completo. Después de 10 días de cultivo a 28ºC, se tomaron muestras del medio. El equivalente de 350 \mul de cultivo sobrenadante, concentrado mediante cromatografía de intercambio iónico, se cargó en el gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla 1:
Características de los clones y cebadores respectivos utilizados para amplificación en la construcción de diferentes formas de la proteína E1 como se dijo anteriormente en el Ejemplo 1.
Tabla 2:
Sumario de pruebas de anti-E1.
Tabla 3:
Péptidos sintéticos para estudios de competencia.
Tabla 4:
Cambios de niveles del anticuerpo de la envoltura a lo largo del tiempo.
Tabla 5:
Diferencia entre LTR y NR.
Tabla 6:
Experimentos de competencia entre anticuerpos monoclonales murinos de E2.
Tabla 7:
Cebadores para la construcción de mutantes de glucosilación de E1.
Tabla 8:
Análisis de mutantes de glucosilación de E1 mediante ELISA.
Ejemplo 1 Clonación y expresión de la proteína E1 del virus de la hepatitis C 1. Construcción de vectores de recombinación de virus de vacuna
El plásmido de recombinación de la vacuna pgptATA18 es una versión modificada de pATA18 (Stunnenberg y otros, 1988) con una inserción adicional que contiene el gen de xantina guanina fosforribosil-transferasa de E. coli bajo control del iniciador intermedio del virus 13 de la vacuna (Figura 1). El plásmido pgsATA18 se construyó insertando un conector de oligonucleótido con SEC ID nº 1/94, que contiene codones de terminación en los tres marcos de lectura, en el vector Pst I y en el Hindlll-cut pATA18. Esto creó un sitio de restricción extra Pac I (Figura 2). El sitio original Hindlll no fue restaurado.
Conector de oligonucleótido con SEC ID nº 1/94:
1000
Para facilitar la purificación rápida y eficiente mediante quelación de Ni^{2+} de tramos de histidina mecanizada fusionada a las proteínas recombinantes, se diseñó el vector pMS66 de recombinación de la vacuna para expresar proteínas segregadas con un marcador de histidina carboxi-terminal adicional. Un conector de oligonucleótido con SEC ID nº 2/95 que contiene sitios únicos para 3 enzimas de restricción que generan terminales cerradas (Sma I, Stu I y Pml I/Bbr PI) se sintetizó de tal modo que el extremo carboxi-terminal de cualquier cADN se insertaría en la estructura con una secuencia que codifica el sitio de escisión del factor de proteasa Xa seguido por una secuencia de nucleótido que codifica 6 histidinas y 2 codones de terminación (un nuevo sitio de restricción Pac I se creó también corriente abajo del extremo 3'). Este oligonucleótido con SEC ID nº 2/95 se introdujo entre los sitios Xma I y Pst I de pgptATA18 (Figura 3).
Conector de oligonucleótido con SEC ID nº 2/95:
1001
Ejemplo 2 Construcción de plásmidos recombinantes del HCV 2.1. Construcciones que codifican diferentes formas de la proteína E1
Los productos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) procedían de muestras de suero mediante preparación de ARN y posterior transcripción inversa y PCR descrita anteriormente (Stuyver y otros, 1993b). La Tabla 1 muestra las características de los clones y los cebadores respectivos utilizados para la amplificación. Los fragmentos de PCR se clonaron en los plásmidos pSP72 del corte Sma I (Promega). Los clones siguientes se seleccionaron para inserción en los vectores de recombinación de la vacuna: HCCI9A (SEC ID nº 3), HCCI10A (SEC ID nº 5), HCCI11A (SEC ID nº 7), HCCI12A (SEC ID nº 9), HCCI13A (SEC ID nº 11) y HCCI17A (SEC ID nº 13) descritos en la Figura 21. Los fragmentos de cADN que contienen las zonas de codificación de E1 se escindieron mediante restricción de EcoRI y HindIII de los plásmidos pSP72 respectivos y se insertaron en el vector de recombinación de la vacuna pgptATA-18 del corte EcoRI/HindIII (descrito en el ejemplo 1), corriente abajo del iniciador último del virus de la viruela 11 K. Los plásmidos respectivos se denominaron pvHCV-9A, pvHCV-10A, pvHCV-11A, pvHCV-12A, pvHCV-13A y pvHCV-17A, de los que pvHCV-11A, se muestra en la Figura 4.
2.2 Mutantes de eliminación de E1 de la zona hidrófoba
El clon HCCI37 que contiene una eliminación de los codones Asp264 a Val287 (nucleótidos 790 a 861, zona que codifica el dominio hidrófobo I) se generó como sigue: se generaron 2 fragmentos de la PCR a partir del clon HCCI10A con grupos de cebador HCPr52 (SEC ID nº 16)/HCPr107 (SEC ID nº 19) y HCPr108 (SEC ID nº 20)/HCPr54 (SEC ID nº 18). Estos cebadores se muestran en la Figura 21. Los dos fragmentos de PCR se purificaron a partir de gel de agarosa después de la electroforesis y se utilizó 1 ng de cada fragmento conjuntamente como plantilla para la PCR por medio de los cebadores HCPr52 (SEC ID nº 16) y HCPr54 (SEC ID nº 18). El fragmento resultante se clonó en el vector pSP72 del corte Sma I y los clones que contenían la eliminación se identificaron fácilmente debido a la eliminación de 24 codones (72 pares de bases). Se seleccionó el plásmido pSP72HCCI37 que contiene el clon HCCI37 (SEC ID 15). Se construyó un plásmido de vacuna recombinante que contenía el cADN de E1 entero, que carecía de dominio hidrófobo, insertando la secuencia del HCV que rodea la eliminación (fragmento escindido del vector pSP72-HCCI37 mediante Xma I y BamH I) en los sitios de Xma I-Bam H I del plásmido de la vacuna pvHCV-10A. El plásmido resultante se denominó pvHCV-37. Después del secuenciado confirmativo, se aisló la zona animo-terminal que contiene la sustitución interna de este vector pvHCV-37 (escisión mediante EcoR I y BstE II) y se reinsertó en el plásmido Eco RI y en el plásmido pvHCV-11A del corte Bst EII. Era de esperar que esta construcción expresara una proteína E1 con ambos dominios hidrófobos eliminados y se denominó pvHCV-38. La zona del clon HCC138 que codifica a E1 se representa mediante la SEC ID nº 23.
Ya que la zona hidrófila en el terminal carboxi de E1 (que se extiende teóricamente en torno a los aminoácidos 337 a 340) no estaba totalmente comprendida en la construcción pvHCV-38, se aisló del plásmido pvHCV-37 una zona de E1 mayor que carece de dominio I hidrófobo mediante la escisión de EcoR I/BamH I y se clonó en un vector pgsATA-18 del corte EcoR I/BamH I. El plásmido resultante se denominó pvHCV-39 y contenía el clon HCCI39 (SEC ID nº 25). El mismo fragmento se escindió del vector pvHCV-37 mediante BamH I (del que se ocuparon los extremos adhesivos con ADN Polimerasa I de Klenow (Boehringer)) y posteriormente mediante EcoR I (extremo unido a 5'). Se insertó esta secuencia en el EcoR I y en el vector pMS-66 del corte Bbr PI. Esto dio como resultado el clon HCCI40 (SEC ID nº 27) en el plásmido pvHCV-40, que contenía una cola de 6 histidina en su extremo terminal carboxi.
2.3. E1 de otros genotipos
El clon HCCI62 (SEC ID nº 29) procedía de un paciente infectado con el tipo 3a con hepatitis C crónica (suero BR36, clon BR36-9-13, SEC ID nº 19 en el documento nº WO 94/25601, y véase también Stuyver y otros 1993a) y HCCI63 (SEC ID nº 31) procedía de un niño infectado por el tipo 5a con hepatitis post-transfusión (suero BE95, clon PC-4-1, SEC ID nº 45 en el documento nº WO 94-25601).
2.4. Construcciones de E2
El fragmento 22 de la PCR de E2 del HCV se obtuvo del suero BE11 (genotipo 1 b) mediante los cebadores HCPr109 (SEC ID nº 33) y HCPr72 (SEC ID nº 34) utilizando técnicas de preparación de ARN, de transcripción inversa y de PCR, descritas por Stuyver y otros, 1993b, y se clonó el fragmento en el vector pSP72 del corte Sma I. El clon HCCI22A (SEC ID nº 35) se escindió con Nco I/AlwN I o mediante BamH I/AlwN I y se cerraron los extremos adhesivos de los fragmentos (sitios de Nco I y BamH I con ADN Polimerasa I de Klenow (Boehringer) y de AlwN I con T4 ADN polimerasa (Boehringer)). Se insertó a continuación el fragmento de cADN de BamHI/AiwNI en el vector pgsATA-18 de la vacuna que había sido linealizado por escisión de EcoR I y Hind III y cuyos extremos unidos se habían ocupado con ADN Polimerasa de Klenow (Boehringer). El plásmido resultante se denominó pvHCV-41 y codificó la zona E2 de los aminoácidos Met347 a Gln673, que comprende 37 aminoácidos (desde Met347 a Gly383) de la proteína E1 que puede servir como secuencia de señal. Se insertó el mismo cADN del HCV en el vector pMS66 del corte EcoR I y del Bbr PI, que posteriormente se había terminado cerrado con ADN Polimerasa de Klenow. El plásmido resultante se denominó pvHCV-42 y codificó además los aminoácidos 347 a 683. El fragmento NcoI/AlwNI se insertó de manera similar en los mismos sitios de los vectores de las vacunas pgsATA-18 o pMS-66 (pvHCV-43), (pvHCV-44). pvHCV-43 y pvHCV-44 codificaron los aminoácidos 364 a 673 de la poliproteína del HCV, cuyos aminoácidos 364 a 383 procedían de la zona carboxi-terminal natural de la proteína E1 que codifica la secuencia de señal para E2 y los aminoácidos 384 a 673 de la proteína E2 definitiva.
2.5. Generación de virus de vacuna de HCV recombinante
Las células RK13 del riñón de conejo (ATCC CCL 37), las líneas celulares (TK^{-}) (ATCC CRL 8303) deficientes en timidina quinasa del osteosarcoma 143B humano, HeLa (ATCC CCL 2) y Hep G2 (ATCC HB 8065) se adquirieron en la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md, USA). Las células se desarrollaron en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero fetal de ternera al 10% y con sales de Earle (EMEM) para RK13 y 143 B (TK-) y con glucosa (4 g/l) para Hep G2. La cepa WR del virus de vacuna (Western Reserve, ATTC VR 119) se propagó rutinariamente en ambas células 143B o RK13, como se describió anteriormente (Panicali & Paoletti, 1982; Piccini y otros, 1987; Mackett y otros, 1982, 1984 y 1986). Una monocapa confluente de células 143B se infectó con virus de vacuna de tipo natural en una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 0,1 (= 0,1 unidades formadoras de placa (PFU) por célula). Dos horas después, se transfectó plásmido de recombinación de vacuna a las células infectadas en forma de coprecipitado de fosfato de calcio que contenía 500 ng del ADN del plásmido para permitir la recombinación homóloga (Graham & van der Eb,1973; Mackett y otros, 1985). Los virus recombinantes que expresan la proteína de la xantina-guanina fosforribosil transferasa (gpt) de Escherichia coli se seleccionaron de las células RK13 del riñón de conejo, incubadas en el medio de selección (EMEM que contiene 25 \mug/ml de ácido micofenólico (MPA), 250 \mug/ml de xantina y 15 \mug/ml de hipoxantina; Falkner y Moss, 1988; Janknecht y otros, 1991). Se purificaron virus recombinantes individuales sobre monocapas recientes de células RK13 bajo una incrustación de agarosa al 0,9% en el medio de selección. Se seleccionaron virus recombinantes deficientes en timidina quinasa (TK) y a continuación se purificó la placa sobre monocapas recientes (TK-) de células 143B humanas en presencia de 25 \mug/ml de 5-bromo-2'-desoxiuridina. Se prepararon existencias de virus de vacuna de HCV recombinante purificada infectando células humanas 143 B o RK13 de conejo en una m.o.i. de 0,05 (Mackett y otros, 1988). Se confirmó la inserción del fragmento de cADN del HCV en los virus de vacuna recombinante en una alícuota (50 \mul) de lisado celular después de la selección de MPA por medio de PCR con los cabadores utilizados para clonar los respectivos fragmentos de HCV (véase Tabla 1). Los virus del HCV de vacuna recombinante se denominaron según el número del plásmido de recombinación de la vacuna, p. ej. el virus de la viruela recombinante vvHCV-10A que procedía de la recombinación de la cepa WR del tipo natural con el plásmido pvHCV-10A.
Ejemplo 3 Infección de células con virus de vacuna recombinante
Se infectó una monocapa confluente de células RK13 a un m.o.i. de 3 con virus de vacuna del HCV recombinante según se describió en el ejemplo 2. Para la infección, se lavó la monocapa celular dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 y las existencias de virus de vacuna recombinante se diluyeron en el medio MEM. Se añadieron doscientos \mul de solución del virus por cada 10^{6} células, de tal forma que el m.o.i. fue de 3, y se incubaron durante 45 min a 24ºC. Se aspiró la solución del virus y se añadieron 2 ml de medio de crecimiento completo (véase ejemplo 2) por cada 10^{6} células. Las células se incubaron 24 hr a 37ºC, durante las que tuvo lugar la expresión de las proteínas del HCV.
Ejemplo 4 Análisis de proteína recombinante mediante transferencia Western
Se lavaron dos veces con PBS las células infectadas, se lisaron directamente con tampón de lisis (Tris.HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, MgCl_{2} 5 mM, 1 \mug/ml de aprotinina (Sigma, Bornem, Bélgica)) o se separaron de los matraces por incubación en Tris.HCl 50 mM pH 7,5/ EDTA 10 mM/ NaCl 150 mM durante 5 min, y se recogieron por centrifugación (5 min a 1000 g). Se volvió a poner en suspensión el sedimento celular en 200 \mul de tampón de lisis (Tris.HCl 50 mM pH 8,0, EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 5 mM, aprotinina, Triton X-100 al 1%) por cada 10^{6} células. Los lisados celulares se aclararon durante 5 min a 14.000 rpm en una centrífuga Eppendorf para eliminar los desechos insolubles. Se separaron las proteínas de 20 \mul de lisado mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE). Las proteínas se electro-transfirieron a continuación del gel a una lámina de nitrocelulosa (Amersham) utilizando una unidad de transferencia HSI de Hoefer enfriada a 4ºC durante 2 hr a un voltaje constante de 100 V, en tampón de transferencia (Tris.HCl 25 mM pH 8,0, glicina 192 mM, metanol al 20% (v/v)). Los filtros de nitrocelulosa se bloquearon con Blotto (leche en polvo instantánea exenta de grasa al 5% (p/v) en PBS; Johnson y otros, 1981) y se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en Blotto/Tween 20 al 0,1%. Generalmente, un suero humano de control negativo o un suero de un paciente infectado con HCV se diluyó 200 veces y se preincubó durante 1 hora a temperatura ambiente con lisado celular infectado con virus de vacuna de tipo natural diluído 200 veces para disminuir la unión no específica. Después del lavado con Blotto/Tween 20 al 0,1%, los filtros de nitrocelulosa se incubaron con solución de sustrato de fosfatasa alcalina diluída en Blotto/Tween 20 al 0,1%. Después del lavado con Tween 20 al 0,1% en PBS se incubaron los filtros con solución de sustrato de fosfatasa alcalina (Tris.HCl 100 mM pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM, 0,38 \mug/ml de nitroblue tetrazolio, 0,165 \mugml de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato). Todas las etapas, excepto la electrotransferencia, se realizaron a temperatura ambiente.
Ejemplo 5 Purificación de proteína E1 o E2 recombinante 5.1. Lisis
Las células RK13 infectadas (que llevan construcciones de E1 o E2) se lavaron 2 veces con solución salina de fosfato tamponada (PBS) y se separaron de los recipientes de cultivo por incubación en PBS que contenía EDTA 10 mM. Las células separadas se lavaron dos veces con PBS y 1ml de tampón de lisis (Tris.HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, MgCl_{2} 5 mM, se añadió 1 \mug/ml de aprotinina (Sigma, Bornem, Bélgica) que contenía N-etilmaleimida biotinilada 2 mM (biotina-NEM) (Sigma) por cada 10^{5} celulasa 4ºC. Este lisado se homogeneizó con un douncer de tipo B y se dejó a temperatura ambiente durante 0,5 horas. Se añadieron al lisado primario otros 5 volúmenes de tampón de lisis que contenía N-etilmaleimida 10 mM (NEM, Aldrich, Bornem, Bélgica) y la mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 15 min. Los desechos celulares insolubles se aclararon en la solución por centrifugación en un rotor Beckman JA-14 a 14.000 rpm (30.100 g a r_{máx}) durante 1 hora a 4ºC.
5.2. Cromatografía en lectina
El lisado celular aclarado se cargó a un ritmo de 1 ml/min en una columna 4B de lentil-lectina sefarosa de 0,8 por 10 cm (Pharmacia) que se había equilibrado con 5 veces el volumen de la columna de tampón de lisis a una velocidad de 1 ml/min. La columna de lentil-lectina se lavó con 5 a 10 veces el volumen de la columna de tampón 1 (fosfato de potasio 0,1M, pH 7,3, KCl 500 mM, glicerol al 5%, ácido 6-NH_{2}-hexanoico 1 mM, MgCl_{2} 1 mM y decilPEG al 1% (KWANT, Bedum, Países Bajos). En algunos experimentos, se lavó posteriormente la columna con 10 volúmenes de columna de tampón 1 que contenía Empigen-BB al 0,5% (Calbiochem, San Diego, CA, USA) en lugar de decilPEG al 1%. El material combinado se eluyó aplicando el tampón de elución (fosfato de potasio 10 mM pH 7,3, glicerol al 5%, ácido hexanoico 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, Empigen-BB al 0,5% y \alpha-metil-manopiranosido 0,5M). El material eluido se fraccionó y en las fracciones se detectó la presencia de proteína E1o E2 mediante ELISA como se describe en el ejemplo 6. La Figura 22 muestra los resultados de ELISA obtenidos a partir de las fracciones del eluido de lentil letina de 4 purificaciones diferentes de E1 de lisados celulares infectados con vvHCV39 (tipo 1b), vvHCV40 (tipo 1b), vvHCV62 (tipo 3a) y vvHCV63 (tipo 5a). La Figura 23 muestra los perfiles obtenidos a partir de los valores mostrados en la Figura 22. Los resultados demuestran que la columna de afinidad de lectin se puede emplear para las proteínas de la envoltura de diferentes tipos de HCV.
5.3. Concentración y reducción parcial
Las fracciones positivas E1 ó E2 se agruparon y se concentraron en un Centricon 30 kDa (Amicon) por centrifugación durante 3 horas a 5.000 rpm en un rotor Beckman JA-20 a 4ºC. En algunos experimentos las fracciones positivas E1 ó E2 se agruparon y se concentraron mediante evaporación con nitrógeno Se concentró un equivalente de 3 \times 10^{8} células hasta aproximadamente 200 \mul. Para reducción parcial, se añadió Empigen-BB al 30% (Calbiochem, San Diego, CA, USA) a estos 200 \mul hasta una concentración final del 3,5% y posteriormente se añadió DTT 1M en H_{2}O hasta una concentración final de 1,5 a 7,5 mM y se incubó durante 30 min a 37ºC. Se añadió posteriormente NEM (1M en dimetilsulfóxido) hasta una concentración final de 50 mM y se dejó reaccionar durante otros 30 min a 37º C para bloquear los grupos sulfhidrilo libres.
5.4. Cromatografía de filtración en gel
Se equilibró una columna Superdex-200 HR 10/20 (Pharmacia) con 3 veces el volumen de la columna de PBS/
Empigen-BB al 3%. La mezcla reducida se inyectó en un bucle de muestra de 500 \mul del Smart System (Pharmacia) y se añadió tampón Empigen-BB al 3%/PBS para la filtración en gel. Se recogieron las fracciones de 250 \mul desde V_{0} a V_{t}. En las fracciones se identificó la presencia de proteína E1 ó E2 según se describe en el ejemplo 6.
La Figura 24 muestra los resultados de ELISA obtenidos a partir de fracciones obtenidas después de la cromatografía de filtración en gel de 4 purificaciones de E1 diferentes de lisados celulares infectados con vvHCV39 (tipo 1b), vvHCV40 (tipo 1b), vvHCV62 (tipo 3a) y vvHCV63 (tipo 5a). La Figura 25 muestra los perfiles obtenidos a partir de purificaciones de proteínas de E1 de los tipos 1b, 3a y 5a (de células RK13 infectadas con vvHCV39, vvHCV62 y vvHCV63, respectivamente; purificadas en lentil lectina y reducidas como en los ejemplos anteriores). Los picos indicados con "1", "2" y "3", representan proteína E1 pura (reactividad de E1 principalmente en las fracciones 26 a 30). Estos picos presentan pesos moleculares muy similares de aproximadamente 70 kDa, correspondientes a la proteína dimérica E1. Los demás picos en los tres perfiles representan virus de vacuna y/o proteínas celulares que se podrían separar de E1 sólo debido a la etapa de reducción indicada en el ejemplo 5.3. y debido a la etapa de filtración en gel posterior en presencia del detergente apropiado. Según se muestra en el grupo 1 de la Figura 26 (que representa las fracciones 10 a 17) y en el grupo 2 (que representa las fracciones 18 a 25) que contienen proteínas contaminantes no presentes en el grupo de E1 (fracciones 26 a 30). Las fracciones del pico de E1 se realizaron por SDS/PAGE y se transfirieron según se describió en el ejemplo 4. Las proteínas marcadas con NEM-biotina se identificaron mediante fosfatasa alcalina de estreptavidina como se muestra en la Figura 27. Se puede observar fácilmente que, entre otras, las proteínas contaminantes de 29 kDa y 45 kDa presentes antes de la cromatografía de filtración en gel (entrada 1) están solamente presentes a muy bajas concentraciones en las fracciones 26 a 30. La banda a aproximadamente 65 kDa representa la forma dimérica de E1 que no se podría interrumpir totalmente en la forma E1 monomérica. Resultados similares se obtuvieron para el tipo 3a de la proteína E1 (entradas 10 a 15), que muestran una movilidad más rápida en SDS/PAGE a causa de la presencia de sólo 5 hidratos de carbono en lugar de 6. La Figura 28 muestra una mancha en la plata de un gel SDS/PAGE realizada en condiciones idénticas que en la Figura 26. En la Figura 29 se da una panorámica completa del procedimiento de purificación.
La presencia de la proteína E1 purificada se confirmó además mediante transferencia Western según se describió en el ejemplo 4. La proteína dimérica E1 parece estar no-agregada y exenta de contaminantes. Se determinó la secuencia de la proteína E1 del subtipo 1b, purificada a partir de células infectadas por vvHCV40 según el esquema anterior, por el grupo amino terminal en un secuenciador 477 Perkin-Elmer y resultó que contenía una tirosina como primer residuo. Esto confirmó que la peptidasa de señal había escindido la proteína E1 en la posición correcta (entre A191 e Y192) a partir de su secuencia de señal. Esto confirma el hallazgo de Hijikata y otros (1991) de que los terminales amino de la proteína E1 definitiva comienzan en la posición 192 de aminoácido.
5.5. Purificación de la proteína E2
Se purificó la proteína E2 (aminoácidos 384 a 673) a partir de células RK13 infectadas con vvHCV44 según se indicó en los Ejemplos 5.1. a 5.4. La Figura 30 muestra el perfil OD_{280} (línea continua) de la cromatografía en lectil lectina. La línea de puntos representa la reactividad de E2 según se detecta mediante ELISA (véase Ejemplo 6). La Figura 31 muestra los mismos perfiles obtenidos a partir de la cromatografía de filtración en gel del grupo E2 de lentil-lectina (véase Figura 30), parte del cual se redujo y se bloqueó según los procedimientos expuestos en el ejemplo 5.3. y parte de los cuales se aplicó inmediatamente en la columna. Ambas partes del grupo E2 se realizaron en columnas separadas de filtración en gel. Se podría demostrar que se han realizado los agregados de las formas E2 unidos covalentemente a proteínas contaminantes si no se ha efectuado la reducción. Después de la reducción y el bloqueo se segregaron la mayoría de las proteínas contaminantes en la fracción V_{0}. Otras proteínas contaminantes copurificadas con la proteína E2, no se unieron covalentemente a la proteína E2, más aún debido a estos contaminantes se podrían eliminar en una etapa posterior. La Figura 32 muestra una etapa purificación Ni^{2+}-IMAC adicional realizada para la purificación de la proteína E2. La etapa de purificación por afinidad emplea los 6 residuos de histidina añadidos a la proteína E2 según se expresa en vvHCV44. Las proteínas contaminantes se desplazan a través de la columna o se pueden separar mediante un lavado con imidazol 30 mM. La Figura 33 muestra una SDS-PAGE de mancha de plata de 0,5 \mug de proteína E2 purificada y un lavado con imidazol 30 mM. La proteína E2 pura se puede recuperar fácilmente mediante una etapa de elución de imidazol 200 mM. La Figura 34 muestra una etapa de desalado adicional destinada a separar el imidazol y de ser capaz de entrar en contacto el tampón deseado, p. ej., PBS, tampón de carbonato, solución salina.
Los procedimientos descritos en los ejemplos 5.1 a 5.5 permiten la purificación de aproximadamente 1,3 mg de proteína E1 y 0,6 mg de proteína E2, partiendo de aproximadamente 50.000 cm^{2} de células RK13 infectadas con vvHCV-11A (o vvHCV40) para la producción de E1 o vvHCV41, vvHCV42, vvHCV43 o vvHCV44 para la producción de proteína E2.
Debería también observarse que la proteína E2 segregada (que constituye aproximadamente del 30-40%, siendo el 60-70% en forma intracelular) se caracteriza por la formación de agregado (contrario a las expectativas). El mismo problema se plantea de este modo al purificar la E2 segregada. La E2 segregada se puede purificar como se expuso anteriormente.
Ejemplo 6 ELISA para la identificación de los anticuerpos anti-E1 ó anti-E2 o para la identificación de las proteínas E1 ó E2
Se cubrieron placas de micropocillos Maxisorb (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 1 volumen (p. ej. 50 \mul ó 100 \mul ó 200 \mul) por pocillo de una solución de Estreptavidina (Boehringer Mannheim) en PBS durante 16 horas a 4ºC o durante una hora a 37ºC. Por otra parte, los pocillos se cubrieron con 1 volumen de 5 \mug/ml de aglutinina de Galanthus nivalis (GNA) en tampón de carbonato de sodio 50 mM, pH 9,6 durante 16 horas a 4ºC o durante 1 hora a 37ºC. En caso de recubrimiento con GNA, las placas se lavaron 2 veces con 400 \mul de solución de lavado del equipo Innotest HCV Ab III (Innogenetics, Zwijndrecht, Bélgica). Las superficies recubiertas no unidas se bloquearon con 1,5 a 2 volúmenes de solución de bloqueo (caseína al 0,1% y NaN_{3} al 0,1% en PBS) durante 1 hora a 37ºC o durante 16 horas a 4ºC. Se aspiró la solución de bloqueo. Se diluyó la E1 ó la E2 purificada hasta 100-1000 ng/ml (concentración medida a A = 280 nm) o se diluyeron 20 veces en solución de bloqueo las fracciones de la columna para identificar E1 ó E2 (véase ejemplo 5), o E1 ó E2 en los lisados celulares no purificados (ejemplo 5.1.), y se añadió un volumen de solución de E1 ó E2 a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a 37ºC en placas cubiertas con Estreptavidina o GNA. Se lavaron los micropocillos 3 veces con 1 volumen de solución de lavado del equipo Innotest HCV Ab III (Innogenetics, Zwijndrecht, Bélgica). Se diluyeron 20 veces las muestras de suero o se diluyeron los anticuerpos anti-E1 ó anti-E2 hasta una concentración de 20 ng/ml en diluyente de muestra del equipo Innotest HCV Ab III y se dejó reaccionar 1 volumen de la solución con la proteína E1 ó E2 durante 1 hora a 37ºC. Se lavaron 5 veces los micropocillos con 400 \mul de solución de lavado del equipo Innotest HCV Ab III (Innogenetics, Zwijndrecht, Bélgica). Se identificaron los anticuerpos unidos incubando cada pocillo durante 1 hora a 37ºC con un anticuerpo secundario conjugado de peroxidasa, IgG anti-humana de cabra o anti-ratón (DAKO, Glostrup, Dinamarca) diluido 1/80.000 en 1 volumen de diluyente del conjugado del equipo Innotest HCV Ab III (Innogenetics, Zwijndrecht, Bélgica), y se obtuvo desarrollo de color mediante adición de sustrato del equipo Innotest HCV Ab III (Innogenetics, Zwijndrecht, Bélgica) diluido 100 veces en 1 volumen de solución de sustrato del equipo Innotest HCV Ab III (Innogenetics, Zwijndrecht, Bélgica) durante 30 min a 24ºC después de lavar las placas 3 veces con 400 \mul de solución de lavado del equipo Innotest HCV Ab III (Innogenetics, Zwijndrecht, Bélgica).
Ejemplo 7 Seguimiento de grupos de pacientes con diferentes perfiles clínicos 7.1. Seguimiento de los anticuerpos anti-E1 y anti-E2
Los análisis de diagnóstico actuales del virus de la hepatitis C (HCV) se han desarrollado para la detección y confirmación de la presencia de anticuerpos de HCV. Dichos análisis no parecen proporcionar información útil para el seguimiento del tratamiento o para el pronóstico de la respuesta de la enfermedad. No obstante, como es el caso de la hepatitis B, la detección y cuantificación de anticuerpos de la anti-envoltura se puede presentar mas útil en un escenario clínico. Para investigar la posibilidad de la utilización del valor de anticuerpo anti-E1 y del valor de anticuerpo anti-E2 como marcadores de pronóstico para la respuesta de la enfermedad de hepatitis C, una serie de pacientes tratados con IFN-\alpha con respuesta mantenida a largo plazo (definidos como pacientes con niveles normales de transaminasa y prueba HCV-ARN negativa (PCR en la zona no codificada 5') en la sangre por un periodo de por lo menos un año después del tratamiento) se compararon con pacientes que no presentan respuesta o que presentan respuesta bioquímica relacionada con el fin del tratamiento.
Se comparó un grupo de 8 pacientes tratados con IFN-\alpha con respuesta mantenida a largo plazo (LTR, seguimiento de 1 a 3,5 años, 3 tipo 3a y 5 tipo 1b) con 9 pacientes que presentaban respuestas incompletas al tratamiento (NR, seguimiento de 1 a 4 años, 6 tipo 1b y 3 tipo 3a). Se expresaron las proteínas tipo 1b (vvHCV-39, véase ejemplo 2.5.) y 3a E1 (vvHCV-62, véase ejemplo 2.5.) mediante el sistema virus de vacuna (véanse los ejemplos 3 y 4) y se purificaron hasta homogeneidad (ejemplo 5). Se analizó reactividad en las muestras procedentes de pacientes infectados con virus de hepatitis C tipo 1b, con la proteína E1 purificada de tipo 1b, mientras que se analizó reactividad en las muestras de una infección de tipo 3a de anticuerpos de E1 del anti-tipo 3a por ELISA según se describió en el ejemplo 6. Se determinaron los genotipos de los virus de hepatitis C que infectan a diferentes pacientes, mediante el análisis de genotipado Inno-LiPA (Innogenetics, Zwijndrecht, Bélgica). La Figura 5 muestra el tratamiento de la señal del anti-E1. Los casos de LTR mostraron consistentemente niveles anti-E1 que disminuyen rápidamente (con resultado negativo completo en 3 casos), mientras que los niveles de anti-E1 de los casos NR permanecieron aproximadamente constantes. Algunos de los datos obtenidos de anti-E1 se muestran en la Tabla 2 como relaciones medias S/N \pm SD (valor medio de anti-E1). El valor anti-E1 se podría deducir de la relación señal a ruido como se muestra en la Figuras 5, 6, 7 y 8.
Ya al final del tratamiento, se podían observar diferencias marcadas entre los 2 grupos. Los valores del anticuerpo anti-E1 han disminuido 6,9 veces en LTR pero sólo 1,5 veces en NR. Al final del seguimiento, los valores de anti-E1 han disminuido por un factor de 22,5 en pacientes con respuesta mantenida e incluso aumentaron ligeramente en NR. Por consiguiente, basada en estos datos, la disminución de los niveles del anticuerpo anti-E1 durante el seguimiento de la terapia de IFN-\alpha se corresponde a largo plazo, con la respuesta mantenida al tratamiento. Los análisis de anti-E1 pueden ser muy útiles en general para pronósticos de la respuesta a largo plazo en el tratamiento de IFN o para el tratamiento de la enfermedad de la hepatitis C.
Este hallazgo fue inesperado. Por el contrario, los inventores habían esperado que los niveles de anticuerpo anti-E1 aumentasen durante el curso del tratamiento de IFN en pacientes con respuesta a largo plazo. Como es el caso para la hepatitis B, el virus se clarifica como consecuencia de la seroconversión para los anticuerpos anti-HBsAg. Además en muchas otras infecciones por virus, el virus se elimina cuando aumentan los anticuerpos anti-envoltura. Sin embargo, en los experimentos de la presente invención, los anticuerpos anti-E1 disminuyeron claramente en pacientes con respuesta al tratamiento a largo plazo, mientras que el nivel de anticuerpo permaneció aproximadamente al mismo nivel en pacientes sin respuesta. Aunque los resultados de estos experimentos fueron inesperados, este hallazgo no obvio puede ser muy importante y útil en el diagnóstico clínico de infecciones por HCV. Como se muestra en las Figuras 9, 10, 11 y 12, los niveles de anti-E2 se comportaron muy diferentemente en los mismos pacientes estudiados y se observó una disminución no obvia en los valores como para los anticuerpos anti-E1. La Figura 35 da una panorámica completa del estudio piloto.
Como se puede deducir de la Tabla 2, los valores de anti-E1 fueron como promedio 2 veces mayores al principio del tratamiento en los pacientes que responden a largo plazo comparados con los que responden de forma incompleta al tratamiento. Por consiguiente, la medición del valor de anticuerpos anti-E1 al comienzo del tratamiento, o el seguimiento del paciente durante el curso de la infección y la medición del valor anti-E1, puede llegar a ser un marcador útil para diagnóstico clínico de la hepatitis C. Además, puede llegar a ser deseable la utilización de zonas más definidas de las proteínas E1 ó E2, como se muestra en el ejemplo 7.3.
7.2 Análisis de anticuerpos de E1 y E2 en un estudio de cohortes mayor del paciente
El estudio piloto llevó a los inventores a concluir que, en caso, de infección estaba completamente claro que los anticuerpos para la proteínas de la envolturas del HCV cambiaron más rápidamente que los anticuerpos para los antígenos del HCV estudiados más convencionalmente, con los anticuerpos de E1 que cambian más enérgicamente. Se incluyeron por consiguiente más LTR infectados con los tipos 1b y 3a y además se complementó la cohorte con una serie igualada de NR, de tal modo que ambos grupos comprendían 14 pacientes cada uno. Se analizaron también algunos pacientes que responden parcialmente (PR) y pacientes que responden con recaída (RR).
La Figura 36 describe los niveles medios de anticuerpo de E1 (E1 Ab) y de anticuerpo de E2 (E2 Ab) en los grupos LTR y NR y las Tablas 4 y 5 muestran los análisis estadísticos. En esta cohorte mayor, los niveles de anticuerpo de E1 más altos antes de la terapia de IFN-\alpha se relacionaron con LTR (P < 0,03). Puesto que se observaron niveles de anticuerpo de E1 mucho más altos en pacientes infectados por el tipo 3a comparados con pacientes infectados por el tipo 1b (Figura 37) se tuvo en cuenta el genotipo (Tabla 4). Dentro del grupo infectado por el tipo 1b, LTR también presentaba niveles más altos de anticuerpo de E1 que NR al inicio del tratamiento [P < 0,05]; el número limitado de NR infectados por el tipo 3a no permitía el análisis estadístico.
De los niveles de anticuerpo controlados en LTR durante el periodo complementario de 1,5 años, sólo los anticuerpos de E1 se depuraron rápidamente comparados con los niveles medidos al inicio del tratamiento [P = 0,0058, final de terapia; P = 0,0047 y P = 0,0051 a los 6 y 12 meses después de la terapia, respectivamente]. Esta depuración continuó importante en el LTR infectado por el tipo 1 o por el tipo 3 (valores de P medios < 0,05). Estos datos confirmaron el hallazgo inicial de que los niveles de E1Ab disminuyen rápidamente en la fase inicial de resolución. Estas características parecen ser independientes del genotipo viral. No se observó ningún cambio en ninguno de los anticuerpos medidos en NR, PR o RR, a lo largo del periodo de seguimiento. En los pacientes que respondieron favorablemente al tratamiento con normalización de niveles de ALTHCV-ARN negativo durante el tratamiento, existía una marcada diferencia entre los que responden en continuo (LTR) y los que responden con una recaída (RR). Por el contrario LTR y RR no presentan ninguna disminución en los niveles de anticuerpo de E1, indicando la presencia de infección oculta de HCV, que ni se podría demostrar por PCR u otras técnicas clásicas para la detección de ARN del HCV, ni mediante niveles elevados de ALT. Las cantidades diminutas de ARN vírico, todavía presentes en el grupo RR durante el tratamiento, parecían ser capaces de estimulación del linfocito B anti-E1. El control de anti-E1 puede por consiguiente no ser capaz de discriminar LTR de NR, si no también de RR.
7.3 Control de los anticuerpos en zonas definidas de la proteína E1
Aunque el planteamiento biológico molecular de la identificación de los antígenos del HCV dieron como resultado el descubrimiento sin precedentes en el desarrollo de diagnósticos virales, el procedimiento de detección inmunitaria de bibliotecas \lambdagt1 1 produjo predominantemente epítopos lineales dispersados por todo el núcleo y en las zonas no estructurales, y el análisis de las zonas de la envoltura tuvieron que esperar la clonación y la expresión de la zona E1/E2 en las células de los mamíferos. Este planteamiento contrasta fuertemente con muchas otras infecciones virales, cuyos epítopos en las zonas de la envoltura habían sido ya cartografiadas mucho antes del descifrado de la estructura genómica. Dichos epítopos y anticuerpos correspondientes con frecuencia tenían actividad neutralizante útil para el desarrollo de la vacuna y/o permitían el desarrollo de análisis de diagnóstico con significado clínico o de pronóstico (p. ej. anticuerpos para el antígeno de superficie de la hepatitis B). Puesto que ninguna de las vacunas del HCV o de las pruebas que permiten el diagnóstico y el pronóstico de la enfermedad de la hepatitis C están disponibles hoy, la caracterización de las zonas de la envoltura vírica expuesta al seguimiento inmunitario puede contribuir significativamente a nuevas direcciones en el diagnóstico y la profilaxis del HCV.
Diversos péptidos de 20-mer (Tabla 3) que se solapaban unos con otros mediante 8 aminoácidos, fueron sintetizados según un procedimiento descrito anteriormente (EP-A-O 489 968) basados en la secuencia HC-J1 (Okamoto y otros, 1990). Ninguno de estos, excepto el péptido env35 (referido además como E1-35), fue capaz de detectar anticuerpos en los sueros de 200 casos aproximadamente de HCV. Sólo 2 sueros reaccionaron ligeramente con el péptido env35. Sin embargo, mediante el ELISA del anti-E1 descrito en el ejemplo 6, fue posible descubrir epítopos adicionales como sigue: El ELISA de anti-E1 descrito en el ejemplo 6 se modificó mezclando 50 \mug/ml del péptido E1 con el suero humano diluído 1/20 en diluyente de la muestra. La Figura 13 muestra los resultados de la reactividad de los sueros humanos en la proteína E1 recombinante (expresada en vvHCV-40), en presencia de un o una mezcla de péptidos de E1. Mientras que solamente el 2% de los sueros se podrían detectar mediante los péptidos de E1 recubiertos con tiras en un formato de inmunoanálisis de línea, sobre la mitad de los sueros contenían anticuerpos anti-E1 que podrían estar en competencia mediante los mismos péptidos, cuando se probaron en la proteína E1 recombinante. Alguno de los anticuerpos monoclonales murinos obtenidos a partir de ratones Balb/C después de la inyección con proteína E1 purificada estaban en competencia posteriormente por reactividad a E1 con los péptidos individuales (Figura 14). Desde luego, la zona de env53 contenía el epítopo predominante, puesto que la adición de env53 podría competir sustancialmente la reactividad de varios sueros con E1, y se detectaron así mismo los anticuerpos en la zona env31. Este hallazgo fue sorprendente, ya que los péptidos env53 y env31 no habían presentado ninguna reactividad cuando cubrieron directamente la fase sólida.
Por lo tanto los péptidos se sintetizaron utilizando la tecnología descrita por el solicitante anteriormente (en el documento nº WO93/18054). Se sintetizaron los péptidos siguientes:
péptido env35A-biotina
NH_{2}-SNSSEAADMIMHTPGCV-Gkbiotina (SEC ID nº 51) aminoácidos que abarcan del 208 al 227 de la poliproteína del HCV en la zona E1
péptido biotina-env53 ("epítopo A")
biotina-GG-ITGHRMAWDMMMNWSPTTAL-COOH (SEC ID nº 52) aminoácidos que abarcan del 313 al 332 de la poliproteína del HCV en la zona E1
péptido 1 bE1 ("epítopo B")
H_{2}N-EVRNVSGIYHVTNDCSNSSIVYEAADMIMHTPGCGK-biotina (SEC ID nº 53) aminoácidos que abarcan del 192 al 228 de la poliproteína del HCV en la zona E1
y se compararon con las reactividades de los péptidos E1a-BB (biotina-GG-TPTVATRDGKLPATQLRRHIDLL, SEC ID nº 54) y E1b-BB (biotina-GG-TPTLAARDASVPTTTIRRHVDLL, SEC ID nº 55) que proceden de la misma zona de secuencias del genotipo 1 a y 1 b respectivamente y que se han descrito en el IX Congreso Internacional de Virología en Glasgow, 1993 ("epítopo C"). Se probó la reactividad de un panel de sueros de HCV en epítopos A, B y C y el epítopo B se comparó también con env35A (de 47 sueros positivos de HCV, 8 fueron positivos en el epítopo B y ninguno reaccionó con env35A). Se probó la reactividad hacia los epítopos A, B y C directamente en los péptidos biotinilados (50 \mug/ml) unidos a placas recubiertas con estreptavidina según se describió en el ejemplo 6. Los epítopos A y B fueron desde luego más reactivos mientras que los epítopos C y env35A-biotina fueron mucho menos reactivos. Se probó la reactividad hacia los epítopos A, B y C en la misma serie de pacientes en que se había sido controlado su reactividad hacia la proteína E1 completa (ejemplo 7.1.). Se ha observado poca reactividad en el epítopo C, mientras que según se mostró en las Figuras 15, 16, 17 y 18, los epítopos A y B reaccionaron con la mayoría de los sueros. Sin embargo, los anticuerpos para el epítopo más reactivo (epítopo A) no parecen predecir la remisión de la enfermedad, mientras que los anticuerpos anti-1 bE1 (epítopo B) se presentaron casi exclusivamente en los pacientes que responden a largo plazo al comienzo del tratamiento con IFN. Por consiguiente, se podría demostrar que los anticuerpos anti-1 bE1 (epítopo B) y los anticuerpos anti-env53 (epítopo A) son marcadores útiles para el pronóstico de la enfermedad de la hepatitis C. El epítopo env53 se puede utilizar ventajosamente para la detección de anticuerpos inter-reactivos (anticuerpos que interreaccionan entre los genotipos principales) y anticuerpos en la zona env53 pueden ser muy útiles para la detección del antígeno universal de E1 en el suero o en el tejido del hígado. Los anticuerpos monoclonales que reconocen la zona del env53 reaccionaron con una biblioteca del epítopo al azar. En 4 clones que reaccionaron en inmunodetección con el anticuerpo monoclonal 5E1 A10, estuvo presente la secuencia GWD-. Debido a su analogía con la presente secuencia del HCV universal presente en todas las variantes del HCV en la zona env53, se pensó que la secuencia AWD contenía la secuencia esencial del epítopo murino env53 inter-reactivo. El env31 desde luego contiene además una zona variable que puede contener un epítopo en la secuencia amino terminal -YQVRNSTGL- (SEC ID nº 93) y puede ser útil para diagnóstico. Env31 o E1-31 según se muestra en la Tabla 3, es una parte del péptido 1 bE1. Los péptidos E1-33 y E1-51 también reaccionaron en alguna extensión con los anticuerpos murinos, y el péptido E1-55 (que contiene la zona 6 variable (V6); aminoácidos que abarcan las posiciones 329 a 336) también reaccionaron con algunos sueros del paciente.
Los anticuerpos anti-E2 siguieron desde luego un modelo diferente que los anticuerpos anti-E1, especialmente en pacientes con una respuesta a largo plazo al tratamiento. Por consiguiente, está claro que la disminución de los anticuerpos anti-envoltura podría no estar medida tan eficazmente con un análisis que emplea una proteína E1/E2 recombinante como con una proteína individual anti-E1 o anti E2. La respuesta de anti-E2 desdibujaría claramente la respuesta de anti-E1 en un análisis que mide ambas clases de anticuerpos al mismo tiempo. Por consiguiente, la capacidad para probar los anticuerpos anti-envoltura en las proteínas individuales E1 y E2 demostró ser útil.
7.4. Cartografía de anticuerpos anti-E2
De los 24 Mabs anti-E2 sólo tres pudieron estar en competencia por reactividad con la E2 recombinante mediante péptidos, dos de los cuales reaccionaron con la zona HVRI (péptidos E2-67 y E2-69, denominados epítopo A) y uno que reconoció un epítopo en competencia por el péptido E2-13B (epítopo C). La mayoría de los anticuerpos murinos reconocieron epítopos conformacionales de anti-E2 (Figura 19). Una respuesta humana a HVRI (epítopo A) y en menor extensión HVRII (epítopo B) y una tercera zona de epítopo lineal (en competencia por los péptidos E2-23, E2-25 y E2-27, denominado epítopo E) y una cuarta zona de epítopo lineal (en competencia por el péptido E2-17B, epítopo D) se podrían también observar frecuentemente, pero la mayoría de los sueros reaccionaron con epítopos conformacionales (Figura 20). Estos epítopos conformacionales estarían agrupados según sus posiciones relativas como sigue: los anticuerpos de IgG en el sobrenadante de los hibridomas 15C8C1, 12D11F1, 9G3E6, 8G10D1H9, 10D3C4, 4H6B2, 17F2C2, 5H6A7, 15B7A2 que reconocen los epítopos conformacionales se purificaron por medio de cromatografía de afinidad a la proteína A y se biotiniló 1 mg/ml de la IgG resultante en tampón de borato en presencia de biotina. Los anticuerpos biotinilados se separaron de la biotina libre por medio de cromatografía de filtración en gel. Las fracciones de anticuerpo biotiniladas agrupadas se diluyeron de 100 a 10.000 veces. La proteína E2 unida a la fase sólida fue detectada por la IgG biotinilada en presencia de 100 veces la cantidad de anticuerpo no biotinilado en competencia y detectada posteriormente por la fosfatasa alcalina denominada estreptavidina.
Los porcentajes de competencia se dan en la Tabla 6. Basados en estos resultados, se podrían definir 4 zonas de epítopo anti-E2 conformacional (epítopos F, G, H e I) (Figura 38). Por otra parte, estos Mabs pueden reconocer epítopos lineales mutantes no representados por los péptidos utilizados en este estudio. Los Mabs 4H6B2 y 10D3C4 compitieron la reactividad de 16A6E7, pero a diferencia de 16A6E7 no reconocieron al péptido E2-13B. Estos Mabs pueden reconocer variantes del mismo epítopo lineal (epítopo C) o reconocer un epítopo conformacional que está impedido estéricamente o cambia la conformación después de la unión de 16A6E7 a la zona 3B de E2-1 (epítopo H).
Ejemplo 8 Mutantes de glucoxidación de E1 8.1. Introducción
La proteína E1 codificada por vvHCV10A y la proteína E2 codificada por vvHCV41 a 44 expresada a partir de células de mamíferos contienen 6 y 11 grupos carbohidrato, respectivamente. Esto se podría demostrar incubando el lisado de las células RK13 infectadas de vvHCV10A o de vvHCV44 con concentraciones decrecientes de glucosidasas (PNGasa F o Endocoglucosidasa H, (Boehringer Mannhein Biochemica) según las instrucciones del fabricante), de modo que las proteínas en el lisado (E1 inclusive) están parcialmente desglucosiladas (Fig. 39 y 40, respectivamente).
Los mutantes desprovistos de algunos de sus sitios de glucosilación permitirían la selección de proteínas de la envoltura con reactividad inmunológica mejorada. Para HIV por ejemplo, se ha observado que las proteínas gp120 que carecen de ciertos motivos de adición de azúcar seleccionados, son particularmente útiles para diagnóstico o vacunas. La adición de una nueva cadena lateral de oligosacárido en la proteína hemaglutinina en un mutante fugitivo del virus de la gripe A/Hong Kong/3/68 (H3N2) evita la reactividad con un anticuerpo monoclonal neutralizante (Skehel y otros, 1984). Cuando se introdujeron nuevos sitios de glicosilación en la proteína hemaglutinina del virus de la gripe mediante mutagénesis específica en el sitio, se observaron cambios drásticos antigénicos, sugiriendo que los carbohidratos sirven como modulador de antigenicidad (Gallagher y otros, 1988). En otro análisis, se eliminaron los 8 motivos de adición de carbohidrato de la proteína de superficie gp70 del Virus Amigo de Leucemia Murina. Aunque siete de las mutaciones no afectaban a infectividad del virus, la mutación de la cuarta señal de glucosilación con respecto al terminal amino dieron como resultado un fenotipo no infeccioso (Kayman y otros, 1991). Además, se sabe en la materia que la adición de cadenas de carbohidrato N-unidas es importante para la estabilización de intermediarios plegados y de este modo para el plegamiento eficaz, la prevención del plegamiento defectuoso y de la degradación en el retículo endoplasmático, la oligomerización, la actividad biológica y el transporte de glucoproteínas (véase revisiones por Rose y otros, 1988; Doms y otros, 1988; Helenius, 1994).
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Después de la alineación de las diferentes secuencias de la proteína de la envoltura de los genotipos del HCV, se puede deducir que no todos los sitios de la 6 glucosilación en la proteína E1 del subtipo 1b del HCV se requieren para una duplicación y reactividad apropiadas, puesto que algunas están ausentes en determinados (sub)tipos. El cuarto motivo de carbohidrato (en Asn251), presente en los tipos 1b, 6a, 7, 8 y 9, está ausente en todos los demás tipos conocidos actualmente. Este motivo de adición de azúcar puede estar mutado para dar un tipo 1b de proteína E1 con reactividad mejorada. Además la secuencias del tipo 2b presentan un sitio de glucosilación en la región V5 (en Asn299). La cepa S83, perteneciente al genotipo 2c, carece incluso del motivo del primer carbohidrato en la zona V1 (en Asn), mientras que está presente en todos las demás cepas (Stuyver y otros, 1994). Sin embargo, incluso entre los motivos de adición de azúcar totalmente conservados la presencia del carbohidrato puede no ser necesaria para el plegamiento, pero puede desempeñar un papel en la evasión de la vigilancia inmunitaria. Por consiguiente, la identificación de los motivos de adición del carbohidrato que no son necesarios para el plegamiento (y reactividad) apropiadas no es obvia y cada mutante ha de ser analizado y probada su reactividad. La mutagénisis de un motivo de glucosilación (secuencias NXS o NXT) se puede conseguir mediante mutación de los codones para N, S o T, de tal modo que estos codones codifiquen diferentes aminoácidos a partir de N en el caso N y/o diferentes aminoácidos diferentes de S o T en el caso de S y en el caso de T. Por otra parte, la posición X puede estar mutada en P, puesto que se sabe que NPS o NPT no se modifican frecuentemente con carbohidratos. Después de establecer qué motivos de adición de carbohidrato se necesitan para el plegamiento y/o reactividad y cuáles no, se pueden hacer combinaciones con dichas mutaciones.
8.2. Mutagénesis de la proteína E1
Todas las mutaciones se realizaron en la secuencia E1 del clon HCCI10A (SEC ID nº 5). La primera alrededor de PCR se realizó utilizando el sentido del cebador "GPT" (véase Tabla 7) dirigiendo la secuencia localizada corriente arriba del iniciador último 11K de la vacuna y un cebador antisentido (denominado GLY nº, con nº representando el número del sitio de glucosilación, véase Fig. 41) que contiene el cambio de base deseado para obtener la mutagénesis. Los seis cebadores GLY nº (cada uno específico para un sitio de glucosilación dado) se diseñaron de modo que:
-
La modificación del codón que codifica Asn N-glucosilado (AAC o AAT) a un codón Gln (CAA o CAG). La glutamina se seleccionó porque es muy similar a la asparagina (ambos aminoácidos son neutros y contienen residuos no polares, la glutamina tiene una cadena lateral mayor (un grupo -CH_{2}- más).
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La introducción de mutaciones imperceptibles en uno o varios de los codones corriente abajo del sitio de la glucosilación, para crear un nuevo, único o raro (p. ej. un segundo sitio Smal para Gly5 de E1) sitio del enzima de restricción. Sin la modificación de la secuencia de aminoácidos, esta mutación proporciona una forma de distinguir las secuencias mutadas de la secuencia de E1 original (pvHCV-10A) o de cada una de las demás (Figura 41). Este sitio de la restricción adicional puede además ser útil para la construcción de nuevos mutantes de glucosilación híbridos (doble, triple, etc.).
-
18 nucleótidos se extienden hasta 5' del primer nucleótido mal emparejado y 12 a 16 nucleótidos llegan hasta el extremo 3'. La Tabla 7 describe las secuencias de los 6 cebadores GLY nº solapando la secuencia de los sitios de glucosilación N-unida.
Para la mutagénesis dirigida al sitio, se utilizó el "cebado erróneo" o la "extensión de solapamiento" (Horton, 1993). El concepto se ilustra en las Figuras 42 y 43. En primer lugar, se ampliaron dos fragmentos separados del gen objetivo de cada sitio mutado. El producto PCR obtenido del extremo 5' (producto GLY nº) se amplió con el cebador GPT de la cadena transcrita 5' (véase Tabla 7) y con los respectivos cebadores GLY nº de la cadena complementaria 3'. El segundo fragmento (producto OVR nº) se amplió con el cebador TK_{R} de la cadena complementaria 3' y los respectivos cebadores de la cadena transcrita 5' (cebadores ORV nº, véase Tabla 7, Figura 43).
Los cebadores OVR nº tienen por objetivo parte de la secuencia del cebador GLY nº. Por consiguiente, los dos grupos de productos de PCR comparten una zona solapada de secuencia idéntica. Cuando estos productos intermedios se mezclan (GLY-1 con OVR-1, GLY-2 con OVR-2, etc.), fundidos a alta temperatura, y sin problemas de hibridación, la parte superior de la cadena transcrita del producto GLY nº puede hibridarse sin problemas con la cadena complementaria del producto OVR nº (y viceversa) de modo que estas dos cadenas actúan como cebadores entre sí (véase Fig. 42.B.). La extensión del solape hibridado sin problemas mediante Taq polimerasa mediante dos ciclos de PCR creó la molécula mutante completa E1 Gly nº, que lleva la mutación que destruye el sitio de glucosilación número nº. Se generaron suficientes cantidades de los productos E1GLY nº para clonación en una tercera PCR mediante un grupo común de dos cebadores internos anidados. Estos dos nuevos cebadores se solapan respectivamente por el extremo 3' del iniciador 11 K de la vacuna (cebador GPT-2 de la cadena transcrita) y por el extremo 5' del locus de timidina quinasa de la vacuna (cebador TK_{R}-2 de la cadena complementaria, véase Tabla 7). Todas las condiciones de PCR se llevaron a cabo como describieron Stuyver y otros (1993).
Cada uno de estos productos de PCR se clonó por escisión de EcoRI/BamHI en el vector de la vacuna del corte EcoRI/BamHI que contiene la secuencia original de E1 (pvHCV-10A).
Se analizó la longitud de los clones seleccionados de la inserción mediante escisión de EcoRI/BamH I y por la presencia de cada nuevo sitio de restricción. Las secuencias que solapan los sitios mutados se confirmaron mediante el secuenciado de doble cadena.
8.3. Análisis de mutantes de glucosilación de E1
Partiendo de los 6 plásmidos que contienen las secuencias mutantes de E1 según se describió en el ejemplo 8.2., se generaron virus de vacuna recombinante por recombinación con virus de vacuna wt, descritos en el ejemplo 2.5. Brevemente, matraces con 175 cm^{3} de células RK13 subconfluentes se infectaron con 6 virus de vacuna recombinante que lleva las secuencias mutantes de E1, así como con el vvHCV-10A (que lleva la secuencia no mutada de E1) y los virus de la viruela wt. Las células se lisaron después de 24 horas de la infección y se analizaron por transferencia Western según se describió en el ejemplo 4 (véase Figura 44A). Todos los mutantes presentaron una movilidad más rápida (correspondiente a un peso molecular más pequeño de aproximadamente 2 a 3 kDa) en SDS-PAGE que la proteína E1 original; confirmando que no se añadió un grupo carbohidrato. Se analizaron así mismo los virus recombinantes por PCR y se hicieron análisis de la enzima de restricción para confirmar la identidad de los diferentes mutantes. La Figura 44B muestra que todos los mutantes (según se muestra en la Figura 41) contenían los sitios de restricción adicionales esperados. Otra parte del lisado celular se utilizó para probar la reactividad del mutante diferente mediante ELISA. Se diluyeron los lisados 20 veces y se añadieron a las placas de micropocillos recubiertas con GNA de lectin según se describió en el ejemplo 6. Se dejaron reaccionar glucoproteínas de E1 capturadas (mutantes) con sueros diluidos 20 veces de 24 pacientes infectados con HCV según se describió en el ejemplo 6. En la Tabla 8 se muestran los valores señal a ruido (S/N) (OD de GLY nº/OD de wt) para los 6 mutantes y para E1. La tabla muestra además las relaciones entre los valores S/N de GLY nº y de las proteínas E1. Se debería entender que el planteamiento para utilizar los lisados celulares de los diferentes mutantes en comparación con la reactividad de los sueros del paciente puede dar como resultado observaciones que son consecuencia de diferentes niveles de expresión antes que niveles de reactividad. Dichas dificultades se pueden superar mediante purificación de los diferentes mutantes según se describe en el ejemplo 5 y probando cantidades idénticas de todas las proteínas E1 diferentes. Sin embargo, los resultados mostrados en la tabla 5 indican ya que la eliminación de los motivos de glucosilación 1º (GLY1), 3º (GLY3) y 6º (GLY6) reducen la reactividad de algunos sueros, mientras que la eliminación del 2º y 5º sitios no lo hacen. La eliminación de GLY4 parece mejorar la reactividad de determinados sueros. Estos datos indican que pacientes diferentes reaccionan de distinta forma con los mutantes de glucosilación de la presente invención. Así pues, dichas proteínas mutantes de E1 se pueden utilizar para el diagnóstico (identificación, confirmación, pronóstico, etc.) y prevención de la enfermedad por HCV.
Ejemplo 9 Expresión de la proteína E2 del HCV en levaduras con insuficiente glucosilación
Se proporcionó la secuencia de E2 correspondiente al clon HCCL41 con la secuencia pre/pro señal del factor a emparejador, insertada en un vector de expresión de levadura y células de S. Cerevisiae transformadas con esta proteína E2 segregada por la construcción en el medio de crecimiento. Se observó que la mayoría de los sitios de glucosilación se modificaban con glucosilaciones del tipo rico en manosa en la expresión de dicha construcción en las cepas de S. Cerevisiae (Figura 45). Esto dio como resultado un alto nivel de heterogeneidad y la protección de la reactividad que no es deseable para la vacuna o el diagnóstico. Para superar este problema, se generaron mutantes de S. Cerevisiae con pasos de glucosilación modificados mediante selección de clones resistentes al vanadato. Se analizaron en dichos clones los pasos de glucosilación modificados mediante análisis del peso molecular y la heterogeneidad de la glucoproteína invertasa. Esto permitió identificar diferentes mutantes de S. Cerevisiae con insuficiente glucosilación. La proteína E2 se expresó posteriormente en algunos de los mutantes seleccionados y dejó de reaccionar con un anticuerpo monoclonal según se describió en el ejemplo 7, en transferencia Western como se describió en el ejemplo 4 (Figura 46).
Ejemplo 10 Utilidad general
Los presentes resultados demuestran que, para alcanzar una alta reactividad de las proteínas de la envoltura del HCV con los sueros del paciente humano, no sólo se necesita un buen sistema de expresión sino también un buen protocolo de purificación. Esto se puede conseguir utilizando el sistema de expresión de la proteína de la envoltura y/o los protocolos de purificación de la presente invención que garantizan la conservación del plegamiento natural de la proteína y los protocolos de purificación de la presente invención que garantizan la eliminación de las proteínas contaminantes y que preservan la conformación, y de este modo la reactividad de las proteínas de la envoltura del HCV. Las cantidades de proteína de la envoltura del HCV purificada necesitadas para los análisis de identificación del diagnóstico son del orden de gramos por año. Para la vacuna, se necesitarían incluso cantidades mayores de proteína de la envoltura. Por consiguiente, el sistema de virus de la viruela se puede utilizar para la selección de las mejores construcciones de expresión y para aumento a escala limitada, y la expresión y purificación a gran escala de las proteínas de la envoltura oligoméricas individuales o específicas que contienen carbohidratos ricos en manosa se pueden conseguir cuando se expresan a partir de varias cepas de levadura. En el caso de la hepatitis B por ejemplo, la fabricación de células de mamífero a partir de HbsAg fue mucho más costoso comparado con las vacunas de la hepatitis B procedentes de levadura.
El procedimiento de purificación dado a conocer en la presente invención también se puede utilizar en general para las "proteínas de la envoltura vírica". Son ejemplos los procedentes de los Flavivirus, los virus de la hepatitis GB-A, GB-B y GB-C descubiertos recientemente, los Pestivirus (tales como el virus de la diarrea vírica bovina (BVDV), virus del cólera del cerdo (HCV), virus de la enfermedad de frontera (BVD)), pero también los virus menos relacionados tal como el virus de la Hepatitis B (principalmente para la purificación de HBsAg).
El procedimiento de purificación de la proteína de la envoltura de la presente invención se puede utilizar para proteínas expresadas intra- así como extracelularmente en células eucarióticas inferiores o superiores o en procariotas según se expuso en la sección de la descripción detallada.
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TABLA 1
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TABLA 2
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TABLA 3
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TABLA 4
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TABLA 5 Diferencia entre LTR y NR (estudio completo)
5
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TABLA 7 Cebadores
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<160> 111
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<170> PatentIn 3.1
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<210> 1
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Virus de hepatitis C
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<400> 1
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ggcatgcaag cttaattaat t 
\hfill
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<213> Virus de hepatitis C
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<212> ADN
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<213> Virus de hepatitis C
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<220>
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<211> 212
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<212> PRT
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<211> 795
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<212> ADN
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<213> Virus de hepatitis C
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<221> CDS
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<221> misc_característica
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<223> /nota = "cadena complementaria"
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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tgggatatga tgatgaactg gtc 
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23 
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<212> ADN
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<213> Virus de hepatitis C
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ctattatggt ggtaagccac agagcaggag 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<222> 1..1473
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
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49
50 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1021
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2..1018
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2..1015
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51
52 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Virus de hepatitis C
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53
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<212> ADN
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<213> Virus de hepatitis C
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> 2..1032
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2..1029
\newpage
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<400> 39
55
56 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 343
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
57
58 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 945
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..942
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..939
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<400> 41
59
60 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
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<211> 314
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
61
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
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<211> 961
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<212> ADN
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<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> 1..958
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
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<222> 1..955
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
63
64 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
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<211> 319
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<212> PRT
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<213> Virus de hepatitis C
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
65
66 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Virus de hepatitis C
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> 1..1392
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<220>
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<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..1389
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67
68
69 
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<212> PRT
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<213> Virus de hepatitis C
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<400> 46
70
71
72 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2082
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..2079
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..2076
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
73
74
75
76 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 692
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<212> PRT
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<213> Virus de hepatitis C
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
77
78
79 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2433
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..2430
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..2427
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
80
81
82
83 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 809
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
84
85
86 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sitio modificado
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Asn Ser Ser Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys}
\sac{Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sitio modificado
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..22
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp}
\sac{Ser Pro Thr Thr Ala Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sitio modificado
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp Cys}
\sac{Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr}
\sac{Pro Gly Cys Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sitio modificado
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Ala Thr}
\sac{Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sitio modificado
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..25
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asp Ala Ser Val Pro Thr Thr}
\sac{Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
<213 > Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Val Arg Asn}
\sac{Ser Thr Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Val Arg Asn Ser Thr Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro}
\sac{Asn Ser Ser Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Asp Cys Pro Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala His Asp Ala Ile}
\sac{Leu His Thr Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr}
\sac{Pro Gly Cys Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Asp Ala Ile Leu His Thr Pro Gly Val Pro Cys Val Arg Glu Gly}
\sac{Asn Val Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Val Arg Glu Gly Asn Val Ser Arg Cys Trp Val Ala Met Thr Pro}
\sac{Thr Val Ala Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Met Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Ala Thr}
\sac{Gln Leu Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Ala Thr Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser}
\sac{Ala Thr Leu Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu}
\sac{Cys Gly Ser Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Gly Cys}
\sac{Asn Cys Ser Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Gln Gly Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His}
\sac{Arg Met Ala Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro}
\sac{Thr Ala Ala Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Met Ala Gln Leu Leu Arg Ile}
\sac{Pro Gln Ala Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile Ala Gly Ala His}
\sac{Trp Gly Val Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met}
\sac{Val Gly Asn Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr Ile Val Ser}
\sac{Gly Gly Gln Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Leu Val Ser Leu Phe Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln}
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<400> 82
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\sa{Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu Asn Asp Thr Asp Val Phe Val}
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<213> Virus de hepatitis C
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
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42 
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48 
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cagggccgtt ctaggcctcc actgcatcac catatcccaa gc 
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42 
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ccggaatgta ccatgtcacg aacgac 
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26 
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gctccattgt gtatgaggca gcgg 
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24 
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gagctcccgc tgctgggtag cgc 
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23 
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<212> ADN
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cctccgtccc caccacgaca atacg 
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25 
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<400> 108
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctacccgggc cacataacgg gtcaccg 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaggcctac aacggccctg gtgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Virus de hepatitis C
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<400> 110
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttctatcgat taaatagaat tc 
\hfill
22 
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<210> 111
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Virus de hepatitis C
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<400> 111
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\hskip-.1em\dddseqskip
gccatacgct cacagccgat ccc 
\hfill
23

Claims (30)

1. Procedimiento para la purificación de proteínas oligoméricas de la envoltura individuales o específicas del HCV recombinante seleccionadas de entre el grupo que consta de E1 y/o E2 y/o E1/E2, caracterizado porque
(i) una etapa de escisión o reducción de enlaces disulfuro se realiza con un agente de escisión de enlaces disulfuro en la proteína expresada recombinantemente; y
(ii) la reformación de los puentes disulfuros se evita mediante un agente de bloqueo o de unión del grupo SH o se provoca mediante un pH inferior a 6.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de escisión o reducción de enlaces disulfuro se realiza bajo condiciones de escisión o reducción parcial.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho agente de escisión de enlaces bisulfuro es el ditiotreitol (DTT), preferentemente en un intervalo de concentración de 0,1 a 50 mM, preferentemente de 0,1 a 20 mM, más preferentemente de 0,5 a 10 mM.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho agente de escisión de enlaces disulfuro está acompañado por un detergente.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho detergente es Empigen- BB, preferentemente a una concentración del 1 al 10%, más preferentemente a una concentración del 3,5%.
6. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho agente de escisión de enlaces disulfuro comprende una combinación de un agente de escisión de enlaces disulfuro clásico, tal como DTT y un detergente, tal como Empigen-BB.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho agente de bloqueo de los grupos SH es N-etilmaleimida (NEM) o un derivado de ella.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además por lo menos, por las etapas siguientes:
-
lisado de las células huésped recombinante que expresan E1 y/o E2 y/o E1/E2, eventualmente en presencia de un agente bloqueante de SH como N-etilmaleimida (NEM),
-
recuperación de dichas proteínas de la envoltura del HCV mediante purificación por afinidad tal como mediante la cromatografía en lectina, tal como la cromatografía en lentil-lectina o mediante inmuno-afinidad utilizando anticuerpos monoclonales específicos anti-E1 y/o anti-E2,
-
reducción o escisión de los enlaces disulfuro con un agente de escisión de enlaces disulfuro, tal como DTT, preferentemente además en presencia de un agente bloqueante de SH, tal como NEM o Biotina-NEM, y,
-
recuperación de las proteínas de la envoltura E1 y/o E2 y/o E1/E2 reducidas mediante filtración en gel y, eventualmente también mediante una cromatografía de Ni^{2+}-IMAC posterior y una etapa de desalado.
9. Proteína de la envoltura del HCV aislada obtenible mediante cualquiera de los procedimientos según las reivindicaciones 1 a 8, que es por lo menos del 80% de pureza, caracterizada por la ausencia de agregados.
10. Proteína de la envoltura del HCV aislada obtenible mediante cualquiera de los procedimientos según las reivindicaciones 1 a 8, que es por lo menos del 90% de pureza, caracterizada por la ausencia de agregados.
11. Proteína de la envoltura del HCV aislada obtenible mediante cualquiera de los procedimientos según las reivindicaciones 1 a 8, que es por lo menos del 95% de pureza, caracterizada por la ausencia de agregados.
12. Proteína de la envoltura del HCV aislada según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque dichas proteínas recombinantes de la envoltura del HCV se expresan en las células recombinantes de los mamíferos tal como mediante la utilización de un sistema basado en un virus de la viruela.
13. Proteína de la envoltura del HCV aislada según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque dichas proteínas recombinantes de la envoltura del HCV se expresan en las células recombinantes de levadura.
\newpage
14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además por comprender por lo menos, las etapas siguientes:
-
crecimiento de la célula huésped transformada con un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótido que permite la expresión de una proteína oligomérica E1 y/o E2 y/o E1/E2 individual o específica en un medio de cultivo adecuado,
-
producción de la expresión de dicha secuencia del vector en condiciones adecuadas, y,
-
lisis de dichas células huésped transformadas, preferentemente en presencia de un agente bloqueante del grupo SH, tal como N-etilmaleimida (NEM),
-
recuperación de dicha proteína de la envoltura del HCV mediante, por ejemplo, cromatografía en lectina o cromatografía por inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales específicos anti-E1 y/o anti-E2, siendo dicha lectina preferentemente lentil-lectina, seguida de,
-
incubación del eluido de la etapa anterior con un agente de escisión de enlaces disulfuro, tal como DTT, preferentemente además en presencia de un agente bloqueante del grupo SH, tal como NEM o Biotina-NEM, y,
-
aislamiento de proteínas oligoméricas E1 y/o E2 y/o E1/E2 individuales o específicas del HCV tal como mediante filtración en gel y, eventualmente, así mismo mediante una cromatografía Ni^{2+}-IMAC adicional y una etapa de desalado.
15. Proteína de la envoltura del HCV aislada según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, para utilización como medicamento.
16. Utilización de una proteína de la envoltura del HCV aislada según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, para la preparación de una vacuna para inmunizar mamíferos, preferiblemente humanos, frente al HCV.
17. Composición de vacuna para inmunizar mamíferos, preferiblemente humanos, frente al HCV, que comprende una cantidad eficaz de una proteína de la envoltura según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, eventualmente acompañada de adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
18. Proteína de la envoltura del HCV aislada según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, para la detección in vitro de anticuerpos de HCV presentes en una muestra biológica.
19. Utilización de una proteína de la envoltura del HCV aislada según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, para la preparación de un equipo de inmunoensayo para la detección de anticuerpos del HCV presentes en una muestra biológica.
20. Procedimiento para el diagnóstico in vitro de anticuerpos de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende por lo menos las etapas siguientes:
(i)
puesta en contacto de dicha muestra biológica con una proteína de la envoltura del HCV aislada según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, preferentemente en una forma inmovilizada en condiciones apropiadas que permitan la formación de un inmunocomplejo,
(ii)
separación de los componentes no unidos,
(iii)
incubación de inmunocomplejos formados con anticuerpos heterólogos, estando dichos anticuerpos heterólogos conjugados con un marcador detectable en condiciones apropiadas,
(iv)
detección de la presencia de dichos inmunocomplejos visualmente o mecánicamente.
21. Equipo para la determinación de la presencia de anticuerpos de HCV presentes en una muestra biológica que comprende:
-
por lo menos una proteína de la envoltura del HCV aislada según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, preferentemente en forma inmovilizada de un sustrato,
-
un tampón o componentes necesarios para la producción de un tampón que permita la reacción de unión entre estas proteínas o péptidos y los anticuerpos contra el HCV presente en la muestra biológica,
-
medios para detectar los inmunocomplejos formados en la reacción de unión anterior.
\newpage
22. Equipo para la identificación de anticuerpos de HCV presentes en una muestra biológica que comprende:
-
por lo menos una proteína de la envoltura del HCV aislada según cualesquiera de las reivindicaciones 9 a 13, preferentemente en forma inmovilizada en un sustrato,
-
un tampón o componentes necesarios para la producción de un tampón que permita la reacción de unión entre estas proteínas o péptidos y los anticuerpos contra el HCV presente en la muestra biológica,
-
medios para detectar los inmunocomplejos formados en la reacción de unión anterior.
23. Equipo para confirmar la presencia de anticuerpos de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
-
por lo menos una proteína de la envoltura del HCV aislada según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, preferentemente en forma inmovilizada de un sustrato,
-
un tampón o componentes necesarios para la producción de un tampón que permita la reacción de unión entre estas proteínas o péptidos y los anticuerpos contra el HCV presente en la muestra biológica,
-
medios para detectar los inmunocomplejos formados en la reacción de unión anterior.
24. Utilización de una proteína de la envoltura del HCV aislada según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende la proteína E1 del HCV, más particularmente proteínas E1 o péptidos E1 individuales del HCV, para control in vitro de la enfermedad por HCV o para pronóstico de la respuesta al tratamiento, particularmente con interferón, de pacientes que sufren infección por HCV, que comprende:
-
la incubación de una muestra biológica de un paciente con infección por HCV con una proteína E1 o su parte adecuada en condiciones que permiten la formación de un complejo inmunológico,
-
la separación de los componentes no ligados,
-
el cálculo de los valores anti-E1 presentes en dicha muestra al comienzo y durante el curso del tratamiento,
-
seguimiento del curso natural de la enfermedad por HCV, o pronóstico de la respuesta al tratamiento de dicho paciente sobre la base de la cantidad de valores anti-E1 hallados en dicha muestra al comienzo del tratamiento y/o durante el curso del tratamiento.
25. Equipo para el seguimiento de la enfermedad por HCV o para el pronóstico de la respuesta al tratamiento, particularmente con interferón, de pacientes que sufren la infección por HCV, que comprende:
-
por lo menos una proteína E1 o péptido E1 del HCV aislada, más particularmente una proteína E1 o péptido E1 según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13,
-
un tampón o componentes necesarios para la producción de un tampón que permita la reacción de unión entre estas proteínas o péptidos y los anticuerpos anti-E1 presentes en la muestra biológica,
-
medios para detectar los inmunocomplejos formados en la reacción de unión anterior,
-
eventualmente además un aparato de detección e interpretación automatizada para la deducción de una disminución de los valores de anti-E1 durante la evolución del tratamiento.
26. Utilización de una proteína de la envoltura del HCV aislada, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende la proteína E2 del HCV, más particularmente proteínas E2 o péptidos E2 individuales del HCV, para control in vitro de la enfermedad por HCV o para pronóstico de la respuesta al tratamiento, particularmente con interferón, de pacientes que sufren infección por HCV, que comprende:
-
la incubación de una muestra biológica de un paciente con infección por HCV con una proteína E2 o su parte adecuada en condiciones que permiten la formación de un complejo inmunológico,
-
la separación de los componentes no ligados,
-
el cálculo de los valores anti-E2 presentes en dicha muestra al comienzo y durante el curso del tratamiento,
-
seguimiento del curso natural de la enfermedad por HCV, o pronóstico de la respuesta al tratamiento de dicho paciente sobre la base de la cantidad de valores anti-E2 hallados en dicha muestra al comienzo del tratamiento y/o durante el curso del tratamiento.
\newpage
27. Equipo para el seguimiento de la enfermedad por HCV o para el pronóstico de la respuesta al tratamiento, particularmente con interferón, de pacientes que sufren la infección por HCV que comprende:
-
por lo menos una proteína E2 o péptido E2 del HCV aislada, más particularmente una proteína E2 o péptido E2 según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13,
-
un tampón o componentes necesarios para la producción de un tampón que permita la reacción de unión entre estas proteínas o péptidos y los anticuerpos anti-E2 presentes en la muestra biológica,
-
medios para detectar los inmunocomplejos formados en la reacción de unión anterior,
-
eventualmente además un aparato de detección e interpretación automatizada para la deducción de una disminución de valores de anti-E2 durante la evolución del tratamiento.
28. Análisis de serotipia para la detección de uno o más tipos serológicos del HCV presentes en una muestra biológica, más particularmente para la detección de anticuerpos de diferentes tipos de HCV a detectar, combinados en un formato de análisis, que comprende por lo menos las etapas siguientes:
(i)
puesta en contacto de la muestra biológica a analizar la presencia de anticuerpos de HCV de uno o más tipos serológicos, con por lo menos una de las proteínas E1 y/o E2 y/o E1/E2 según cualquier de las reivindicaciones 9 a 13, preferentemente en forma inmovilizada bajo condiciones apropiadas que permitan la formación de un inmunocomplejo,
(ii)
separación de los componentes no unidos,
(iii)
incubación de inmunocomplejos formados con anticuerpos heterólogos, estando dichos anticuerpos heterólogos conjugados con un marcador detectable en condiciones apropiadas,
(iv)
detección de la presencia de dichos inmunocomplejos visualmente o mecánicamente (p. ej. mediante densitometría, fluorimetría, colorimetría) y deduciendo la presencia de uno o más tipos serológicos de HCV presentes del modelo de enlace observado.
29. Equipo para serotipia de uno o más tipos serológicos del HCV presentes en una muestra biológica, más particularmente para la detección de anticuerpos de estos tipos serológicos del HCV que comprende:
-
por lo menos una proteína E1 y/o E2 y/o E1/E2 según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13,
-
un tampón o componentes necesarios para la producción de un tampón que permita la reacción de unión entre estas proteínas o péptidos y los anticuerpos anti-E1 presentes en la muestra biológica,
-
medios para detectar los inmunocomplejos formados en la reacción de unión anterior,
-
eventualmente además un aparato de detección e interpretación automatizada para la detección de uno o más tipos serológicos del HCV presentes del modelo de enlace observado.
30. Proteína de la envoltura del HCV aislada según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, para inmovilización sobre una fase sólida e incorporación en un inmunoanálisis, preferentemente para inmovilización como líneas paralelas sobre una fase sólida tal como una tira de membrana, para determinación de la presencia o del genotipo del HCV, según un procedimiento de la reivindicación 20.
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