JPH05344899A - Ｃ型肝炎ウイルス外被タンパク質の産生法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 Ｃ型肝炎ウイルス外被タンパク質をコードす
るＤＮＡ断片を含有する発現ベクターで形質転換された
形質転換体を培養し、細胞外にＣ型肝炎ウイルス外被タ
ンパク質を産生させる方法。 【効果】 Ｃ型肝炎ワクチン、診断用抗原として利用で
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノ
ムから翻訳される外被タンパク質の産生法に関し、さら
に詳しくは、Ｃ型肝炎ウイルス（以下ＨＣＶという）遺
伝子にコードされるタンパク質であって、ワクチン及び
抗ＨＣＶエンベロープタンパク質抗体を検出するための
診断薬としての利用が期待される第一番目のエンベロー
プタンパク質（以下Ｅ１と略す）と呼ばれる糖タンパク
質の産生法に関する。

【０００２】

【従来の技術】１９８８年米国カイロン社によって、従
来非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスと呼ばれて来た新種のヒト肝
炎ウイルス一つがクローニングされ、ＨＣＶと命名さ
れ、その遺伝子断片がコードするペプチドとヒト・スー
パーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）を組換え酵母で
産生させた融合蛋白（Ｃ１００−３）がＣ型肝炎診断薬
として開発され、輸血後肝炎の７１％、散発性肝炎の５
８％が該抗体陽性であることが明かとなった〔サイエン
ス(Science), ２４４，３５９−３６２，３６２−３６
４，（１９８９）〕。

【０００３】すなわち、従来主としてウイルスで汚染さ
れた輸血または血液製剤により感染すると考えられてい
たＣ型肝炎が散発的にも発生することが明らかとなった
のである。このことは、Ｃ型肝炎の予防にワクチンによ
る免疫が有効である事を強く示唆している。

【０００４】その後、日本人の患者血清由来のＨＣＶ遺
伝子がクローニングされ、日本で流行しているＨＣＶ
は、カイロン社が得たものと似ているが明かに異なる配
列からなる日本株であることが判明した〔蛋白質 核酸
酵素，３６，１６７９−１６９１，（１９９１）〕
が、米国株との抗原性の相違は明確となっておらず、こ
れまでの所アミノ酸配列の多様性にもかかわらず、Ｃ型
肝炎ウイルスの血清型は一つであると考えられている。

【０００５】上記Ｃ１００−３抗体測定系は、検出率及
び検出感度が低く、現在第二世代の診断薬としてコア、
ＮＳ３、ＮＳ５領域等のタンパクの混合物がより有効な
検出用抗原として使用されているが、未だ個々のウイル
スタンパクに対する抗体測定系は確立されておらず、新
たな診断薬、診断法が期待されている。また、Ｃ型肝炎
を予防するワクチンや治療する薬もまったく開発されて
いない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、Ｃ型肝炎の発症を予防するワクチン及び新たな診断
薬を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、Ｃ型肝
炎ウイルスの外被タンパク質をコードするＤＮＡ断片を
含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を培
養し、細胞外に産生するＣ型肝炎ウイルス外皮タンパク
質を取得することにより達成できる。類似の遺伝子構成
を持つペスチウイルスあるいはフラビウイルスの例から
推定して、Ｃ型肝炎ウイルスの外被タンパクが感染防御
抗体を誘導すると考えられ、また該タンパク質に対する
抗体を検出することによりＣ型肝炎患者の病状を判定す
る新規なＣ型肝炎診断薬とすることができると推定され
る。従って、本発明の目的は上記方法、特に、Ｅ１領域
由来のタンパク質を、好ましくは昆虫細胞叉は動物細胞
産生タンパク質として高率に発現させることにより達成
できる。

【０００８】ところで、Ｅ１領域由来のタンパク質は細
胞膜結合型糖タンパク質であり、一般に組換え体では発
現量が少ない、細胞からの精製が困難、等の理由でこの
領域の抗原蛋白質をワクチンあるいは診断薬として使用
することは困難と考えられていた。本発明者の一部も既
に該タンパク遺伝子ｃＤＮＡを昆虫細胞及び動物細胞で
発現させたが、産生量が少なく精製は困難であった〔ジ
ャーナル オブ ビロロジー(J. Virol.),６６，１４２
５−１４３１，（１９９２）〕。さらに一般に知られて
いる、膜タンパク質Ｃ末端アンカー領域を切断し、目的
のタンパク質を細胞外に分泌発現させることにより発現
精製効率を高める方法〔サイエンス(Science),２３８，
１７０４−１７０７，（１９−８７）〕も試みたが効果
はなかった。しかしながら、本発明者らは、Ｅ１領域の
Ｃ末端アンカー領域と中央部の疎水性領域を欠失させた
ｃＤＮＡを昆虫細胞あるいは動物細胞で発現させると、
Ｅ１タンパク質が、予想外にも高率に細胞外に分泌発現
することを見い出し、本発明を完成するに至った。

【０００９】本発明のＥ１タンパク質は、ＨＣＶ遺伝子
にコ−ドされるタンパク質であり、第一番目の外被タン
パク質とよばれる領域のタンパク質であって、例えば、
配列表の配列番号１および２に示すようなものである。
このようなタンパク質において、一部のアミノ酸を除
去、挿入、修飾あるいは追加する等の改変を行って得ら
れるタンパク質も、それがヒトに対する免疫原性やＣ型
肝炎患者血清との反応性を損なわない限り、本発明に包
含されるものであることは、いうまでもない。

【００１０】〔１〕配列表の配列番号１に示すＣ型肝炎
患者血清由来ｃＤＮＡクローンを得る方法と該クローン
の塩基配列を決定する方法 配列表の配列番号１に示す塩基配列で表される、Ｅ１タ
ンパク質をコードする遺伝子またはＤＮＡ断片は、例え
ば、次のような方法によって得られる。

【００１１】このＨＣＶは、血清中に微量しか存在しな
い上、遺伝子がＲＮＡであり、従来のｃＤＮＡクローニ
ング法であるOkayama-Berg法や、Gubler-Hoffman法を基
本とした方法でのクローニングには困難が予想されたの
で、少量の血清から変異の多い該遺伝子を確実にクロー
ニングするために、以下の方法によった。

【００１２】即ち、後述の実施例１で示すようにＣ型肝
炎患者の血清から核酸を抽出する。該血清としては、通
常、オルソ社の検査キットでの測定値でＯＤが3.5 以上
のものを使用するのが好ましいが、この値のものに限ら
れるわけではない。血清にはウイルスＲＮＡのキャリア
としてトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を混ぜておく
のが好ましい。キャリアは必ずしもｔＲＮＡに限られる
ものではなく、ポリリボヌクレオシドであれば代用でき
る。ただし、ｔＲＮＡを使用すればインタクトな長さを
もったｔＲＮＡが必要量存在するかどうかを電気泳動で
迅速に確認できる利点がある。またこの確認をすること
で、少なくとも、ウイルスＲＮＡのキャリアとしてｔＲ
ＮＡを混合した段階以降において、ウイルスＲＮＡの分
解があるかどうかを確認することができる。かかる核酸
からｃＤＮＡをクローニングする手段としては、Saiki
らの開発したポリメラーゼ チェイン リアクション法
〔（ＰＣＲ法） ネーチャー（Nature）、３２４，１２
６，（１９８６）〕を利用することが好ましい。まず、
ウイルスＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素を反応させる。
この時、使用するプライマーとしては、市販のランダム
プライマーでも良いし、下記配列番号３に示したプライ
マーＡＳ１の様な塩基配列の合成ＤＮＡを用いても良
い。

【００１３】 配列番号３ AS1; 5' CGGGATCCGG AGTAACTGCG 3' これらの配列で５’側の配列の数塩基を他の配列に変え
ても良いが、好ましくは５’側から１０塩基以内の範囲
で数塩基内であれば良い、さらに好ましくは、５’側か
ら５塩基以内の範囲が良い。また、これらの配列で５’
側の配列の４から５塩基を欠如してもよいが、５’側か
ら数塩基の欠如が好ましい。また、８から１２塩基程度
であれば５’側に任意の配列を付加してもよいが、好ま
しくは５から６塩基の付加、さらに好ましくは数塩基の
付加が良い。

【００１４】ＰＣＲ法は、具体的には、実施例１に記述
したような条件で実施される。このようにして得られた
第１鎖相補鎖ＤＮＡ（1st ｃＤＮＡ）を鋳型にして実施
例１の様にＰＣＲ法を行い目的のＤＮＡ断片を得ること
ができる。このとき、ＰＣＲの条件は、適宜状況に応じ
て選択される。センスプライマーとしては、具体的に
は、例えば、次のようなものが挙げられる。

【００１５】 配列番号４ S1; 5' CGCTGCAGAC CGTGCATCAT GAGCAC 3' これらの配列で５’側の配列の数塩基を他の配列に変え
ても良いが、好ましくは５’側から１０塩基以内の範囲
で数塩基内であれば良い、さらに好ましくは、５’側か
ら５塩基以内の範囲が良い。また、これらの配列で５’
側の配列の４から５塩基を欠如してもよいが、５’側か
ら数塩基の欠如が好ましい。また、８から１２塩基程度
であれば５’側に任意の配列を付加してもよいが、好ま
しくは５から６塩基の付加、さらに好ましくは数塩基の
付加が良い。

【００１６】このようにして得られたＤＮＡ断片は、常
法によりクローニングベクター（例えば、pUC19)のクロ
ーニングサイトの１つ（例えば、ＳｍａＩサイト）に組
み込まれる。このＤＮＡ断片を持つプラスミドを用い
て、クローンの塩基配列を両鎖に関して決定する。塩基
配列の決定は、ジデオキシ法により、例えば７−デアザ
シークエンス キット（宝酒造社製）やデュポン社製蛍
光シークエンサージェネシス2000（GENESIS 2000）シス
テムを用いて、該キットのプロトコールに従って容易に
行うことができる。塩基配列が決定しにくい部位や、決
定しようとするＤＮＡ断片が約１８０塩基対以上ある場
合には、常法に従い、サブクローニングを行えばよい。
このようにして決定された、ＤＮＡ断片の塩基配列から
推定されるタンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列
番号１に表される通りである。

【００１７】〔２〕 〔１〕で得られたクローンにコー
ドされるポリペプチドの発現 大腸菌や真核生物用の発現ベクターに目的クローンを導
入する際、ベクター由来の開始コドンのフレームに合う
ようにすればよく、また、ベクター由来の開始コドンを
利用しない場合でも、該クローンの翻訳フレームに合う
ように５’側に開始コドンを付加してから発現ベクター
に導入すればよい。この場合の、該クローンの翻訳フレ
ームとは、例えば代表されるクローンとして示した配列
表の配列番号１において、アミノ酸一つに対して対応し
ている３つずつに分けられた塩基配列の枠組みのことで
ある。

【００１８】本発明で用いる発現ベクターは、上記のよ
うにして得られたＨＣＶ由来のＥ１タンパク質をコード
するＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有して
いる。例えば、大腸菌、枯草菌等、微生物を宿主とする
ときは、発現ベクターは、プロモーター、リボゾーム結
合（ＳＤ）配列、ＨＣＶ由来の組換えＣ型肝炎Ｅ１タン
パク質遺伝子、転写終結因子、及びプロモーターを制御
する遺伝子より成ることが望ましい。

【００１９】プロモーターとしては、大腸菌、ファージ
等由来のもの、例えば、トリプトファン合成酵素(trp)
、ラクトースオペロン(lac) 、ラムダファージＰL 、
ＰR 、Ｔ5 初期遺伝子Ｐ25、Ｐ26プロモーター等が挙げ
られる。また、これらは独自に設計された配列でも良
い。

【００２０】リボゾーム結合配列としては、大腸菌、フ
ァージ等由来のものでも良いが、独自に設計された配列
を合成により作成した１６ＳリボゾームＲＮＡの３′末
端領域に相補的な配列を４塩基以上連続して持つコンセ
ンサス配列を持ったものでも良い。転写終結因子は必ず
しも必要ではないが、ρ非依存性のもの、例えばリポプ
ロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネータ
ー、等を有している方が望ましい。

【００２１】さらに、これらの発現に必要な因子の発現
プラスミド上での配列順序は、５′上流から、プロモー
ター、ＳＤ配列、ＨＣＶ由来のＥ１タンパク質遺伝子、
転写終結因子の順に並ぶことが望ましい。

【００２２】発現ベクターとしては、市販のｐＫＫ２３
３−２（ファルマシア社製）等が使用できる。また、融
合タンパクとして発現させるには、発現ベクターｐＧＥ
Ｘシリーズ（ファルマシア社製）等が使用される。

【００２３】宿主の形質転換法としては、以下の実施例
に示すように東洋紡績社のプロトコールに従うか、常法
に従って行うことができる。

【００２４】形質転換体の培養は、モレキュラー クロ
ーニング(Molecular Cloning,1982)に記述の方法を参考
に行えばよい。培養温度は２８℃から４２℃程度であ
る。

【００２５】またＥ１タンパク質の生産のためには、タ
ンパク質を安定に発現する宿主−ベクター系を選択する
こと、さらに発現したＥ１タンパク質が生物学的活性す
なわちＨＣＶと同様の抗原性を有している必要がある。
特に天然のＥ１タンパク質が糖タンパク質と予測される
こと、またＥ１タンパク質が多くのシステイン残基を含
み、そのシステイン残基間のチオール結合の位置および
タンパク質の高次構造が活性維持に重要であることを考
慮した場合、宿主としては、昆虫細胞、例えばＳｆ９細
胞、Ｓｆ２１細胞等、好ましくはＳｆ９細胞が、また動
物細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細
胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞等、好ま
しくはＣＨＯ細胞を用いて発現させることが望ましい。
またこれらの細胞を宿主とする場合は、配列番号１に示
すアミノ酸配列の内、シグナル様配列、すなわち１７４
から１９１番目を持つＥ１遺伝子を細胞内に導入するこ
とにより、プロセッシングされたＥ１タンパク質が産生
されることが期待される。これらの昆虫細胞または動物
細胞を宿主とする発現用プラスミドは次のように構築さ
れる。

【００２６】昆虫細胞でのプロモーターとしては、多核
体プロモーター（実験医学、８、93-96, 1990)が、動物
細胞でのプロモーターとしては、アデノウイルスＥＩＡ
遺伝子による活性型プロモーター〔続生化学実験講座
１、遺伝子研究法II、189-190,(1986)〕、ＳＶ４０初期
プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、アポリポプ
ロテインＥ遺伝子プロモーター、ＳＲαプロモーター
〔モレキュラー アンドセルラー バイオロジー（Mol.
Cell. Biol.), 8, 466-472, (1988) 〕等が使用される
が、ＳＶ４０プロモーターまたはＳＲαプロモーターが
好ましい。

【００２７】このプロモーターの下流に上記シグナル様
配列を含むＥ１タンパク質遺伝子のＤＮＡ断片を転写方
向にしたがって挿入する。またＥ１タンパク質の発現ベ
クター構築の際には、該プロモーターの下流にＥ１タン
パク質遺伝子断片を２個以上結合したものを挿入しても
よい。またＥ１タンパク質遺伝子のＤＮＡ断片の５’上
流側にＳＶ４０などのプロモーターを結合したＤＮＡ断
片を単位としたものを、転写方向を揃えて２個以上結合
してベクターに挿入してもよい。このＥ１タンパク質遺
伝子の下流には、ポリアデニル化配列が必要である。例
えばＳＶ４０遺伝子、β−グロビン遺伝子またはメタロ
チオネイン遺伝子由来のポリアデニル化配列がＥ１タン
パク質遺伝子の下流に１つ存在することが必要である。
またプロモーターとＥ１タンパク質遺伝子を結合したＤ
ＮＡ断片を２個以上結合する場合には、各単位のＥ１タ
ンパク質遺伝子の３’側にそれぞれポリアデニル化配列
を存在させることもできる。

【００２８】この発現ベクターを用いて動物細胞、例え
ばＣＨＯ細胞を形質転換する際には選択マーカーを用い
ることが望ましい。選択マーカーとしては、メトトレキ
セート耐性を与えるＤＨＦＲ遺伝子〔ジャーナル オブ
モレキュラー バイオロジー(J. Mol. Biol.),１５
９，601, (1982) 〕、抗生物質Ｇ−４１８耐性を与える
Neo 遺伝子〔ジャーナル オブ モレキュラー アプラ
イド ジェネティクス(J. Mol. Appl. Gent.),１，327,
(1982) 〕、ミコフェノール酸耐性を与える大腸菌由来
のEcogpt遺伝子〔プロシーディングス オブ ナショナ
ル アカデミーオブ サイエンス ユー・エス・エー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA),78, 2072, (1981)〕、
抗生物質ハイグロマイシン耐性を与えるｈｐｈ遺伝子
〔モレキュラー アンド セルラー バイオロジー(Mo
l. Cell. Biol.), ５, 410, (1985) 〕等が挙げられ、
各耐性遺伝子の５’上流側にはプロモーター、例えば前
述のＳＶ４０由来のプロモーターや、ヘルペスウイルス
のＴＫ遺伝子プロモーターが挿入されており、各耐性遺
伝子の３’下流側には、前述のポリアデニル化配列が含
まれる。Ｅ１タンパク質の発現ベクターにこれらの耐性
遺伝子を挿入する場合、Ｅ１タンパク質遺伝子のポリア
デニル化部位下流に順方向あるいは逆方向に挿入すれば
よい。これらの発現ベクターは、形質転換体を得る際
に、選択マーカー遺伝子を含む別のプラスミドを二重形
質転換する必要がない。

【００２９】またＥ１タンパク質の発現ベクターにこれ
らの選択マーカー遺伝子が挿入されていない場合には、
形質転換体の選択マーカーを有するベクター、例えば、
pSV2neo 〔ジャーナル オブ モレキュラー アプライ
ド ジェネティクス(J. Mol.Appl. Gent.), 1, 327, (1
982) 〕、pMBG（ネーチャー(Nature), 294, 228,(198
1)〕、pSV2gpt 〔プロシーディングス オブ ナショナ
ル アカデミー オブ サイエンス ユー・エス・エー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA),78, 2072,(1981)〕、p
AD-D26-1 〔ジャーナル オブ モレキュラー バイオ
ロジー(J. Mol. Biol.),159, 601, (1982)〕等をＥ１タ
ンパク質遺伝子の発現ベクターと共に二重形質転換し、
選択マーカー遺伝子の表現形質により形質転換体を容易
に選択できる。

【００３０】発現ベクターの昆虫細胞または動物細胞へ
の導入法としては、リン酸カルシウム法〔ビロロジー(V
irol.)52, 456, (1973) 〕、エレクトロポレーション法
〔ジャーナル オブ メンブレン バイオロジー (J. M
embr. Biol.), 10, 279, (1972) 〕等が挙げられるが、
リン酸カルシウム法が一般的である。

【００３１】形質転換された細胞の培養は、常法により
浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地とし
ては、グレース、ＭＥＭ、Ｈａｍ Ｆ−１２等を用い、
５〜１０％血清存在下もしくは適当量のインシュリン、
デキサメサゾン、トランスフェリンの存在下、もしくは
無血清下にて培養する。Ｅ１タンパク質を発現している
細胞は、常法に従い患者血清等を用いた蛍光抗体法によ
り検出され、限界希釈法により常法通りクローニングを
行う事により、安定にＥ１タンパク質を産生するセルラ
インを樹立する事ができる。

【００３２】このようにして得られたＨＣＶ遺伝子由来
Ｅ１タンパク質は、アジュバント等と混合しワクチンと
してあるいは診断用ＨＣＶ抗原として利用でき、ＨＣＶ
抗体を含有する血清と免疫的に反応する該抗原は、例え
ば、血清等におけるＨＣＶ抗体の存在を確認し、あるい
は検出をするために有用である。このイムノアッセイの
方法には、例えば、RIA (radioimmunoassay)、ELISA (e
nzyme-linked immunoadsorbent assay）、蛍光抗体法、
凝集反応（ラテックス法を含む）、免疫沈殿法等があ
る。また、検出にはほとんどの場合、標識化抗体が使用
され、このために標識化を行う場合、標識化物として
は、例えば蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、染色
物質等が使用される。従って、本発明のＨＣＶ遺伝子由
来Ｅ１タンパク質を抗原として、Ｃ型肝炎予防のための
ワクチンや治療効果を判定するため等に有用な免疫診断
薬を作製することができる。

【００３３】

【発明の効果】本発明の方法により産生されるＥ１領域
由来のタンパク質は、Ｃ型肝炎予防のためのワクチンと
して使用され、該タンパクを含む診断薬は、血清等にお
けるＨＣＶ抗体の存在を確認し、あるいは検出をするた
めに有用であり、特異的かつ高感度でＣ型肝炎を診断す
ることができる。

【００３４】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１ 〔１〕Ｃ型肝炎患者血清からの核酸の抽出 Ｃ型肝炎患者血清（この血清は、オルソ社製ＨＣＶ Ｅ
ＩＡ キットでＯＤ＝３．５以上の値を示した）10 ml
にトリス緩衝液（50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA,
100 mM NaCl) 25 ml を加え、混和後20,000ｇ、２０℃
で２０分間遠心し、その上清を更に100,000 ｇ、２０℃
で５時間遠心した。この沈殿にプロテネースＫ溶液（１
％ドデシル硫酸ナトリウム、10 mM EDTA, 10 mM Tris-H
Cl, pH 7.5,Protenase K（シグマ社製）2 mg/ml, yeast
tRNA mixture 6.6 μｇ）1.5 mlを加え溶解後、９０分
間４５℃で保温し、これに等量のフェノール／クロロホ
ルムを加えた後、激しく混和し遠心分離操作により核酸
を含む水相を回収するいわゆるフェノール／クロロホル
ム処理を４回以上行った。さらに、クロロホルム処理を
２回以上行った。この様にして得られた水相に１０分の
１量の３Ｍ酢酸ナトリウムもしくは等量の４Ｍ酢酸アン
モニウムと水相の2.5 倍容のエタノールを加え混和し、
−２０℃で一晩もしくは−８０℃で１５分以上静置した
後、ＳＷ４１Ｔｉロータ（ベックマン社製）で35,000 r
pmで４時間遠心を行い、核酸を沈殿物として回収した。

【００３５】〔２〕ｃＤＮＡの合成 〔２−１〕ＲＮＡサンプルの調製 〔１〕で得られた核酸を乾燥させた後、水３０μｌとリ
ボヌクレアーゼインヒビター（１００ユニット／μｌ、
宝酒造社製）１０μｌを加え溶解させた。この核酸水溶
液を用い下記に示すｃＤＮＡ合成を行った。

【００３６】〔２−２〕アンチセンスプライマーを用い
たｃＤＮＡの合成 〔２−１〕で調製した核酸水溶液２μｌにアンチセンス
プライマー（合成ＤＮＡプライマーAS1 がアンチセンス
プライマーである。15 pmols/ μl) 1μl, 10ｘＲＴ緩
衝液（100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl) 2μｌ、
25 mM MgCl₂ 4μl, 2.5 mM 4dNTP 8 μl,水１μｌを加
え６５℃５分、次に室温５分保温後、逆転写酵素（ライ
フ サイエンス社製）２５ユニットを１μｌ、リボヌク
レアーゼインヒビター（１００ユニット／μｌ、宝酒造
社製）１μｌを加え３７℃２０分、次に４２℃３０分、
最後に９５℃２分保温後、すぐに０℃に冷却した（相補
鎖ＤＮＡ合成）。このＤＮＡ試料１０μｌを用いてSaik
i らの方法〔ネーチャー(Nature), ３２４，１２６，
（１９８６）〕に準じて、いわゆるＰＣＲ法により特異
的配列を持つＤＮＡを増幅した。

【００３７】即ち、このＤＮＡ試料１０μｌ、１０ｘＰ
ＣＲ緩衝液(100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15
mM MgCl₂), 1%ゼラチン10μl, 2.5 mM 4dNTP 8 μl 、
相補鎖ＤＮＡ合成時に使用した合成ＤＮＡプライマー
（150 pmols/μl) 2μl 、このプライマーに対応した合
成ＤＮＡプライマー（15 pmols/ μl 、相補鎖ＤＮＡ合
成時に使用した合成ＤＮＡプライマーと対になるもので
あり、前述のプライマーS1を使用した。）３μｌに水を
加えて合計が１００μｌになるようにして、まず９５℃
に５分間保温後、０℃に急冷した。１分後、Taq ＤＮＡ
ポリメラーゼ（７ユニット／μｌ、AmpliTaqTM宝酒造社
製）0.5 μl を加え混和後、ミネラルオイルで重層し
た。このサンプルを、パーキン エルマー シータス社
製のＤＮＡThermal Cyclerで９５℃１分、４０〜５５℃
１分、７２℃１〜５分で２５回処理した。最後に７２℃
で７分保温した後、この反応水溶液をフェノール／クロ
ロホルム処理、エタノール沈殿（エタノール沈殿とは、
水相に１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムもしくは等量
の４Ｍ酢酸アンモニウムと水相の２．５倍容のエタノー
ルを加え混和し、半径５cm程度のロータを用いて15,000
rpm, ４℃で15分間冷却遠心を行い、その沈殿を乾燥さ
せる処理）を行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。

【００３８】〔３〕増幅された該ＤＮＡ断片のクローニ
ングと塩基配列の決定 〔２−２〕の方法によって得たＤＮＡ断片を少なくとも
１pmole 用意し、このＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ及びＢ
ａｍＨＩ（東洋紡績社製）で消化しフェノール／クロロ
ホルム処理、エタノール沈殿させた後、ライゲーション
キット（宝酒造社製）を用いて、マルチクローニングサ
イト内にあるＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ
１９クローニングベクターに組み込んだ。

【００３９】この時ライゲーションに用いたベクターＤ
ＮＡとしては、次の様に用意されたものを5 ng〜10 ng
使用した。即ち、ｐＵＣ１９クローニングベクターを制
限酵素ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩ（東洋紡績社製）で切断
し、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿さ
せた後、さらにアルカリフォスファターゼ（ベーリンガ
ーマンハイム社製）で５′末端を脱リン酸化して〔モレ
キュラー・クローニング(Molecular Cloning),1982，コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス
(Cold Spring Harbor Lab. Press) 〕、フェノール／ク
ロロホルム処理し、エタノール沈殿させた。

【００４０】この様にして作成したＤＮＡを用いて大腸
菌ＪＭ１０９を形質転換させた（この時、コンピテント
セルは東洋紡績社製のものを用いた）。形質転換させる
方法は、東洋紡績社製のコンピテント ハイ(COMPETENT
HIGH)のプロトコールに従った。この様にして、前述の
プライマーの組み合わせから〔２−２〕の方法によって
得た該ＤＮＡ断片を持つｐＵＣ１９クローニングベクタ
ーで形質転換させた形質転換体を、少なくとも、２０個
以上得ることができた。

【００４１】このようにして得られた形質転換体の一つ
ｐＵＣ０１０からプラスミドＤＮＡを調製し、デレーシ
ョン キット（宝酒造社製）のプロトコールに従いデレ
ーション ミュータントを作製し、これらを常法により
宝酒造社製７−デアザ シークエンス キットまたはデ
ュポン社製蛍光シークエンサーGENESIS ２０００システ
ムを用いて、配列を決定した。シークエンスプライマー
として次の配列番号５及び６に示す２種の合成プライマ
ー 配列番号５ 5' d(GTAAAACGACGGCCAGT) 3' 配列番号６ 5' d(CAGGAAACAGCTATGAC) 3' を使用し、該ＤＮＡ断片の＋鎖、−鎖の塩基配列を決定
した。該ＤＮＡ断片は配列表の配列番号１に示す通りの
塩基配列を有していた。配列表の配列番号１に示すアミ
ノ酸配列は、それぞれ上記で得られた形質転換体のプラ
スミドに組み込まれたＨＣＶ由来遺伝子の＋鎖にコード
されている。

【００４２】〔４〕Ｅ１タンパク質遺伝子の改変 〔３〕で得たプラスミドに含まれるＤＮＡ断片からＥ１
タンパク質を高率に分泌発現させるために、以下の改変
を行った。まず、〔３〕で得られたプラスミド１μｇを
制限酵素ＤｒａＩＩＩ（ニューイングランド バイオラ
ブ社製）で消化後、制限酵素ＨｇｉＡＩで部分消化し、
フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿させ
た。このようにして得たＤＮＡ１０ｎｇに、配列番号７
に示す合成リンカー 配列番号７ 5' d(AGCGGCCGCT) 3' ５ｎｇをライゲーションキット（宝酒造社製）を用い挿
入した。この様にして作成したＤＮＡを用いて大腸菌Ｄ
Ｈ５を形質転換させた（この時、コンピテントセルは東
洋紡績社製のものを用いた）。形質転換させる方法は、
東洋紡績社製のコンピテント ハイ(COMPETENT HIGH)の
プロトコールに従った。この様にして得た組換え体か
ら、常法によりミニスクリーニングを行い〔モレキュラ
ー・クローニング(Molecular Cloning),1982，コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold
Spring Harbor Lab. Press) 〕、Ｅ１遺伝子内に上記の
合成リンカーが組み込まれたプラスミドｐＵＣ８１３を
得た。

【００４３】次に、このようにして得たＤＮＡ１μｇを
制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した後、制限酵素ＰｖｕＩ
Ｉで部分消化し、フェノール／クロロホルム処理、エタ
ノール沈殿させた。このようにして得たＤＮＡ５ｎｇを
ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてライゲー
ションし、大腸菌ＤＨ５を形質転換させた（この時、コ
ンピテントセルは東洋紡績社製のものを用いた）。形質
転換させる方法は、東洋紡績社製のコンピテント ハイ
(COMPETENT HIGH)のプロトコールに従った。この様にし
て得た組換え体から常法によりミニスクリーニングを行
い〔モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning),
１９８２，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス(Cold Spring Harbor Lab. Press) 〕、ベ
クター内のＰｖｕＩＩサイトでなくＥ１タンパク質遺伝
子内のＰｖｕＩＩサイトが切断されたプラスミドｐＵＣ
８１３ｄを得た。

【００４４】〔５〕Ｅ１タンパクの昆虫細胞での発現 〔４〕で構築したプラスミドｐＵＣ８１３ｄにコードさ
れている改変したＥ１タンパク質を昆虫細胞で発現させ
るため、松浦らにより作製された、トランスファーベク
ターｐＡｃ８１３〔ジャーナル オブ ビロロジー(J.
Virol.), 66,1425-1431, (1992) に記載した改変前のＥ
１タンパク質遺伝子を挿入したトランスファーベクタ
ー、国立予防衛生研究所より入手できる〕の制限酵素Ｎ
ｏｔＩ及びＢａｍＨＩ切断部位に、ｐＵＣ８１３ｄプラ
スミドの制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩ切断断片を常
法により挿入し（ライゲーションには、宝酒造社製のラ
イゲーションキットを用い、方法は宝酒造社のライゲー
ションキット用のプロトコールに従った）、大腸菌ＤＨ
５を形質転換しミニスクリーニングにより目的のプラス
ミドを得た。このようにして得たプラスミドを、Maniat
isらの方法（「モレキュラー・クローニング」、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、86-96(198
2))に従い組換え大腸菌から回収、精製しＨＣＶ改変Ｅ
１遺伝子トランスファープラスミドｐＡｃ８１３ｄＤＮ
Ａを大量に得た。このようにして得たｐＡｃ８１３ｄＤ
ＮＡ12.5μｇとウイルス（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ１μｇを
トランスフェクション バッファー（20 mM HEPES, 1 M
m Na₂HPO₄, 5 mM KCl, 140 mM NaCl, 10 mM グルコー
ス, pH 7.05) 750μｌと混合し、最終的に蒸留水で950
μｌとした。このものに2.5 M CaCl₂, 50 μｌをチュー
ブを攪はんしながら滴下し、室温で３０分静置し沈殿を
生じさせた。この沈殿をチップで軽くほぐし、Ｓｆ９細
胞を形質転換した。すなわち、まず直径3.5 cmのシャー
レの中でＦＣＳ（牛胎児血清）が１０％入ったグレース
(Grace's) 培地（ＧＩＢＣＯ社製）中でＳｆ９細胞を１
×１０⁶ ／シャーレになるよう培養した。

【００４５】次にシャーレから培地を除き、そこに先述
のＤＮＡを混合したトランスフェクション バッファー
を０．９５ｍｌ加え室温で１時間静置後、ＤＮＡ液を除
きＦＣＳが１０％入ったグレース培地２ｍｌをシャーレ
に入れて２７℃６日間培養した。３日目には幾つかの細
胞中に多核体が観察され、６日目にほとんどの細胞が多
核体を形成していた。この培養上清を遠心チューブに取
り、1,000 rpm 、１０分間遠心した上清を同時感染ウイ
ルス液とした。

【００４６】この同時感染ウイルス液には１mlあたり１
０⁸ 個のウイルスが含まれており、またそのうちの約
０．５％が組換え体である。組換えウイルスを単離する
ためにプラーク単離法を用いた。その方法は以下の通り
である。同時感染ウイルス液を１０^-4、１０^-5に希釈し
た。予め６cmシャーレに１枚当り１．５×１０⁶ 個の細
胞をまき、吸着させたものを用意し、培地を完全に除い
た後、１０^-4液、１０^-5液を一枚のシャーレあたりそれ
ぞれ１００μｌずつ加えた。細胞の乾燥を防ぐため、シ
ャーレを１５分おきに傾けてウイルス液が全面に行き渡
るようにした。このようにして室温で１時間感染させて
いる間に３％シープラークアガロース(Sea Plaque Agar
ose,宝酒造社製）を105 ℃、１０分間オートクレーブ
し、46℃で暖めておいた１０％ＦＣＳを含むグレース培
地と１対２の比率で混合し、46℃で保温しておいた。

【００４７】感染終了後、ウイルス液を完全に吸い取
り、保温された重層寒天培地を細胞がはがれないように
シャーレ１枚あたり２mlずつ静かに加えた。アガロース
が固化して乾燥するまでシャーレの蓋を少しずらした状
態で静置し、その後１mlの10％ＦＣＳを含むグレース培
地をさらに重層し、２７℃でインキュベーションした。
４日間培養した後、ニュートラル レッド（ナカライテ
スク社製）で細胞を超生体染色した後、位相差顕微鏡で
多核体を形成していないプラークを見いだした。この多
核体非産生プラークをパスツールピペットでアガロース
ごと吸い取り、１mlのグレース培地中でピペッテイング
して組換えウイルスを浮遊させた。これら一連の操作
（感染させてから、４日間培養し該組換えウイルスを単
離する操作）をプラーク純化法と呼ぶ。該ウイルス浮遊
液１００μｌをとり同様のプラーク純化法を行った。こ
れら一連の操作を３回繰り返して野性株の混入のないＨ
ＣＶ由来Ｅ１タンパク質遺伝子を持つ組換えウイルスＡ
ｃ８１３ｄを得た。

【００４８】改変Ｅ１タンパク質を産出させるために、
予め５×１０⁶ 個のＳｆ９細胞を10％ＦＣＳを含むグレ
ース培地10mlに懸濁して10cmシャーレに撒き、１時間静
置し細胞をシャーレに吸着させた。シャーレから培地を
取り除き、Ａｃ８１３ｄウイルス液を２５０μｌ加え、
全体に行き渡らせたのち10％ＦＣＳを含むグレース培地
10mlを加え２７℃で４日間培養した。このようにして、
該ウイルスに感染されたＳｆ９細胞外にＨＣＶ由来Ｅ１
糖タンパク質を発現させた。

【００４９】〔６〕Ｅ１タンパクの動物細胞での発現 〔４〕で構築したプラスミドｐＵＣ８１３ｄにコードさ
れている改変したＥ１タンパク質を動物細胞で発現させ
るため、松浦らにより作製された、発現ベクターｐＳＲ
８１６Ｘ〔ジャーナル オブ ビロロジー(J. Virol.),
66, 1425-1431, (1992)に記載した、改変前のＥ１タン
パク質遺伝子を挿入した動物細胞発現ベクター、国立予
防衛生研究所より入手できる〕の制限酵素ＮｏｔＩ及び
ＢａｍＨＩ切断部位に（ＢａｍＨＩは部分消化）、ｐＵ
Ｃ８１３ｄプラスミドの制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨ
Ｉ切断断片を常法により挿入し、大腸菌ＤＨ５を形質転
換しミニスクリーニングにより目的のプラスミドを得
た。このようにして得たプラスミドを、Maniatisらの方
法（「モレキュラー・クローニング」、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー、86-96, (1982))に従
い組換え大腸菌から回収、精製しＨＣＶ改変Ｅ１遺伝子
発現プラスミドｐＳＲ８１３ｄＸＤＮＡを大量に得た。

【００５０】〔６〕により作製された発現ベクターｐＳ
Ｒ８１３ｄＸＤＮＡを用いてAusubel らの方法〔カレン
ト プロトコールズ イン モレキュラー バイオロジ
ー(Current Protocols in Molecular Biology)，グリー
ン パブリッシング アソシエイツ アンド ウイリー
−インターサイエンス(Greene Publishing Associates
and Wiley-Interscience),９・１・１章〜９・１・４
章,(１９８７）〕を基にＣＨＯ細胞にトランスフェクシ
ョンしてＣＨＯ細胞を形質転換した。

【００５１】すなわち、まず直径６cmのシャーレの中で
ＦＣＳ（牛胎児血清）が１０％入ったＨａｍ Ｆ−１２
培地（ＧＩＢＣＯ社製）中でＣＨＯ細胞をセミコンフル
エントな状態になる様培養した。次にシャーレから培地
を除き、そこにＤＮＡ溶液を滴加するが、ＤＮＡ溶液は
予め次に示す手順に従って調製した。まず直径６cmのシ
ャーレ一枚につき３００μｌの２ｘＨＥＢＳ溶液（２ｘ
ＨＥＢＳ溶液；1.6%NaCl, 0.074% KCl, 0.05% NaH₂PO₄
・12H₂O, 0.2% デキストロース, 1%HEPES,pH 7.05)と１
０μｇの該プラスミドＤＮＡを加え、滅菌水で５７０μ
ｌに合わせた溶液をエッペンドルフ遠心管中に準備す
る。次に該ＤＮＡ溶液に３０μｌの2.5Mの塩化カルシウ
ム溶液を滴加しながらボルテックスミキサーを用い１〜
２秒間激しく混和する。これを室温で３０分間放置する
が、その間およそ１０分おきにボルテックスミキサーで
混和する。この様にしてできたＤＮＡ溶液を前述の細胞
にかけて室温で３０分間静置した。その後ＦＣＳが１０
％入ったＨａｍ Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）５ml
をシャーレに加え、37℃、5%CO₂ 存在下で４〜５時間培
養した。次にシャーレから培地を除き５mlのＴＢＳ⁺⁺溶
液（25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 140 mM NaCl, 5 mM KCl,
0.6 mM NaH₂PO₄, 0.08 mM CaCl₂, 0.08 mM MgCl₂)で細
胞を洗浄し、ＴＢＳ⁺⁺溶液を除去した後、グリセロール
を２０％含むＴＢＳ⁺⁺溶液を５ml細胞にかけて室温で１
〜２分間静置した後、上清を除去した。その後5 mlのＴ
ＢＳ⁺⁺溶液で細胞を再び洗浄し、ＦＣＳが１０％入った
Ｈａｍ Ｆ−１２培地５mlをシャーレに入れ、３７℃、
5% CO₂存在下で培養し、４８時間が経過した時点で培地
を除き、５mlのＴＢＳ⁺⁺溶液で細胞を洗浄した後、細胞
にトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社）１mlをかけ、
室温で30秒静置した。その後トリプシン−ＥＤＴＡ溶液
を除き５分後にＦＣＳが１０％入ったＨａｍＦ−１２培
地５mlをシャーレに入れて細胞を分散し、細胞数を計測
後９６ウェルマイクロプレートに０．５細胞/ウェル/１
００μｌ、１細胞/ウェル/１００μｌ、２細胞/ウェル/
１００μｌ、４細胞/ウェル/１００μｌ、８細胞/ウェ
ル/１００μｌとなるように細胞をまきＧ４１８（Ｇ４
１８硫酸塩(GENETICIN);ＧＩＢＣＯ社製）を６００μｇ
／ｍｌの濃度になるように加えて培養を続けた。その後
１０日が経過した時点で細胞の増殖を確認し、培養上清
５０μｌを回収し新たに５０μｌを加えた。

【００５２】培養上清中のＥ１タンパク質は、〔５〕で
得た組換えバキュロウイルスＡｃ８１３ｄ感染Ｓｆ９細
胞の培養上清を濃縮し、ＧＰＣカラムであるAsahipakGS
520（旭化成社製）で分画したＥ１タンパクをウサギに
免疫して得た抗Ｅ１抗体を補足（一次）抗体とし、Ｃ型
肝炎患者血清を二次抗体とし、パーオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗ヒトＩｇＧ抗体（カペル社製）を三次抗体とするサ
ンドイッチ エライザ法で常法により検出した。

【００５３】また、同時に細胞の一部を採取し、ラブテ
ック チャンバー スライド(Lab-Tek Chamber Slides,
Nunc4808;日本インターメッド社製）で一晩培養した。
培養したスライドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で
リンスした後、冷アセトン・メタノール（１：１）混液
に浸し−２０℃に１５分間置き細胞を固定した。次にこ
のスライドグラス上に固定した細胞を、ＰＢＳで２０倍
に希釈したＣ型肝炎患者血清と３７℃で３０分間反応さ
せた。次にこのスライドグラスを、ＰＢＳで３回各５分
間洗浄し、ＰＢＳで５０倍に希釈したＦＩＴＣ標識ウサ
ギ抗ヒトＩｇＧ（ダコ・ジャパン社製）と３７℃で３０
分間反応させた。次にこのスライドグラスを、ＰＢＳで
３回各５分間洗浄し、ろ紙にはさんで乾燥させた後、グ
リセリンで封入し蛍光顕微鏡で観察した。

【００５４】この様にして陽性細胞をスクリーニングし
ながら、連続３回の限界希釈によりＥ１タンパク質を持
続的に産生する細胞株を樹立した。

【００５５】〔７〕昆虫細胞で産生されたＥ１タンパク
のＣ型肝炎患者血清との反応性の検討 Ｃ型肝炎ウイルスに感染したヒトの血清が、〔５〕、
〔６〕で発現された該ポリペプチドと免疫学的に反応す
るので、該ポリペプチドはＣ型肝炎関連抗原として同定
された。この同定は、以下に示す免疫沈殿法により行っ
た。まず、例えば〔５〕で記述した組換えウイルスＡｃ
８１３ｄをＳｆ９細胞に４ＰＦＵ／ＣＥＬＬで感染さ
せ、約３０時間後に２％透析ＦＣＳ、正常の１／２０濃
度のメチオニン、７５μＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−メチオニン
（アマシャム社製）を含むグレース培地に交換し、約４
８時間２７℃で培養した。

【００５６】この培養液を2,000 rpm で５分間遠心分離
させ、培養上清を回収した。この標識したＥ１タンパク
質を含む上清100 μｌに、Ｃ型肝炎患者血清１μｌを加
え４℃で１時間反応させた後、プロテインＡアガロース
（ファルマシア社製）10μｌを添加し、さらに４℃で１
時間反応させた。15,000 rpm、１分の遠心分離によりプ
ロテインＡアガロースを沈殿させ、上清を除き200 μｌ
のＲＩＰＡ バッファー（50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.1
5 M NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 1% ナトリウム
デオキシコレート) で３回洗浄し、２０μｌのＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動用試料処理液（２％Ｓ
ＤＳ、５％メルカプトエタノール、１０％グリセリン及
び0.005%ブロモフェノールブルーを含む50mMトリス塩酸
緩衝液、ｐＨ６．８）に溶解した。

【００５７】次に、この試料を１００℃、１０分間煮沸
した。 このようにして得られた試料１０μｌを、０．
１％ＳＤＳ−１２．５％ポリアクリルアミドゲル(70 ×
85×１mm）に添加した。その際、マーカータンパク質と
してファルマシア社製「ＬＭＷ ＫｉｔＥ」（低分子量
マーカータンパク質）を使用した。電極液としてトリス
緩衝液（25 mM トリス pH 8.3, 192 mM グリシン, 0.1%
SDS) を用い、30 mAの定電流で約４５分間泳動後、ク
ーマシー ブリリアント ブルーで常法により染色後乾
燥し、オートラジオグラフィーを行った。

【００５８】〔８〕Ｅ１タンパク質（ｐＵＣ８１３由
来）と改変Ｅ１タンパク質（ｐＵＣ８１３ｄ由来）の分
泌発現量の比較 〔７〕と同様に組換えバキュロウイルスＡｃ８１３をＳ
ｆ９細胞に感染させ、アイソトープ標識し、培養上清中
のＥ１タンパク質量を免疫沈殿し、Ａｃ８１３ｄのもの
と比較したところ、図１に示すとおり著しい発現量の差
が認められた。

【配列表】

【００５９】配列番号:1 配列の長さ:1037 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖ト ポロジー:直鎖状 アンチセンス:No 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：pUC010 配列 CTGCAGACCG TGCATC ATG AGC ACA AAT CCT AAA CCC CAA AGA AAA ACC AAA 52 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys 1 5 10 CGT AAC ACC AAC CGT CGC CCA CAG GAC GTT AAG TTC CCG GGC GGT GGT 100 Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly 15 20 25 CAG ATC GTC GGT GGA GTT TAC TTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG 148 Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu 30 35 40 GGT GTG CGT GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA 196 Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly 45 50 55 60 AGG CGA CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CGG CCC GAG GGC AGG ACC TGG 244 Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp 65 70 75 GCT CAG CCT GGG TAT CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG GGC TTG GGG 292 Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly 80 85 90 TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGC GGC TCT CGG CCT AGT TGG GGC 340 Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly 95 100 105 CCT AAT GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT 388 Pro Asn Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp 110 115 120 ACC CTT ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATC CCG CTT GTC 436 Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val 125 130 135 140 GGC GCC CCC TTA GGG GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCA CAT GGT GTC CGG 484 Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg 145 150 155 GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT TTG CCC GGT TGC 532 Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys 160 165 170 TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTA GCT CTG CTG TCC TGT TTG ACC ATC CCA 580 Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro 175 180 185 GCT TCC GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG TCC GGG ATA TAC CAT GTC ACA 628 Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr 190 195 200 AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGC ATT GTG TAT GAG GCG GCG GAC GTG ATC 676 Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Val Ile 205 210 215 220 ATG CAT GCC CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTT CGG GAG AAC AAT TCC TCC 724 Met His Ala Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser 225 230 235 CGT TGC TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AGG AAT GCC AGC 772 Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser 240 245 250 GTC CCC ACT ACG ACA TTA CGA CGC CAC GTC GAC TTG CTC GTT GGG ACG 820 Val Pro Thr Thr Thr Leu Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Thr 255 260 265 GCT GCT TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGC GGA TCT GTT 868 Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val 270 275 280 TTC CTC ATC TCC CAG CTG TTC ACC TTC TCG CCT CGC CGG CAT GAG ACA 916 Phe Leu Ile Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr 285 290 295 300 GTA CAG GAC TGC AAC TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAC GTA TCA GGC CAT 964 Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His 305 310 315 CGT ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCG CCC ACG GCA GCC TTA 1012 Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu 320 325 330 GTG GTG TCG CAG TTA CTC CGG ATC C 1037 Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile 335 340

【００６０】配列番号：２ 配列の長さ：１０３７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：No 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：pUCM010 配列 CTGCAGACCG TGCATC ATG AGC ACA AAT CCA AAA CCC CAA AGA AAA ATC AAA 52 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Ile Lys 1 5 10 CGT AAC ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTT AAG TTC CCG GGC GGT GGT 100 Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly 15 20 25 CAG ATC GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG 148 Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu 30 35 40 GGT GTG CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG CCG CAA CCT CGT GGA 196 Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Pro Gln Pro Arg Gly 45 50 55 60 AGG CGA CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAA CCC GAG GGT AGG GCC TGG 244 Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Ala Trp 65 70 75 GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG GGC TTG GGG 292 Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly 80 85 90 TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGC GGC TCC CGG CCT AGT TGG GGC 340 Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly 95 100 105 CCC ACG GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT 388 Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp 110 115 120 ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTC GTC 436 Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val 125 130 135 140 GGC GCC CCC CTA GGG GGC GCT GCC AGG GCT CTA GCG CAT GGC GTC CGG 484 Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg 145 150 155 GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT CTG CCT GGT TGC 532 Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys 160 165 170 TCC TTT TCT ATC TTC CTT TTG GCT TTG CTG TCC TGT TTG ACC ATC CCA 580 Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro 175 180 185 GCT TCC GCC TAC CAA GTG CGC AAC GCG TCC GGG GTG TAC CAT GTC ACG 628 Ala Ser Ala Tyr Gln Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr 190 195 200 AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGT ATT GTG TAT GAG GCG GCG GAC GTG ATT 676 Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Val Ile 205 210 215 220 ATG CAC ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTC CGG GAG AAC AAT TCC TCC 724 Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser 225 230 235 CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTT GCG GCC AGG AAC AGC AGC 772 Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ser Ser 240 245 250 ATC CCC ACT ACG ACA ATA CGG CGT CAT GTC GAC TTG CTC GTT GGG GCA 820 Ile Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala 255 260 265 GCT GCT CTC TGT TCC GCT ATG TAT GTG GGG GAT TTT TGC GGA TCT GTT 868 Ala Ala Leu Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Phe Cys Gly Ser Val 270 275 280 TTC CTC GTC TCC CAG CTG TTC ACT TTC TCA CCT CGC CGG TAT GAG ACG 916 Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg Tyr Glu Thr 285 290 295 300 GTG CAA GAC TGC AAT TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAT GTA TCA GGC CAT 964 Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His 305 310 315 CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATA ATG AAT TGG TCA CCT ACA ACA GCC CTA 1012 Arg Met Ala Trp Asp Met Ile Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu 320 325 330 GTG GTA TCG CAG CTA CTC CGG ATC C 1037 Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile 335 340

【００６１】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ＰＣＲ用合成ＤＮＡ） 配列 CGGGATCCGG AGTAACTGCG 20

【００６２】配列番号：４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ＰＣＲ用合成ＤＮＡ） 配列 CGCTGCAGAC CGTGCATCAT GAGCAC 26

【００６３】配列番号：５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（シークエンス用合成ＤＮＡ） 配列 GTAAAACGAC GGCCAGT 17

【００６４】配列番号：６ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（シークエンス用合成ＤＮＡ） 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17

【００６５】

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えバキュロウイルスＡｃ８１３及びＡｃ８
１３ｄ感染Ｓｆ９細胞の培養上清を、Ｃ型肝炎患者血清
で免疫沈殿した結果を示す。

フロントページの続き (72)発明者 関 誠 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地三菱 化成株式会社総合研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルスの外被タンパク質をコ
   ードするＤＮＡ断片を含有する発現ベクターで形質転換
   された形質転換体を培養し、細胞外に産生するＣ型肝炎
   ウイルス外皮タンパク質を取得することを特徴とするＣ
   型肝炎ウイルス外被タンパク質の産生方法。