CN111876386B - 一种乳腺癌类器官的培养方法以及和肿瘤相关成纤维细胞的共培养方法 - Google Patents

一种乳腺癌类器官的培养方法以及和肿瘤相关成纤维细胞的共培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乳腺癌类器官的培养方法以及和肿瘤相关成纤维细胞的共培养方法。本发明建立了更加高效便捷的乳腺癌患者肿瘤组织类器官(PDO)培养、传代与维持等关键技术环节的改进体系，包括多方面简化PDO细胞系建立、传代的操作步骤和方法，优化培养基、消化液和洗涤液成分等，最终成功建立乳腺癌PDO培养体系，相比于现有技术，成功率和传代次数基本一致，然而操作更简单，所需时间更短，为PDO模型将来拥有更好的临床和科研应用打好了基础，节省了相应成本。本发明还建立了乳腺癌PDO与肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的稳定的共培养体系，实现了PDO与CAFs可以同时培养、扩增并传代，且二者互不产生明显影响。

Description

一种乳腺癌类器官的培养方法以及和肿瘤相关成纤维细胞的 共培养方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体地说，涉及一种乳腺癌类器官的培养方法以及和肿瘤相关成纤维细胞的共培养方法。
背景技术
乳腺癌(Breast Cancer，BC)是导致女性恶性肿瘤死亡的主要原因，全球范围内中国占新诊断病例12.2％，占BC死亡9.6％。根据国内最新流行病统计研究，乳腺癌发病率在女性恶性肿瘤中高居第一位，同时死亡率高居女性恶性肿瘤的第五位。乳腺癌是一个具有高度异质性的细胞群体，且可以分为多种亚型。现如今，对乳腺癌的研究主要依赖于已建立的细胞系，但是在维持肿瘤原发灶的细胞生物学和行为学特征方面，细胞系难以维持。而在临床治疗中，乳腺癌的异质性在指导使用药物中起着非常重要的作用，细胞系完全发挥不到此类临床应用价值。人源肿瘤异体移植模型(patient-derived xenograft，PDX)加以高通量测序或多色免疫组织化学等分析技术进行分子分析，对于解决乳腺肿瘤的复杂生物学非常有价值。但是，PDX模型成功率低，成本高，动物饲养周期长等缺点对该应用限制较大。近年来，病人来源类器官(patient-derived organoids，PDO)的3D培养在研究乳腺癌肿瘤方面提供了一个更加有效和可靠的模型。类器官培养可以保持原代肿瘤组织的异质性，并且在逐渐演化为新的分子分类的依据模型，此外，还可以用于验证药物敏感性、鉴定原代细胞的基因及染色体突变信息、构建异种移植动物模型等等。但是乳腺癌类器官的培养还存在培养的成功率不高，传代效率低，冻存复苏复活成功率低，培养基和培养体系尚需优化以及培养基价格昂贵难得等问题。
文献(Sachs,N.,de Ligt,J.,Kopper,O.,Gogola,E.,Bounova,G.,Weeber,F.etal.(2018)A living biobank of breast cancer organoids capturesdiseaseheterogeneity.Cell 172,373–86.)公开了一种可以长期培养和维持乳腺上皮类器官的方法，成功建立了100例以上乳腺癌原发瘤或者转移瘤类器官，乳腺癌类器官培养成功率在80％以上，并且对模型进行了深入的组织病理学、基因表达、基因测序等分析，同时还对乳腺癌类器官的药敏活性进行了深入研究。其公开分离的乳腺癌细胞重悬于BME滴剂中，加入优化的BC类器官培养基培养，关键在于添加了神经调节蛋白1(NRG-1)，其添加保证了可有效形成BC类器官和扩增长达20代。
然而，以上培养方法的培养基价格昂贵，操作也较为繁琐。目前未见如本申请所述的更为简洁、廉价、高效的乳腺癌类器官培养模式，也未见乳腺癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts，CAFs)的共培养体系模型。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种更为简洁、廉价、高效的乳腺癌类器官培养模式以及和CAFs的共培养模式。
第一方面，本发明提供了一种乳腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
A)取乳腺癌组织块，剪碎，加入消化液消化，向消化好的组织混合液加入洗涤液，洗涤后过滤得到细胞悬液，离心收集细胞，再加入洗涤液洗涤和离心收集细胞；
B)如观察到细胞离心团块中有明显可见的红细胞，则进行裂解红细胞处理；如观察到细胞离心团块中无明显可见的红细胞，则直接进行下一步；
C)用洗涤液重悬细胞得到细胞悬液，加入基质胶BME和PDO完全培养基后培养至混合液凝固，再加入PDO完全培养基，继续培养，至有3D球状体形成；
其中，所述消化液的配方为：
成分 终浓度
Advanced DMEM/F12 1x
Collagen type IV 1-2mg/mL
DNase 300-500μg/mL
Y-27632 2-5μM
Penicillin/Streptomycin 50-100x
所述洗涤液的配方为：
Figure GDA0004187058500000021
Figure GDA0004187058500000031
所述PDO完全培养基的配方为：
成分名称 终浓度
R-Spondin 1conditioned medium 220-280ng·ml-1
Neuregulin 1 5nM
EGF 2-5ng·ml-1
Noggin 90-110ng·ml-1
A83-01 500nM
Y-27632 5μM
SB202190 500nM
B27 supplement 1x
N-Acetylcysteine 1.25mM
Nicotinamide 5mM
GlutaMax 100x 1x
HEPES 1x
Penicillin/Streptomycin 1x
Primocin 50mg·ml-1
Advanced DMEM/F12 1x
作为本发明的一个优选例，步骤A)中，所述消化液的加入量按以下比例来确定：如乳腺癌组织块标本小于500mm3则加入5ml消化液，500-1000mm3则加入8ml消化液，1000-1500mm3则加入10ml消化液。
作为本发明的另一优选例，步骤A)的具体操作是：取手术切除的乳腺癌组织块，剪到碎块直径小于1mm；加入消化液混合，放置于37℃摇床消化，转速50rpm；消化20min后取出用力震荡，将组织散开，再放回37℃摇床继续消化20min，总计消化时间40min；将消化好的组织混合液加入一倍消化液体积的洗涤液，用力震荡，将细胞从组织中脱落，用70μm直径的细胞过滤网过滤细胞悬液，弃去未消化完全的胶原残余；将过滤好的细胞悬液离心，4℃，400g，5min；用洗涤液重悬，离心，4℃，400g，5min，重复两次，离心收集细胞沉淀。
作为本发明的另一优选例，步骤C)中，初次加入的PDO完全培养基和BME的体积比为1:1，细胞与初次加入的PDO完全培养基和BME总体积的比例为5000个细胞:80μl。
作为本发明的另一优选例，步骤C)中，当3D球状体形成后，则换液继续培养，并在换液10天的时候再次换液，14天的时候传代。
作为本发明的另一优选例，步骤C)之后还包括传代步骤D)：弃去培养基；用洗涤液重悬基质胶；然后采取下列步骤中的任一种：
步骤d1：离心，4℃，400g，5min；用cell recovery solution重悬，冰上消化30min；离心，4℃，400g，5min，此时基质胶被消化分解；加入洗涤液重悬，离心，4℃，400g，5min；加入TrypLE Express Enzyme，用移液枪反复吹吸12-15下，37℃消化5-10min，每2-3分钟拿出晃匀，放回37℃继续消化，并显微镜下观察，细胞是否成絮状或者单个为止，一般不超过10min；
步骤d2：离心，4℃，600g，5min；弃去上清，保留基质胶，加入TrypLE ExpressEnzyme，37℃消化5-10min，每2-3分钟拿出晃匀，放回继续消化，并显微镜下观察，细胞是否成絮状或者单个为止，一般不超过10min；
步骤d3：离心，4℃，900g，5min；弃去上清，并换用20μl移液枪小心地将上层基质胶吸去，加入TrypLE Express Enzyme，用移液枪反复吹吸12-15下，37℃消化5-10min，每2-3分钟拿出晃匀，放回继续消化，并显微镜下观察，细胞是否成絮状或者单个为止，一般不超过10min；
继所述步骤d1、步骤d2和步骤d3中的任一种完毕之后，继续：离心，4℃，400g，5min；加入洗涤液，用移液枪吹吸重悬；离心，4℃，400g，5min；将PDO完全培养基和BME基质胶1:1重悬，再将细胞沉淀重悬，37℃，5％CO2，培养箱培养10-15min。
第二方面，本发明提供了一种用于乳腺癌类器官细胞系建立或传代的培养基，配方为：
Figure GDA0004187058500000041
Figure GDA0004187058500000051
第三方面，本发明提供了一种用于乳腺癌类器官细胞系建立或传代的消化液，配方为：
成分 终浓度
Advanced DMEM/F12 1x
Collagen type IV 1-2mg/mL
DNase 300-500μg/mL
Y-27632 2-5μM
Penicillin/Streptomycin 50-100x
第四方面，本发明提供了一种用于乳腺癌类器官细胞系建立或传代的洗涤液，配方为：
成分 终浓度
Advanced DMEM/F12 1x
Penicillin/Streptomycin 50-100x
BSA 0.1％-0.3％m/V
GlutaMax 1x
Y-27632 2-5μM
EDTA 15-20μM
第五方面，本发明提供了一种乳腺癌类器官和CAFs的共培养方法，包括以下步骤：将消化重悬洗涤过的乳腺癌类器官细胞与消化离心过的CAFs用基质胶和PDO完全培养基1:1混合重悬，铺板，37℃孵育10-15分钟，基质胶混合物凝固之后加入PDO完全培养基+10ng/mL的bFGF，继续培养，培养基每两天换一次；
其中，所述PDO完全培养基的配方为：
成分名称 终浓度
R-Spondin 1 conditioned medium 220-280ng·ml-1
Neuregulin 1 5nM
EGF 2-5ng·ml-1
Noggin 90-110ng·ml-1
A83-01 500nM
Y-27632 5μM
SB202190 500nM
B27 supplement 1x
N-Acetylcysteine 1.25mM
Nicotinamide 5mM
GlutaMax 100x 1x
HEPES 1x
Penicillin/Streptomycin 1x
Primocin 50mg·ml-1
Advanced DMEM/F12 1x
本发明优点在于：
1、本发明提供了一套新的PDO处理和培养的优化体系。通过对PDO培养的观察、归纳、总结，以及传代和冻存的摸索和验证等方面做一详细总结，来建立一套更加成熟、简便、经济的PDO的培养方法，该PDO培养体系成功率高达79％(与cell文献报道相当)，相比于现有技术中乳腺癌类器官培养体系和方法，操作步骤和方法上的主要改进包括：(1)本发明所使用的PDO未添加FGF-7和FGF-10两种细胞因子，但并不明显影响类器官生成效率和性质，并且有利于PDO形成和生长；(2)在组织消化步骤中，先将脂肪组织和正常组织完全剔除再加入消化液，消化液无需使用复杂的organoid culture，而是优化节省了体系，而且消化液配方使用Collagentype IV而不是Collagentype XI，并添加了DNase，消化效果更好，时间可以缩短为30分钟以内，对细胞损伤更小；(3)消化后通过震荡使乳腺癌细胞从组织中脱落，对细胞干扰小，维持了细胞活力，相比于现有技术更加简便；(4)收集细胞后是将细胞与BME基质胶和PDO完全培养基的混合液一起重悬，再种植到培养板，该处理有利于胶体中乳腺癌细胞的增殖，提高了成功率；(5)配制了一种全新的洗涤液，能取得良好的洗涤效果，且不损伤细胞活力。
期间，本发明人发现(1)EGF添加过多会使上皮细胞更多贴壁生长，添加过少会影响PDO生长速度；(2)SB202190不可添加过多，否则会影响PDO形成效率，这与现有技术报道一致。
2、本发明建立了更简洁、廉价和高效的PDO传代方式，传代数多达20代以上(与cell文献报道相当)，在操作上：(1)无需使用Cell recovery solution消化基质胶，且回收效率更高；(2)高转速离心(≥900g)不会损伤细胞，细胞回收效率更高。
3、本发明还首次将PDO与肿瘤相关成纤维细胞共培养，建立了稳定的共培养体系模型，体系中加入促进肿瘤相关成纤维细胞生成的试剂，可以和类器官同时培养、扩增并传代，且二者互不产生明显影响，为后续相关生物功能实验打下基础。
附图说明
图1：建立和传代PDO的时候一些关键技术关节的参考图片。a：养成PDO所需最少组织样本的量；b、c：600g，5min离心可以将基质胶和细胞分离开，且可轻轻将基质胶分离；d、e：TrypLE Express消化彻底PDO之前和之后的图片对比。
图2：第一代类器官随时间进程生长形成图片合集。
图3：第二代类器官随时间进程生长形成图片合集。
图4：类器官与肿瘤原发灶表达ER、PR和HER2的对比：PDO与原代肿瘤的ER、PR、HER2表达水平相当。
图5：类器官内部之间保持了肿瘤的异质性，不同3D sphere之间PR和HER2的表达水平不同。
图6：类器官与CAFs共培养模型的构建，CAFs和PDO可以实现共培养。
其中，图2-6中的Scale Bar均为50μm。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、实验试剂
主要试剂：
试剂名称 供应商 货号
GlutaMax Gibco 35050061
Collagen type IV Sigma C5139-500MG
FBS Gibco 10437028
BME R&D 3433-005-01P
红细胞裂解液 Home made
Cell recovery solution Corning 354253
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher 12605010
多聚甲醛 Beyondtime P0099-100ml
PDO完全培养基成分和比例：
Figure GDA0004187058500000081
Figure GDA0004187058500000091
洗涤液(Washing Buffer)配方和比例：1x Advanced DMEM/F12，100xPenicillin/Streptomycin，0.3％BSA(m/V)(Sigma,B2064)，1000x 20mM EDTA(BioInd，41-922-25)，1x GlutaMax，5μM Y-27632。
消化液(Digesting Buffer)配方和比例：1x Advanced DMEM/F12，1mg/mLCollagen type IV，500μg/mL DNase(Sigma-Aldrich，D5025)，5μM Y-27632，100xPenicillin/Streptomycin。
冻存液配方和比例：10％DMSO(Sigma-Aldrich，2650)，90％胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)。
二、类器官的培养和传代
1.在处理类器官的至少前6个小时，将分装好的BME 4℃融化，将低吸附24孔板置于37℃培养箱预热。
2.处理标本前将培养基从4℃冰箱拿出，置于37℃水浴锅预热。
3.现配现用标本消化试剂，处理标本前，将配制好的消化液置于37℃加热。
(注：a.经过平行实验，用本发明消化液和消化体系可更彻底地消化肿瘤组织，细胞得率可提高20％-50％，不加入透明质酸酶和分散酶不影响原代细胞活性和PDO形成率。b.如果一周内不可将消化液使用完毕，则需现配现用。)
4.取肿瘤和正常组织标本，拍照，并记录标本信息，包括形态、尺寸、脂肪含量、坏死情况等等。记录病人信息，包括医院、日期、患者病案号、姓名、手术标本何时离体、何时开始处理、存放时间和运输方式等等。
5.处理手术肿瘤和正常组织标本(尖刀镊子需提前一天高温高压灭菌)，先用4℃的含有双抗的PBS洗涤两遍，可降低被细菌污染概率，将脂肪组织和正常组织完全剔除，目的是去除非肿瘤细胞形成的类器官干扰。然后用剪刀均匀耐心地剪到碎块直径小于1mm，离开冰上时间不可过久。取少量碎片冻存以备后用。
6.如果肿块足够大，则取额外的一块做冰冻切片。
7.将剪碎的组织块加入消化液混合，装入50ml离心管中，以充分接触。(注：加入消化液含量视组织标本大小而定，小于500mm3加入5ml，500-1000mm3加入8ml，1000-1500mm3加入10ml，经过摸索，组织样品总体积不可小于100mm3，否则难以得到足够量的原代上皮细胞，见图1)。
8.将混合的消化液和组织放置于37℃摇床消化，转速50rpm。
9.消化20min后取出用力震荡，将组织散开，再放回37℃摇床继续消化20min，总计消化时间40min。
10.将消化好的组织混合液加入一倍消化液体积的洗涤液，用力震荡，将细胞从组织中脱落，用70μm直径的细胞过滤网过滤细胞悬液，弃去未消化完全的胶原残余。
11.将过滤好的细胞悬液离心，4℃，400g，5min。
12.用5ml洗涤液重悬，离心，4℃，400g，5min，重复两次。
(注：如果此时细胞离心团块中有明显可见的红细胞，则需要裂解红细胞处理，否则培养基的背景会杂乱。如果无明显可见的红细胞，则跳至步骤16。)
13.用3ml红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温放置5min。
14.将细胞悬液离心，4℃，400g，5min。
15.重复步骤12。
16.用1ml洗涤液重悬，加入1.5ml EP管中，细胞计数。4℃，400g，5min。
17.弃去上清，根据细胞计数情况，决定加培养基的量和种植孔的量，5000个细胞/孔，每个孔加入40μl BME和40μl PDO完全培养基。将PDO完全培养基和BME基质胶1:1重悬，再将细胞沉淀重悬，80μl/孔种植到24孔板中，37℃，5％CO2，培养箱培养10-15min。
18.待混合液凝固，加入PDO完全培养基，600μl/孔。并拍照。
19.培养时间为3天的时候，拍照。
20.培养时间为5天的时候，拍照。若有3D球状体形成，则换液。若无球状PDO形成，则丢弃。
21.培养时间为7、10、14天时，各自拍照，10天的时候换液，14天的时候传代。(见图2)
传代步骤如下：
1.弃去培养基。
2.用洗涤液重悬基质胶，1ml洗涤液可以重悬2个孔。将重悬液加到15ml离心管或者5ml离心管中。
对于是否消化基质胶，有多种可选的处理步骤：
第一种：
3.离心，4℃，400g，5min。
4.用cell recovery solution重悬，冰上消化30min。
5.离心，4℃，400g，5min，此时基质胶被消化分解。
6.加入洗涤液重悬，离心，4℃，400g，5min。
7.加入TrypLE Express Enzyme 0.5ml/孔，用移液枪反复吹吸12-15下，37℃消化5-10min，每2-3分钟拿出晃匀，放回37℃继续消化，并显微镜下观察，细胞是否成絮状或者单个为止，一般不超过10min。
第二种：
3.离心，4℃，600g，5min。
4.弃去上清，保留基质胶，加入TrypLE Express Enzyme 0.5ml/孔，37℃消化5-10min，每2-3分钟拿出晃匀，放回继续消化，并显微镜下观察，细胞是否成絮状或者单个为止，一般不超过10min。(见图1)
第三种：
3.离心，4℃，900g，5min。此时可见细胞与基质胶是分层状态(见图1)
4.弃去上清，并换用20μl移液枪小心地将上层基质胶吸去。加入TrypLE ExpressEnzyme 0.5ml/孔，用移液枪反复吹吸12-15下，37℃消化5-10min，每2-3分钟拿出晃匀，放回继续消化，并显微镜下观察，细胞是否成絮状或者单个为止，一般不超过10min。
(注：第一种基质胶消化较为彻底，但是操作步骤繁琐，细胞在消化离心和换液的过程中会有较多损失；第二种操作简单，细胞得率高，但是传代的类器官培养体系中背景较为杂乱；第三种细胞得率与第二种相当，且传代的类器官培养体系背景较为干净。)
8.离心，4℃，400g，5min。
9.加入3ml洗涤液，用移液枪吹吸重悬。
10.取一半重悬液于另外一支离心管中，离心，4℃，400g，5min。
11.弃去上清，加入10％DMSO+90％FBS混合冻存液，重悬，放入梯度降温冻存盒中。
12.取另一半细胞悬液，离心，4℃，400g，5min。
13.将PDO完全培养基和BME基质胶1:1重悬，再将细胞沉淀重悬，80μl/孔种植到24孔板中，37℃，5％CO2，培养箱培养10-15min使基质胶凝固，加入PDO完全培养基。
14.第二代3D球体形成速度较快，第三天即可拍照换液，分别在3、7、10天拍照，10天可传下一代。
三、类器官的鉴定
1.取一孔生长完全的类器官，离心，室温，600g，5min。
2.弃去上清，保留下方细胞沉淀团块，加入5ml 4％多聚甲醛，室温过夜。
3.按照病理科制造石蜡切片的标准流程，分别脱水、包埋、切片，染色。乳腺癌分子分型的三个分子：ER、PR、HER2，原发灶和PDO进行对比。(图4)
四、培养成功率和传代次数
本方法类器官培养成功率与cell文献报道成功率相当(66/83，79％)，传代亦可超过20代，部分患者资料如表1所示，但是操作相对cell文献报道简单，培养成本亦相对降低。
表1部分患者资料
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五、CAFs细胞的获取
1.在PDO培养体系中，会有部分上皮细胞和成纤维细胞贴壁生长，第一代PDO传代的时候，吸取PDO的同时，贴壁生长的细胞不会被吸入PDO体系；在贴壁细胞培养孔中加入100μl EDTA-胰蛋白酶，消化37℃，5分钟。
2.消化好的培养孔中加入500μl DMEM+10％FBS的培养基终止消化，并吹吸，转移至1.5mL EP管中，离心，400g，2min。
3.弃去上清，用CAFs专用培养基重悬细胞，转移至6孔板中，加入2mL sf培养基，培养三天，上皮细胞停止生长，CAFs细胞长满。
4.用同样的传代方法，可扩增CAFs。
六、类器官和CAFs的共培养
1.将消化重悬洗涤过的PDO细胞与消化离心过的CAFs用基质胶和PDO完全培养基1:1混合重悬，铺板，37℃孵育10-15分钟，基质胶混合物凝固之后加入PDO完全培养基+10ng/mL的bFGF，后续操作与单独培养PDO相同。
2.由于CAFs存在，培养基消耗较大，培养基每两天换一次。(图6)
3.PDO和共培养CAFs的传代：
1)弃去培养基；
2)用洗涤液重悬基质胶，1ml洗涤液可以重悬2个孔。将重悬液加到15ml离心管或者5ml离心管中，之后的离心、消化同单独PDO离心消化步骤；
3)冲洗BME的时候不会将贴壁的CAFs吹起，吸去PDO洗涤混合物后，加入胰蛋白酶200μL/孔。37℃培养箱消化5min至贴壁的细胞脱离。
4)将培养孔中加入1mL 10％FBS DMEM完全培养基，用移液枪吹打均匀，将重悬液加入15mL离心管，1000rpm，2min离心。
5)弃去上清，用PDO完全培养基重悬细胞团块，将细胞重悬液插在冰上。
6)等PDO消化离心洗涤完毕后，将CAFs细胞重悬液加入PDO细胞离心团块，再加入与CAFs等体积的BME，并用移液枪重悬均匀，80μl/孔种植到24孔板中，37℃，5％CO2，培养箱培养10-15min使基质胶凝固，加入PDO完全培养基。
结果PDO细胞和CAFs可以同时培养、扩增并传代，且二者互不产生明显影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种乳腺癌类器官和肿瘤相关成纤维细胞共培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)取乳腺癌组织块，剪碎，加入消化液消化，向消化好的组织混合液加入洗涤液，洗涤后过滤得到细胞悬液，离心收集细胞，再加入洗涤液洗涤和离心收集细胞；加入基质胶BME和PDO完全培养基后培养至混合液凝固，再加入PDO完全培养基，继续培养，至有3D球状体形成；
B)CAFs细胞的获取；
C)将消化重悬洗涤过的乳腺癌类器官细胞与消化离心过的CAFs用基质胶和PDO完全培养基1:1混合重悬，铺板，37℃孵育10-15分钟，基质胶混合物凝固之后加入PDO完全培养基+10ng/mL的bFGF，继续培养，培养基每两天换一次。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌类器官和肿瘤相关成纤维细胞共培养的方法，其特征在于，所述的乳腺癌类器官细胞系建立或传代的培养基的配方为：
成分名称 终浓度 R-Spondin1conditionedmedium 220-280ng·ml-1 Neuregulin1 5nM EGF 2-5ng·ml-1 Noggin 90-110ng·ml-1 A83-01 500nM Y-27632 5μM SB202190 500nM B27supplement 1x N-Acetylcysteine 1.25mM Nicotinamide 5mM GlutaMax100x 1x HEPES 1x Penicillin/Streptomycin 1x Primocin 50mg·ml-1 AdvancedDMEM/F12 1x
3.根据权利要求1所述的乳腺癌类器官和肿瘤相关成纤维细胞共培养的方法，其特征在于，所述的乳腺癌类器官细胞系建立或传代的消化液的配方为：
成分 终浓度 AdvancedDMEM/F12 1x IV型胶原酶 1-2mg/mL DNase 300-500μg/mL Y-27632 2-5μM Penicillin/Streptomycin 50-100x
4.根据权利要求1所述的乳腺癌类器官和肿瘤相关成纤维细胞共培养的方法，其特征在于，所述的乳腺癌类器官细胞系建立或传代的洗涤液的配方为：
成分 终浓度 AdvancedDMEM/F12 1x Penicillin/Streptomycin 50-100x BSA 0.1％-0.3％m/V GlutaMax 1x Y-27632 2-5μM EDTA 15-20μM
5.根据权利要求1所述的乳腺癌类器官和肿瘤相关成纤维细胞共培养的方法，其特征在于，步骤A)的具体操作是：取手术切除的乳腺癌组织块，剪到碎块直径小于1mm；加入消化液混合，放置于37℃摇床消化，转速50rpm；消化20min后取出用力震荡，将组织散开，再放回37℃摇床继续消化20min，总计消化时间40min；将消化好的组织混合液加入一倍消化液体积的洗涤液，用力震荡，将细胞从组织中脱落，用70μm直径的细胞过滤网过滤细胞悬液，弃去未消化完全的胶原残余；将过滤好的细胞悬液离心，4℃，400g，5min；用洗涤液重悬，离心，4℃，400g，5min，重复两次，离心收集细胞沉淀。
6.根据权利要求1所述的乳腺癌类器官和肿瘤相关成纤维细胞共培养的方法，其特征在于，所述步骤A)之后还包括步骤D)：弃去培养基；用洗涤液重悬基质胶；然后采取下列步骤中的任意一种：
步骤d1：离心，4℃，400g，5min；用cell recovery solution重悬，冰上消化30min；离心，4℃，400g，5min，此时基质胶被消化分解；加入洗涤液重悬，离心，4℃，400g，5min；加入TrypLE Express Enzyme，用移液枪反复吹吸12-15下，37℃消化5-10min，每2-3分钟拿出晃匀，放回37℃继续消化，并显微镜下观察，细胞是否成絮状或者单个为止，一般不超过10min；
步骤d2：离心，4℃，600g，5min；弃去上清，保留基质胶，加入TrypLE Express Enzyme，37℃消化5-10min，每2-3分钟拿出晃匀，放回继续消化，并显微镜下观察，细胞是否成絮状或者单个为止，一般不超过10min；
步骤d3：离心，4℃，900g，5min；弃去上清，并换用20μl移液枪小心地将上层基质胶吸去，加入TrypLE Express Enzyme，用移液枪反复吹吸12-15下，37℃消化5-10min，每2-3分钟拿出晃匀，放回继续消化，并显微镜下观察，细胞是否成絮状或者单个为止，一般不超过10min；
继所述步骤d1、步骤d2和步骤d3中的任一种完毕之后，继续：离心，4℃，400g，5min；加入洗涤液，用移液枪吹吸重悬；离心，4℃，400g，5min；将PDO完全培养基和BME基质胶1:1重悬，再将细胞沉淀重悬，种植到24孔板中，37℃，5％CO2，培养箱培养10-15min。使基质胶凝固，加入PDO完全培养基。
所述步骤B)的具体步骤为d4-d6：
步骤d4：在PDO培养体系中，会有部分上皮细胞和成纤维细胞贴壁生长，第一代PDO传代的时候，吸取PDO的同时，贴壁生长的细胞不会被吸入PDO体系；在贴壁细胞培养孔中加入100μl EDTA-胰蛋白酶，消化37℃，5分钟。
步骤d5：消化好的培养孔中加入500μl DMEM+10％FBS的培养基终止消化，并吹吸，转移至1.5mL EP管中，离心，400g，2min。
步骤d6：弃去上清，用CAFs专用培养基重悬细胞，转移至6孔板中，加入2mL sf培养基，培养三天，上皮细胞停止生长，CAFs细胞长满。
用同样的传代方法，可扩增CAFs。
7.根据权利要求1所述的乳腺癌类器官和肿瘤相关成纤维细胞共培养的方法，其特征在于，步骤C)的具体步骤为：
1.将消化重悬洗涤过的PDO细胞与消化离心过的CAFs用基质胶和PDO完全培养基1:1混合重悬，铺板，37℃孵育10-15分钟，基质胶混合物凝固之后加入PDO完全培养基+10ng/mL的bFGF，后续操作与单独培养PDO相同。
2.由于CAFs存在，培养基消耗较大，培养基每两天换一次。
3.PDO和共培养CAFs的传代：
1)弃去培养基；
2)用洗涤液重悬基质胶，1ml洗涤液可以重悬2个孔。将重悬液加到15ml离心管或者5ml离心管中，之后的离心、消化同单独PDO离心消化步骤；
3)冲洗BME的时候不会将贴壁的CAFs吹起，吸去PDO洗涤混合物后，加入胰蛋白酶200μL/孔。37℃培养箱消化5min至贴壁的细胞脱离。
4)将培养孔中加入1mL 10％FBSDMEM完全培养基，用移液枪吹打均匀，将重悬液加入15mL离心管，1000rpm，2min离心。
5)弃去上清，用PDO完全培养基重悬细胞团块，将细胞重悬液插在冰上。
6)等PDO消化离心洗涤完毕后，将CAFs细胞重悬液加入PDO细胞离心团块，再加入与CAFs等体积的BME，并用移液枪重悬均匀，80μl/孔种植到24孔板中，37℃，5％CO2，培养箱培养10-15min使基质胶凝固，加入PDO完全培养基。
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