CN113945719A - 一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测系统及其检测方法，属于医学检验技术领域，所述系统包括大鼠培养模块、大鼠检测样品采集模块、指标检测模块、数据分析模块；所述大鼠培养模块和大鼠检测样品采集模块数据连接；所述大鼠检测样品采集模块和指标检测模块数据连接；所述指标检测模块和数据分析模块数据连接；大鼠培养模块和数据分析模块数据连接。本发明可以大规模的检测实验大鼠，系统性的进行实验动物管理、样品采集、药品配置，方便海量检测数据的采集和分析，对于自身免疫性脑脊髓炎的研究有重要作用。
Description
技术领域
本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测的方法，实现了大鼠自身免疫性脑脊髓炎的自动检测和高精度指标数据采集。
背景技术
多发性硬化是一种中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病，以中枢神经系统炎性脱髓鞘、神经胶质细胞增生和不同程度的轴索损害为主要病理特征。目前认为多发性硬化是多种因素共同作用的结果，但多发性硬化的发病机制尚不完全清楚。众多研究表明多发性硬化早期就存在血脑屏障的破坏，并推测其可能为多发性硬化发病的一个关键环节。实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型是国际公认的多发性硬化的理想动物模型，并且已有很多学者用来研究多发性硬化的血脑屏障的变化。基质金属蛋白酶是基质金属蛋白酶系家族中重要的一员，在炎症反应中有很强的破坏作用，与多种神经系统疾病的血脑屏障破坏密切相关。研究证实主要在复发期及活动期表达，与疾病的活动性更为相关。但是单一指标的检测虽然可以判定自身免疫性脑脊髓炎的确诊信息，难以了解病理变化过程状态，所以多指标物质的检测对于实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型的病理变化过程的探究极为关键，我们需要通过明确了解动物模型中自身免疫性脑脊髓炎的表征过程为多发性硬化这种自身免疫性疾病提供更多的研究参考。
发明内容
本发明的目的在于：针对以上现有技术实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测了解有限的问题，本发明提供一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测系统，以便于充分了解大鼠自身免疫性脑脊髓炎中的病理变化，从而为自身免疫病的实验探究提供更多的信息支持。
一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测系统，所述系统包括大鼠培养模块、大鼠检测样品采集模块、指标检测模块、数据分析模块；所述大鼠培养模块和大鼠检测样品采集模块数据连接；所述大鼠检测样品采集模块和指标检测模块数据连接；所述指标检测模块和数据分析模块数据连接；大鼠培养模块和数据分析模块数据连接；所述指标检测模块包括基质金属蛋白酶-9检测模块、CD4+CD25+检测模块、CD4+IL-10+模块、CD4+IFN-γ+检测模块。
一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测的方法，所述检测方法具体步骤如下：
1)大鼠培养模块数据采集：将需要检测的大鼠放置到大鼠培养模块培养20-30h，采集每只大鼠毛发外观、活动次数、进食状况、睡眠状况数据，将数据发送到数据分析模块，数据分析模块对比出状态稳定的大鼠，将大鼠信息发送至大鼠培养模块，大鼠培养模块对状态稳定的大鼠进行标记，将数据发送至大鼠检测样品采集模块；
2)大鼠检测样品采集模块采集样品：
A大鼠检测样品采集模块根据大鼠培养模块标记的数据，用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经心穿刺抽取血液放入离心管内，在室温下静置1-2小时，以2000-3000r/min离心5-8min，留取上清液备用；
B将大鼠用0.28-0.33g/L戊巴比妥钠0.2-0.25mL麻醉后，取脾脏，制备成单个核细胞悬液，调整细胞数为3×109/L，用0.02g/LMOG35-55刺激，放在CO2培养箱培养；
3)指标检测模块检测数据：
指标检测模块根据大鼠检测样品采集模块采集的样品，取4份未偶联羧基化微球原液，分组标记，分别对应基质金属蛋白酶-9检测模块、CD4+CD25+检测模块、CD4+IL-10+模块、CD4+IFN-γ+检测模块；将微球原液取出放置于室温，离心，漩涡振荡2-3分钟，去除上清液，将微球加入洗涤缓冲液超声洗涤，分别加入10μlEDC和10μlSulfo-NHS，室温避光震摇20分钟；重悬于微球激活缓冲液；用所得微球激活缓冲液配置新鲜的EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐，50mg/ml)和Sulfo-NHS(硫化N-羟基琥珀酰亚胺，50mg/ml)，现配现用，每管分别加入PBS，pH 7.4，高速漩涡振荡10秒，14500×RCF离心4分钟；
在上述所得微球中分别加入对应检测指标的单克隆抗体，将四种捕获抗体与四种微球相对应，经室温避光摇震2-3小时；14500×RCF离心4分钟，小心弃上清；加入500μlPBS，14500×RCF离心4分钟，小心弃上清；重悬微球于250μl封闭缓冲液中，漩涡振荡15秒，室温避光摇震30分钟；14500×RCF离心4分钟，小心弃上清；加入储存缓冲液，14500×RCF离心6分钟，小心弃上清，将原液重悬于储存缓冲液；
向各管中均加入PE标记的亲和素，包括空白管，振荡混匀，按优化的孵育时间避光反应；加入PBS，混匀后离心5分钟，小心去除上清，再加入ml PBS，混匀后离心5分钟，去除上清；依次加入PBS振荡混匀；
3)指标检测模块检测数据
将上一步骤制作好的样本放入检测模块，检测出数据存储，所述数据检测模块为流式细胞仪；
4)数据分析模块检验数据
数据分析模块收到检测模块发送的数据，汇总大鼠培养模块、大鼠检测样品采集模块、指标检测模块中的初始数据，检验初始数据的检测误差和数据计算模型，确认前期数据在可控误差内；检验指标检测模块的最终数据统计，分析数据的真实性，输出最终的检测报告。
作为一种优选方案，所述未偶联羧基化微球原液，每份约1.25×107个/mL，避光保存于4℃。
作为一种优选方案，所述洗涤缓冲液为PBS+5％Tween-20。
作为一种优选方案，所述微球激活缓冲液为0.1mol/L NaH2PO4溶液，PH＝6.2。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测的方法，该检测方法将微球分析技术与流式细胞分析技术相结合，实现了自身免疫性脑脊髓炎动物模型的前期数据采集，方便后续指标与实验动物的前期状态对照进行研究，便于甄别最终数据的可靠性，避免单纯的统计分析导致数据结果偏离实验事实，可以保证得到的自身免疫性脑脊髓炎检测指标与实验动物状态高度吻合；
(2)本发明提供的一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测的方法，可以大规模的检测实验大鼠，系统性的进行实验动物管理、样品采集、药品配置，实现检测的数据与动物模型高度统一，方便海量检测数据的采集和分析，对于自身免疫性脑脊髓炎的研究有重要作用；
(3)目前对于自身免疫性脑脊髓炎的测定方法大都还是采用化学发光法、酶联免疫吸附法、免疫透射比浊法、免疫印迹法等，其检测方式精密度差、时效性不高，往往在检测中耗费大量的时间和人力，数据采集效率低下，不能实现数据的高效流动，导致自身免疫性脑脊髓炎动物模型的研究进程缓慢；采用本发明系统和方法，将有效解决这些问题。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测系统，所述系统包括大鼠培养模块、大鼠检测样品采集模块、指标检测模块、数据分析模块；所述大鼠培养模块和大鼠检测样品采集模块数据连接；所述大鼠检测样品采集模块和指标检测模块数据连接；所述指标检测模块和数据分析模块数据连接；大鼠培养模块和数据分析模块数据连接；所述指标检测模块包括基质金属蛋白酶-9检测模块、CD4+CD25+检测模块、CD4+IL-10+模块、CD4+IFN-γ+检测模块。
一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测的方法，所述检测方法具体步骤如下：
1)大鼠培养模块数据采集：将需要检测的大鼠放置到大鼠培养模块培养20-30h，采集每只大鼠毛发外观、活动次数、进食状况、睡眠状况数据，将数据发送到数据分析模块，数据分析模块对比出状态稳定的大鼠，将大鼠信息发送至大鼠培养模块，大鼠培养模块对状态稳定的大鼠进行标记，将数据发送至大鼠检测样品采集模块；
2)大鼠检测样品采集模块采集样品：
A大鼠检测样品采集模块根据大鼠培养模块标记的数据，用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经心穿刺抽取血液放入离心管内，在室温下静置1-2小时，以2000-3000r/min离心5-8min，留取上清液备用；
B将大鼠用0.28-0.33g/L戊巴比妥钠0.2-0.25mL麻醉后，取脾脏，制备成单个核细胞悬液，调整细胞数为3×109/L，用0.02g/LMOG35-55刺激，放在CO2培养箱培养；
3)指标检测模块检测数据：
所述未偶联羧基化微球原液，每份约1.25×107个/mL，避光保存于4℃；所述洗涤缓冲液为PBS+5％Tween-20；所述微球激活缓冲液为0.1mol/LNaH2PO4溶液，PH＝6.2；
指标检测模块根据大鼠检测样品采集模块采集的样品，取4份未偶联羧基化微球原液，分组标记，分别对应基质金属蛋白酶-9检测模块、CD4+CD25+检测模块、CD4+IL-10+模块、CD4+IFN-γ+检测模块；将微球原液取出放置于室温，离心，漩涡振荡2-3分钟，去除上清液，将微球加入洗涤缓冲液超声洗涤，分别加入10μlEDC和10μlSulfo-NHS，室温避光震摇20分钟；重悬于微球激活缓冲液；用所得微球激活缓冲液配置新鲜的EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐，50mg/ml)和Sulfo-NHS(硫化N-羟基琥珀酰亚胺，50mg/ml)，现配现用，每管分别加入PBS，pH 7.4，高速漩涡振荡10秒，14500×RCF离心4分钟；
在上述所得微球中分别加入对应检测指标的单克隆抗体，将四种捕获抗体与四种微球相对应，经室温避光摇震2-3小时；14500×RCF离心4分钟，小心弃上清；加入500μlPBS，14500×RCF离心4分钟，小心弃上清；重悬微球于250μl封闭缓冲液中，漩涡振荡15秒，室温避光摇震30分钟；14500×RCF离心4分钟，小心弃上清；加入储存缓冲液，14500×RCF离心6分钟，小心弃上清，将原液重悬于储存缓冲液；
向各管中均加入PE标记的亲和素，包括空白管，振荡混匀，按优化的孵育时间避光反应；加入PBS，混匀后离心5分钟，小心去除上清，再加入ml PBS，混匀后离心5分钟，去除上清；依次加入PBS振荡混匀；
3)指标检测模块检测数据
将上一步骤制作好的样本放入检测模块，检测出数据存储，所述数据检测模块为流式细胞仪；
4)数据分析模块检验数据
数据分析模块收到检测模块发送的数据，汇总大鼠培养模块、大鼠检测样品采集模块、指标检测模块中的初始数据，检验初始数据的检测误差和数据计算模型，确认前期数据在可控误差内；检验指标检测模块的最终数据统计，分析数据的真实性，输出最终的检测报告。
本发明中，检测用的的流式细胞仪使用方法为：
(1)准备好相应的流式上样管，并标记号码，标准曲线10管，一管做阴性对照，其他根据样本编号分别排管；(2)向标准曲线管中依次加入系列稀释的混合标准品25μl；向空白管中加入PBS 25μl；向样品管中加入待测血清25μl；(3)向各管中均加入混合微球25μl，包括空白管。(4)向所有管中加入50ul优化的生物素标记抗体混合物，包括空白管；(5)均匀混合流式管，按优化的免疫反应时间避光放于摇床上缓慢发生反应；(6)2小时后加入1mlPBS，混匀后200g离心5分钟，小心去除上清，再加入1ml PBS，混匀后200g离心5分钟，去除上清，保留100ul液体振荡混匀；(7)向各管中均加入PE标记的亲和素50μl，包括空白管，振荡混匀，按优化的孵育时间避光反应；(8)加入1ml PBS，混匀后200g离心5分钟，小心去除上清，再加入1ml PBS，混匀后200g离心5分钟，去除上清；(9)向各管中加入500μl PBS振荡混匀后上流式细胞仪检测。
本实施例采用的微球一种表面含有羧基并包埋了有机荧光分子的聚苯乙烯微球，其具有粒径均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高，微球表面弧度有利于抗原决定簇和抗体结合位点的暴露面处于最佳的反应状态等特点。Bio-Rad公司提供100种不同光谱羧基化荧光编码微球，每一种羧基化荧光编码微球都采用两种不同的荧光染料根据不同的比率调制而成，因此，可以根据羧基化荧光微球自身所携带的荧光来区别100种羧基化荧光编码微球。
本实施例通过流式微球联合检测分析技术，采用高分子微球作为带有一定颜色指示染料的免疫吸附分析的固态载体，利用捕获抗体与一种聚苯乙烯微球藕合，每种聚苯乙烯微球由两种(如红色和橙色)荧光染料编码的高分子微球组成，一旦藕合完成，即可把不同种类的聚苯乙烯微球混合到一起，用于样品中各相应组分的检测。检测时每个聚苯乙烯微球相当于一个细胞，顺次高速通过流式细胞仪的检测区，其聚苯乙烯微球本身(FL2，FL3)和指示染料(FLI)的荧光和散射光将被相应的检测系统检测和记录下来。根据FL2和FL3的强度可把各组编码的聚苯乙烯微球分开。而根据FLI的平均强度，可以求得相应待测物的浓度。本实验需要检测四种标志物，因此将针对四种标志物的捕获抗体与四种不同型号的羧基化荧光编码微球偶联后就可以分别与血清中的四种标志物反应，再加入生物素标记的针对四种标志物的检测抗体和PE标记的亲和素就可以检测血清中四种标志物的含量。
单克隆抗体与微球的成功偶联对后面的检测至关重要，在实践中发现，当4种单克隆抗体加入量少时，微球上的结合位点未被完全占据(多余的位点已被封闭掉)，MFI值随着单抗加入量的增多而增多，本实验中选取四种型号的微球，每种微球分别取5份微球原液(每份约含1.25×106个微球)，分别与5个浓度梯度的单抗偶联，同时设立阴性对照，MFI比阴性对照大2000，可以认为偶联成功。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (5)
1.一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测系统，其特征在于，所述系统包括大鼠培养模块、大鼠检测样品采集模块、指标检测模块、数据分析模块；所述大鼠培养模块和大鼠检测样品采集模块数据连接；所述大鼠检测样品采集模块和指标检测模块数据连接；所述指标检测模块和数据分析模块数据连接；大鼠培养模块和数据分析模块数据连接；所述指标检测模块包括基质金属蛋白酶-9检测模块、CD4+CD25+检测模块、CD4+IL-10+模块、CD4+IFN-γ+检测模块。
2.一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测的方法，其特征在于，所述检测方法具体步骤如下：
1)大鼠培养模块数据采集：将需要检测的大鼠放置到大鼠培养模块培养20-30h，采集每只大鼠毛发外观、活动次数、进食状况、睡眠状况数据，将数据发送到数据分析模块，数据分析模块对比出状态稳定的大鼠，将大鼠信息发送至大鼠培养模块，大鼠培养模块对状态稳定的大鼠进行标记，将数据发送至大鼠检测样品采集模块；
2)大鼠检测样品采集模块采集样品：
A大鼠检测样品采集模块根据大鼠培养模块标记的数据，用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经心穿刺抽取血液放入离心管内，在室温下静置1-2小时，以2000-3000r/min离心5-8min，留取上清液备用；
B将大鼠用0.28-0.33g/L戊巴比妥钠0.2-0.25mL麻醉后，取脾脏，制备成单个核细胞悬液，调整细胞数为3×109/L，用0.02g/LMOG35-55刺激，放在CO2培养箱培养；
3)指标检测模块检测数据：
指标检测模块根据大鼠检测样品采集模块采集的样品，取4份未偶联羧基化微球原液，分组标记，分别对应基质金属蛋白酶-9检测模块、CD4+CD25+检测模块、CD4+IL-10+模块、CD4+IFN-γ+检测模块；将微球原液取出放置于室温，离心，漩涡振荡2-3分钟，去除上清液，将微球加入洗涤缓冲液超声洗涤，分别加入10μlEDC和10μlSulfo-NHS，室温避光震摇20分钟；重悬于微球激活缓冲液；用所得微球激活缓冲液配置新鲜的EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐，50mg/ml)和Sulfo-NHS(硫化N-羟基琥珀酰亚胺，50mg/ml)，现配现用，每管分别加入PBS，pH 7.4，高速漩涡振荡10秒，14500×RCF离心4分钟；
在上述所得微球中分别加入对应检测指标的单克隆抗体，将四种捕获抗体与四种微球相对应，经室温避光摇震2-3小时；14500×RCF离心4分钟，小心弃上清；加入500μl PBS，14500×RCF离心4分钟，小心弃上清；重悬微球于250μl封闭缓冲液中，漩涡振荡15秒，室温避光摇震30分钟；14500×RCF离心4分钟，小心弃上清；加入储存缓冲液，14500×RCF离心6分钟，小心弃上清，将原液重悬于储存缓冲液；
向各管中均加入PE标记的亲和素，包括空白管，振荡混匀，按优化的孵育时间避光反应；加入PBS，混匀后离心5分钟，小心去除上清，再加入mlPBS，混匀后离心5分钟，去除上清；依次加入PBS振荡混匀；
3)指标检测模块检测数据
将上一步骤制作好的样本放入检测模块，检测出数据存储，所述数据检测模块为流式细胞仪；
4)数据分析模块检验数据
数据分析模块收到检测模块发送的数据，汇总大鼠培养模块、大鼠检测样品采集模块、指标检测模块中的初始数据，检验初始数据的检测误差和数据计算模型，确认前期数据在可控误差内；检验指标检测模块的最终数据统计，分析数据的真实性，输出最终的检测报告。
3.根据权利要求2所述的一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测的方法，其特征在于，所述未偶联羧基化微球原液，每份约1.25×107个/mL，避光保存于4℃。
4.根据权利要求2所述的一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测的方法，其特征在于，所述洗涤缓冲液为PBS+5％Tween-20。
5.根据权利要求2所述的一种实验大鼠自身免疫性脑脊髓炎多标志物联合检测的方法，其特征在于，所述微球激活缓冲液为0.1mol/L NaH2PO4溶液，PH＝6.2。
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