CN112575069A - 一种基于亚克隆水平敏感药物筛选的肿瘤演化调控模型及其建立方法 - Google Patents

一种基于亚克隆水平敏感药物筛选的肿瘤演化调控模型及其建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于亚克隆水平敏感药物筛选的肿瘤演化调控模型及其建立方法，所述方法包括：(1)患者肿瘤细胞药敏筛查获得突变亚克隆敏感药物；(2)监测其循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)建立肿瘤演化数学模型，以指导肿瘤适应性治疗。本发明利用循环肿瘤DNA监测肿瘤克隆演化，筛选亚克隆敏感药物作为肿瘤演化调控手段，通过建立克隆演化数学模型指导肿瘤演化调控的具体实施，为肿瘤的个体化治疗提供了技术手段。

Description

一种基于亚克隆水平敏感药物筛选的肿瘤演化调控模型及其 建立方法
技术领域
本发明涉及一种基于亚克隆水平敏感药物筛选的肿瘤演化调控模型及其建立方法，本发明通过对原代培养的肿瘤细胞进行药敏筛查和循环肿瘤DNA突变检测，建立克隆演化数学模型，指导依据循环肿瘤DNA监测结果进行适应性治疗。
背景技术
恶性肿瘤是人类健康的头号杀手，现阶段肿瘤治疗方法包括手术、放疗、化疗、细胞免疫治疗等等。
恶性肿瘤是一种全身性疾病，手术、放疗等局部治疗手段只能控制局部情况，单独依靠局部治疗，患者的生存获益已经达到极限。化疗、细胞免疫治疗等全身治疗手段，能够有效杀灭体内的残存肿瘤细胞，有效提高整体生存率。
现阶段全身治疗，依据大型临床研究获得的结论，进行固定药物、固定方案、固定周期的治疗，直到出现耐药，才更换其它方案。这其中必然有很多患者接受了过度治疗、不充分治疗，甚至无效治疗。
个体化治疗要求根据患者个体的实际情况，通过监测标志物水平，进行个体化药物选择和个体化治疗周期的制定。
耐药在肿瘤治疗过程中，尤其是复发、转移患者中，频繁出现。传统治疗理念：持续应用敏感药物直到耐药，不符合肿瘤演化调控原则。应该提倡通过监测肿瘤演化调控，进行适应性治疗。
发明内容
为了克服目前肿瘤全身治疗依据群体获益概率制定个体化治疗方案的缺陷，我们将循环肿瘤DNA检测技术与肿瘤演化调控-适应性治疗理论相结合，提出了一种基于亚克隆水平敏感药物筛选的肿瘤演化调控模型。利用该模型能够在现有全身治疗药物中，给出个体化治疗建议。通过使用该模型能够降低过度治疗、避免治疗不充分、提高术前全身治疗的病理完全缓解率、提高无疾病生存率和总生存率，并能够降低治疗费用。
为此，本发明采用了以下技术手段：
本发明所述方法包括如下步骤：
一种基于亚克隆水平敏感药物筛选的肿瘤演化调控模型，其特征在于，所述的肿瘤演化调控模型是通过以下方法构建得到的：
(1)获得肿瘤细胞、测序：
对从肿瘤手术标本或穿刺样本中获得的寡细胞或单细胞进行目标基因的测序，从肿瘤手术标本的取材至少来自3个不同位置，目标基因为全基因组、外显子组或特定基因的组合；
(2)测序原始数据进行有效数据获取、序列比对、假阳性变异过滤和变异识别：
用贝叶斯聚类工具PyClone推断克隆群体结构，将来源于同一个样本的不同位置的测序所得突变，聚类到亚克隆；ClonEvol根据校正后的等位基因频率和突变聚类组，构建克隆进化树，同一来源的样本绘制出一棵克隆进化树，树干上的突变，对应克隆性突变，是肿瘤发生早期出现的突变，肿瘤克隆性演化过程中，这类突变依然保留在各亚克隆中，随着肿瘤演化，新突变出现，形成亚克隆，进化树树枝、树叶上的突变对应亚克隆突变，其中新出现的突变为亚克隆特有突变，依据绘制的肿瘤进化树，选取亚克隆特有突变、克隆突变；根据突变位点，设计引物、探针或CRIPR-crRNA，后续用数字PCR(ddPCR)或微流控芯片检测野生位点和突变位点；
(3)原代肿瘤细胞类器官培养：
将肿瘤组织置于0.2％Ⅲ型胶原酶溶液中，于4℃消化过夜，消化成单个细胞，中和消化液，以孔径100μm滤纱，过滤2次，收集细胞滤液，800r/min，离心5min，弃上清，加入类器官培养液培养；
(4)游离核酸判定药筛敏感和耐药亚克隆：
将类器官接种于96孔板或384孔板，添加不同浓度梯度的各种药物，包括常见化疗药物，同时设置空白对照和阴性对照，采用ATP化学发光法进行药敏筛查，方法如下：加入40μL CellTiter-GIo 3D Reagent(Promega)，室温下摇动30min，96微孔板发光检测仪检测荧光强度，重复2-3次筛选；分析数据，计算细胞存活率，抑制率，绘制生长抑制量效曲线，SPSS统计软件probit回归分析确定IC50(half maximal inhibitory concentration，半数抑制浓度)和IC90；判定特定类器官对该药物敏感还是耐药，比较敏感组给药前后ctDNA突变构成，获得敏感亚克隆，敏感亚克隆所对应的敏感药物，作为后续适应性治疗中突变ctDNA发现敏感克隆成长为优势克隆时的治疗选择用药；
(5)肿瘤演化数学模型的建立：
类器官持续给予敏感药物，直到出现耐药，每次类器官传代前，吸取培养液提取游离核酸，进行亚克隆突变检测，用于拟合肿瘤演化数学模型。
以亚克隆敏感药物筛选为基础的肿瘤演化数学模型的建立流程图如图1所示。
其中，优选的，所述的肿瘤演化调控模型包括肿瘤指数生长模型、种间竞争模型等。
其中，优选的，步骤(4)中将给药后突变频率降低最高的前1-2个亚克隆判定为敏感亚克隆。
其中，优选的，通过血浆检测患者亚克隆突变情况，结合药敏筛查结果和已经建立的个体化肿瘤演化数学模型，选择治疗药物和治疗周期，治疗过程中ctDNA持续监测克隆演化，及时调整治疗药物和治疗周期。
本发明利用ctDNA监测肿瘤克隆演化，筛选亚克隆敏感药物作为肿瘤演化调控手段，通过建立克隆演化数学模型指导肿瘤演化调控的具体实施，是一种肿瘤治疗的系统方法。本发明并不以肿瘤解剖学标志，如：大小、淋巴结转移情况等，作为判定药物是否有效或者治疗周期的决定条件。本发明所公开的方法以ctDNA代表全身肿瘤负荷，所采取的治疗手段、评估方法，都与肿瘤是全身性疾病这一判定相对应。
附图说明
图1为以亚克隆敏感药物筛选为基础的肿瘤演化数学模型的建立流程图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：恶性肿瘤患者的肿瘤演化调控治疗
1、患者情况说明：
刘某，女，45岁，左乳癌症，重物大小5.0cm×4.8cm，该患者给与EC方案化疗2周期后，未见明显缩小，疗效评估为稳定。
2、肿瘤演化数学模型的建立
(1)获得肿瘤细胞、测序：
对患者的肿瘤部位进行多点穿刺，获得3处以上的组织样本，每份样本均分成两份，一份用于类器官培养，另一份用于全基因组测序。
(2)测序原始数据进行有效数据获取、序列比对、假阳性变异过滤和变异识别：
用贝叶斯聚类工具PyClone推断克隆群体结构，将来源于同一个样本的不同位置的测序所得突变，聚类到亚克隆；ClonEvol根据校正后的等位基因频率和突变聚类组，构建克隆进化树，同一来源的样本绘制出一棵克隆进化树，树干上的突变，对应克隆性突变，是肿瘤发生早期出现的突变，肿瘤克隆性演化过程中，这类突变依然保留在各亚克隆中，随着肿瘤演化，新突变出现，形成亚克隆，进化树树枝、树叶上的突变对应亚克隆突变，其中新出现的突变为亚克隆特有突变，依据绘制的肿瘤进化树，选取亚克隆特有突变、克隆突变；根据突变位点，设计引物、探针或CRIPR-crRNA，后续用数字PCR(ddPCR)或微流控芯片检测野生位点和突变位点；
选取亚克隆突变位点和克隆突变位点3个，设计ddPCR引物和探针。3个突变位点引物和探针分别为：
TP53，GRCh37,17:7577568，
上游引物5'-TGGGCCTCCGGTTCATGC-3'，
下游引物5'-CTGACTGTACCACCATCCACTAC-3'，
野生位点探针5'-FAM-CAGGAACTGTTACACAT-TAMRA-3'，
突变位点探针5'-VIC-CAGGAACTGTTATACAT-TAMRA-3'
PIK3CA，GRCh37,3:178952085，
上游引物5'-TGAGCAAGAGGCTTTGGAG,-3'
下游引物5'-TCGGTCTTTGCCTGCTGAG-3'，
野生位点探针5'-FAM-AATGATGCACATCATGGTG-TAMRA-3'，
突变位点探针5'-VIC-AATGATGCACGTCATGGTG-TAMRA-3'
KRAS，GRCh37,12:25398285，
上游引物5'-AGGCACTCTTGCCTACGCC-3',
下游引物T5'-AAGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3'，
野生位点探针5'-FAM-ACCAGCTCCAACTACCACAAGT-TAMRA-3'，突变位点探针5'-VIC-ACAAGCTCCAACTACCACAAGT-TAMRA-3'
(3)原代肿瘤细胞类器官培养：
将肿瘤组织置于0.2％Ⅲ型胶原酶溶液中，于4℃消化过夜，消化成单个细胞，中和消化液，以孔径100μm滤纱，过滤2次，收集细胞滤液，800r/min，离心5min，弃上清，加入类器官培养液培养；
(4)游离核酸判定药筛敏感和耐药亚克隆：
用含5％BME的培养液，收获类器官并稀释至75个类器官/μl。10μL BME包被96孔板，加入30μL类器官悬液。2天后更换培养液，吸出培养液(用于ddPCR检测)。然后，加入7个浓度梯度的6种药物：Afatinib、Alpelisib、Tamoxifen、Epirubicin、Docetaxel、Carboplatin。5天后，吸出培养液(用于ddPCR检测)。ATP化学发光法进行药敏筛查。加入40μL CellTiter-GIo 3D Reagent(Promega)，室温下摇动30min，96微孔板发光检测仪检测荧光强度。重复2-3次筛选。分析数据，计算细胞存活率，抑制率，绘制生长抑制量效曲线，SPSS统计软件probit回归分析确定IC50和IC90。
细胞存活率＝(加药孔荧光强度-空白对照孔荧光强度)/(阴性对照孔荧光强度-空白对照孔荧光强度)×100％
抑制率＝(阴性对照孔荧光强度-加药孔荧光强度)/(阴性对照孔荧光强度-空白对照孔荧光强度)
强敏感(SS)：IC50<25％及IC90<100％PPC(测试药物血浆峰值浓度)
中度敏感(IS)：IC50<25％及IC90>100％PPC
轻度敏感(MS)：IC50>25％及IC90<100％PPC
耐药(R)：IC50>25％及IC90>100％PPC
比较敏感组给药前后ctDNA突变构成，可以获得敏感亚克隆，给药后突变频率降低最高的前1-2个亚克隆判定为敏感亚克隆类别，标记为：XX患者-XX类器官-XX药物-XX突变敏感亚克隆，同法获得耐药亚克隆。
结果表明，PIK3CA突变亚克隆对Docetaxel敏感；KRAS亚克隆突变对Epirubicin耐药。此时检测患者血浆，发现PIK3CA突变为优势亚克隆，因此给与Docetaxel化疗。
(5)肿瘤演化数学模型的建立：
肿瘤类器官持续培养，敏感药物持续给药，直到出现耐药。每次传代前留取培养液用于ddPCR检测突变。根据敏感和耐药亚克隆突变监测数据、传代前细胞计数，建立肿瘤指数生长的Malthus模型。
3、ctDNA监测指导适应性治疗
根据建立的肿瘤指数生长的Malthus模型，建议患者进行每两周一次单药Docetaxel化疗，化疗5周期后，肿物缩小95％。
本方法能够有效提高病理完全缓解率，降低新辅助化疗期间病情进展的发生率。
实施例2：转移性恶性肿瘤患者的肿瘤演化调控治疗
1、患者情况说明：
李某，女，56岁，乳腺癌术后6年，肝转移。
2、肿瘤演化数学模型的建立
转移病灶穿刺获取肿瘤组织。亚克隆突变位点选择、原代肿瘤细胞类器官培养、亚克隆敏感药物筛选步骤同实施例1。依据进化树，所选取的两个亚克隆位点，及检测用引物和探针如下：
RB1，GRCh37,13:48955550，
上游引物5'-ATCAAAGCAGAAGGCAACTTGA-3'，
下游引物5'-AGCTACTTACTGAGAGCCATGC-3'，
野生位点探针5'-FAM-ATGTGAACATCGAATCATG-TAMRA-3'，
突变位点探针5'-VIC-ATGTGAACATTGAATCATG-TAMRA-3'
FGFR2，GRCh37,10:123279677，
上游引物5'-ACTCTACGTCTCCTCCGACC,-3'
下游引物5'-CCCTCTGGACAACACAGCTT-3'，
野生位点探针5'-FAM-CCGGTGAGGCGATCGCTCTGGTGG-TAMRA-3'，突变位点探针5'-VIC-CCGGTGAGGCCATCGCTCTGGTGG-TAMRA-3'
RB1基因突变亚克隆对应敏感药物Carboplatin，FGFR2基因突变亚克隆对应敏感药物Epirubicin。
肿瘤类器官持续培养，敏感药物持续给药，直到出现耐药。每次传代前留取培养液用于ddPCR检测突变。根据敏感和耐药亚克隆突变监测数据、传代前细胞计数，建立Lotka-Volterra种间竞争模型。
3、ctDNA监测指导适应性治疗
根据患者ctDNA血浆检测结果以及建立的Lotka-Volterra种间竞争模型，建议敏感药物适时交替给药，患者生存期显著延长，药物副反应明显降低。
本方法降低了患者的药物暴露剂量，降低了治疗费用，提高了患者生存率。
实施例3：恶性肿瘤患者的肿瘤演化调控治疗
1、患者情况说明：
郑某，女，62岁，左乳癌。
2、肿瘤演化数学模型的建立
术中肿瘤大体标本离体后，无菌手术刀于肿物中央剖开，取12点钟、3点钟、6点钟、9点钟，中心区域组织各一块(共5块)，长径3-5mm，任意两处取材点间距至少1cm，去除脂肪和坏死组织，无菌PBS冲洗去除血液和组织液。每一块组织均分成两份，一份放入冻存管，标记患者病案号，取材位置，立即液氮冻存，转移到-80℃冰箱保存，准备进行全基因组测序；余下5份组织混合，剪碎，置于0.2％Ⅲ型胶原酶溶液中，消化，用于后续原代培养。测序数据分析绘制肿瘤进化树，选取亚克隆突变位点2个，设计ddPCR引物和探针：
CDKN2A，GRCh37,9:21970985，
上游引物5'-ATGGTTACTGCCTCTGGTGC-3'，
下游引物5'-GACCTGGCTGAGGAGCTG-3'，
野生位点探针5'-FAM-TACCGTGCGACATCGCGATGGC-TAMRA-3'，
突变位点探针5'-VIC-TACCGTGCGACATTGCGATGGC-TAMRA-3'
TP53，GRCh37,17:7578211，
上游引物5'-AGAGACCCCAGTTGCAAACC-3'
下游引物5'-GCCCCTCCTCAGCATCTTATC-3'，
野生位点探针5'-FAM-CACACTATGTCGAAAAGTGTT-TAMRA-3'，
突变位点探针5'-VIC-CACACTATGTTGAAAAGTGTT-TAMRA-3'
原代肿瘤细胞类器官培养、亚克隆敏感药物筛选步骤同实施例1。CDKN2A突变亚克隆敏感药物Tamoxifen，TP53突变亚克隆对该药物耐药。
肿瘤类器官持续培养，敏感药物Tamoxifen持续给药，直到出现耐药。每次传代前留取培养液用于ddPCR检测突变。根据敏感和耐药亚克隆突变监测数据、传代前细胞计数，建立肿瘤指数生长模型和间竞争模型。
3、ctDNA监测指导适应性治疗
根据患者ctDNA血浆检测结果以及建立的肿瘤指数生长模型和间竞争模型，建议敏感药物适时交替给药，患者生存期显著延长，药物副反应明显降低。
本方法能够有效降低过度治疗，提高患者生存率。

Claims (4)

1.一种基于亚克隆水平敏感药物筛选的肿瘤演化调控模型，其特征在于，所述的肿瘤演化调控模型是通过以下方法构建得到的：
(1)获得肿瘤细胞、测序：
将肿瘤手术标本或穿刺样本均分成两份，一份用于类器官培养，另一份用于测序，其中肿瘤手术标本或穿刺样本至少来自肿瘤的3个不同位置，测序的目标基因为全基因组、外显子组或特定基因的组合；
(2)测序原始数据进行有效数据获取、序列比对、假阳性变异过滤和变异识别：
用贝叶斯聚类工具PyClone推断克隆群体结构，将来源于同一个样本的不同位置的测序所得突变，聚类到亚克隆；ClonEvol根据校正后的等位基因频率和突变聚类组，构建克隆进化树，同一来源的样本绘制出一棵克隆进化树，树干上的突变，对应克隆性突变，是肿瘤发生早期出现的突变，肿瘤克隆性演化过程中，这类突变依然保留在各亚克隆中，随着肿瘤演化，新突变出现，形成亚克隆，进化树树枝、树叶上的突变对应亚克隆突变，其中新出现的突变为亚克隆特有突变，依据绘制的肿瘤进化树，选取亚克隆特有突变、克隆突变；根据突变位点，设计引物、探针或CRIPR-crRNA，后续用数字PCR(ddPCR)或微流控芯片检测野生位点和突变位点；
(3)原代肿瘤细胞类器官培养：
将肿瘤组织置于0.2％Ⅲ型胶原酶溶液中，于4℃消化过夜，消化成单个细胞，中和消化液，以孔径100μm滤纱，过滤2次，收集细胞滤液，800r/min，离心5min，弃上清，加入类器官培养液培养；
(4)游离核酸判定药筛敏感和耐药亚克隆：
将类器官接种于96孔板或384孔板，添加不同浓度梯度的各种药物，包括常见化疗药物，同时设置空白对照和阴性对照，采用ATP化学发光法进行药敏筛查，方法如下：加入40μLCellTiter-GIo 3D Reagent(Promega)，室温下摇动30min，96微孔板发光检测仪检测荧光强度，重复2-3次筛选；分析数据，计算细胞存活率，抑制率，绘制生长抑制量效曲线，SPSS统计软件probit回归分析确定IC50(half maximalinhibitory concentration，半数抑制浓度)和IC90；判定特定类器官对该药物敏感还是耐药，比较敏感组给药前后ctDNA突变构成，获得敏感亚克隆，敏感亚克隆所对应的敏感药物，作为后续适应性治疗中突变ctDNA发现敏感克隆成长为优势克隆时的治疗选择用药；
(5)肿瘤演化数学模型的建立：
类器官持续给予敏感药物，直到出现耐药，每次类器官传代前，吸取培养液提取游离核酸，进行亚克隆突变检测，用于拟合肿瘤演化数学模型。
2.如权利要求1所述的肿瘤演化调控模型，其特征在于，所述的肿瘤演化调控模型包括肿瘤指数生长模型、种间竞争模型等。
3.如权利要求1所述的肿瘤演化调控模型，其特征在于，步骤(4)中将给药后突变频率降低最高的前1-2个亚克隆判定为敏感亚克隆。
4.如权利要求1所述的肿瘤演化调控模型，其特征在于，通过血浆检测患者亚克隆突变情况，结合药敏筛查结果和已经建立的个体化肿瘤演化数学模型，选择治疗药物和治疗周期，治疗过程中ctDNA持续监测克隆演化，及时调整治疗药物和治疗周期。
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