CN102645534B - 基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫分析、体外诊断技术领域，涉及一种基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法。它解决了现有技术只能检测单一指标、检测效率低、实验强度大等技术问题。本方法将不同颜色的量子点编码微球表面偶联不同的HCV诊断标志物，然后与待测样本混合孵育，通过检测编码微球上的荧光信号，对编码微球进行解码和检测待分析的HCV诊断指标。优点在于：1、采用量子点编码微球为载体，可以对HCV的多个检测指标进行同时检测，提高了检测效率、简化操作步骤。2、采用量子点编码微球载体进行免疫反应，其反应动力学优于微孔板免疫反应，缩短反应时间和提高检测灵敏度。3、对HCV的多个指标的检测，可以提高诊断结果的准确性。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析、体外诊断技术领域，涉及丙型肝炎病毒的检测，尤其是涉及一种基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法。
背景技术
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是上世纪70年代出现的一种非甲非乙型肝炎，1989年被鉴定为丙型肝炎病毒。感染呈世界性分布，全球有约2.7-3亿丙肝患者。我国HCV感染属中高流行区，是一个严重影响人群健康的公共卫生问题，全国有约4,000万HCV携带者，平均感染率高达3.2％。HCV慢性感染导致肝脏发生慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可能会发展成肝硬化，严重者可发展成肝癌，及时准确快速地检测HCV病毒对于疾病的诊断、治疗和监控具有十分重要的临床应用意义。
实验室检测HCV的方法主要有两类：血清分析和核酸分析。目前，血清分析仍是普遍使用的方法，常用检测方法是酶联免疫分析方法(Enzyme Immunoassay，EIA)检测血清中HCV抗体和抗原。根据检测靶标分子的不同，目前已经发展了三代检测HCV的诊断试剂，第一代HCV血清诊断方法使用标准的酶联免疫分析(ELISA)技术，用c100-3抗原检测血清中HCV病毒NS4位点的抗体，因而第一代HCV诊断方法主要用于降低感染输血型HCV的风险，但仍有较长的窗口期；第二代诊断方法在c100-3抗原检测靶向HCV病毒NS4位点抗体的基础上，增加了分别靶向HCV病毒NS3位点的抗体和核心抗原，特别是HCV核心抗原的检测可以将HCV的检测“窗口”期平均缩短约5周；第三代诊断试剂，所用核心抗原比例下降，而增加了检测靶向NS3位点抗体的c33c抗原的比例，去掉了特异性和灵敏性较差的的c100-3抗原，增加了检测靶向HCV病毒NS5位点抗体的抗原，提高了抗原的纯度。第二、三代HCV诊断试剂中都使用了多种HCV标志物检测，而传统的多元检测技术具有操作繁琐，劳动强度大，结果重复性差，易发生交叉感染，样本需求量大等缺点，限制了其在临床诊断上的应用。
量子点(Quantum Dots，QDs)通常指粒径小于或接近激子玻尔半径的半导体纳米晶粒，由于量子限域、尺寸效应和表面效应等，量子点具有许多独特的荧光性能，如发射波长的尺寸依赖性，激发光波长范围广，斯托克斯位移大等，与有机荧光染料相比还具有荧光强度强、灵敏度高和光漂白速率慢等特点。用量子点代替有机荧光染料制备编码微球，多色发射光谱不出现重叠或只有很小程度的重叠，单色激发光即可同时激发多色量子点发射荧光，因此大大提高了荧光编码的能力，得到更多种类的荧光微球；理论上使用6种不同颜色的荧光量子点，每种10个荧光强度，这样就可以得到106-1种微球，基本上可以满足同时检测大量生物分子的需要。由于量子点可用单色光同时激发多色量子点，使用常见的流式细胞仪就可以检测，无需特殊的芯片分析仪器，具有更强的应用灵活性。
基于微球的免疫诊断试剂是一种新型诊断技术，该方法原理上与传统ELISA方法类似，将捕获分子固定在微球载体上，捕获样品中待测分子至微球表面，然后使用报告分子的信号检测微球上待测分子的数量。具有操作简便、反应动力学优良、分辨率高、灵敏度高和稳定性好等优点。有文献报道使用微球或者磁性微球建立丙型肝炎诊断试剂盒，其具有灵敏度高、特异性好、稳定性好等优点。但目前使用的微球诊断试剂只能检测单一指标，尤其丙肝病毒诊断需要检测多元指标。为此，人们进行了长期的探索，但均未能获得较为理想的进展。
发明内容
本发明目的是针对上述问题，提供一种能够提高丙型肝炎的诊断准确率、缩短检测窗口期、降低检测试验强度和减少样本需求量的基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法，本方法包括下述步骤：
S1：在不同颜色的量子点编码微球表面偶联不同的HCV抗体和/或抗原；
S2：将步骤S1得到的一种或者多种量子点编码微球加入待测样品中孵育，富集待测样品中的HCV抗原和/或抗体至量子点编码微球表面；
S3：将荧光抗体与步骤S2得到的量子点编码微球混合免疫杂交；
S4：检测步骤S3得到的量子点编码微球的荧光信号，并检测量子点编码微球表面报告分子的荧光信号强度；
S5：根据量子点编码微球表面报告分子的荧光信号强度进行定性检测和/或定量检测。
鉴于丙型肝炎病毒的血清诊断试剂的多元检测特性，本发明公开了一种基于量子点编码微球载体的HCV多元检测技术，对于提高丙型肝炎的诊断准确率、缩短检测窗口期、降低检测试验强度和减少样本需求量具有重要意义。本发明步骤S1的量子点编码微球系表面带羧基的量子点编码微球。
在上述的基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法中，上述的步骤S1包括下述步骤：
a、将量子点编码微球分散在磷酸盐缓冲液中，量子点编码微球浓度为104-106个/mL，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酸亚胺，二者浓度分别为0.1-100μM和0.2-200μM，然后在室温孵育10-90分钟；
b、将量子点编码微球悬浮液3000-10000rpm离心，弃去上清，加磷酸盐缓冲液洗涤，然后加入浓度0.1-1mg/mL的HCV抗体和/或抗原，室温下孵育0.5-2小时；
c、然后加入浓度0.1-10mg/mL的牛血清蛋白封闭量子点编码微球表面，室温下继续孵育0.5-2小时，再将量子点编码微球悬浮液3000-10000rpm离心，弃去上清，加磷酸盐缓冲液洗涤。
本发明中的磷酸盐缓冲液的pH值为7.3-7.5，优选为7.4。步骤a和步骤c中，磷酸盐缓冲液洗涤的次数以两次为宜。
在上述的基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法中，所述的步骤b中，加入的抗体和/或抗原分子包括HCV核心抗体、NS3、NS4和NS5区特异性抗原中的一种或者多种。
在上述的基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法中，所述的待测样品包括：阴性对照血清和阳性对照血清，所述的阴性对照血清为非丙型肝炎患者混合血清，所述的阳性对照血清为经确定的HCV抗体和/或抗原血清。
在上述的基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法中，所述的量子点编码微球基质材料为聚苯乙烯、二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯或三聚氰胺甲醛中的一种，粒径0.5-50微米。
在上述的基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法中，所述的量子点编码微球中的量子点包括CdSe、CdTe、CdS量子点，以及CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe核壳量子点。
在上述的基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法中，上述的步骤S3中的荧光抗体为羊、鼠、兔抗人免疫球蛋白抗体或者抗-HCV核心抗体，且荧光抗体分子的荧光发射峰与量子点编码微球的荧光发射峰不重叠。
在上述的基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法中，上述的步骤S4中，使用荧光显微镜或者流式细胞仪检测量子点编码微球的上的荧光信号，根据量子点编码微球报告分子的荧光信号确定量子点编码微球种类，根据报告分子荧光信号强度确定待测样品中HCV抗体和/或抗原浓度。
在上述的基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法中，上述的步骤S5中，定性检测用阴性对照血清、阳性对照血清为参照，根据待测样品的报告分子荧光强度进行定性判断，当强度大于等于阴性对照血清检测值的2.1倍时为阳性，当强度小于阴性对照血清检测值的2.1倍时为阴性；定量检测用一组已知浓度的阳性对照血清制作标准曲线，然后对待测样本进行定量分析。
在上述的基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法中，每种量子点编码微球表面包被一种HCV探针，使用多种量子点编码微球混合物与待测样品混合孵育，同时检测待测样品中的多个HCV指标。
与现有的技术相比，本基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法的优点在于：1、采用量子点编码微球为载体，可以对HCV的多个检测指标进行同时检测，提高了检测效率、简化操作步骤。2、采用量子点编码微球载体进行免疫反应，其反应动力学优于微孔板免疫反应，缩短反应时间和提高检测灵敏度。3、对HCV的多个指标的检测，可以提高诊断结果的准确性。
具体实施方式
本基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法是将不同颜色的量子点编码微球表面偶联不同的HCV诊断标志物，然后与待测样本混合孵育，通过检测编码微球上的荧光信号，对编码微球进行解码和检测待分析的HCV诊断指标。
本基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的方法包括下述步骤：
S1：在不同颜色的量子点编码微球表面偶联不同的HCV抗体和/或抗原。本发明步骤S1的量子点编码微球系表面带羧基的量子点编码微球。具体地说步骤S1包括下述步骤：a、将量子点编码微球分散在磷酸盐缓冲液中，量子点编码微球浓度为104-106个/mL，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酸亚胺，二者浓度分别为0.1-100μM和0.2-200μM，然后在室温孵育10-90分钟。b、将量子点编码微球溶液3000-10000rpm离心，弃去上清，加磷酸盐缓冲液洗涤，然后加入浓度0.1-1mg/mL的HCV抗体和/或抗原，室温下孵育0.5-2小时；c、然后加入浓度0.1-10mg/mL的牛血清蛋白封闭量子点编码微球表面，室温下继续孵育0.5-2小时，再将量子点编码微球悬浮液3000-10000rpm离心，弃去上清，加磷酸盐缓冲液洗涤。
上述步骤b中，加入的抗体和/或抗原分子包括HCV核心抗体、NS3、NS4和NS5区特异性抗原中的一种或者多种。待测样品包括：阴性对照血清和阳性对照血清，所述的阴性对照血清为非丙型肝炎患者混合血清，所述的阳性对照血清为经确定的HCV抗体和抗原血清。量子点编码微球基质材料为聚苯乙烯、二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯、三聚氰胺甲醛中的一种，粒径0.5-50微米。量子点编码微球中的量子点包括CdSe、CdTe、CdS量子点，以及CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe核壳量子点。本发明中每种量子点编码微球表面包被一种HCV探针，使用多种量子点编码微球混合物与待测样品混合孵育，同时检测待测样品中的多个HCV指标。本发明中的磷酸盐缓冲液的pH值为7.3-7.5，优选为7.4。步骤a和步骤c中，磷酸盐缓冲液洗涤的次数以两次为宜。
S2：将步骤S1得到的一种或者多种量子点编码微球加入待测样品中孵育，富集待测样品中的HCV抗体和/或抗原至量子点编码微球表面。
S3：将荧光抗体与步骤S2得到的量子点编码微球混合免疫杂交。步骤S3中的荧光抗体为羊、鼠、兔抗人免疫球蛋白抗体或者抗-HCV核心抗体，且荧光抗体分子的荧光发射峰与量子点编码微球的荧光发射峰不重叠。
S4：检测步骤S3得到的量子点编码微球的荧光信号确定量子点编码微球种类，并检测量子点编码微球表面报告分子的荧光信号强度。步骤S4中，使用荧光显微镜或者流式细胞仪检测量子点编码微球的上的荧光信号，根据量子点编码微球报告分子的荧光信号确定量子点编码微球种类，根据报告分子荧光信号强度确定待测样品中HCV抗体和/或抗原浓度。
S5：根据量子点编码微球表面报告分子的荧光信号强度进行定性检测和/或定量检测。步骤S5中，定性检测用阴性对照血清、阳性对照血清为参照，根据待测样品的报告分子荧光强度进行定性判断，当强度大于等于阴性对照血清检测值的2.1倍时为阳性，当强度小于阴性对照血清检测值的2.1倍时为阴性；定量检测用一组已知浓度的阳性对照血清制作标准曲线，然后对待测样本进行定量分析。
临床实施例1：
HCV核心抗体包被的量子点编码微球的制备：粒径约5微米包覆发射波长520nm的CdSe/ZnS量子点编码微球，取约105个分散在1mL的磷酸盐缓冲液中，5000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散在200μL的磷酸盐缓冲液溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)50μM和N-羟基硫代琥珀酸亚胺(sulfo-NHS)100μM，然后室温下孵育30分钟；将量子点编码微球5000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散在200μL的磷酸盐缓冲液中；加入HCV核心抗体，最终抗体浓度约0.5mg/mL，然后室温下孵育1小时；加入牛血清白蛋白(BSA)，最终BSA浓度约5mg/mL，然后室温下继续孵育1小时；将量子点编码微球5000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，分散在200μL的磷酸盐缓冲液中，即得到HCV核心抗体包被的量子点编码微球(免疫微球)。
将得到的免疫微球与200μL待测样品混合，室温下孵育1小时，然后5000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散在200μL的磷酸盐缓冲液中。
向微球悬浮液中加入10μL的TR ITC-抗-HCV荧光抗体，室温下孵育1小时，然后5000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散200μL的磷酸盐缓冲液。
将杂交微球悬浮液滴加在玻片上，均匀分散，然后在荧光显微镜下观察，统计量子点编码微球580nm滤波片下的荧光强度，将待测样品与阴性对照进行比较，判定血清中HCV核心抗原的存在。
临床实施例2：
HCV核心抗体包被的量子点编码微球的制备：粒径约0.1微米包覆发射波长580nm的CdSe量子点编码微球，取约106个分散在1mL的磷酸盐缓冲液中，10000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散在200μL的磷酸盐缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)0.1μM和N-羟基硫代琥珀酸亚胺(sulfo-NHS)0.2μM，然后室温下孵育10分钟；将量子点编码微球10000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散在200μL的磷酸盐缓冲液中；加入HCV核心抗体，最终抗体浓度约0.1mg/mL，然后室温下孵育1小时；加入牛血清白蛋白(BSA)，最终BSA浓度约0.1mg/mL，然后室温下继续孵育1小时；将量子点编码微球10000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，分散在200μL的磷酸盐缓冲液中，即得到HCV核心抗体包被的量子点编码微球。
相同方法在650nm的CdSe量子点编码微球表面包被NS3区特异性抗原，580nm和650nm的CdSe量子点混合编码微球表面包被NS4区特异性抗原。
将得到的3种免疫微球一起与200μL样本混合，室温下孵育1小时，然后10000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散200μL的磷酸盐缓冲液，制得免疫微球悬浮液。
向免疫微球悬浮液中加入10μL的F ITC-兔抗人IgG荧光抗体和TRITC-抗-HCV荧光抗体，室温下孵育1小时，然后10000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散在200μL的磷酸盐缓冲液中。
在流式细胞仪上检测杂交微球在520nm、580nm和650nm通道的荧光强度，根据580nm和650nm通道荧光强度确定微球的种类，根据520nm通道荧光强度确定待测分子的浓度，将待测样品的520通道的荧光值与阴性对照和阳性对照血清的荧光值进行比较，判定血清中HCV核心抗原、HCV抗体的存在。
临床实施例3
HCV核心抗体包被的量子点编码微球的制备：粒径约50微米包覆发射波长520nm的CdSe/ZnSe量子点编码微球，取约104个分散在1mL的磷酸盐缓冲液中，3000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散在200μL的磷酸盐缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)100μM和N-羟基硫代琥珀酸亚胺(sulfo-NHS)200μM，然后室温下孵育10分钟；将微球3000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散在200μL的磷酸盐缓冲液中；加入HCV核心抗体，最终抗体浓度约0.1mg/mL，然后室温下孵育1小时；加入牛血清白蛋白(BSA)，最终BSA浓度约1mg/mL，然后室温下继续孵育1小时；将微球3000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，分散在200μL的磷酸盐缓冲液中，即得到HCV核心抗体包被的量子点编码微球。
相同方法在580nm的CdSe/ZnSe量子点编码微球表面包被NS3区特异性抗原，520nm和580nm(荧光强度比2∶1)的CdSe/ZnSe量子点混合编码微球表面包被NS4区特异性抗原，520nm和580nm(荧光强度比1∶2)的CdS e/ZnSe量子点混合编码微球表面包被NS5区特异性抗原。
将得到的4种免疫微球一起与200μL样本混合，室温下孵育1小时，然后3000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散在200μL的磷酸盐缓冲液中。
向微球悬浮液中加入10μL的FITC-兔抗人IgG荧光抗体和TRITC-抗-HCV荧光抗体，室温下孵育1小时，然后3000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散200μL的磷酸盐缓冲液。
将混合免疫杂交微球在流式细胞仪上检测520nm、580nm和650nm通道的荧光强度，根据520nm和580nm通道荧光强度确定微球的种类，根据650nm通道荧光强度确定待测分子的浓度，将一系列浓度阳性对照血清的650nm通道荧光值制作标准曲线，阴性对照血清作阴性对照，将待测样本的荧光值与之比较，判定血清中HCV核心抗原、HCV抗体的浓度。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管本文较多地使用了术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。
Claims (1)
1.一种基于量子点编码微球芯片检测丙型肝炎病毒的非疾病诊断与治疗目的的方法，其特征在于，本方法包括下述步骤：
S1：在不同颜色的量子点编码微球表面偶联不同的HCV抗体和/或抗原；
S2：将步骤S1得到的一种或者多种量子点编码微球加入待测样品中孵育，富集待测样品中的HCV抗原和/或抗体至量子点编码微球表面；
S3：将荧光抗体与步骤S2得到的量子点编码微球混合免疫杂交；
S4：检测步骤S3得到的量子点编码微球的荧光信号，并检测量子点编码微球表面报告分子的荧光信号强度；
S5：根据量子点编码微球表面报告分子的荧光信号强度进行定性检测和/或定量检测；
每种量子点编码微球表面包被一种HCV探针，使用多种量子点编码微球混合物与待测样品混合孵育，同时检测待测样品中的多个HCV指标；
所述的待测样品包括：阴性对照血清和阳性对照血清，所述的阴性对照血清为非丙型肝炎患者混合血清，所述的阳性对照血清为经确定的HCV抗体和/或抗原血清；
粒径50微米包覆发射波长520nm的CdSe/ZnSe量子点编码微球，取104个分散在1mL的磷酸盐缓冲液中，3000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散在200μL的磷酸盐缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)100μM和N-羟基硫代琥珀酸亚胺(sulfo-NHS)200μM，然后室温下孵育10分钟；将微球3000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散在200μL的磷酸盐缓冲液中；加入HCV核心抗体，最终抗体浓度0.1mg/mL，然后室温下孵育1小时；加入牛血清白蛋白(BSA)，最终BSA浓度1mg/mL，然后室温下继续孵育1小时；将微球3000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，分散在200μL的磷酸盐缓冲液中，即得到HCV核心抗体包被的量子点编码微球；相同方法在580nm的CdSe/ZnSe量子点编码微球表面包被NS3区特异性抗原，520nm和580nm荧光强度比2：1的CdSe/ZnSe量子点混合编码微球表面包被NS4区特异性抗原，520nm和580nm荧光强度比1：2的CdSe/ZnSe量子点混合编码微球表面包被NS5区特异性抗原；将得到的4种免疫微球一起与200μL样本混合，室温下孵育1小时，然后3000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散在200μL的磷酸盐缓冲液中；向微球悬浮液中加入10μL的FITC-兔抗人IgG荧光抗体和TRITC-抗-HCV荧光抗体，室温下孵育1小时，然后3000rpm离心分离，弃去上清，洗涤2次，然后分散200μL的磷酸盐缓冲液；将混合免疫杂交微球在流式细胞仪上检测520nm、580nm和650nm通道的荧光强度，根据520nm和580nm通道荧光强度确定微球的种类，根据650nm通道荧光强度确定待测分子的浓度，将一系列浓度阳性对照血清的650nm通道荧光值制作标准曲线，阴性对照血清作阴性对照，将待测样本的荧光值与之比较，判定血清中HCV核心抗原、HCV抗体的浓度。
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