JP3158177B2 - Ｃ型肝炎診断薬 - Google Patents
Ｃ型肝炎診断薬Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノ
ムから翻訳される抗原蛋白質を含むＣ型肝炎診断薬に関
する。さらに詳しくは、Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣ
Ｖ」という）遺伝子にコードされる蛋白質であって、第
二番目のエンベロープ蛋白質あるいは第一番目の非構造
蛋白質（以下Ｅ２／ＮＳ１と略す）と呼ばれる糖蛋白質
を利用したＣ型肝炎関連抗体の検出のための診断薬に関
する。
ムから翻訳される抗原蛋白質を含むＣ型肝炎診断薬に関
する。さらに詳しくは、Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣ
Ｖ」という）遺伝子にコードされる蛋白質であって、第
二番目のエンベロープ蛋白質あるいは第一番目の非構造
蛋白質（以下Ｅ２／ＮＳ１と略す）と呼ばれる糖蛋白質
を利用したＣ型肝炎関連抗体の検出のための診断薬に関
する。
【０００２】
【従来の技術】１９８８年米国カイロン社によって、従
来非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスと呼ばれて来たヒト肝炎ウイ
ルスがクローニングされて、ＨＣＶと命名され、その遺
伝子断片がコードするペプチドとヒト・スーパーオキシ
ド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）を組換え酵母で産生させた
融合蛋白（Ｃ１００−３）が、Ｃ型肝炎診断薬として開
発された〔サイエンス(Science), ２４４，３５９−３
６２，３６２−３６４，（１９８９）〕。
来非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスと呼ばれて来たヒト肝炎ウイ
ルスがクローニングされて、ＨＣＶと命名され、その遺
伝子断片がコードするペプチドとヒト・スーパーオキシ
ド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）を組換え酵母で産生させた
融合蛋白（Ｃ１００−３）が、Ｃ型肝炎診断薬として開
発された〔サイエンス(Science), ２４４，３５９−３
６２，３６２−３６４，（１９８９）〕。
【０００３】わが国では、１９８９年末から日本赤十字
社が献血のスクリーニングに、この系を導入し、輸血後
肝炎の防止に努めているが、Ｃ１００−３抗体検査だけ
では完全ではなく、未だに輸血後肝炎は発生している。
社が献血のスクリーニングに、この系を導入し、輸血後
肝炎の防止に努めているが、Ｃ１００−３抗体検査だけ
では完全ではなく、未だに輸血後肝炎は発生している。
【０００４】その後、日本人の患者血清由来のＨＣＶ遺
伝子がクローニングされ、日本で流行しているＨＣＶ
は、カイロン社が得たものと似ているが明かに異なる配
列からなる日本株であることが判明した〔蛋白質 核酸
酵素，３６，１６７９−１６９１，（１９９１）〕。
また、Ｃ１００−３より有効な診断薬としてコア蛋白質
（Ｃ）領域、第三番目の非構造蛋白質（ＮＳ３）領域、
第五番目の非構造蛋白質（ＮＳ５）領域等が提唱されて
いる〔ランセット(Lancet)，３３７，３１７−３１９，
１９９１；特開平３−１０３１８０〕。
伝子がクローニングされ、日本で流行しているＨＣＶ
は、カイロン社が得たものと似ているが明かに異なる配
列からなる日本株であることが判明した〔蛋白質 核酸
酵素，３６，１６７９−１６９１，（１９９１）〕。
また、Ｃ１００−３より有効な診断薬としてコア蛋白質
（Ｃ）領域、第三番目の非構造蛋白質（ＮＳ３）領域、
第五番目の非構造蛋白質（ＮＳ５）領域等が提唱されて
いる〔ランセット(Lancet)，３３７，３１７−３１９，
１９９１；特開平３−１０３１８０〕。
【０００５】上記Ｃ１００−３抗体測定系は、検出率及
び検出感度が低い。また、上記Ｃ、ＮＳ３、ＮＳ５領域
等がより有効な検出用抗原として提唱されているが、未
だ満足できる結果は得られておらず、Ｃ型肝炎の新たな
診断薬、診断法が期待されている。
び検出感度が低い。また、上記Ｃ、ＮＳ３、ＮＳ５領域
等がより有効な検出用抗原として提唱されているが、未
だ満足できる結果は得られておらず、Ｃ型肝炎の新たな
診断薬、診断法が期待されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、検出率及び検出感度の高い、Ｃ型肝炎の診断薬を提
供することである。
は、検出率及び検出感度の高い、Ｃ型肝炎の診断薬を提
供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的は、Ｃ型肝炎ウ
イルスの感染によって誘導される抗体を検出することに
よりＣ型肝炎を診断するＣ型肝炎診断薬であって、動物
細胞で発現された糖鎖を有するＥ２／ＮＳ１領域由来の
蛋白質を含むことを特徴とするＣ型肝炎診断薬により達
成される。本発明に使用する、動物細胞で発現された糖
鎖を有するＥ２／ＮＳ１領域由来の蛋白質は、好ましく
はＣＨＯ細胞産生蛋白質である。
イルスの感染によって誘導される抗体を検出することに
よりＣ型肝炎を診断するＣ型肝炎診断薬であって、動物
細胞で発現された糖鎖を有するＥ２／ＮＳ１領域由来の
蛋白質を含むことを特徴とするＣ型肝炎診断薬により達
成される。本発明に使用する、動物細胞で発現された糖
鎖を有するＥ２／ＮＳ１領域由来の蛋白質は、好ましく
はＣＨＯ細胞産生蛋白質である。
【０００８】ところで、Ｅ２／ＮＳ１領域由来の蛋白質
は、一般に、アミノ酸配列の変異が大きい、大腸菌での
該領域発現蛋白ではＨＣＶ患者との反応性がＨＣＶの他
の領域由来の蛋白質と比較して低い、等の理由でこの領
域の抗原蛋白質を診断薬として使用することはあまり考
えられていなかった。しかしながら、本発明者らは、Ｅ
２／ＮＳ１領域のｃＤＮＡを動物細胞で発現させて得ら
れる、糖鎖を持つＥ２／ＮＳ１蛋白質が、予想外にも蛍
光抗体法により高率にＣ型肝炎患者血清と反応すること
を見い出し、本発明を完成するに至った。
は、一般に、アミノ酸配列の変異が大きい、大腸菌での
該領域発現蛋白ではＨＣＶ患者との反応性がＨＣＶの他
の領域由来の蛋白質と比較して低い、等の理由でこの領
域の抗原蛋白質を診断薬として使用することはあまり考
えられていなかった。しかしながら、本発明者らは、Ｅ
２／ＮＳ１領域のｃＤＮＡを動物細胞で発現させて得ら
れる、糖鎖を持つＥ２／ＮＳ１蛋白質が、予想外にも蛍
光抗体法により高率にＣ型肝炎患者血清と反応すること
を見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】本発明のＥ２／ＮＳ１蛋白質は、ＨＣＶ遺
伝子にコ−ドされる蛋白質であって、第二番目のエンベ
ロープ蛋白質あるいは第１番目の非構造蛋白質とよばれ
る領域の蛋白質であって、例えば、配列表の配列番号１
〜１２に示すようなものである。このような蛋白質にお
いて、一部のアミノ酸を除去、挿入、修飾あるいは追加
する等の改変を行って得られる蛋白質も、それがＣ型肝
炎患者血清との反応性を損なわない限り、本発明に包含
されるものであることは、いうまでもない。
伝子にコ−ドされる蛋白質であって、第二番目のエンベ
ロープ蛋白質あるいは第１番目の非構造蛋白質とよばれ
る領域の蛋白質であって、例えば、配列表の配列番号１
〜１２に示すようなものである。このような蛋白質にお
いて、一部のアミノ酸を除去、挿入、修飾あるいは追加
する等の改変を行って得られる蛋白質も、それがＣ型肝
炎患者血清との反応性を損なわない限り、本発明に包含
されるものであることは、いうまでもない。
【００１０】〔１〕配列表の配列番号１から３に示すＣ
型肝炎患者血清由来ｃＤＮＡクローンを得る方法と該ク
ローンの塩基配列を決定する方法 配列表の配列番号１から３に示す塩基配列で表される、
新規なポリペプチドをコードする遺伝子またはＤＮＡ断
片は、例えば、次のような方法によって得られる。
型肝炎患者血清由来ｃＤＮＡクローンを得る方法と該ク
ローンの塩基配列を決定する方法 配列表の配列番号１から３に示す塩基配列で表される、
新規なポリペプチドをコードする遺伝子またはＤＮＡ断
片は、例えば、次のような方法によって得られる。
【００１１】このＨＣＶは、血清中に微量しか存在しな
い上、遺伝子がＲＮＡであると予想され、従来のｃＤＮ
Ａクローニング法であるOkayama-Berg法や、Gubler-Hof
fman法を基本とした方法でのクローニングには困難が予
想されたので、少量の血清から変異の多い該遺伝子を確
実にクローニングするために、以下の方法によった。
い上、遺伝子がＲＮＡであると予想され、従来のｃＤＮ
Ａクローニング法であるOkayama-Berg法や、Gubler-Hof
fman法を基本とした方法でのクローニングには困難が予
想されたので、少量の血清から変異の多い該遺伝子を確
実にクローニングするために、以下の方法によった。
【００１２】即ち、後述の実施例１で示すようにＣ型肝
炎患者の血清から核酸を抽出する。該血清としては、通
常、オルソ社の検査キットでの測定値でＯＤが３．５以
上のものを使用するのが好ましいが、この値のものに限
られるわけではない。血清にはウイルスＲＮＡのキャリ
アとしてトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を混ぜてお
くのが好ましい。キャリアは必ずしもｔＲＮＡに限られ
るものではなく、ポリリボヌクレオシドであれば代用で
きる。ただし、ｔＲＮＡを使用すればインタクトな長さ
をもったｔＲＮＡが必要量存在するかどうかを電気泳動
で迅速に確認できる利点がある。またこの確認をするこ
とで、少なくとも、ウイルスＲＮＡのキャリアとしてｔ
ＲＮＡを混合した段階以降において、ウイルスＲＮＡの
分解があるかどうかを確認することができる。かかる核
酸からｃＤＮＡをクローニングする手段としては、Saik
i らの開発したポリメラーゼ チェイン リアクション
法〔（ＰＣＲ法） ネーチャー（Nature）、３２４，１
２６，（１９８６）〕を利用することが好ましい。ま
ず、ウイルスＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素を反応させ
る。この時、使用するプライマーとしては、市販のラン
ダムプライマーでも良いし、下記に示したプライマーＡ
Ｓ１の様な塩基配列の合成ＤＮＡを用いても良い。
炎患者の血清から核酸を抽出する。該血清としては、通
常、オルソ社の検査キットでの測定値でＯＤが３．５以
上のものを使用するのが好ましいが、この値のものに限
られるわけではない。血清にはウイルスＲＮＡのキャリ
アとしてトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を混ぜてお
くのが好ましい。キャリアは必ずしもｔＲＮＡに限られ
るものではなく、ポリリボヌクレオシドであれば代用で
きる。ただし、ｔＲＮＡを使用すればインタクトな長さ
をもったｔＲＮＡが必要量存在するかどうかを電気泳動
で迅速に確認できる利点がある。またこの確認をするこ
とで、少なくとも、ウイルスＲＮＡのキャリアとしてｔ
ＲＮＡを混合した段階以降において、ウイルスＲＮＡの
分解があるかどうかを確認することができる。かかる核
酸からｃＤＮＡをクローニングする手段としては、Saik
i らの開発したポリメラーゼ チェイン リアクション
法〔（ＰＣＲ法） ネーチャー（Nature）、３２４，１
２６，（１９８６）〕を利用することが好ましい。ま
ず、ウイルスＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素を反応させ
る。この時、使用するプライマーとしては、市販のラン
ダムプライマーでも良いし、下記に示したプライマーＡ
Ｓ１の様な塩基配列の合成ＤＮＡを用いても良い。
【００１３】 ５′ ３′ ＡＳ１；ＧＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡ （配列番号１３） これらの配列で５’側の配列の数塩基を他の配列に変え
ても良いが、好ましくは５’側から１０塩基以内の範囲
で数塩基内であれば良い、さらに好ましくは、５’側か
ら５塩基以内の範囲が良い。また、これらの配列で５’
側の配列の４から５塩基を欠如してもよいが、５’側か
ら数塩基の欠如が好ましい。また、８から１２塩基程度
であれば５’側に任意の配列を付加してもよいが、好ま
しくは５から６塩基の付加、さらに好ましくは数塩基の
付加が良い。
ても良いが、好ましくは５’側から１０塩基以内の範囲
で数塩基内であれば良い、さらに好ましくは、５’側か
ら５塩基以内の範囲が良い。また、これらの配列で５’
側の配列の４から５塩基を欠如してもよいが、５’側か
ら数塩基の欠如が好ましい。また、８から１２塩基程度
であれば５’側に任意の配列を付加してもよいが、好ま
しくは５から６塩基の付加、さらに好ましくは数塩基の
付加が良い。
【００１４】ＰＣＲ法は、具体的には、実施例１に記述
したような条件で実施される。このようにして得られた
第１鎖相補鎖ＤＮＡ（１ｓｔ ｃＤＮＡ）を鋳型にして
実施例１の様にＰＣＲ法を行い目的のＤＮＡ断片を得る
ことができる。このとき、ＰＣＲの条件は、適宜状況に
応じて選択される。センスプライマーとしては、具体的
には、例えば、次のようなものが挙げられる。
したような条件で実施される。このようにして得られた
第１鎖相補鎖ＤＮＡ（１ｓｔ ｃＤＮＡ）を鋳型にして
実施例１の様にＰＣＲ法を行い目的のＤＮＡ断片を得る
ことができる。このとき、ＰＣＲの条件は、適宜状況に
応じて選択される。センスプライマーとしては、具体的
には、例えば、次のようなものが挙げられる。
【００１５】 ５’ ３’ Ａ１；ＣＡＧＩＴＡＩＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＩＣＡＡＧ （配列番号１４） この配列中にある「Ｉ」は、イノシンを示している。
これらの配列で５’側の配列の数塩基を他の配列に変え
ても良いが、好ましくは５’側から１０塩基以内の範囲
で数塩基内であれば良い、さらに好ましくは、５’側か
ら５塩基以内の範囲が良い。また、これらの配列で５’
側の配列の４から５塩基を欠如してもよいが、５’側か
ら数塩基の欠如が好ましい。また、８から１２塩基程度
であれば５’側に任意の配列を付加してもよいが、好ま
しくは５から６塩基の付加、さらに好ましくは数塩基の
付加が良い。
これらの配列で５’側の配列の数塩基を他の配列に変え
ても良いが、好ましくは５’側から１０塩基以内の範囲
で数塩基内であれば良い、さらに好ましくは、５’側か
ら５塩基以内の範囲が良い。また、これらの配列で５’
側の配列の４から５塩基を欠如してもよいが、５’側か
ら数塩基の欠如が好ましい。また、８から１２塩基程度
であれば５’側に任意の配列を付加してもよいが、好ま
しくは５から６塩基の付加、さらに好ましくは数塩基の
付加が良い。
【００１６】このようにして得られたＤＮＡ断片は、常
法によりクローニングベクター（例えば、pUC19)のクロ
ーニングサイトの１つ（例えば、ＳｍａＩサイト）に組
み込まれる。このＤＮＡ断片を持つプラスミドを用い
て、独立に３つ以上のクローンの塩基配列を両鎖に関し
て決定する。塩基配列の決定は、ジデオキシ法により、
例えば７−デアザ シークエンス キット（宝酒造社
製）やデュポン社製蛍光シークエンサージェネシス２０
００（GENESIS2000）システムを用いて、該キットのプ
ロトコールに従って容易に行うことができる。塩基配列
が決定しにくい部位や、決定しようとするＤＮＡ断片が
約１８０塩基対以上ある場合には、常法に従い、サブク
ローニングを行えばよい。このようにして決定された、
ＤＮＡ断片の塩基配列から推定される蛋白質のアミノ酸
配列は、配列表の配列番号１から３に表される通りであ
る。
法によりクローニングベクター（例えば、pUC19)のクロ
ーニングサイトの１つ（例えば、ＳｍａＩサイト）に組
み込まれる。このＤＮＡ断片を持つプラスミドを用い
て、独立に３つ以上のクローンの塩基配列を両鎖に関し
て決定する。塩基配列の決定は、ジデオキシ法により、
例えば７−デアザ シークエンス キット（宝酒造社
製）やデュポン社製蛍光シークエンサージェネシス２０
００（GENESIS2000）システムを用いて、該キットのプ
ロトコールに従って容易に行うことができる。塩基配列
が決定しにくい部位や、決定しようとするＤＮＡ断片が
約１８０塩基対以上ある場合には、常法に従い、サブク
ローニングを行えばよい。このようにして決定された、
ＤＮＡ断片の塩基配列から推定される蛋白質のアミノ酸
配列は、配列表の配列番号１から３に表される通りであ
る。
【００１７】クローンＪ１−１３２５、クローンＮ２
７、クローンＮ１９、Ｈ１９、Ｙ１９はそれぞれ独立の
患者血清から得られたクローンである。ＭＸ２４は複数
のＣ型肝炎患者のプール血清から得られた。さらにプラ
イマーＳ１とプライマーＡＳ１の組み合せから得られた
配列番号１から３に示すクローンは、ＨＣＶ遺伝子上で
同じ領域に対応する。
７、クローンＮ１９、Ｈ１９、Ｙ１９はそれぞれ独立の
患者血清から得られたクローンである。ＭＸ２４は複数
のＣ型肝炎患者のプール血清から得られた。さらにプラ
イマーＳ１とプライマーＡＳ１の組み合せから得られた
配列番号１から３に示すクローンは、ＨＣＶ遺伝子上で
同じ領域に対応する。
【００１８】また、本発明においては、配列表の配列番
号４〜１２に示すＥ２／ＮＳ１蛋白質領域由来の抗原蛋
白質も使用することができる。配列番号４の抗原蛋白質
は、ジャーナル オブ ビロロジー（J. Virol.)，６
５，１１０５−１１１３，（１９９１）、配列番号５の
抗原蛋白質は、プロシーディングス オブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス ユー・エス・エー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ，８７，９５２４−９
５２８，（１９９０）、配列番号６の抗原蛋白質は、第
５０回 日本癌学会総会，３７９，（１９９１）、配列
番号７の抗原蛋白質は、欧州特許０，３８８，２３２
（１９９０）〕、配列番号８及び９の抗原蛋白質は、プ
ロシーディングス オブ ナショナルアカデミー オブ
サイエンス ユー・エス・エー（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA),８８，３３９２−３３９６，（１９９１）、
配列番号１０及び１１の抗原蛋白質は、ジャパニーズ
ジャーナル オブ エクスペリメンタル メディシン(J
pn. J. Exp. Med.),６０，１６７−１７７，（１９９
０）、また配列番号１２の抗原蛋白質は、バイオケミカ
ル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケ
ーションズ（ＢＢＲＣ），１７５，２２０−２２８，
（１９９１）等に記載のｃＤＮＡを発現することによっ
て得られる。配列番号４から１２に示す配列は、配列番
号１から３に示すものと同じ領域に対応する。
号４〜１２に示すＥ２／ＮＳ１蛋白質領域由来の抗原蛋
白質も使用することができる。配列番号４の抗原蛋白質
は、ジャーナル オブ ビロロジー（J. Virol.)，６
５，１１０５−１１１３，（１９９１）、配列番号５の
抗原蛋白質は、プロシーディングス オブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス ユー・エス・エー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ，８７，９５２４−９
５２８，（１９９０）、配列番号６の抗原蛋白質は、第
５０回 日本癌学会総会，３７９，（１９９１）、配列
番号７の抗原蛋白質は、欧州特許０，３８８，２３２
（１９９０）〕、配列番号８及び９の抗原蛋白質は、プ
ロシーディングス オブ ナショナルアカデミー オブ
サイエンス ユー・エス・エー（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA),８８，３３９２−３３９６，（１９９１）、
配列番号１０及び１１の抗原蛋白質は、ジャパニーズ
ジャーナル オブ エクスペリメンタル メディシン(J
pn. J. Exp. Med.),６０，１６７−１７７，（１９９
０）、また配列番号１２の抗原蛋白質は、バイオケミカ
ル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケ
ーションズ（ＢＢＲＣ），１７５，２２０−２２８，
（１９９１）等に記載のｃＤＮＡを発現することによっ
て得られる。配列番号４から１２に示す配列は、配列番
号１から３に示すものと同じ領域に対応する。
【００１９】〔２〕 〔１〕で得られたクローンにコー
ドされるポリペプチドの発現 Ｅ２／ＮＳ１蛋白質の生産のためには、その蛋白質を安
定に発現する宿主−ベクター系を選択すること、さらに
発現したＥ２／ＮＳ１蛋白質が生物学的活性すなわちＨ
ＣＶと同様の抗原性を有している必要がある。特に天然
のＥ２／ＮＳ１蛋白質が糖蛋白質と予測されること、ま
たＥ２／ＮＳ１蛋白質が多くのシステイン残基を含み、
そのシステイン残基間のチオール結合の位置および蛋白
質の高次構造が活性維持に重要であることを考慮した場
合、宿主としては、動物細胞例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ
細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ
３Ａ細胞等、好ましくはＣＨＯ細胞を用いて発現させる
ことが望ましい。またこれらの細胞を宿主とする場合
は、配列番号１〜１２に示すアミノ酸配列（シグナル様
配列）、すなわち３２から４４番目を持つＥ２／ＮＳ１
遺伝子を細胞内に導入することにより、プロセッシング
されたＥ２／ＮＳ１蛋白質が産生されることが期待され
る。これらの動物細胞を宿主とした発現用プラスミドは
次のように構築される。
ドされるポリペプチドの発現 Ｅ２／ＮＳ１蛋白質の生産のためには、その蛋白質を安
定に発現する宿主−ベクター系を選択すること、さらに
発現したＥ２／ＮＳ１蛋白質が生物学的活性すなわちＨ
ＣＶと同様の抗原性を有している必要がある。特に天然
のＥ２／ＮＳ１蛋白質が糖蛋白質と予測されること、ま
たＥ２／ＮＳ１蛋白質が多くのシステイン残基を含み、
そのシステイン残基間のチオール結合の位置および蛋白
質の高次構造が活性維持に重要であることを考慮した場
合、宿主としては、動物細胞例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ
細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ
３Ａ細胞等、好ましくはＣＨＯ細胞を用いて発現させる
ことが望ましい。またこれらの細胞を宿主とする場合
は、配列番号１〜１２に示すアミノ酸配列（シグナル様
配列）、すなわち３２から４４番目を持つＥ２／ＮＳ１
遺伝子を細胞内に導入することにより、プロセッシング
されたＥ２／ＮＳ１蛋白質が産生されることが期待され
る。これらの動物細胞を宿主とした発現用プラスミドは
次のように構築される。
【００２０】まず動物細胞でのプロモーターとしては、
アデノウイルスＥＩＡ遺伝子による活性型プロモーター
〔続生化学実験講座１、遺伝子研究法II、１８９−１９
０、（１９８６）〕、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ
４０後期プロモーター、アポリポプロテインＥ遺伝子プ
ロモーター、ＳＲαプロモーター〔モレキュラー アン
ド セルラー バイオロジー（Mol. Cell. Biol.),８，
４６６−４７２，（１９８８）〕等が使用されるが、Ｓ
Ｖ４０プロモーターまたはＳＲαプロモーターが好まし
い。
アデノウイルスＥＩＡ遺伝子による活性型プロモーター
〔続生化学実験講座１、遺伝子研究法II、１８９−１９
０、（１９８６）〕、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ
４０後期プロモーター、アポリポプロテインＥ遺伝子プ
ロモーター、ＳＲαプロモーター〔モレキュラー アン
ド セルラー バイオロジー（Mol. Cell. Biol.),８，
４６６−４７２，（１９８８）〕等が使用されるが、Ｓ
Ｖ４０プロモーターまたはＳＲαプロモーターが好まし
い。
【００２１】このプロモーターの下流に上記シグナル様
配列を含むＥ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子のＤＮＡ断片を転
写方向にしたがって挿入する。またＥ２／ＮＳ１蛋白質
の発現ベクター構築の際には、該プロモーターの下流に
Ｅ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子断片を２個以上結合したもの
を挿入してもよい。またＥ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子のＤ
ＮＡ断片の５’上流側にＳＶ４０などのプロモーターを
結合したＤＮＡ断片を単位としたものを、転写方向を揃
えて２個以上結合してベクターに挿入してもよい。この
Ｅ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子の下流には、ポリアデニル化
配列が必要である。例えばＳＶ４０遺伝子、β−グロビ
ン遺伝子またはメタロチオネイン遺伝子由来のポリアデ
ニル化配列がＥ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子の下流に１つ存
在することが必要である。またプロモーターとＥ２／Ｎ
Ｓ１蛋白質遺伝子を結合したＤＮＡ断片を２個以上結合
する場合には、各単位のＥ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子の
３’側にそれぞれポリアデニル化配列を存在させること
もできる。
配列を含むＥ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子のＤＮＡ断片を転
写方向にしたがって挿入する。またＥ２／ＮＳ１蛋白質
の発現ベクター構築の際には、該プロモーターの下流に
Ｅ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子断片を２個以上結合したもの
を挿入してもよい。またＥ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子のＤ
ＮＡ断片の５’上流側にＳＶ４０などのプロモーターを
結合したＤＮＡ断片を単位としたものを、転写方向を揃
えて２個以上結合してベクターに挿入してもよい。この
Ｅ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子の下流には、ポリアデニル化
配列が必要である。例えばＳＶ４０遺伝子、β−グロビ
ン遺伝子またはメタロチオネイン遺伝子由来のポリアデ
ニル化配列がＥ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子の下流に１つ存
在することが必要である。またプロモーターとＥ２／Ｎ
Ｓ１蛋白質遺伝子を結合したＤＮＡ断片を２個以上結合
する場合には、各単位のＥ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子の
３’側にそれぞれポリアデニル化配列を存在させること
もできる。
【００２２】この発現ベクターを用いて動物細胞例えば
ＣＨＯ細胞を形質転換する際には選択マーカーを用いる
ことが望ましい。選択マーカーとしては、メトトレキセ
ート耐性を与えるＤＨＦＲ遺伝子〔ジャーナル オブ
モレキュラー バイオロジー(J. Mol. Biol.),１５９，
６０１，（１９８２）〕、抗生物質Ｇ−４１８耐性を与
えるＮｅｏ遺伝子〔ジャーナル オブ モレキュラー
アプライド ジェネティクス(J. Mol. Appl. Gent.),
１，３２７，（１９８２）〕、ミコフェノール酸耐性を
与える大腸菌由来のＥｃｏｇｐｔ遺伝子〔プロシーディ
ングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンス ユー・エス・エー（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A),７８，２０７２，（１９８１）〕、抗生物質ハイグ
ロマイシン耐性を与えるｈｐｈ遺伝子〔モレキュラーア
ンド セルラー バイオロジー(Mol. Cell. Biol.),
５，４１０，（１９８５）〕等が挙げられ、各耐性遺伝
子の５’上流側にはプロモーター、例えば前述のＳＶ４
０由来のプロモーターや、ヘルペスウイルスのＴＫ遺伝
子プロモーターが挿入されており、各耐性遺伝子の３’
下流側には、前述のポリアデニル化配列が含まれる。Ｅ
２／ＮＳ１蛋白質の発現ベクターにこれらの耐性遺伝子
を挿入する場合、Ｅ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子のポリアデ
ニル化部位下流に順方向あるいは逆方向に挿入すればよ
い。これらの発現ベクターは、形質転換体を得る際に、
選択マーカー遺伝子を含む別のプラスミドを二重形質転
換する必要がない。
ＣＨＯ細胞を形質転換する際には選択マーカーを用いる
ことが望ましい。選択マーカーとしては、メトトレキセ
ート耐性を与えるＤＨＦＲ遺伝子〔ジャーナル オブ
モレキュラー バイオロジー(J. Mol. Biol.),１５９，
６０１，（１９８２）〕、抗生物質Ｇ−４１８耐性を与
えるＮｅｏ遺伝子〔ジャーナル オブ モレキュラー
アプライド ジェネティクス(J. Mol. Appl. Gent.),
１，３２７，（１９８２）〕、ミコフェノール酸耐性を
与える大腸菌由来のＥｃｏｇｐｔ遺伝子〔プロシーディ
ングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンス ユー・エス・エー（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A),７８，２０７２，（１９８１）〕、抗生物質ハイグ
ロマイシン耐性を与えるｈｐｈ遺伝子〔モレキュラーア
ンド セルラー バイオロジー(Mol. Cell. Biol.),
５，４１０，（１９８５）〕等が挙げられ、各耐性遺伝
子の５’上流側にはプロモーター、例えば前述のＳＶ４
０由来のプロモーターや、ヘルペスウイルスのＴＫ遺伝
子プロモーターが挿入されており、各耐性遺伝子の３’
下流側には、前述のポリアデニル化配列が含まれる。Ｅ
２／ＮＳ１蛋白質の発現ベクターにこれらの耐性遺伝子
を挿入する場合、Ｅ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子のポリアデ
ニル化部位下流に順方向あるいは逆方向に挿入すればよ
い。これらの発現ベクターは、形質転換体を得る際に、
選択マーカー遺伝子を含む別のプラスミドを二重形質転
換する必要がない。
【００２３】またＥ２／ＮＳ１蛋白質の発現ベクターに
これらの選択マーカー遺伝子が挿入されていない場合に
は、形質転換体の選択マーカーを有するベクター例え
ば、ｐＳＶ２ｎｅｏ〔ジャーナル オブ モレキュラー
アプライド ジェネティクス(J. Mol. Appl. Gent.),
１，３２７，（１９８２）〕、ｐＭＢＧ（ネーチャー
(Nature), ２９４，２２８，（１９８１）〕、ｐＳＶ２
ｇｐｔ〔プロシーディングス オブ ナショナル アカ
デミー オブ サイエンス ユー・エス・エー（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA),７８，２０７２，（１９８
１）〕、ｐＡｄ−Ｄ２６−１〔ジャーナル オブ モレ
キュラーバイオロジー(J. Mol. Biol.),１５９，６０
１，（１９８２）〕等をＥ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子の発
現ベクターと共に二重形質転換し、選択マーカー遺伝子
の表現形質により形質転換体を容易に選択できる。
これらの選択マーカー遺伝子が挿入されていない場合に
は、形質転換体の選択マーカーを有するベクター例え
ば、ｐＳＶ２ｎｅｏ〔ジャーナル オブ モレキュラー
アプライド ジェネティクス(J. Mol. Appl. Gent.),
１，３２７，（１９８２）〕、ｐＭＢＧ（ネーチャー
(Nature), ２９４，２２８，（１９８１）〕、ｐＳＶ２
ｇｐｔ〔プロシーディングス オブ ナショナル アカ
デミー オブ サイエンス ユー・エス・エー（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA),７８，２０７２，（１９８
１）〕、ｐＡｄ−Ｄ２６−１〔ジャーナル オブ モレ
キュラーバイオロジー(J. Mol. Biol.),１５９，６０
１，（１９８２）〕等をＥ２／ＮＳ１蛋白質遺伝子の発
現ベクターと共に二重形質転換し、選択マーカー遺伝子
の表現形質により形質転換体を容易に選択できる。
【００２４】発現ベクターの動物細胞への導入法として
は、リン酸カルシウム法〔ビロロジー(Virol.)５２，４
５６，（１９７３）〕、エレクトロポレーション法〔ジ
ャーナル オブ メンブレン バイオロジー(J. Membr.
Biol.),１０，２７９，（１９７２）〕等が挙げられる
がリン酸カルシウム法が一般的である。
は、リン酸カルシウム法〔ビロロジー(Virol.)５２，４
５６，（１９７３）〕、エレクトロポレーション法〔ジ
ャーナル オブ メンブレン バイオロジー(J. Membr.
Biol.),１０，２７９，（１９７２）〕等が挙げられる
がリン酸カルシウム法が一般的である。
【００２５】形質転換された動物細胞の培養は、常法に
より浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地
としては、ＭＥＭ、Ｈａｍ Ｆ−１２等を用い、５〜１
０％血清存在下もしくは適当量のインシュリン、デキサ
メサゾン、トランスフェリンの存在下、もしくは無血清
下にて培養する。Ｅ２／ＮＳ１蛋白質を発現している動
物細胞は、常法に従い患者血清等を用いた蛍光抗体法に
より検出され、限界希釈法により常法通りクローニング
を行う事により、安定にＥ２／ＮＳ１蛋白質を産生する
セルラインを樹立する事ができる。
より浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地
としては、ＭＥＭ、Ｈａｍ Ｆ−１２等を用い、５〜１
０％血清存在下もしくは適当量のインシュリン、デキサ
メサゾン、トランスフェリンの存在下、もしくは無血清
下にて培養する。Ｅ２／ＮＳ１蛋白質を発現している動
物細胞は、常法に従い患者血清等を用いた蛍光抗体法に
より検出され、限界希釈法により常法通りクローニング
を行う事により、安定にＥ２／ＮＳ１蛋白質を産生する
セルラインを樹立する事ができる。
【００２６】このようにして得られたＨＣＶ遺伝子由来
Ｅ２／ＮＳ１蛋白質はＨＣＶ抗原として利用でき、ＨＣ
Ｖ抗体を含有する血清と免疫的に反応する該抗原は、例
えば、血液または血清等を含む試料におけるＨＣＶ抗体
の存在を確認し、あるいは検出をするために有用であ
る。このイムノアッセイの方法には、例えば、ＲＩＡ
（radioimmunoassay）、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked im
munoadsorbent assay ）、蛍光抗体法、凝集反応（ラテ
ックス法を含む）、免疫沈澱法等がある。また、検出に
はほとんどの場合、標識化抗体が使用され、このために
標識化を行う場合、標識化物としては、例えば蛍光物
質、化学発光物質、放射性物質、染色物質等が使用され
る。従って、上記ＨＣＶ遺伝子由来Ｅ２／ＮＳ１蛋白質
を抗原として、本発明のＣ型肝炎診断のための免疫診断
薬を作製することができる。
Ｅ２／ＮＳ１蛋白質はＨＣＶ抗原として利用でき、ＨＣ
Ｖ抗体を含有する血清と免疫的に反応する該抗原は、例
えば、血液または血清等を含む試料におけるＨＣＶ抗体
の存在を確認し、あるいは検出をするために有用であ
る。このイムノアッセイの方法には、例えば、ＲＩＡ
（radioimmunoassay）、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked im
munoadsorbent assay ）、蛍光抗体法、凝集反応（ラテ
ックス法を含む）、免疫沈澱法等がある。また、検出に
はほとんどの場合、標識化抗体が使用され、このために
標識化を行う場合、標識化物としては、例えば蛍光物
質、化学発光物質、放射性物質、染色物質等が使用され
る。従って、上記ＨＣＶ遺伝子由来Ｅ２／ＮＳ１蛋白質
を抗原として、本発明のＣ型肝炎診断のための免疫診断
薬を作製することができる。
【００２７】
【発明の効果】本発明の、糖鎖を有するＥ２／ＮＳ１領
域由来の蛋白質を含む診断薬は、血液または血清等を含
む試料におけるＨＣＶ抗体の存在を確認し、あるいは検
出をするために有用であり、高感度にＣ型肝炎を診断す
ることができる。
域由来の蛋白質を含む診断薬は、血液または血清等を含
む試料におけるＨＣＶ抗体の存在を確認し、あるいは検
出をするために有用であり、高感度にＣ型肝炎を診断す
ることができる。
【００２８】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１ 〔１〕Ｃ型肝炎患者血清からの核酸の抽出 Ｃ型肝炎患者血清（この血清は、オルソ社製ＨＣＶ Ｅ
ＩＡ キットでＯＤ＝３．５以上の値を示した）１０ml
にトリス緩衝液（５０mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA,
100 mM NaCl)25mlを加え、混和後２０，０００ｇ、２０
℃で２０分間遠心し、その上清を更に１００，０００
ｇ、２０℃で５時間遠心した。この沈殿にプロテネース
Ｋ溶液（１％ドデシル硫酸ナトリウム、10 mM EDTA, 10
mM Tris-HCl（ｐＨ７．５），Protenase K(ファルマシ
ア製）２ｍｇ／ｍｌ，yeast tRNAmixture ６．６μ
ｇ）１．５ｍｌを加え溶解後、９０分間４５℃で保温
し、これに等量のフェノール／クロロホルムを加えた
後、激しく混和し遠心分離操作により核酸を含む水相を
回収するいわゆるフェノール／クロロホルム処理を４回
以上行った。さらに、クロロホルム処理を２回以上行っ
た。この様にして得られた水相に１０分の１量の３Ｍ酢
酸ナトリウムもしくは等量の４Ｍ酢酸アンモニウムと水
相の２．５倍容のエタノールを加え混和し、−２０℃で
一晩もしくは−８０℃で１５分以上静置した後、ＳＷ４
１Ｔｉロータ（ベックマン社製）で３５，０００ｒｐｍ
で４時間遠心を行い、核酸を沈殿物として回収した。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１ 〔１〕Ｃ型肝炎患者血清からの核酸の抽出 Ｃ型肝炎患者血清（この血清は、オルソ社製ＨＣＶ Ｅ
ＩＡ キットでＯＤ＝３．５以上の値を示した）１０ml
にトリス緩衝液（５０mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA,
100 mM NaCl)25mlを加え、混和後２０，０００ｇ、２０
℃で２０分間遠心し、その上清を更に１００，０００
ｇ、２０℃で５時間遠心した。この沈殿にプロテネース
Ｋ溶液（１％ドデシル硫酸ナトリウム、10 mM EDTA, 10
mM Tris-HCl（ｐＨ７．５），Protenase K(ファルマシ
ア製）２ｍｇ／ｍｌ，yeast tRNAmixture ６．６μ
ｇ）１．５ｍｌを加え溶解後、９０分間４５℃で保温
し、これに等量のフェノール／クロロホルムを加えた
後、激しく混和し遠心分離操作により核酸を含む水相を
回収するいわゆるフェノール／クロロホルム処理を４回
以上行った。さらに、クロロホルム処理を２回以上行っ
た。この様にして得られた水相に１０分の１量の３Ｍ酢
酸ナトリウムもしくは等量の４Ｍ酢酸アンモニウムと水
相の２．５倍容のエタノールを加え混和し、−２０℃で
一晩もしくは−８０℃で１５分以上静置した後、ＳＷ４
１Ｔｉロータ（ベックマン社製）で３５，０００ｒｐｍ
で４時間遠心を行い、核酸を沈殿物として回収した。
【００２９】〔２〕ｃＤＮＡの合成 〔２−１〕ＲＮＡサンプルの調製 〔１〕で得られた核酸を乾燥させた後、水３０μｌとリ
ボヌクレアーゼインヒビター（１００ユニット／μｌ、
宝酒造社製）１０μｌを加え溶解させた。この核酸水溶
液を用い下記に示すｃＤＮＡ合成を行った。
ボヌクレアーゼインヒビター（１００ユニット／μｌ、
宝酒造社製）１０μｌを加え溶解させた。この核酸水溶
液を用い下記に示すｃＤＮＡ合成を行った。
【００３０】〔２−２〕アンチセンスプライマーを用い
たｃＤＮＡの合成 〔２−１〕で調製した核酸水溶液２μｌにアンチセンス
プライマー（合成ＤＮＡプライマーＡＳ１がアンチセン
スプライマーである。１５ｐｍｏｌｓ／μｌ）１μｌ、
１０ｘＲＴ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．３），５００ｍＭ ＫＣｌ）２μｌ、２５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ４μｌ、２．５ｍＭ ４ｄＮＴＰ ８μ
ｌ、水１μｌを加え６５℃５分、次に室温５分保温後、
逆転写酵素（ライフ サイエンス社製）２５ユニットを
１μｌ、リボヌクレアーゼインヒビター（１００ユニッ
ト／μｌ、宝酒造社製）１μｌを加え３７℃２０分、次
に４２℃３０分、最後に９５℃２分保温後、すぐに０℃
に冷却した（相補鎖ＤＮＡ合成）。このＤＮＡ試料１０
μｌを用いてSaiki らの方法〔ネーチャー(Nature), ３
２４，１２６，（１９８６）〕に準じて、いわゆるＰＣ
Ｒ法により特異的配列を持つＤＮＡを増幅した。
たｃＤＮＡの合成 〔２−１〕で調製した核酸水溶液２μｌにアンチセンス
プライマー（合成ＤＮＡプライマーＡＳ１がアンチセン
スプライマーである。１５ｐｍｏｌｓ／μｌ）１μｌ、
１０ｘＲＴ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．３），５００ｍＭ ＫＣｌ）２μｌ、２５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ４μｌ、２．５ｍＭ ４ｄＮＴＰ ８μ
ｌ、水１μｌを加え６５℃５分、次に室温５分保温後、
逆転写酵素（ライフ サイエンス社製）２５ユニットを
１μｌ、リボヌクレアーゼインヒビター（１００ユニッ
ト／μｌ、宝酒造社製）１μｌを加え３７℃２０分、次
に４２℃３０分、最後に９５℃２分保温後、すぐに０℃
に冷却した（相補鎖ＤＮＡ合成）。このＤＮＡ試料１０
μｌを用いてSaiki らの方法〔ネーチャー(Nature), ３
２４，１２６，（１９８６）〕に準じて、いわゆるＰＣ
Ｒ法により特異的配列を持つＤＮＡを増幅した。
【００３１】即ち、このＤＮＡ試料１０μｌ、１０ｘＰ
ＣＲ緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３），５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１
％ゼラチン）１０μｌ、２．５ｍＭ ４ｄＮＴＰ ８μ
ｌ、相補鎖ＤＮＡ合成時に使用した合成ＤＮＡプライマ
ー（１５０ｐｍｏｌｓ／μｌ）２μｌ、このプライマー
に対応した合成ＤＮＡプライマー（１５ｐｍｏｌｓ／μ
ｌ、相補鎖ＤＮＡ合成時に使用した合成ＤＮＡプライマ
ーと対になるものであり、前述のプライマーＳ１を使用
した。）３μｌに水を加えて合計が１００μｌになるよ
うにして、まず９５℃に５分間保温後、０℃に急冷し
た。１分後、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（７ユニット
／μｌ、AmpliTaqTM宝酒造社製）０．５μｌを加え混和
後、ミネラルオイルで重層した。このサンプルを、パー
キン エルマー シータス社製のＤＮＡ Thermal Cycl
erで９５℃１分、４０〜５５℃１分、７２℃１〜５分で
２５回処理した。最後に７２℃で７分保温した後、この
反応水溶液をフェノール／クロロホルム処理、エタノー
ル沈殿（エタノール沈殿とは、水相に１０分の１量の３
Ｍ酢酸ナトリウムもしくは等量の４Ｍ酢酸アンモニウム
と水相の２．５倍容のエタノールを加え混和し、半径５
cm程度のロータを用いて１５，０００ｒｐｍ，４℃で１
５分間冷却遠心を行い、その沈殿を乾燥させる処理）を
行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。
ＣＲ緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３），５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１
％ゼラチン）１０μｌ、２．５ｍＭ ４ｄＮＴＰ ８μ
ｌ、相補鎖ＤＮＡ合成時に使用した合成ＤＮＡプライマ
ー（１５０ｐｍｏｌｓ／μｌ）２μｌ、このプライマー
に対応した合成ＤＮＡプライマー（１５ｐｍｏｌｓ／μ
ｌ、相補鎖ＤＮＡ合成時に使用した合成ＤＮＡプライマ
ーと対になるものであり、前述のプライマーＳ１を使用
した。）３μｌに水を加えて合計が１００μｌになるよ
うにして、まず９５℃に５分間保温後、０℃に急冷し
た。１分後、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（７ユニット
／μｌ、AmpliTaqTM宝酒造社製）０．５μｌを加え混和
後、ミネラルオイルで重層した。このサンプルを、パー
キン エルマー シータス社製のＤＮＡ Thermal Cycl
erで９５℃１分、４０〜５５℃１分、７２℃１〜５分で
２５回処理した。最後に７２℃で７分保温した後、この
反応水溶液をフェノール／クロロホルム処理、エタノー
ル沈殿（エタノール沈殿とは、水相に１０分の１量の３
Ｍ酢酸ナトリウムもしくは等量の４Ｍ酢酸アンモニウム
と水相の２．５倍容のエタノールを加え混和し、半径５
cm程度のロータを用いて１５，０００ｒｐｍ，４℃で１
５分間冷却遠心を行い、その沈殿を乾燥させる処理）を
行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。
【００３２】〔３〕増幅された該ＤＮＡ断片のクローニ
ングと塩基配列の決定 〔２−２〕の方法によって得たＤＮＡ断片を少なくとも
１pmole 用意し、このＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
（東洋紡績社製）で平滑末端化し〔モレキュラー・クロ
ーニング(Molecular Cloning),１９８２，コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spri
ng Harbor Lab. Press) 〕、ポリヌクレオチドキナーゼ
（東洋紡績社製）で５′末端にリン酸基を導入後〔モレ
キュラー・クローニング(Molecular Cloning),１９８
２，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス(Cold Spring Harbor Lab. Press) 、ライゲーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用いて、ｐＵＣ１９クロー
ニングベクターのマルチクローニングサイト内にあるＳ
ｍａＩサイトに組み込んだ。
ングと塩基配列の決定 〔２−２〕の方法によって得たＤＮＡ断片を少なくとも
１pmole 用意し、このＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
（東洋紡績社製）で平滑末端化し〔モレキュラー・クロ
ーニング(Molecular Cloning),１９８２，コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spri
ng Harbor Lab. Press) 〕、ポリヌクレオチドキナーゼ
（東洋紡績社製）で５′末端にリン酸基を導入後〔モレ
キュラー・クローニング(Molecular Cloning),１９８
２，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス(Cold Spring Harbor Lab. Press) 、ライゲーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用いて、ｐＵＣ１９クロー
ニングベクターのマルチクローニングサイト内にあるＳ
ｍａＩサイトに組み込んだ。
【００３３】この時ライゲーションに用いたベクターＤ
ＮＡとしては、次の様に用意されたものを５ｎｇ〜１０
ｎｇ使用した。即ち、ｐＵＣ１８クローニングベクター
を制限酵素ＳｍａＩ（東洋紡績社製）で切断し、フェノ
ール／クロロホルム処理、エタノール沈殿させた後、さ
らにアルカリフォスファターゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）で５′末端を脱リン酸化して〔モレキュラー・
クローニング(Molecular Cloning),１９８２，コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold
Spring Harbor Lab. Press) 〕、フェノール／クロロホ
ルム処理し、エタノール沈殿させた。この様にして作成
したＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９あるいはＤＨ５を
形質転換させた（この時、コンピテントセルは東洋紡績
社製のものを用いた）。形質転換させる方法は、東洋紡
績社製のコンピテント ハイ(COMPETENT HIGH)のプロト
コールに従った。この様にして、前述のプライマーの組
み合わせから〔２−２〕の方法によって得た該ＤＮＡ断
片を持つｐＵＣ１８クローニングベクターで形質転換さ
せた形質転換体を、少なくとも、各々２０個以上得るこ
とができた。
ＮＡとしては、次の様に用意されたものを５ｎｇ〜１０
ｎｇ使用した。即ち、ｐＵＣ１８クローニングベクター
を制限酵素ＳｍａＩ（東洋紡績社製）で切断し、フェノ
ール／クロロホルム処理、エタノール沈殿させた後、さ
らにアルカリフォスファターゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）で５′末端を脱リン酸化して〔モレキュラー・
クローニング(Molecular Cloning),１９８２，コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold
Spring Harbor Lab. Press) 〕、フェノール／クロロホ
ルム処理し、エタノール沈殿させた。この様にして作成
したＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９あるいはＤＨ５を
形質転換させた（この時、コンピテントセルは東洋紡績
社製のものを用いた）。形質転換させる方法は、東洋紡
績社製のコンピテント ハイ(COMPETENT HIGH)のプロト
コールに従った。この様にして、前述のプライマーの組
み合わせから〔２−２〕の方法によって得た該ＤＮＡ断
片を持つｐＵＣ１８クローニングベクターで形質転換さ
せた形質転換体を、少なくとも、各々２０個以上得るこ
とができた。
【００３４】得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡ
ｐＵＣ１３２５（図１）を常法により調製し、宝酒造
社製７−デアザ シークエンス キットまたはデュポン
社製蛍光シークエンサーGENESIS ２０００システムを用
いて、配列を決定した。シークエンスプライマーとして
次の２種の合成プライマー５′ｄ（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡ
ＣＧＧＣＣＡＧＴ）３′（配列番号１５），５′ｄ（Ｃ
ＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）３′（配列番号１
６）を使用し、該ＤＮＡ断片の＋鎖、−鎖の塩基配列を
決定した。該ＤＮＡ断片は配列表の配列番号１に示す通
りの塩基配列を有していた。配列表の配列番号１に示す
アミノ酸配列は、それぞれ上記で得られた形質転換体の
プラスミドに組み込まれたＨＣＶ由来遺伝子の＋鎖にコ
ードされている。
ｐＵＣ１３２５（図１）を常法により調製し、宝酒造
社製７−デアザ シークエンス キットまたはデュポン
社製蛍光シークエンサーGENESIS ２０００システムを用
いて、配列を決定した。シークエンスプライマーとして
次の２種の合成プライマー５′ｄ（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡ
ＣＧＧＣＣＡＧＴ）３′（配列番号１５），５′ｄ（Ｃ
ＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）３′（配列番号１
６）を使用し、該ＤＮＡ断片の＋鎖、−鎖の塩基配列を
決定した。該ＤＮＡ断片は配列表の配列番号１に示す通
りの塩基配列を有していた。配列表の配列番号１に示す
アミノ酸配列は、それぞれ上記で得られた形質転換体の
プラスミドに組み込まれたＨＣＶ由来遺伝子の＋鎖にコ
ードされている。
【００３５】つぎに、得られた該ＤＮＡ断片がコードす
るアミノ酸配列をすでに報告されたＣ型肝炎ウイルスの
遺伝子配列と比較した。なお、実施例１の〔２−２〕に
おいて、同一患者の血清から３つのクローンを得、その
塩基配列を決定した結果、一人の患者には複数のウイル
スが存在していることが判明した。
るアミノ酸配列をすでに報告されたＣ型肝炎ウイルスの
遺伝子配列と比較した。なお、実施例１の〔２−２〕に
おいて、同一患者の血清から３つのクローンを得、その
塩基配列を決定した結果、一人の患者には複数のウイル
スが存在していることが判明した。
【００３６】〔４〕Ｅ２／ＮＳ１蛋白質発現プラスミド
の調製 図１〜６にＥ２／ＮＳ１蛋白質発現プラスミドの調製方
法を示す。 〔４−１〕ＤＮＡ断片１３２５ＳＫの作成 〔３〕で得たプラスミドｐＵＣ１３２５に含まれるクロ
ーン１３２５の該ＤＮＡ断片はｐＵＣ１８のＳｍａＩサ
イトに挿入されているが、該断片はＥ２／ＮＳ１蛋白質
のコードされているクローン１３２５の＋鎖の５’側に
ｐＵＣ１８のＫｐｎＩサイトを、また、３’側にｐＵＣ
１８のＢａｍＨＩサイトを持つ方向に挿入されている。
制限酵素ＨｉｎｄIII で完全に分解した後、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで部分分解し、ベクター内のＢａｍＨＩサイト
でなく、もう１つのＢａｍＨＩサイト（クローン１３２
５に１つある。）のみで切断されたＤＮＡ断片を得た。
該ＤＮＡ断片にはＨＣＶ遺伝子由来の〔２−２〕で得た
ＤＮＡ断片であるクローン１３２５の５’末端にあるＢ
ａｍＨＩサイトから３’側の全てが含まれている。
の調製 図１〜６にＥ２／ＮＳ１蛋白質発現プラスミドの調製方
法を示す。 〔４−１〕ＤＮＡ断片１３２５ＳＫの作成 〔３〕で得たプラスミドｐＵＣ１３２５に含まれるクロ
ーン１３２５の該ＤＮＡ断片はｐＵＣ１８のＳｍａＩサ
イトに挿入されているが、該断片はＥ２／ＮＳ１蛋白質
のコードされているクローン１３２５の＋鎖の５’側に
ｐＵＣ１８のＫｐｎＩサイトを、また、３’側にｐＵＣ
１８のＢａｍＨＩサイトを持つ方向に挿入されている。
制限酵素ＨｉｎｄIII で完全に分解した後、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで部分分解し、ベクター内のＢａｍＨＩサイト
でなく、もう１つのＢａｍＨＩサイト（クローン１３２
５に１つある。）のみで切断されたＤＮＡ断片を得た。
該ＤＮＡ断片にはＨＣＶ遺伝子由来の〔２−２〕で得た
ＤＮＡ断片であるクローン１３２５の５’末端にあるＢ
ａｍＨＩサイトから３’側の全てが含まれている。
【００３７】次に、図１に示すように、該ＤＮＡ断片を
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、５’ｐＧＧＡ
ＣＴＡＧＴＣＣ ３’（配列番号１７）の配列からなる
ＳｐｅＩリンカー（ニューイングランド バイオラブ社
製）をライゲーションして、制限酵素ＸｂａＩで切断
（このＸｂａＩサイトはプラスミドｐＵＣ１８由来であ
る。）した。これに、下記に示すアダプターをＸｂａＩ
サイトの３’側にライゲーションし、ＤＮＡ断片１３２
５ＳＫを得た。
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、５’ｐＧＧＡ
ＣＴＡＧＴＣＣ ３’（配列番号１７）の配列からなる
ＳｐｅＩリンカー（ニューイングランド バイオラブ社
製）をライゲーションして、制限酵素ＸｂａＩで切断
（このＸｂａＩサイトはプラスミドｐＵＣ１８由来であ
る。）した。これに、下記に示すアダプターをＸｂａＩ
サイトの３’側にライゲーションし、ＤＮＡ断片１３２
５ＳＫを得た。
【００３８】 ５’ｐＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣ ３’（配列番号１８） ３’ ＴＣＴＴＡＡＧＣｐ ５’
【００３９】〔４−２〕プラスミドｐＳＲＮｏｔの構築 ジャーナル オブ ビロロジー(J. Virol.),６５，３０
１５−３０２１，（１９９１）に報告した発現ベクター
ｐＡＣ３１６を制限酵素Ｔｔｈ１１１Ｉ（３’ｐｏｌｙ
Ａ領域の３’側にあるＴｔｈ１１１Ｉサイト）で切断
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。また、
池田らがジーン(Gene)、７１、１９−１７、（１９８
８）で報告したプラスミドｐｍｏＲＨのＳａｌＩサイト
とＥｃｏＲＩサイトで挟まれたＳＶ４０の初期プロモー
ターを含むＤＮＡ断片（図２）を切り出し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑末端化した。
１５−３０２１，（１９９１）に報告した発現ベクター
ｐＡＣ３１６を制限酵素Ｔｔｈ１１１Ｉ（３’ｐｏｌｙ
Ａ領域の３’側にあるＴｔｈ１１１Ｉサイト）で切断
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。また、
池田らがジーン(Gene)、７１、１９−１７、（１９８
８）で報告したプラスミドｐｍｏＲＨのＳａｌＩサイト
とＥｃｏＲＩサイトで挟まれたＳＶ４０の初期プロモー
ターを含むＤＮＡ断片（図２）を切り出し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑末端化した。
【００４０】ｐＡＣ３１６由来の該ＤＮＡ断片とｐｍｏ
ＲＨ由来の該ＤＮＡ断片を図２のようにして、ＢｇｌII
リンカー（宝酒造社製）と共にライゲーションし、Ｂｇ
ｌIIリンカーとｐｍｏＲＨ由来のＳＶ４０の初期プロモ
ーターを含む該ＤＮＡ断片をそれぞれ１つずつ含むプラ
スミドｐＳＲ３１６ＥＰを得た。さらに図３に示すよう
に、このプラスミドｐＳＲ３１６ＥＰを制限酵素Ｈｇｉ
ＡＩとＤｒａIII で切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで
平滑末端化し、次に示すＮｏｔＩリンカーを１つ導入し
たｐＳＲＮｏｔ（図３）を得た。即ち、（５’ＡＧＣＧ
ＧＣＣＧＣ３’）の配列の合成ＤＮＡを作成し、５’末
端にリン酸をカイネーション〔モレキュラー クローニ
ング、セカンドエディション(Molecular Cloning secon
d edition), １１．３１−１１．４４、（１９８９），
コールドスプリング ハーバーラボラトリー プレス(C
old Spring Harbor Lab. Press) 〕したものをＮｏｔＩ
リンカーとした。
ＲＨ由来の該ＤＮＡ断片を図２のようにして、ＢｇｌII
リンカー（宝酒造社製）と共にライゲーションし、Ｂｇ
ｌIIリンカーとｐｍｏＲＨ由来のＳＶ４０の初期プロモ
ーターを含む該ＤＮＡ断片をそれぞれ１つずつ含むプラ
スミドｐＳＲ３１６ＥＰを得た。さらに図３に示すよう
に、このプラスミドｐＳＲ３１６ＥＰを制限酵素Ｈｇｉ
ＡＩとＤｒａIII で切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで
平滑末端化し、次に示すＮｏｔＩリンカーを１つ導入し
たｐＳＲＮｏｔ（図３）を得た。即ち、（５’ＡＧＣＧ
ＧＣＣＧＣ３’）の配列の合成ＤＮＡを作成し、５’末
端にリン酸をカイネーション〔モレキュラー クローニ
ング、セカンドエディション(Molecular Cloning secon
d edition), １１．３１−１１．４４、（１９８９），
コールドスプリング ハーバーラボラトリー プレス(C
old Spring Harbor Lab. Press) 〕したものをＮｏｔＩ
リンカーとした。
【００４１】次に、池田らがジーン（Gene) 、７１、１
９−２７、（１９８８）に報告したプラスミドｐＣＨＤ
２Ｌを制限酵素ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＶで切断したｄｈｆ
ｒ遺伝子を切り出し、この領域にｄｈｆｒ遺伝子をコー
ドするＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＶ断片の代わりとして、プロ
シーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ
サイエンス ユー・エス・エー（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA),８３，８６６４−８６６８，（１９８６）に
記載のプラスミドＣｈａｒｏｍｉｄ９−３６のＫｐｎ
Ｉ、ＥｃｏＲＶ断片を図５のように挿入して、プラスミ
ドｐＣｈｍＢｐ１を得た。該プラスミドはプラスミドＣ
ｈａｒｏｍｉｄ９−３６由来のポリリンカーを持つ。
９−２７、（１９８８）に報告したプラスミドｐＣＨＤ
２Ｌを制限酵素ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＶで切断したｄｈｆ
ｒ遺伝子を切り出し、この領域にｄｈｆｒ遺伝子をコー
ドするＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＶ断片の代わりとして、プロ
シーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ
サイエンス ユー・エス・エー（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA),８３，８６６４−８６６８，（１９８６）に
記載のプラスミドＣｈａｒｏｍｉｄ９−３６のＫｐｎ
Ｉ、ＥｃｏＲＶ断片を図５のように挿入して、プラスミ
ドｐＣｈｍＢｐ１を得た。該プラスミドはプラスミドＣ
ｈａｒｏｍｉｄ９−３６由来のポリリンカーを持つ。
【００４２】次に、ガラピンらが、ジャーナル オブ
モレキュラー バイオロジー(J. Mol. Biol.),１５０、
１−１４、（１９８１）に報告したプラスミドｐＡＧ６
０を制限酵素ＰｖｕIIで切断し、ネオマイシン遺伝子の
コードされているＰｖｕII断片を得た。プラスミドｐＣ
ｈｍＢｐ１を制限酵素ＥｃｏＲＶで切断した後、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで平滑末端化したＤＮＡ断片と該Ｐｖ
ｕII断片をライゲーションすることによって、プラスミ
ドｐＣｈｍＢｐ１の制限酵素ＥｃｏＲＶサイトにプラス
ミドｐＡＧ６０由来のネオマイシン遺伝子が挿入された
プラスミドｐＨＬｐ１を得た（図５）。
モレキュラー バイオロジー(J. Mol. Biol.),１５０、
１−１４、（１９８１）に報告したプラスミドｐＡＧ６
０を制限酵素ＰｖｕIIで切断し、ネオマイシン遺伝子の
コードされているＰｖｕII断片を得た。プラスミドｐＣ
ｈｍＢｐ１を制限酵素ＥｃｏＲＶで切断した後、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで平滑末端化したＤＮＡ断片と該Ｐｖ
ｕII断片をライゲーションすることによって、プラスミ
ドｐＣｈｍＢｐ１の制限酵素ＥｃｏＲＶサイトにプラス
ミドｐＡＧ６０由来のネオマイシン遺伝子が挿入された
プラスミドｐＨＬｐ１を得た（図５）。
【００４３】〔４−３〕発現ベクターｐａＳＲ１３２５
Ｘ−３の構築 図４のようにして、〔４−２〕で得たプラスミドｐＳＲ
Ｎｏｔを制限酵素ＮｏｔＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで平滑末端化した後、制限酵素ＫｐｎＩで切断し
た。さらに該ＤＮＡ断片を、〔４−１〕で得られたＤＮ
Ａ断片１３２５ＳＫとライゲーションして、ＤＮＡ断片
１３２５ＳＫを１つだけ持つ発現ベクターｐａＳＲ１３
２５Ｘ−３を得た（図４）。
Ｘ−３の構築 図４のようにして、〔４−２〕で得たプラスミドｐＳＲ
Ｎｏｔを制限酵素ＮｏｔＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで平滑末端化した後、制限酵素ＫｐｎＩで切断し
た。さらに該ＤＮＡ断片を、〔４−１〕で得られたＤＮ
Ａ断片１３２５ＳＫとライゲーションして、ＤＮＡ断片
１３２５ＳＫを１つだけ持つ発現ベクターｐａＳＲ１３
２５Ｘ−３を得た（図４）。
【００４４】〔４−４〕発現ベクターｐＨＬ１６ＳＲ１
３２５の構築 図６に示すように、〔４−３〕で得た発現ベクターｐａ
ＳＲ１３２５Ｘ−３を制限酵素ＳｆｉＩで２つの断片に
切断し、クローン１３２５の発現ユニットを切り出し
た。制限酵素ＳｆｉＩサイトはＳＶ４０の初期プロモー
ターの中にある。クローン１３２５の発現ユニットを持
つＳｆｉＩ断片を５μｇと、発現ベクターｐＨＬｐ１を
制限酵素ＳｆｉＩで切断したもの５０ｎｇとを１０μｌ
の反応溶液中でライゲーションし（ライゲーションに
は、宝酒造社製のライゲーションキットを用い、方法は
宝酒造社のライゲーションキット用のプロトコールに従
った）、発現ベクターｐＨＬ１６ＳＲ１３２５（図６）
を得た。
３２５の構築 図６に示すように、〔４−３〕で得た発現ベクターｐａ
ＳＲ１３２５Ｘ−３を制限酵素ＳｆｉＩで２つの断片に
切断し、クローン１３２５の発現ユニットを切り出し
た。制限酵素ＳｆｉＩサイトはＳＶ４０の初期プロモー
ターの中にある。クローン１３２５の発現ユニットを持
つＳｆｉＩ断片を５μｇと、発現ベクターｐＨＬｐ１を
制限酵素ＳｆｉＩで切断したもの５０ｎｇとを１０μｌ
の反応溶液中でライゲーションし（ライゲーションに
は、宝酒造社製のライゲーションキットを用い、方法は
宝酒造社のライゲーションキット用のプロトコールに従
った）、発現ベクターｐＨＬ１６ＳＲ１３２５（図６）
を得た。
【００４５】該ベクターは、発現ベクターｐａＳＲ１３
２５Ｘ−３の制限酵素ＳｆｉＩサイトに、Ｅ２／ＮＳ１
蛋白質遺伝子であるクローン１３２５の発現ユニットを
持つＤＮＡ断片１３２５ＳＫを１６個連続して持ち、こ
のＤＮＡ断片１３２５ＳＫは全て、発現ベクターｐａＳ
Ｒ１３２５Ｘ−３のＳＶ４０プロモーターの下流に、転
写方向にしたがって挿入されていた。
２５Ｘ−３の制限酵素ＳｆｉＩサイトに、Ｅ２／ＮＳ１
蛋白質遺伝子であるクローン１３２５の発現ユニットを
持つＤＮＡ断片１３２５ＳＫを１６個連続して持ち、こ
のＤＮＡ断片１３２５ＳＫは全て、発現ベクターｐａＳ
Ｒ１３２５Ｘ−３のＳＶ４０プロモーターの下流に、転
写方向にしたがって挿入されていた。
【００４６】〔５〕Ｅ２／ＮＳ１蛋白質蛋白質を持続的
に発現する細胞株の取得 〔４〕により作製された発現ベクターｐＨＬ１６ＳＲ１
３２５を常法〔モレキュラー・クローニング，セカンド
エディション(Molecular Cloning second edition),
（１９８９），コールド スプリング ハーバー ラボ
ラトリー プレス(Cold Spring Harbor Lab. Press) 〕
に従い、組換え体の大腸菌ＤＨ１株から回収、精製し、
該発現プラスミドＤＮＡを大量に得た。該プラスミドＤ
ＮＡを用いてAusubel らの方法〔カレント プロトコー
ルズ インモレキュラー バイオロジー(Current Proto
cols in Molecular Biology)，グリーン パブリッシン
グアソシエイツ アンド ウイリー−インターサイエン
ス(Greene Publishing Associates and Wiley-Intersci
ence),９・１・１章〜９・１・４章,(１９８７）〕を基
にＣＨＯ細胞にトランスフェクションしてＣＨＯ細胞を
形質転換した。
に発現する細胞株の取得 〔４〕により作製された発現ベクターｐＨＬ１６ＳＲ１
３２５を常法〔モレキュラー・クローニング，セカンド
エディション(Molecular Cloning second edition),
（１９８９），コールド スプリング ハーバー ラボ
ラトリー プレス(Cold Spring Harbor Lab. Press) 〕
に従い、組換え体の大腸菌ＤＨ１株から回収、精製し、
該発現プラスミドＤＮＡを大量に得た。該プラスミドＤ
ＮＡを用いてAusubel らの方法〔カレント プロトコー
ルズ インモレキュラー バイオロジー(Current Proto
cols in Molecular Biology)，グリーン パブリッシン
グアソシエイツ アンド ウイリー−インターサイエン
ス(Greene Publishing Associates and Wiley-Intersci
ence),９・１・１章〜９・１・４章,(１９８７）〕を基
にＣＨＯ細胞にトランスフェクションしてＣＨＯ細胞を
形質転換した。
【００４７】すなわちまず直径６cmのシャーレの中でＦ
ＣＳ（牛胎児血清）が１０％入ったＨａｍ Ｆ−１２培
地中でＣＨＯ細胞をセミコンフルエントな状態になる様
培養した。次にシャーレから培地を除き、そこにＤＮＡ
溶液を滴加するが、ＤＮＡ溶液は予め次に示す手順に従
って調製した。まず直径６cmのシャーレ一枚につき３０
０μｌの２ｘＨＥＢＳ溶液（２ｘＨＥＢＳ溶液；１．６
％塩化ナトリウム ０．０７４％塩化カリウム ０．０
５％燐酸水素二ナトリウム１２水塩 ０．２％デキスト
ロース １％ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０５））と１０μｇ
の該プラスミドＤＮＡを加え、滅菌水で５７０μｌに合
わせた溶液をエッペンドルフ遠心管中に準備する。次に
該ＤＮＡ溶液に３０μｌの２．５Ｍの塩化カルシウム溶
液を滴加しながらボルテックスミキサーを用い１〜２秒
間激しく混和する。これを室温で３０分間放置するが、
その間およそ１０分おきにボルテックスミキサーで混和
する。この様にしてできたＤＮＡ溶液を前述の細胞にか
けて室温で３０分間静置した。その後ＦＣＳが１０％入
ったＨａｍ Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）５mlをシ
ャーレに加え、３７℃、５％ＣＯ2 存在下で４〜５時間
培養した。次にシャーレから培地を除き５mlの１ｘＴＢ
Ｓ++溶液（１ｘＴＢＳ++溶液；２５mMトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．５），１４０mM塩化ナトリウム，５mM塩化カリウ
ム，０．６mM燐酸水素二ナトリウム，０．０８mM塩化カ
ルシウム，０．０８mM塩化マグネシウム）で細胞を洗浄
し、１ｘＴＢＳ++溶液を除去した後、グリセロールを２
０％含む１ｘＴＢＳ++溶液を５ml細胞にかけて室温で１
〜２分間静置した後、上清を除去した。その後５mlの１
ｘＴＢＳ++溶液で細胞を再び洗浄し、ＦＣＳが１０％入
ったＨａｍ Ｆ−１２培地５mlをシャーレに入れ、３７
℃、５％ＣＯ2 存在下で培養し、４８時間が経過した時
点で培地を除き、５mlの１ｘＴＢＳ++溶液で細胞を洗浄
した後、細胞にトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社）
１mlをかけ、室温で３０秒静置した。その後トリプシン
−ＥＤＴＡ溶液を除き５分後にＦＣＳが１０％入ったＨ
ａｍ Ｆ−１２培地５mlをシャーレに入れて細胞を剥し
５cmシャーレ一枚分の細胞を９cmシャーレ１０枚に分け
て薬剤Ｇ４１８（Ｇ４１８硫酸塩(GENETICIN);ＧＩＢＣ
Ｏ社）を６００μｇ／ｍｌの濃度になるように加えて培
養を続けた。その後１０日が経過した時点で生き残った
Ｇ４１８に耐性の細胞を単離し、一つの培養用の穴がお
よそ３．１cm2 の２４穴の培養皿の中で、それぞれＦＣ
Ｓが１０％入ったＨａｍ Ｆ−１２培地１ml中でおよそ
７日間培養した。
ＣＳ（牛胎児血清）が１０％入ったＨａｍ Ｆ−１２培
地中でＣＨＯ細胞をセミコンフルエントな状態になる様
培養した。次にシャーレから培地を除き、そこにＤＮＡ
溶液を滴加するが、ＤＮＡ溶液は予め次に示す手順に従
って調製した。まず直径６cmのシャーレ一枚につき３０
０μｌの２ｘＨＥＢＳ溶液（２ｘＨＥＢＳ溶液；１．６
％塩化ナトリウム ０．０７４％塩化カリウム ０．０
５％燐酸水素二ナトリウム１２水塩 ０．２％デキスト
ロース １％ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０５））と１０μｇ
の該プラスミドＤＮＡを加え、滅菌水で５７０μｌに合
わせた溶液をエッペンドルフ遠心管中に準備する。次に
該ＤＮＡ溶液に３０μｌの２．５Ｍの塩化カルシウム溶
液を滴加しながらボルテックスミキサーを用い１〜２秒
間激しく混和する。これを室温で３０分間放置するが、
その間およそ１０分おきにボルテックスミキサーで混和
する。この様にしてできたＤＮＡ溶液を前述の細胞にか
けて室温で３０分間静置した。その後ＦＣＳが１０％入
ったＨａｍ Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）５mlをシ
ャーレに加え、３７℃、５％ＣＯ2 存在下で４〜５時間
培養した。次にシャーレから培地を除き５mlの１ｘＴＢ
Ｓ++溶液（１ｘＴＢＳ++溶液；２５mMトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．５），１４０mM塩化ナトリウム，５mM塩化カリウ
ム，０．６mM燐酸水素二ナトリウム，０．０８mM塩化カ
ルシウム，０．０８mM塩化マグネシウム）で細胞を洗浄
し、１ｘＴＢＳ++溶液を除去した後、グリセロールを２
０％含む１ｘＴＢＳ++溶液を５ml細胞にかけて室温で１
〜２分間静置した後、上清を除去した。その後５mlの１
ｘＴＢＳ++溶液で細胞を再び洗浄し、ＦＣＳが１０％入
ったＨａｍ Ｆ−１２培地５mlをシャーレに入れ、３７
℃、５％ＣＯ2 存在下で培養し、４８時間が経過した時
点で培地を除き、５mlの１ｘＴＢＳ++溶液で細胞を洗浄
した後、細胞にトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社）
１mlをかけ、室温で３０秒静置した。その後トリプシン
−ＥＤＴＡ溶液を除き５分後にＦＣＳが１０％入ったＨ
ａｍ Ｆ−１２培地５mlをシャーレに入れて細胞を剥し
５cmシャーレ一枚分の細胞を９cmシャーレ１０枚に分け
て薬剤Ｇ４１８（Ｇ４１８硫酸塩(GENETICIN);ＧＩＢＣ
Ｏ社）を６００μｇ／ｍｌの濃度になるように加えて培
養を続けた。その後１０日が経過した時点で生き残った
Ｇ４１８に耐性の細胞を単離し、一つの培養用の穴がお
よそ３．１cm2 の２４穴の培養皿の中で、それぞれＦＣ
Ｓが１０％入ったＨａｍ Ｆ−１２培地１ml中でおよそ
７日間培養した。
【００４８】この時一部の細胞を、ラブテック チャン
バー スライド(Lab-Tek Chamber Slides, Nunc4808;日
本インターメッド社製）で一晩培養した。培養したスラ
イドをリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）でリンスした
後、冷アセトン・メタノール（１：１）混液に浸し−２
０℃に１５分間置き細胞を固定した。次にこのスライド
グラス上に固定した細胞を、ＰＢＳで２０倍に希釈した
Ｃ型肝炎患者血清と３７℃で３０分間反応させた。次に
このスライドグラスを、ＰＢＳで３回各５分間洗浄し、
ＰＢＳで５０倍に希釈したＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩ
ｇＧ（ダコ・ジャパン社製）と３７℃で３０分間反応さ
せた。次にこのスライドグラスを、ＰＢＳで３回各５分
間洗浄し、ろ紙にはさんで乾燥させた後、グリセリンで
封入し蛍光顕微鏡で観察した。この様にして陽性細胞を
スクリーニングしながら、連続３回の限界希釈によりＥ
２／ＮＳ１蛋白質を持続的に産生する細胞株１３Ｌ２０
を樹立した。
バー スライド(Lab-Tek Chamber Slides, Nunc4808;日
本インターメッド社製）で一晩培養した。培養したスラ
イドをリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）でリンスした
後、冷アセトン・メタノール（１：１）混液に浸し−２
０℃に１５分間置き細胞を固定した。次にこのスライド
グラス上に固定した細胞を、ＰＢＳで２０倍に希釈した
Ｃ型肝炎患者血清と３７℃で３０分間反応させた。次に
このスライドグラスを、ＰＢＳで３回各５分間洗浄し、
ＰＢＳで５０倍に希釈したＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩ
ｇＧ（ダコ・ジャパン社製）と３７℃で３０分間反応さ
せた。次にこのスライドグラスを、ＰＢＳで３回各５分
間洗浄し、ろ紙にはさんで乾燥させた後、グリセリンで
封入し蛍光顕微鏡で観察した。この様にして陽性細胞を
スクリーニングしながら、連続３回の限界希釈によりＥ
２／ＮＳ１蛋白質を持続的に産生する細胞株１３Ｌ２０
を樹立した。
【００４９】〔６〕１３Ｌ２０細胞とＣ型肝炎患者血清
の反応性の検討 〔５〕により樹立されたＥ２／ＮＳ１蛋白質を持続的に
産生する１３Ｌ２０細胞を、ラブテック チャンバー
スライド(Lab-Tek Chamber Slides, Nunc4808;日本イン
ターメッド社製）で一晩培養し、冷アセトン・メタノー
ルで固定したものに、５９サンプルのＣ型肝炎患者血清
を反応させ、前述の通り洗浄し二次抗体と反応させたも
のを蛍光顕微鏡で観察したところ、５３サンプルが陽性
と判定された。この５９サンプルの血清は、ＨＣＶのエ
ンベロープ領域を持続的に産生しているＣＨＯ細胞にお
いて、６サンプルのみが陽性と判定されたものである。
の反応性の検討 〔５〕により樹立されたＥ２／ＮＳ１蛋白質を持続的に
産生する１３Ｌ２０細胞を、ラブテック チャンバー
スライド(Lab-Tek Chamber Slides, Nunc4808;日本イン
ターメッド社製）で一晩培養し、冷アセトン・メタノー
ルで固定したものに、５９サンプルのＣ型肝炎患者血清
を反応させ、前述の通り洗浄し二次抗体と反応させたも
のを蛍光顕微鏡で観察したところ、５３サンプルが陽性
と判定された。この５９サンプルの血清は、ＨＣＶのエ
ンベロープ領域を持続的に産生しているＣＨＯ細胞にお
いて、６サンプルのみが陽性と判定されたものである。
【００５０】実施例２ １９９１年１０月７日出願の特許出願（発明の名称「Ｃ
型肝炎ウイルス由来の遺伝子またはＤＮＡ断片、それが
コードするポリペプチド」）の明細書に記載の実施例４
〔３〕で得られたＤＮＡ断片をテンプレートとして、本
発明の実施例１に記載のプライマーを用いた同様の方法
でＰＣＲ反応を行い、配列表の配列番号１のクローンＪ
１−１３２５と同様な領域のＤＮＡ断片を得ることがで
きる。該領域はクローンＪ１−１３２５と同様にＥ２／
ＮＳ１蛋白質をコードするＤＮＡ断片である。例えば、
上記１９９１年１０月７日出願の特許出願明細書に記載
の配列番号１９の塩基配列のＤＮＡ断片クロ−ンＮ２７
ＭＸ２４Ａ−１をテンプレートに用いて、プラスミドｐ
ＵＣＮ２７ＭＸ２４Ａ−２を得た。該プラスミドにクロ
ーニングされたＥ２／ＮＳ１蛋白質をコードするＤＮＡ
断片の塩基配列は、配列表の配列番号２に記載された通
りである。さらに、実施例１の〔４〕〜〔５〕と同様の
方法により、Ｅ２／ＮＳ１蛋白質持続産生細胞株ＭＫ２
７２４Ａ２を樹立した。次に該細胞株を用いて、実施例
１の〔６〕と同様の方法により、実施例１の〔６〕と同
一のサンプル血清の反応性を調べたところ、実施例１の
〔６〕と同様の結果を得た。
型肝炎ウイルス由来の遺伝子またはＤＮＡ断片、それが
コードするポリペプチド」）の明細書に記載の実施例４
〔３〕で得られたＤＮＡ断片をテンプレートとして、本
発明の実施例１に記載のプライマーを用いた同様の方法
でＰＣＲ反応を行い、配列表の配列番号１のクローンＪ
１−１３２５と同様な領域のＤＮＡ断片を得ることがで
きる。該領域はクローンＪ１−１３２５と同様にＥ２／
ＮＳ１蛋白質をコードするＤＮＡ断片である。例えば、
上記１９９１年１０月７日出願の特許出願明細書に記載
の配列番号１９の塩基配列のＤＮＡ断片クロ−ンＮ２７
ＭＸ２４Ａ−１をテンプレートに用いて、プラスミドｐ
ＵＣＮ２７ＭＸ２４Ａ−２を得た。該プラスミドにクロ
ーニングされたＥ２／ＮＳ１蛋白質をコードするＤＮＡ
断片の塩基配列は、配列表の配列番号２に記載された通
りである。さらに、実施例１の〔４〕〜〔５〕と同様の
方法により、Ｅ２／ＮＳ１蛋白質持続産生細胞株ＭＫ２
７２４Ａ２を樹立した。次に該細胞株を用いて、実施例
１の〔６〕と同様の方法により、実施例１の〔６〕と同
一のサンプル血清の反応性を調べたところ、実施例１の
〔６〕と同様の結果を得た。
【００５１】
【００５２】配列番号：1 配列の長さ：1207 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：No 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：J1-1325 配列 G ATC CCA CAA GCT GTC ATG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC 49 Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val 1 5 10 15 CTA GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT 97 Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 20 25 30 TTG ATT GTG ATG CTA CTC TTT GCC GGC GTT GAC GGG CAT ACC CGC GTG 145 Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val 35 40 45 ACG GGG GGG GTG CAA GGC CAT GTC ACC TCT ACA CTC ACG TCC CTC TTT 193 Thr Gly Gly Val Gln Gly His Val Thr Ser Thr Leu Thr Ser Leu Phe 50 55 60 AGA CCT GGG GCG TCC CAG AAA ATT CAG CTT GTA AAC ACC AAT GGC AGT 241 Arg Pro Gly Ala Ser Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser 65 70 75 80 TGG CAT ATC AAC AGG ACT GCC CTG AAC TGC AAT GAC TCC CTC AAA ACT 289 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Lys Thr 85 90 95 GGG TTT CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACA CAC AAG TTC AAC GCG TCC GGA 337 Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Lys Phe Asn Ala Ser Gly 100 105 110 TGC CCG GAG CGC ATG GCC AGC TGT CGC TCC ATT GAC AAG TTC GAC CAG 385 Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys Phe Asp Gln 115 120 125 GGA TGG GGT CCC ATC ACC TAT GCT CAA CCT GAC AAC TCG GAC CAG AGG 433 Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Ala Gln Pro Asp Asn Ser Asp Gln Arg 130 135 140 CCG TAT TGC TGG CAC TAC GCA CCT CGA CAG TGT GGT ATC GTA CCC GCG 481 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Gln Cys Gly Ile Val Pro Ala 145 150 155 160 TCG CAG GTG TGC GGT CCA GTG TAT TGC TTC ACC CCA AGC CCT GTT GTA 529 Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val 165 170 175 GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGC GCC CCT ACG TAT AAC TGG GGG GAC 577 Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Asp 180 185 190 AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTC CTA AAC AAC ACG CGG CCG CCG CAT GGC 625 Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro His Gly 195 200 205 AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG ATG AAT AGC ACT GGG TTC ACC AAG ACG 673 Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr 210 215 220 TGC GGA GGC CCC CCG TGT AAC ATC AGG GGG GTC GGC AAC AAC ACC TTG 721 Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Arg Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu 225 230 235 240 ACC TGC CCC ACG GAC TGC TTC CGG AAG CAC CCC GAC GCC ACT TAC ACA 769 Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Asp Ala Thr Tyr Thr 245 250 255 AAA TGT GGT TCG GGC CCT TGG TTG ACA CCT AGG TGC TTG GTT GAC TAC 817 Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Leu Val Asp Tyr 260 265 270 CCA TAC AGG CTC TGG CAC TAC CCC TGC ACT GTC AAC TTT ACC ATC TTC 865 Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe 275 280 285 AAG GTT AGG ATG TAT GTG GGG GGC GTG GAG CAC AGG CTT GAT GCT GCA 913 Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Asp Ala Ala 290 295 300 TGC AAC TGG ACT CGA GGA GAG CGT TGC GAC TTG GAG GAC AGG GAT AGA 961 Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg 305 310 315 320 GCA GAG CTC AGC CCG CTA CTG CTG TCT ACG ACA GAG TGG CAG GTA CTG 1009 Ala Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Val Leu 325 330 335 CCC TGT TCC TTC ACC ACC CTA CCG GCT CTG TCC ACT GGT CTA ATC CAT 1057 Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His 340 345 350 CTC CAT CAG AAC GTC GTG GAC GTG CAA TAC CTG TAC GGT ATA GGG TCA 1105 Leu His Gln Asn Val Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Ile Gly Ser 355 360 365 GCA GTT GTC TCC TTT GTA ATC AAA TGG GAG TAT GTC CTG TTG CTT TTC 1153 Ala Val Val Ser Phe Val Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu Leu Leu Phe 370 375 380 CTT CTC CTG GCT GAC GCA CGC GTC TGT GCC TGC TTG TGG ATG ATG CTG 1201 Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu 385 390 395 400 CTG ATA 1207 Leu Ile
【００５３】配列番号：2 配列の長さ：1207 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：No 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：N27MX24A-2 配列 G ATC CCA CAA GCC GTG GTG GAT ATG GTG GCA GGG GCC CAC TGG GGA GTC 49 Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val 1 5 10 15 CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTC 97 Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 20 25 30 TTG GTT GTG ATG CTG CTC TTC GCC GGT GTT GAC GGG GGG ACC CAC GTG 145 Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly Gly Thr His Val 35 40 45 ACA GGG GGG AAG GTA GCC TAC ACC ACC CAG GGC TTT ACA CCC TTC TTT 193 Thr Gly Gly Lys Val Ala Tyr Thr Thr Gln Gly Phe Thr Pro Phe Phe 50 55 60 TCA CGA GGG CCG TCT CAG AAA ATC CAA CTT GTA AAC ACT AAC GGC AGC 241 Ser Arg Gly Pro Ser Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser 65 70 75 80 TGG CAC ATC AAT AGG ACT GCC CTC AAT TGC AAT GAC TCC CTT AAC ACC 289 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr 85 90 95 GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACC CAC AGC TTC AAC GCG TCC GGA 337 Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Ser Phe Asn Ala Ser Gly 100 105 110 TGT CCG GAG CGT ATG GCC GGT TGC CGC CCC ATT GAC GAG TTC GCT CAG 385 Cys Pro Glu Arg Met Ala Gly Cys Arg Pro Ile Asp Glu Phe Ala Gln 115 120 125 GGG TGG GGT CCC ATC ACT CAT GTT GTG CCT AAC ATC TCG GAC CAG AGG 433 Gly Trp Gly Pro Ile Thr His Val Val Pro Asn Ile Ser Asp Gln Arg 130 135 140 CCC TAT TGC TGG CAC TAC GCG CCT CGA CCG TGT GGT ATC GTA CCC GCG 481 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala 145 150 155 160 TCG CAG GTG TGT GGT CCG GTG TAT TGC TTC ACC CCA AGC CCT GTT GTG 529 Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val 165 170 175 GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGC GCC CCC ACG TAC AAC TGG GGA AAC 577 Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Asn 180 185 190 AAT GAG ACG GAT GTG CTA CTC CTC AAC AAC ACA CGG CCG CCG CAG GGC 625 Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Gln Gly 195 200 205 AAC TGG TTC GGT TGT ACC TGG ATG AAT GGC ACT GGG TTC ACA AAG ACG 673 Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr 210 215 220 TGC GGG GGC CCC CCG TGC AAC ATC GGG GGG GTC GGC AAC AAT ACC TTG 721 Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu 225 230 235 240 ACT TGC CCC ACG GAC TGC TTC CGG AAG CAC CCC GAG GCC ACT TAC ACA 769 Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr 245 250 255 AAA TGT GGT TCG GGG CCT TGG TTG ACG CCT AGG TGC CTA GTT CAT TAC 817 Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Leu Val His Tyr 260 265 270 CCA TAC AGG CTC TGG CAC TAT CCC TGC ACT GTC AAC TTT ACC ATC TTC 865 Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe 275 280 285 AAG GTT AGG ATG TAT GTG GGG GGC GTG GAA CAC AGG CTT GAA GCT GCA 913 Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu Ala Ala 290 295 300 TGC AAT TGG ACC CGA GGA GAG CGT TGT GAC TTG GAG GAC AGG GAT AGA 961 Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg 305 310 315 320 TCA GAG CTT AGC CCG CTA TTG CTG TCC ACA ACA GAG TGG CAG GTA CTG 1009 Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Val Leu 325 330 335 CCC TGT TCC TTC ACC ACC CTG CCG GCT CTG TCC ACT GGT TTG ATT CAT 1057 Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His 340 345 350 CTC CAT CAG AAC ATC GTG GAC GTG CAA TAT CTG TAC GGC ATA GGG TCG 1105 Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Ile Gly Ser 355 360 365 GCG GTT GTC TCC TTC GCA ATC AAA TGG GAA TAT ATT CTG TTG CTT TTC 1153 Ala Val Val Ser Phe Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Ile Leu Leu Leu Phe 370 375 380 CTC CTC CTG GCG GAC GCG CGC GTC TGT GCC TGC TTG TGG ATG ATG CTG 1201 Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu 385 390 395 400 CTG ATA 1207 Leu Ile
【００５４】配列番号：3 配列の長さ：402 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：N27,N19,H19,Y19,MX24 配列 Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val 1 5 10 15 Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 20 25 30 Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly Gly Thr His Val Arg 35 40 45 Thr Gly Gly Lys Val Ala Tyr Thr Thr Gln Gly Phe Thr Pro Phe Phe Arg Ser Ser 50 55 60 Ser Arg Gly Pro Ser Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Arg 65 70 75 80 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr Gln 85 90 95 Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Ser Phe Asn Ala Ser Gly Thr Arg Asp 100 105 110 Cys Pro Glu Arg Met Ala Gly Cys Arg Pro Ile Asp Glu Phe Ala Gln Ser Ser 115 120 125 Gly Trp Gly Pro Ile Thr His Val Val Pro Asn Ile Ser Asp Gln Arg Asp Asp Val 130 135 140 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Val 145 150 155 160 Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Trp 165 170 175 Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Asn Ser Thr Ala 180 185 190 Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Gln Gly 195 200 205 Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr 210 215 220 Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu 225 230 235 240 Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr 245 250 255 Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Leu Val His Tyr 260 265 270 Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe 275 280 285 Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu Ala Ala 290 295 300 Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg 305 310 315 320 Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Val Leu 325 330 335 Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His 340 345 350 Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Ile Gly Ser 355 360 365 Ala Val Val Ser Phe Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Ile Leu Leu Leu Phe 370 375 380 Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu 385 390 395 400 Leu Ile
【００５５】配列番号：4 配列の長さ：1207 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：No 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：BK164 配列 G ATC CCA CAA GCC GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC 49 Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val 1 5 10 15 CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GCG GGG AAC TGG GCT AAG GTT 97 Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Gly Asn Trp Ala Lys Val 20 25 30 CTG ATT GTG ATG CTA CTT TTT GCT GGC GTT GAC GGG GAT ACC CAC GTG 145 Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly Asp Thr His Val 35 40 45 ACA GGG GGG GCG CAA GCC AAA ACC ACC AAC AGG CTC GTG TCC ATG TTC 193 Thr Gly Gly Ala Gln Ala Lys Thr Thr Asn Arg Leu Val Ser Met Phe 50 55 60 GCA AGT GGG CCG TCT CAG AAA ATC CAG CTT ATA AAC ACC AAT GGG AGT 241 Ala Ser Gly Pro Ser Gln Lys Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser 65 70 75 80 TGG CAC ATC AAC AGG ACT GCC CTG AAC TGC AAT GAC TCT CTC CAG ACT 289 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr 85 90 95 GGG TTT CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACA CAT AGT TTC AAC TCG TCC GGG 337 Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Ser Phe Asn Ser Ser Gly 100 105 110 TGC CCA GAG CGC ATG GCC CAG TGC CGC ACC ATT GAC AAG TTC GAC CAG 385 Cys Pro Glu Arg Met Ala Gln Cys Arg Thr Ile Asp Lys Phe Asp Gln 115 120 125 GGA TGG GGT CCC ATT ACT TAT GCT GAG TCT AGC AGA TCA GAC CAG AGG 433 Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Ala Glu Ser Ser Arg Ser Asp Gln Arg 130 135 140 CCA TAT TGC TGG CAC TAC CCA CCT CCA CAA TGT ACC ATC GTA CCT GCG 481 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Pro Gln Cys Thr Ile Val Pro Ala 145 150 155 160 TCG GAG GTG TGC GGC CCA GTG TAC TGC TTC ACC CCA AGC CCT GTC GTC 529 Ser Glu Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val 165 170 175 GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGT GTC CCT ACG TAT AGA TGG GGG GAG 577 Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Arg Trp Gly Glu 180 185 190 AAC GAG ACT GAC GTG CTG CTG CTC AAC AAC ACG CGG CCG CCG CAA GGC 625 Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Gln Gly 195 200 205 AAC TGG TTC GGC TGC ACA TGG ATG AAT AGC ACC GGG TTC ACC AAG ACA 673 Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr 210 215 220 TGT GGG GGG CCC CCC TGT AAC ATC GGG GGG GTC GGC AAC AAC ACC CTG 721 Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu 225 230 235 240 ACC TGC CCC ACG GAC TGC TTC CGG AAG CAC CCC GAG GCT ACC TAC ACA 769 Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr 245 250 255 AAA TGT GGT TCG GGG CCT TGG CTG ACA CCT AGG TGC ATG GTT GAC TAT 817 Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val Asp Tyr 260 265 270 CCA TAC AGG CTC TGG CAT TAC CCC TGC ACT GTT AAC TTT ACC ATC TTC 865 Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe 275 280 285 AAG GTT AGG ATG TAT GTG GGG GGG GTG GAG CAC AGG CTC AAT GCT GCA 913 Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Asn Ala Ala 290 295 300 TGC AAT TGG ACC CGA GGA GAG CGT TGT GAC TTG GAG GAC AGG GAT AGG 961 Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg 305 310 315 320 CCG GAG CTC AGC CCG CTG CTG CTG TCT ACA ACA GAG TGG CAG GTA CTG 1009 Pro Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Val Leu 325 330 335 CCC TGT TCC TTC ACC ACC CTA CCA GCT CTG TCC ACT GGC TTG ATT CAC 1057 Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His 340 345 350 CTC CAT CAG AAC ATC GTG GAC GTG CAA TAC CTA TAC GGT ATA GGG TCA 1105 Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Ile Gly Ser 355 360 365 GCG GTT GTC TCC TTT GCA ATC AAA TGG GAG TAT GTC CTG TTG CTT TTC 1153 Ala Val Val Ser Phe Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu Leu Leu Phe 370 375 380 CTT CTC CTA GCG GAC GCA CGT GTC TGT GCC TGC TTG TGG ATG ATG CTG 1201 Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu 385 390 395 400 CTG ATA 1207 Leu Ile
【００５６】配列番号：5 配列の長さ：1207 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：No 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：HCV-J 配列 G ATC CCA CAA GCC GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGT GTC 49 Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val 1 5 10 15 CTA GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTC 97 Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 20 25 30 TTG ATT GTG ATG CTA CTC TTT GCT GGC GTT GAC GGG CAC ACC CAC GTG 145 Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His Thr His Val 35 40 45 ACA GGG GGA AGG GTA GCC TCC AGC ACC CAG AGC CTC GTG TCC TGG CTC 193 Thr Gly Gly Arg Val Ala Ser Ser Thr Gln Ser Leu Val Ser Trp Leu 50 55 60 TCA CAA GGC CCA TCT CAG AAA ATC CAA CTC GTG AAC ACC AAC GGC AGC 241 Ser Gln Gly Pro Ser Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser 65 70 75 80 TGG CAC ATC AAC AGG ACC GCT CTG AAT TGC AAT GAC TCC CTC CAA ACT 289 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr 85 90 95 GGG TTC ATT GCT GCG CTG TTC TAC GCA CAC AGG TTC AAC GCG TCC GGG 337 Gly Phe Ile Ala Ala Leu Phe Tyr Ala His Arg Phe Asn Ala Ser Gly 100 105 110 TGC CCA GAG CGC ATG GCT AGC TGC CGC CCC ATC GAT GAG TTC GCT CAG 385 Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile Asp Glu Phe Ala Gln 115 120 125 GGG TGG GGT CCC ATC ACT CAT GAT ATG CCT GAG AGC TCG GAC CAG AGG 433 Gly Trp Gly Pro Ile Thr His Asp Met Pro Glu Ser Ser Asp Gln Arg 130 135 140 CCA TAT TGC TGG CAC TAC GCG CCT CGA CCG TGC GGG ATC GTG CCT GCG 481 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala 145 150 155 160 TCG CAG GTG TGT GGT CCA GTG TAT TGC TTC ACT CCG AGC CCT GTT GTA 529 Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val 165 170 175 GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGC GCT CCT ACG TAT AGC TGG GGG GAG 577 Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu 180 185 190 AAT GAG ACA GAC GTG CTG CTA CTT AGC AAC ACG CGG CCG CCT CAA GGC 625 Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Ser Asn Thr Arg Pro Pro Gln Gly 195 200 205 AAC TGG TTT GGG TGC ACG TGG ATG AAC AGC ACT GGG TTC ACC AAG ACG 673 Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr 210 215 220 TGC GGG GGC CCT CCG TGC AAC ATC GGG GGG GTC GGC AAC AAC ACC TTG 721 Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu 225 230 235 240 GTC TGC CCC ACG GAT TGC TTC CGG AAG CAC CCC GAG GCC ACT TAC ACA 769 Val Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr 245 250 255 AAG TGT GGC TCG GGG CCC TGG TTG ACA CCC AGG TGC ATG GTT GAC TAC 817 Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val Asp Tyr 260 265 270 CCA TAC AGG CTC TGG CAC TAC CCC TGC ACT GTT AAC TTT ACC GTC TTT 865 Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Val Phe 275 280 285 AAG GTC AGG ATG TAT GTG GGG GGC GTG GAG CAC AGG CTC AAT GCT GCA 913 Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Asn Ala Ala 290 295 300 TGC AAT TGG ACT CGA GGA GAG CGC TGT GAC TTG GAG GAC AGG GAT AGG 961 Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg 305 310 315 320 TCA GAA CTC AGC CCG CTG CTG CTG TCT ACA ACA GAG TGG CAG ATA CTG 1009 Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ile Leu 325 330 335 CCC TGT TCC TTC ACC ACC CTA CCG GCC CTG TCC ACT GGC TTG ATC CAT 1057 Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His 340 345 350 CTT CAC CGG AAC ATC GTG GAC GTG CAA TAC CTG TAC GGT ATA GGG TCG 1105 Leu His Arg Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Ile Gly Ser 355 360 365 GCA GTT GTC TCC TTT GCA ATC AAA TGG GAG TAT ATC CTG TTG CTT TTC 1153 Ala Val Val Ser Phe Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Ile Leu Leu Leu Phe 370 375 380 CTT CTT CTG GCG GAC GCG CGC GTC TGT GCC TGC TTG TGG ATG ATG CTG 1201 Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu 385 390 395 400 CTG ATA 1207 Leu Ile
【００５７】配列番号：6 配列の長さ：1207 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：No 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：HCV-RNA33 配列 G ATC CCG CAA GCT GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC 49 Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val 1 5 10 15 CTG GCG GGC CTG GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT 97 Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 20 25 30 TTG ATT GTG ATG CTA CTC TTT GCC GGC GTT GAC GGG CAA ACC TAT ACG 145 Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly Gln Thr Tyr Thr 35 40 45 ACG GGG GGG GCG GTT GCC CGC ACC ACC ACC GGG TTC GCG TCC CTC TTC 193 Thr Gly Gly Ala Val Ala Arg Thr Thr Thr Gly Phe Ala Ser Leu Phe 50 55 60 TCC GCT GGG TCG CAG GAG AAC ATC CAG CTT ATA AAC ACC AAT GGC AGC 241 Ser Ala Gly Ser Gln Glu Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser 65 70 75 80 TGG CAC ATC AAC AGG ACT GCC CTG AAC TGC AAC GAC TCC CTC AAC ACT 289 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr 85 90 95 GGA TTT CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACA CAC AAG TTC AAC TCA TCC AGA 337 Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Lys Phe Asn Ser Ser Arg 100 105 110 GCC GAG AGC GTA TTG GCC AGC TGC CGC TTC ATC GAC GAG TTC GAT CAG 385 Ala Glu Ser Val Leu Ala Ser Cys Arg Phe Ile Asp Glu Phe Asp Gln 115 120 125 GGA TGG GGC CCC ATC ACT TAC ACC GAG CGT AAC AGT TCG GAC CAG AGG 433 Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Thr Glu Arg Asn Ser Ser Asp Gln Arg 130 135 140 CCT TAT TGC TGG CAC TAT CCA CCC CGA CAG TGT GGT ATC ATA CCC GCG 481 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Gln Cys Gly Ile Ile Pro Ala 145 150 155 160 TCG GAG GTG TGC GGT CCA GTG TAT TGT TTC ACC CCA AGC CCT GTT GTG 529 Ser Glu Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val 165 170 175 GTG GGG ACA ACC GAT CGG TTC GGT GTC CCT ACA TAC AGC TGG GGG GAG 577 Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu 180 185 190 AAT GAG ACG GAC GTG CTG GTT CTC AAC AAC ACG CGG CCG CCG CAG GGC 625 Asn Glu Thr Asp Val Leu Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Gln Gly 195 200 205 AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG ATG AAT GGC ACT GGT TTC ACC AAG ACA 673 Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr 210 215 220 TGC GGG GGT CCC CCG TGT CAC ATC GGG GGG CGC GGC AAC AAC ACC CTG 721 Cys Gly Gly Pro Pro Cys His Ile Gly Gly Arg Gly Asn Asn Thr Leu 225 230 235 240 ACT TGC CCC ACG GAC TGC TTC CGG AAG CAT CCC GAG GCT ACG TAT ACA 769 Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr 245 250 255 AAA TGT GGT TCG GGG CCT TGG TTG ACA CCT AGG TGC ATG GTT GAT TAC 817 Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val Asp Tyr 260 265 270 CCA TAC AGG CTC TGG CAC TAC CCC TGC ACT GTC AAC TTT ACC ACC TTT 865 Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Thr Phe 275 280 285 AAG GTT AGG ATG TAT GTG GGG GGC GTG GAG CAC AGG CTC ATT GCT GCA 913 Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Ile Ala Ala 290 295 300 TGC AAT TGG ACT CGA GGA GAC CGT TGT AAC TTG GAG GAC AGG GAT AGA 961 Cys Asn Trp Thr Arg Gly Asp Arg Cys Asn Leu Glu Asp Arg Asp Arg 305 310 315 320 TCA GAG CTT AGT CCG CTG CTG CTG TCT ACG ACA GAG TGG CAG ATA CTG 1009 Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ile Leu 325 330 335 CCC TGT TCC TTC ACC ACC CTA CCG GCT CTC TCC ACC GGT TTG ATC CAT 1057 Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His 340 345 350 CTC CAT CAG AAC ATC GTG GAC GTG CAA TAC CTG TAC GGT ATA GGG TCT 1105 Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Ile Gly Ser 355 360 365 GCT GTT GTC TCC ATT GCA ATC AGG TGG GAA TAT GTC CTG TTG CTT TTC 1153 Ala Val Val Ser Ile Ala Ile Arg Trp Glu Tyr Val Leu Leu Leu Phe 370 375 380 CTT CTC CTG GCG GAC GCG CGT GTC TGT GCC TGC TTG TGG ATG ATG CTG 1201 Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu 385 390 395 400 CTG ATA 1207 Leu Ile
【００５８】配列番号：7 配列の長さ：1207 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：No 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：HCV1 配列 G ATC CCA CAA GCC ATC TTG GAC ATG ATC GCT GGT GCT CAC TGG GGA GTC 49 Ile Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp Gly Val 1 5 10 15 CTG GCG GGC ATA GCG TAT TTC TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCG AAG GTC 97 Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 20 25 30 CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC GGC GTC GAC GCG GAA ACC CAC GTC 145 Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr His Val 35 40 45 ACC GGG GGA AGT GCC GGC CAC ACT GTG TCT GGA TTT GTT AGC CTC CTC 193 Thr Gly Gly Ser Ala Gly His Thr Val Ser Gly Phe Val Ser Leu Leu 50 55 60 GCA CCA GGC GCC AAG CAG AAC GTC CAG CTG ATC AAC ACC AAC GGC AGT 241 Ala Pro Gly Ala Lys Gln Asn Val Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser 65 70 75 80 TGG CAC CTC AAT AGC ACG GCC CTG AAC TGC AAT GAT AGC CTC AAC ACC 289 Trp His Leu Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr 85 90 95 GGC TGG TTG GCA GGG CTT TTC TAT CAC CAC AAG TTC AAC TCT TCA GGC 337 Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr His His Lys Phe Asn Ser Ser Gly 100 105 110 TGT CCT GAG AGG CTA GCC AGC TGC CGA CCC CTT ACC GAT TTT GAC CAG 385 Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Pro Leu Thr Asp Phe Asp Gln 115 120 125 GGC TGG GGC CCT ATC AGT TAT GCC AAC GGA AGC GGC CCC GAC CAG CGC 433 Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Pro Asp Gln Arg 130 135 140 CCC TAC TGC TGG CAC TAC CCC CCA AAA CCT TGC GGT ATT GTG CCC GCG 481 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala 145 150 155 160 AAG AGT GTG TGT GGT CCG GTA TAT TGC TTC ACT CCC AGC CCC GTG GTG 529 Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val 165 170 175 GTG GGA ACG ACC GAC AGG TCG GGC GCG CCC ACC TAC AGC TGG GGT GAA 577 Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu 180 185 190 AAT GAT ACG GAC GTC TTC GTC CTT AAC AAT ACC AGG CCA CCG CTG GGC 625 Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Leu Gly 195 200 205 AAT TGG TTC GGT TGT ACC TGG ATG AAC TCA ACT GGA TTC ACC AAA GTG 673 Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Val 210 215 220 TGC GGA GCG CCT CCT TGT GTC ATC GGA GGG GCG GGC AAC AAC ACC CTG 721 Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu 225 230 235 240 CAC TGC CCC ACT GAT TGC TTC CGC AAG CAT CCG GAC GCC ACA TAC TCT 769 His Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Asp Ala Thr Tyr Ser 245 250 255 CGG TGC GGC TCC GGT CCC TGG ATC ACA CCC AGG TGC CTG GTC GAC TAC 817 Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Leu Val Asp Tyr 260 265 270 CCG TAT AGG CTT TGG CAT TAT CCT TGT ACC ATC AAC TAC ACC ATA TTT 865 Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe 275 280 285 AAA ATC AGG ATG TAC GTG GGA GGG GTC GAA CAC AGG CTG GAA GCT GCC 913 Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu Ala Ala 290 295 300 TGC AAC TGG ACG CGG GGC GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 961 Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg 305 310 315 320 TCC GAG CTC AGC CCG TTA CTG CTG ACC ACT ACA CAG TGG CAG GTC CTC 1009 Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Thr Thr Thr Gln Trp Gln Val Leu 325 330 335 CCG TGT TCC TTC ACA ACC CTA CCA GCC TTG TCC ACC GGC CTC ATC CAC 1057 Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His 340 345 350 CTC CAC CAG AAC ATT GTG GAC GTG CAG TAC TTG TAC GGG GTG GGG TCA 1105 Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser 355 360 365 AGC ATC GCG TCC TGG GCC ATT AAG TGG GAG TAC GTC GTT CTC CTG TTC 1153 Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu Leu Phe 370 375 380 CTT CTG CTT GCA GAC GCG CGC GTC TGC TCC TGC TTG TGG ATG ATG CTA 1201 Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met Met Leu 385 390 395 400 CTC ATA 1207 Leu Ile
【００５９】配列番号：8 配列の長さ：1207 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：No 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：H77 配列 G ATC CCA CAA GCC ATC ATG GAC ATG ATC GCT GGT GCT CAC TGG GGA GTC 49 Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp Gly Val 1 5 10 15 CTG GCG GGC ATA GCG TAT TTC TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCG AAG GTC 97 Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 20 25 30 CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC GGC GTC GAC GCG GAA ACC CAC GTC 145 Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr His Val 35 40 45 ACC GGG GGA AGT GCC GGC CGC ACC ACG GCT GGG CTT GTT GGT CTC CTT 193 Thr Gly Gly Ser Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu Leu 50 55 60 ACA CCA GGC GCC AAG CAG AAC ATC CAA CTG ATC AAC ACC AAC GGC AGT 241 Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser 65 70 75 80 TGG CAC ATC AAT AGC ACG GCC TTG AAC TGC AAT GAA AGC CTT AAC ACC 289 Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu Asn Thr 85 90 95 GGC TGG TTA GCA GGG CTC TTC TAT CAC CAC AAA TTC AAC TCT TCA GGC 337 Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr His His Lys Phe Asn Ser Ser Gly 100 105 110 TGT CCT GAG AGG TTG GCC AGC TGC CGA CGC CTT ACC GAT TTT GCC CAG 385 Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe Ala Gln 115 120 125 GGC TGG GGT CCT ATC AGT TAT GCC AAC GGA AGC GGC CTC GAC GAA CGC 433 Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu Asp Glu Arg 130 135 140 CCC TAC TGC TGG CAC TAC CCT CCA AGA CCT TGT GGC ATT GTG CCC GCA 481 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala 145 150 155 160 AAG AGC GTG TGT GGC CCG GTA TAT TGC TTC ACT CCC AGC CCC GTG GTG 529 Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val 165 170 175 GTG GGA ACG ACC GAC AGG TCG GGC GCG CCT ACC TAC AGC TGG GGT GCA 577 Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Ala 180 185 190 AAT GAT ACG GAT GTC TTC GTC CTT AAC AAC ACC AGG CCA CCG CTG GGC 625 Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Leu Gly 195 200 205 AAT TGG TTC GGT TGT ACC TGG ATG AAC TCA ACT GGA TTC ACC AAA GTG 673 Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Val 210 215 220 TGC GGA GCG CCC CCT TGT GTC ATC GGA GGG GTG GGC AAC AAC ACC TTG 721 Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu 225 230 235 240 CTC TGC CCC ACT GAT TGC TTC CGC AAG CAT CCG GAA GCC ACA TAC TCT 769 Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ser 245 250 255 CGG TGC GGC TCC GGT CCC TGG ATT ACA CCC AGG TGC ATG GTC GAC TAC 817 Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val Asp Tyr 260 265 270 CCG TAT AGG CTT TGG CAC TAT CCT TGT ACC ATC AAT TAC ACC ATA TTC 865 Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe 275 280 285 AAA GTC AGG ATG TAC GTG GGA GGG GTC GAG CAC AGG CTG GAA GCG GCC 913 Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu Ala Ala 290 295 300 TGC AAC TGG ACG CGG GGC GAA CGC TGT GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 961 Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg 305 310 315 320 TCC GAG CTC AGC CCA TTG CTG CTG TCC ACC ACA CAG TGG CAG GTC CTT 1009 Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln Val Leu 325 330 335 CCG TGT TCT TTC ACG ACC CTG CCA GCC TTG TCC ACC GGC CTC ATC CAC 1057 Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His 340 345 350 CTC CAC CAG AAC ATT GTG GAC GTG CAG TAC TTG TAC GGG GTA GGG TCA 1105 Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser 355 360 365 AGC ATC GCG TCC TGG GCC ATT AAG TGG GAG TAC GTC GTT CTC CTG TTC 1153 Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu Leu Phe 370 375 380 CTT CTG CTT GCA GAC GCG CGC GTC TGC TCC TGC TTG TGG ATG ATG TTA 1201 Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met Met Leu 385 390 395 400 CTC ATA 1207 Leu Ile
【００６０】配列番号：9 配列の長さ：1207 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：No 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：H90 配列 G ATC CCA CAA GCC ATC ATG GAT ATG ATC GCT GGT GCT CAC TGG GGA GTC 49 Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp Gly Val 1 5 10 15 CTG GCG GGC ATA GCG TAT TTC TCC ATG GTA GGG AAC TGG GCG AAG GTC 97 Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 20 25 30 CTA GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC GGC GTC GAC GCG GAA ACC CAC GTC 145 Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr His Val 35 40 45 ACC GGG GGA AGT GCC GGC CGC TCC GTG CTT GGG ATT GCT AGT TTC CTT 193 Thr Gly Gly Ser Ala Gly Arg Ser Val Leu Gly Ile Ala Ser Phe Leu 50 55 60 ACA CGA GGC CCC AAG CAG AAC ATC CAG CTG ATC AAA ACC AAC GGC AGT 241 Thr Arg Gly Pro Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Lys Thr Asn Gly Ser 65 70 75 80 TGG CAC ATC AAT AGC ACG GCC CTG AAC TGC AAT GAC AGC CTT AAC GCC 289 Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Asn Ala 85 90 95 GGC TGG ATA GCG GGG CTC TTC TAT CAC CAT GGA TTC AAC TCT TCA GGC 337 Gly Trp Ile Ala Gly Leu Phe Tyr His His Gly Phe Asn Ser Ser Gly 100 105 110 TGT CCT GAG AGG TTG GCC AGC TGC CGA CGC CTT ACC GAT TTT GAC CAG 385 Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe Asp Gln 115 120 125 GGC TGG GGC CCT ATC AGT TAT GCC AAC GGA AGC GGC CCC GAC GAA CGT 433 Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Pro Asp Glu Arg 130 135 140 CCC TAC TGC TGG CAC TAC CCC CCA AGA CCT TGT GGC ATT GTG CCC GCA 481 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala 145 150 155 160 AAG AGC GTG TGT GGC CCG GTA TAC TGC TTC ACT CCC AGC CCC GTG GTG 529 Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val 165 170 175 GTG GGA ACG ACC GAC AGG TCG GGC GCG CCT ACC TAC AAC TGG GGT GAA 577 Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Glu 180 185 190 AAT GAT ACG GAT GTC CTC ATC CTT AAC AAC ACC AGG CCG CCG CTG GGC 625 Asn Asp Thr Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Leu Gly 195 200 205 AAT TGG TTC GGT TGT ACC TGG ATG AAC TCA ACT GGA TTC ACC AAA GTG 673 Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Val 210 215 220 TGC GGA GCG CCC CCT TGT GTC ATC GGA GGG GTG GGC AAC AAC ACC TTG 721 Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu 225 230 235 240 CGC TGC CCC ACT GAT TGT TTC CGC AAG CAT CCG GAA GCC ACA TAC TCT 769 Arg Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ser 245 250 255 CGG TGC GGC TCC GGT CCC TGG ATC ACA CCC AGG TGC ATG GTC CAC TAC 817 Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr 260 265 270 CCG TAT AGG CTT TGG CAC TAT CCT TGT ACC ATC AAT TAC ACT ATA TTT 865 Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe 275 280 285 AAA GTC AGG ATG TAC GTG GGA GGG ATC GAG CAC AGG CTG GAA GCG GCC 913 Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Ile Glu His Arg Leu Glu Ala Ala 290 295 300 TGC AAC TGG ACG CGG GGC GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 961 Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg 305 310 315 320 TCC GAG CTC AGC CCA TTG CTG CTG TCC ACT ACG CAG TGG CAG GTC CTT 1009 Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln Val Leu 325 330 335 CCG TGT TCT TTC ACG ACC CTG CCA GCC TTG TCC ACC GGC CTC ATC CAC 1057 Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His 340 345 350 CTC CAC CAG AAC ATT GTG GAC GTG CAG TAC TTG TAC GGG GTA GGG TCA 1105 Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser 355 360 365 AGC ATC GCG TCC TGG ACC ATC AAG TGG GAG TAC GTC GTT CTC CTG TTC 1153 Ser Ile Ala Ser Trp Thr Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu Leu Phe 370 375 380 CTC CTG CTT GCA GAC GCG CGC GTC TGC TCC TGC TTG TGG ATG ATG TTA 1201 Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met Met Leu 385 390 395 400 CTC ATA 1207 Leu Ile
【００６１】配列番号：10 配列の長さ：523 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：No 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：J1(JM) 配列 G ATC CCA CAA GCC ATC TTG GAT ATG ATC GCT GGT GCT CAC TGG GGA GTC 49 Ile Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp Gly Val 1 5 10 15 CTG GCG GGC ATA GCG TAT TTC TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCG AAG GTC 97 Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 20 25 30 CTG GTA GTG CTG TTG CTG TTT GCC GGC GTC GAC GCG GAA ACC ATC GTC 145 Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr Ile Val 35 40 45 TCC GGG GGA CAA GCC GCC CGC GCC ATG TCT GGA CTT GTT AGT CTC TTC 193 Ser Gly Gly Gln Ala Ala Arg Ala Met Ser Gly Leu Val Ser Leu Phe 50 55 60 ACA CCA GGC GCT AAG CAG AAC ATC CAG CTG ATC AAC ACC AAC GGC AGT 241 Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser 65 70 75 80 TGG CAC ATC AAT AGC ACG GCC TTG AAC TGC AAT GAA AGC CTT AAC ACC 289 Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu Asn Thr 85 90 95 GGC TGG TTA GCA GGG CTT ATC TAT CAA CAC AAA TTC AAC TCT TCG GGC 337 Gly Trp Leu Ala Gly Leu Ile Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser Ser Gly 100 105 110 TGT CCC GAG AGG TTG GCC AGC TGC CGA CGC CTT ACC GAT TTT GAC CAG 385 Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe Asp Gln 115 120 125 GGC TGG GGC CCT ATC AGT CAT GCC AAC GGA AGC GGC CCC GAC CAA CGC 433 Gly Trp Gly Pro Ile Ser His Ala Asn Gly Ser Gly Pro Asp Gln Arg 130 135 140 CCC TAT TGT TGG CAC TAC CCC CCA AAA CCT TGC GGT ATC GTG CCC GCA 481 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala 145 150 155 160 AAG AGC GTA TGT GGC CCG GTA TAT TGC TTC ACT CCC AGC CCC 523 Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro 165 170
【００６２】配列番号：11 配列の長さ：523 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：No 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：J4(JM) 配列 G ATC CCA CAA GCT GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC 49 Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val 1 5 10 15 CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTA GGG AAC TGG GCT AAG GTC 97 Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 20 25 30 CTG ATT GTG GCG CTA CTC TTC GCC GGC GTT GAC GGG GAG ACC TAC ACG 145 Leu Ile Val Ala Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly Glu Thr Tyr Thr 35 40 45 TCG GGG GGG GCG GCC AGC CAC ACC ACC TCC ACG CTC GCG TCC CTC TTC 193 Ser Gly Gly Ala Ala Ser His Thr Thr Ser Thr Leu Ala Ser Leu Phe 50 55 60 TCA CCT GGG GCG TCT CAG AGA ATC CAG CTT GTG AAT ACC AAC GGC AGC 241 Ser Pro Gly Ala Ser Gln Arg Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser 65 70 75 80 TGG CAC ATC AAC AGG ACT GCC CTA AAC TGC AAT GAC TCC CTC CAC ACT 289 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu His Thr 85 90 95 GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACA CAC AGG TTC AAC TCG TCC GGG 337 Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Arg Phe Asn Ser Ser Gly 100 105 110 TGC CCG GAG CGC ATG GCC AGC TGC CGC CCC ATT GAC TGG TTC GCC CAG 385 Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile Asp Trp Phe Ala Gln 115 120 125 GGA TGG GGC CCC ATC ACC TAT ACT GAG CCT GAC AGC CCG GAT CAG AGG 433 Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Thr Glu Pro Asp Ser Pro Asp Gln Arg 130 135 140 CCT TAT TGC TGG CAT TAC GCG CCT CGA CCG TGT GGT ATC GTA CCC GCG 481 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala 145 150 155 160 TCG CAG GTG TGT GGT CCA GTG TAT TGC TTC ACC CCA AGC CCT 523 Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro 165 170
【００６３】配列番号：12 配列の長さ：402 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源：Hepatitis C virus 配列 Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Ile Met Ile Leu 1 5 10 15 Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Ile Phe Ala 20 25 30 Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly Gly Thr His Val Ile Ala Ala Arg Arg Thr Leu His Tyr Arg Asp Ile Gln Gln Glu His Thr Thr 35 40 45 Thr Gly Gly Lys Val Ala Tyr Thr Thr Gln Gly Phe Thr Pro Phe Phe Ser Val Ala Val Gln Gly His Val Val Ser Arg Leu Val Ser Leu Leu Met Ala Ala Ser Lys Ser Met Asn Ser Val Ala Arg Met Arg Ser Ala Ala Thr Thr Ile Gly Trp Ser Arg Arg His Ala Gln Phe Gly Leu His His Tyr Asn Ala Ile 50 55 60 Ser Arg Gly Pro Ser Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Arg Pro Ala Gln Glu Arg Val Ile Lys Thr Ser Ser Lys Asn Ala Gln Ala Asp Asn Ala Arg Leu 65 70 75 80 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr Leu Ser Glu Gln Ala Lys His 85 90 95 Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Ser Phe Asn Ala Ser Gly Trp Ile Thr Ile Arg Lys Asp Ser Arg Gly Ala Arg His Gly Gln 100 105 110 Cys Pro Glu Arg Met Ala Gly Cys Arg Pro Ile Asp Glu Phe Ala Gln Ala Glu Ser Val Leu Ser Cys Ser Leu Ser Lys Asp Gln Gln Thr Thr Trp Phe Asp Arg Thr 115 120 125 Gly Trp Gly Pro Ile Thr His Val Val Pro Asn Ile Ser Asp Gln Arg Asp Ser Tyr Ala Gln Ser Asp Val Pro Glu Glu Lys Asp Glu Arg Ser Asn Thr Thr Met Gly Glu Arg Gly Asn Asn Gln Arg Ser Lys Gly Gly Thr 130 135 140 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Pro Pro Gln Thr Val Lys 145 150 155 160 Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Trp Glu Lys Ser 165 170 175 Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Asn Ser Val Thr Ala Arg Asp Ser Glu 180 185 190 Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Gln Gly Asp Phe Val Ser His Ile Leu 195 200 205 Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr Ser Val 210 215 220 Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu Ala His Arg Arg Val Ala 225 230 235 240 Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Val Asp Ser His Leu Arg 245 250 255 Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Leu Val His Tyr Arg Ile Met Asp 260 265 270 Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Ile Tyr Val Thr 275 280 285 Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu Ala Ala Ile Ile Asp Asn Ile 290 295 300 Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Asp Asn 305 310 315 320 Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Val Leu Ala Thr Gln Ile Pro 325 330 335 Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His 340 345 350 Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Ile Gly Ser Arg Val Val 355 360 365 Ala Val Val Ser Phe Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Ile Leu Leu Leu Phe Ser Ile Ala Ile Val Arg Val Val Trp Thr 370 375 380 Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu Ser 385 390 395 400 Leu Ile
【００６４】配列番号：13 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ＰＣＲ用合成ＤＮＡ） 配列 GCTATCAGCA GCATCATCCA 20
【００６５】配列番号：14 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ＰＣＲ用合成ＤＮＡ） 配列の特徴：N はイノシンを表す。 配列 CAGNTANTCC GGATCCCNCA AG 22
【００６６】配列番号：15 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ＰＣＲ用合成ＤＮＡ） 配列 GTAAAACGAC GGCCAGT 17
【００６７】配列番号：16 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ＰＣＲ用合成ＤＮＡ） 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17
【００６８】配列番号：17 配列の長さ：10 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ＰＣＲ用合成ＤＮＡ） 配列 GGACTAGTCC 10
【００６９】配列番号：18 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ＰＣＲ用合成ＤＮＡ） 配列 CTAGAGAATT CGGTAC 16
【図１】クローンＪ１−１３２５の塩基配列を含むＤＮ
Ａ断片１３２５ＳＫを構築する過程を表す。
Ａ断片１３２５ＳＫを構築する過程を表す。
【図２】プラスミドｐＳＲ３１６ＥＰを構築する過程を
表す。
表す。
【図３】プラスミドｐＳＲＮｏｔを構築する過程を表
す。
す。
【図４】Ｅ２／ＮＳ１蛋白質をコードするＤＮＡ断片を
有する発現ベクターｐａＳＲ１３２５Ｘ−３を構築する
過程を表す。
有する発現ベクターｐａＳＲ１３２５Ｘ−３を構築する
過程を表す。
【図５】プラスミドｐＨＬｐ１を構築する過程を表す。
【図６】Ｅ２／ＮＳ１蛋白質をコードするＤＮＡ断片１
６個を有する発現ベクターｍｕｌｃｏｓ ｐＨＬ１６Ｓ
Ｒ１３２５を構築する過程を表す。
６個を有する発現ベクターｍｕｌｃｏｓ ｐＨＬ１６Ｓ
Ｒ１３２５を構築する過程を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特表 平６−504431（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開388232（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/576 C07K 14/18 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルスの感染によって誘導さ
れる抗体を検出することによりＣ型肝炎を診断するＣ型
肝炎診断薬であって、動物細胞で発現された糖鎖を有す
るＥ２／ＮＳ１領域由来の蛋白質を含むことを特徴とす
るＣ型肝炎診断薬。 - 【請求項２】 糖鎖を有するＥ２／ＮＳ１領域由来の蛋
白質が、ＣＨＯ細胞産生蛋白質であることを特徴とする
請求項１記載のＣ型肝炎診断薬。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26082491A JP3158177B2 (ja) | 1991-10-08 | 1991-10-08 | Ｃ型肝炎診断薬 |
| DE69231719T DE69231719T2 (de) | 1991-10-08 | 1992-10-08 | Diagnostisches Reagenz für Hepatitis C |
| ES92117191T ES2156858T3 (es) | 1991-10-08 | 1992-10-08 | Reactivo de diagnostico para hepatitis c. |
| EP92117191A EP0537626B1 (en) | 1991-10-08 | 1992-10-08 | Diagnostic reagent for hepatitis C |
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