CN113308436A - 一种人类骨髓、脐带血干细胞处理试剂盒及干细胞分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人类骨髓、脐带血干细胞处理试剂盒，所述的干细胞处理试剂盒由1号液、2号液组成，所述百分比(％)均为重量百分比(W/W)，密度单位：g/ml，1号液、2号液的溶剂均为水；1号液：0.1％‑30％羟乙基淀粉或0.1％‑30％甲基纤维素；2号液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0‑1.2g/ml的分层液组成。在本发明实施过程中，能够缩短反应时间，且本方案中所用的试剂更少，所得到的干细胞数量更多。

Description

一种人类骨髓、脐带血干细胞处理试剂盒及干细胞分离方法

技术领域

本发明属于生物医学技术应用技术领域，具体为一种人类骨髓、脐带血干细胞处理试剂盒及干细胞分离方法。

背景技术

现有技术中，用于人类血液细胞分离的方法包括免疫磁珠法、流式细胞仪法、血细胞分离机法和培养扩增法等方法。

免疫磁珠法

将已知的抗体包被在磁珠微粒上，使磁珠微粒与人类血液混合。呈抗原抗体阳性的细胞粘附在磁珠上，通过一条磁性管道，磁珠被吸附在管壁上；其它没有结合磁珠的细胞都流走后，去除管道磁性，搜集所有含有磁珠的细胞。存在问题：造价高，中低收入患者不适用。对细胞本身活性有损伤，影响细胞治疗疗效。

流式细胞仪法

分选原理：流式细胞计的分选功能是由细胞分选器完成的。

总的过程：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。存在问题，一台流式细胞仪造价300-500万元，标记用抗体1500-5000元一支，造价高，标记物有致癌性，应用于临床不安全，只能适用于科研。

血细胞分离机法

主要用于分离外周血，先给患者注射动员剂，然后使患者外周血经过血细胞分离机循环过滤，得到一定范围直径的细胞，用于细胞治疗。存在问题：打动员剂增加治疗负担，分离后细胞液体积过大，患者承担一定的生命危险。

培养扩增法

采集人类血液后，加入试剂置于培养箱扩增，1周后清洗使用。存在问题：污染率高，干细胞向未知方向分化为未知干细胞，时间长。

现有技术中，已经公开的涉及骨髓和血液分离专利文献：

申请号：200510130326.7，名称：一种分离细胞的方法及专用细胞分离液。该分离细胞的方法缺点：上述方法针对鸡，牛，人血液需要做各种调整，准确度堪忧，由于添加了表面活性剂，分离出的细胞未知，只能用于简单的细胞试验使用。

申请号：200610035900.5，名称：一种干细胞分离液及其用于干细胞分离的方法。该干细胞分离液和干细胞分离的方法的缺点：需要配制工作液，需要调节密度，只能搜集密度在1.083g/ml范围内的细胞，即搜集到的细胞较杂，而可用于治疗所需要的目标细胞数量少，并且对于脐带血来说，使用该方法去除红细胞不净，最终临床应用的时候会导致患者产生排异反应。

申请号：200610114475.9名称：用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒：使用该试剂盒的缺点：使用该试剂盒直接分离血液中的干细胞，数量不足以临床治疗使用，所以该方法进行了细胞培养，培养的细胞污染率高，体外模拟体内环境使细胞扩增，导致培养出的细胞有形态没功能，不能用于临床治疗。

申请号：200610106875.5名称：一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法。缺点：此试剂盒及其应用方法所用的HISTOPAGUE 1077为密度1.077g/ml的淋巴细胞分离液，经此分离后的细胞绝大多数为淋巴细胞，这样导致细胞中能够用于治疗的干细胞占少数，影响临床疗效。

申请号：200710137781.9名称：骨髓脐带血干细胞体外分离试剂盒及其应用方法。缺点：该试剂盒的使用中添加了lin抗体，导致成本大大提高，投入到临床使用后，给中低收入患者造成经济负担，导致患者看不起病，接受不起细胞治疗，并且使用了lin抗体对细胞清洗造成了较大负担，此种物质进入人体后会发生何种变化还是未知数。

背景技术中需要解决的技术问题

治疗成本高。

完成细胞分离工作的仪器设备(如：血细胞分离机及流式细胞仪)价格昂贵，导致治疗成本升高，增加了患者的治疗费用，不利于项目的推广和普及。

细胞活性低。

免疫磁珠法和流式细胞仪法筛选出来的均是被标记了的细胞，这些分选方法均存在筛选细胞范围小、细胞负重后活性降低以及标记物留在人体内会变成什么还是未知等问题。

细胞液体积大。

使用血细胞分离机分离的一般为外周血，且需要采集前打2-7天动员剂，将骨髓中干细胞动员到外周血里，经血细胞分离机分离后筛选出的细胞液体积较大，一般都超过50ml，且红细胞去除不干净。最后得到的细胞悬液体积大、质量不佳，只能用于自体皮下注射。

获取细胞时间过长。

培养扩增一周后才能用于临床治疗，时间过长会延误治疗的最佳时机，影响治疗效果，培养期间造成污染率提高。

传统的分离方法仅限于实验室及科研使用。

许多分离方法操作过程繁琐，对人员的专业要求较高，既费时又费力。从实验方法到临床应用还需要技术改进。

不能产业化。

实验成本高、操作环节中污染机率大、细胞液的保存运输条件不备，导致提取的细胞液数量有限，满足不了临床治疗的大量需求。

以上专利文献公开的试剂盒或其使用方法存在的缺点。

以上相关专利文献公开的试剂盒或方法存在原料来源复杂，配制繁琐，对于分离哪种血液针对性不强(因为人类血和动物血细胞存在一定差异)，获得的分离液用与治疗难以控制等缺点。

在申请号为CN201110026680.0中国发明专利申请中，公开了一种人类骨髓、脐带血干细胞处理试剂盒及干细胞分离方法，其技术方案解决了上述问题，但在其方案实施的时候，所耗费的时间较长。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种人类骨髓、脐带血干细胞处理试剂盒及干细胞分离方法，有效的解决了背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种人类骨髓、脐带血干细胞处理试剂盒，所述的干细胞处理试剂盒由1号液、2号液组成，所述百分比(％)均为重量百分比(W/W)，密度单位：g/ml，1号液、2号液的溶剂均为水；

1号液：0.1％-30％羟乙基淀粉或0.1％-30％甲基纤维素；

2号液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2g/ml的分层液组成。

本发明还公开了一种干细胞处理试剂盒，其中，所述的1号液和2号液是经过温度为100℃-130℃，时间为10分钟-50分钟灭菌的液体。

优选的，其中，所述的1号液和2号液是经过温度为105℃-120℃，时间为15分钟-20分钟灭菌的液体。

本发明还公开了一种人类骨髓、脐带血干细胞处理的方法，所述方法包括：第一步，将骨髓、脐带血样品中加入抗凝剂与适量的磷酸盐缓冲液，得到混合液一，且抗凝剂为枸橼酸钠，并将其放置保存在0-4摄氏度的环境下，

第二步，取混合液一，将其加入到含有一份1号液的大容量培养液瓶中，得到混合液二

第三步，使用磁力搅拌器对混合液二进行混匀，搅拌转速为300-500r/min，待搅拌均匀后，静置20-30分钟，

第四步，静置后的混合液二出现分层，使用助理移液器对其上层细胞液进行吸取，助理移液器在使用的时候，其枪头应保证在上层液上液面以下0.5厘米，以及上层液下液面以上0.5厘米之间，将吸取的细胞液进行离心处理并稀释得到干细胞液，铺于2号液上方，再次离心处理得到干细胞层。

优选的，离心分离的离心机转速为500-4000转/分钟。

优选的，离心温度为18-22度，且离心时间为10-20分钟。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过将脑蛋白水解物注射液更换成胞磷胆碱注射液，使得整个实验耗时由常规4小时缩减到2小时内完成，沉淀后得到的细胞下层液紧实，页面分界点清晰，轻微摇晃培养液瓶下层细胞层不会散，便于收集更多的干细胞。胞磷胆碱钠加入到样本及1号液中混匀时候起到保护和修复分离提取出的干细胞脱离样本环境所造成的细胞膜损伤。能保证在2个小时的分离过程中干细胞始终保持良好活性及状态。使干细胞能够在后续使用中起到良好的肉眼可见的效果。

附图说明

附图用来提供对本发明专利的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明专利的实施例一起用于解释本发明专利，并不构成对本发明专利的限制。在附图中：

图1为本发明所分离干细胞的计数示意图；

图2为本发明所分离干细胞的计数示意图；

图3为本发明所分离干细胞的计数示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明公开了一种人类骨髓、脐带血干细胞处理试剂盒，所述的干细胞处理试剂盒由1号液、2号液组成，所述百分比(％)均为重量百分比(W/W)，密度单位：g/ml，1号液、2号液和3号液的溶剂均为水；

1号液：0.1％-30％羟乙基淀粉或0.1％-30％甲基纤维素；羟乙基淀粉，是现在临床上广泛使用的人工合成的胶体溶液，同时也是一种天然多糖。羟乙基淀粉(HES)是玉米或土豆中支链淀粉的葡萄糖环经羟乙基化形成的高分子复合物。大量实验表明，平均分子量越大，对样本中红细胞的凝集作用越强，所以在制作1号液的时候在每一份1号液中都加入氮气，用于提高1号液的质量，使之在之后的使用中能够更好，更牢固的结合样本中的红细胞，保证将其压缩到最小体积存在于培养液瓶最底部

2号液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2g/ml的分层液组成。

一种干细胞处理试剂盒，其中，所述的1号液和2号液是经过温度为100℃-130℃，时间为10分钟-50分钟灭菌的液体。

其中，所述的1号液和2号液是经过温度为105℃-120℃，时间为15分钟-20分钟灭菌的液体。

一种人类骨髓、脐带血干细胞处理的方法，包括：第一步，将骨髓、脐带血样品中加入抗凝剂与适量的磷酸盐缓冲液，得到混合液一，且抗凝剂为枸橼酸钠，并将其放置保存在0-4摄氏度的环境下，

第二步，取混合液一，将其加入到含有一份1号液的大容量培养液瓶中，得到混合液二，

第三步，使用磁力搅拌器对混合液二进行混匀，搅拌转速为300-500r/min，待搅拌均匀后，静置20-30分钟，

第四步，静置后的混合液二出现分层，使用助理移液器对其上层细胞液进行吸取，助理移液器在使用的时候，其枪头应保证在上层液上液面以下0.5厘米，以及上层液下液面以上0.5厘米之间，从而保证吸取的细胞液中干细胞的浓度更大，且更加有利于排除细胞液中的杂质被吸入到助理移液器内。

将吸取的细胞液进行离心处理得到干细胞液，使用2号液继续处理得到干细胞层。离心分离的离心机转速为500-4000转/分钟，离心温度为18-22度，且离心时间为10-20分钟。

本申请将脑蛋白水解物注射液更换成胞磷胆碱注射液，能够缩短实验时间，当使用脑蛋白水解物注射液完成本实验方案需要4个小时，而将脑蛋白水解物注射液更换成胞磷胆碱注射液后，完成本实验只需两小时，加快了反应进程，且本实验中通过限定反应时间与环境温度，使得沉淀后得到的细胞下层液紧实，页面分界点清晰，轻微摇晃培养液瓶下层细胞层不会散，便于收集更多的干细胞。

总结：从表1可以对比出，分离同一份人类脐带血样品，分离后细胞总数，A组比B组多0.9×108-1.7×108；分离后CD34的细胞总数，A组比B组多2.2×106-3.4×106，分离后干细胞存活率A组比B组多3％-4％，分离干细胞所消耗时间A组比B组少2小时。

其中A组为本专利申报产品。

B组为市售分离细胞产品。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种人类骨髓、脐带血干细胞处理试剂盒，所述的干细胞处理试剂盒由1号液、2号液组成，所述百分比(％)均为重量百分比(W/W)，密度单位：g/ml，1号液、2号液的溶剂均为水；

1号液：0.1％-30％羟乙基淀粉或0.1％-30％甲基纤维素；

2号液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2g/ml的分层液组成。

2.根据权利要求1所述的干细胞处理试剂盒，其特征在于：

其中，所述的1号液和2号液是经过温度为100℃-130℃，时间为10分钟-50分钟灭菌的液体。

3.根据权利要求2所述的干细胞处理试剂盒，其特征在于：

其中，所述的1号液和2号液是经过温度为105℃-120℃，时间为15分钟-20分钟灭菌的液体。

4.一种人类骨髓、脐带血干细胞处理的方法，所述方法包括：

第一步，将骨髓、脐带血样品中加入抗凝剂与适量的磷酸盐缓冲液，得到混合液一，且抗凝剂为枸橼酸钠，并将其放置保存在0-4摄氏度的环境下，

第二步，取混合液一，将其加入到含有一份1号液的大容量培养液瓶中，得到混合液二

第三步，使用磁力搅拌器对混合液二进行混匀，搅拌转速为300-500r/min，待搅拌均匀后，静置20-30分钟，

第四步，静置后的混合液二出现分层，使用助理移液器对其上层细胞液进行吸取，助理移液器在使用的时候，其枪头应保证在上层液上液面以下0.5厘米，以及上层液下液面以上0.5厘米之间，将吸取的细胞液进行离心处理并稀释得到干细胞液，铺于2号液上方，再次离心处理得到干细胞层。

5.根据权利要求4所述的人类骨髓、脐带血干细胞分离的方法，其特征在于：离心分离的离心机转速为500-4000转/分钟。

6.根据权利要求5所述的人类骨髓、脐带血干细胞分离的方法，其特征在于：离心温度为18-22度，且离心时间为10-20分钟。

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