CN102604890A - 脐带血间充质干细胞分离液及分离流程 - Google Patents

Abstract

一种人脐带血间充质干细胞分离液及其分离流程。分离液由9％聚蔗糖与33.9％泛影葡胺按26.88∶10配伍而成，密度1.073±0.001g/L。两步法分离脐带血间充质干细胞流程：第一步：羟乙基淀粉沉淀红细胞。第二步：密度1.073g/L分离液分离间充质干细胞。本发明分离液和分离流程可得到脐带血中最大比例的间充质干细胞，淋巴细胞和单核细胞比例很小，获得的细胞状态好、活力高。所用材料、试剂为医用级产品，无毒无热源，可产业化生产，便于储存。所用方法为优化的流程，稳定性、重复性好。还可用于人骨髓、外周血间充质干细胞的分离。是目前密度梯度离心法中分离提取间充质干细胞的最优方法，优于其它同类产品和方法。

Description

脐带血间充质干细胞分离液及分离流程

技术领域

本发明涉及一种改进的脐带血间充质干细胞分离液及优化分离流程。

背景技术

国内、外分离脐带血干细胞方法常采用磁珠/流式细胞分选法、脐血库仪器/羟乙基淀粉沉淀法和密度梯度离心法。由于目的不同，各类方法有其自身特点。磁珠法或流式细胞分选法应用相应单克隆抗体分离得到较纯的细胞群体，但细胞收获率较低，适宜做分析及科研应用。脐血库分离干细胞常用羟乙基淀粉沉淀和仪器离心分离法，分离的细胞量大、成分较多但混有大量红细胞，适用于大量分离、储存干细胞。密度梯度离心法采用Ficoll分离液分离细胞，得到单个核细胞(Mononuclear cells，MNC)群。目前可查到1个美国专利(专利1)^[1]和2个中国专利(专利2、专利3)^[2-3]用密度梯度离心法分离MNC。专利1、2所用分离液密度均为1.077g/L，专利3所用分离液密度为1.075g/L。这两个密度的分离液分离得到的实际上是一组包括淋巴细胞、单核细胞、间充质干细胞、造血干细胞及少量分叶核细胞在内的MNC群。因此，选择简单、实用、成本低廉的密度梯度离心法从脐带血中分离得到最大比例间充质干细胞，直接作临床应用或继续培养、扩增细胞是需要解决的主要技术问题。干细胞分离过程中的各种实验条件，如：离心力、离心时间、分离液与稀释脐带血比例、温度、试剂准备等环节各家报道差别很大，更无客观和科学的标准。建立一套优化的最佳分离流程即标准操作流程是脐带血干细胞临床应用中亟待解决的方法学问题。

发明内容

本发明的目的在于寻找一种密度梯度离心法分离脐带血干细胞的最佳分离液密度并建立一套分离流程。该密度分离液能分离出比例最高的间充质干细胞；对实验过程中的各种条件进行优选，建立相应配套流程；实验所用各种材料、试剂均为无菌无热源医用级产品，能够满足临床治疗级制备干细胞的需要。

为解决上述问题本发明采用的技术方案如下：

一种新的人脐带血间充质干细胞分离液，其密度是1.073±0.001g/L。该分离液由9％聚蔗糖与33.9％泛影葡胺按26.88份与10份配伍而成。其配法如下：

药用级聚蔗糖(polysucrose solution)干粉，分子量400 000，先用灭菌无热源蒸馏水配置成40±1％(w/v)水溶液，备用。应用时，用蒸馏水配置9％溶液。60％泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，结构式为3，5-二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1-去氧-甲氨基山梨醇(医用造影剂)。应用时取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml即为33.9％泛影葡胺。在室温(18～20℃)下，取9％聚蔗糖26.88份、33.9％泛影葡胺10份充分混匀，用波美比重计测混合液比重或适当调整两者体积，即得1.073±0.001g/L脐带血间充质干细胞分离液。分装成100ml/瓶，过滤除菌，室温避光保存。可用下列公式计算分离液密度或两者体积：

分离液比密＝[9％聚蔗糖的比密×其体积+33.9％泛影葡胺的比密×其体积]/二者的体积之和。

一种优选的人脐带血间充质干细胞分离流程[4]：采用两步法分离脐带血间充质干细胞：第一步，6％羟乙基淀粉沉淀红细胞；第二步，密度1.073g/L分离液分离间充质干细胞。

第一步：羟乙基淀粉沉淀红细胞。取枸橼酸钠抗凝脐血80～100ml，无菌操作加入500ml圆形沉降瓶中，加脐带血量2倍体积的PBS，充分混匀。加脐带血量2倍体积的医用6％中分子羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液，充分混匀，盖盖(不要盖紧)，20℃，静置60min。

第二步：应用密度1.073g/L分离液密度梯度离心法分离间充质干细胞。

吸取羟乙基淀粉沉淀红细胞后的上清液，缓慢加至分离液液面上(上清液∶分离液为1∶1)。置水平离心机上，4℃，离心力700g，离心30min。离心后用移液管伸到单个核细胞(云雾层混浊带)层，轻轻吸出，加入到PBS液中，4℃，洗涤细胞3遍。即得到脐带血间充质干细胞。取少量样品做细胞计数、检测细胞活性，完成质检和质控。

本发明的分离液和分离流程可分离得到脐带血中最大比例的间充质干细胞，淋巴细胞和单核细胞比例很小，获得的细胞状态好、活力高。可直接应用于临床治疗或进一步培养、扩增。还可用于外周血、骨髓间充质干细胞细胞的分离提取。是目前密度梯度离心法中分离提取间充质干细胞的最优方法。本分离液所用材料、试剂均为医用级产品，便于储存，无毒无热源，可产业化生产；所用方法为优化的流程，简单、易行，稳定性好，重复性好，可广泛推广应用。优于其它同类产品和方法。

本发明分离液与其它密度分离液分离效果比较，及实验流程对比分析优化结果如下：

第一部分本发明分离液与其它密度分离液分离效果比较。

1材料与方法

1.1脐带血来源

本院健康产妇脐血。产妇年龄24～35岁。检查无肝炎、梅毒、艾滋病及其他妊娠并发症。实验共使用脐血30份，每份80～120ml，无菌采集后3小时内处理。

1.2主要试剂和仪器设备

PBS缓冲液，6％羟乙基淀粉，CD34-PE，CD45-FITC，CD14-APC，CD90-FITC，CD3-PerCP，CD29-APC，CD73-PE，CD105-PE购自美国BD公司。9％聚蔗糖液购自上海试剂二厂，33.9％泛影葡胺购自上海信谊制药厂。光学显微镜、生物安全柜、电子秤、pH计、离心机、大容量移液枪、超纯水制造系统、流式细胞仪(BD公司)。

1.3三种密度的分离液配制

方法同上。可得到密度为1.073±0.001(本品)、1.075±0.001、1.077±0.001g/L 3种密度的分离液。

1.4羟乙基淀粉沉淀红细胞

方法同上。

1.5密度梯度离心法分离单个核细胞

分别用三种密度的分离液分离脐带血MNC，其它方法同上。MNC质量鉴定：采用胎盼蓝拒染法检测细胞活性；计数盘法计数MNC总数。

1.6流式细胞仪检测单个核细胞纯度

取100μl单个核细胞悬液(细胞密度约1×10⁶)，加100μl FITC或PE标记的特异性荧光直标单抗，包括CD34-PE，CD45-FITC，CD14-APC，CD3-PerCP，CD90-FITC，CD29-APC，CD73-PE，CD105-PE。另一份加入荧光标记的无关单抗，作为同型对照样品，室温下避光反应15～30min。加入500μl PBS重悬成单细胞悬液，流式细胞仪检测。

2结果

2.1三种密度的分离液分离脐带血MNC总数及细胞活力

比较三种分离液分离脐带血MNC的总数和细胞活力，如表1。

表1.三种密度分离液分离脐血MNC总数及细胞存活率(n＝30)

从表1可见，密度1.073g/L(本品)时获得的细胞数最低，与用密度为1.077g/L获得的细胞数相比，少39.18％；密度为1.077g/L时最多，1.075g/L时居中。三种密度的分离液获得的细胞存活率均较高。

2.2三种密度的分离液分离脐带血MNC亚群比例

用1.073g/L，1.075g/L，1.077g/L三种密度的分离液分离脐带血单个核细胞后，流式细胞仪分析CD34+CD45+，CD14+，CD3+，CD73+，CD105+，CD29+，CD90+表型，结果见表2。

表2.三种密度分离液分离脐带血MNC表面抗原表达率(％，n＝30)

从表2可见，用三种密度的分离液分离所得的MNC中，CD34+CD45+双阳性细胞所占比例和CD73+，CD105+，CD29+，CD90+细胞表型在密度为1.073g/L(本品)时最高；而CD14+、CD3+细胞在密度为1.075、1.077g/L时最高。

2.3综合比较

比较1.073g/L(本品)，1.075g/L，1.077g/L三种密度分离液分离脐带血MNC中CD34+CD45+、CD14+、CD3+、CD73+、CD105+、CD29+和CD90+细胞表达百分率并绘制成直方图，图1(见说明书附图)。

3讨论

脐带血MNC中含有多种干/祖细胞，如造血干/祖细胞(HSCs/HPCs)、间充质干细胞(MSC)、内皮前体细胞(EPC)和非限制性体干细胞(USSCs)等。这些干细胞有其特异的表面标志。造血干细胞的表面标志随着个体发育时期的不同而不同，但具有共同的标志：CD34+CD45+，CD133+，HLA-DR-，Sca-1+，ABCG2+，CD38-，等。CD34抗原是仅存在于造血干/祖细胞表面的分化群抗原，也有不少文献证实在大多数造血组织中，造血干细胞在CD34+细胞中所占的比例是恒定的。也有文献报道CD14+为造血干细胞标志物。间充质干细胞表达CD73，CD105，CD29，CD44、CD90，CD166等，而不表达造血干细胞标志CD34、CD45和内皮细胞特异性标志-CD31和vW。到目前为止没有一个很统一的间充质干细胞的表面标志，选择用于鉴定间充质干细胞表面标志各家报道略有不同。本研究选择CD34+和CD45+作为造血干细胞的标志物；CD73+、CD105+、CD29+、CD90+作为鉴定间充质干细胞的标志物；CD14+作为单核细胞标志物，CD3+作为淋巴细胞标志物，用于分析密度梯度离心法用三种密度分离液分离得到间充质干细胞的最佳效果。

本实验结果表明：1)使用密度为1.077g/L的分离液获得的MNC总数高于密度为1.075和1.073g/L的分离液获得的MNC总数，与密度为1.073g/L的分离液获得的细胞数相比，高39.18％。说明密度1.077g/L的分离液获得的MNC中含有较多的单核细胞和淋巴细胞；而密度1.073g/L(本品)的分离液获得的MNC中含有较少的单核细胞和淋巴细胞，相应的间充质干细胞和造血干细胞比例较高。2)按流式细胞仪检测得细胞表面标志物结果，重新将MNC分群，将CD34+、CD45+和CD14+列为造血干细胞群；CD73+、CD105+、CD29+和CD90+列为间充质干细胞群；CD3+作为淋巴细胞群。进一步分析密度为1.073、1.075、1.077g/L分离得到这三个细胞群的结果。从表2可以看出，密度1.073g/L(本品)分离液分离得到约10％造血干细胞群、54％间充质干细胞群和20％淋巴细胞群。而密度1.075、1.077g/L分离液分离得到约27％、17％造血干细胞群、41％、42％间充质干细胞群和20％、11％淋巴细胞群。从图1(见说明书附图)直方图结果还可看出，密度为1.073g/L(本品)分离液获得间充质干细胞和淋巴细胞两个主要细胞群，以间充质干细胞比例最大。密度为1.075、1.077g/L分离液获得间充质干细胞、造血干细胞和淋巴细胞三个主要细胞群，且间充质干细胞比例较低。密度为1.075g/L分离液获得造血干细胞比例最高。上述结果表明，本品密度1.073g/L分离液分离得到间充质干细胞群比例最高、造血干细胞群比例最低，达到分离间充质干细胞最佳效果。

第二部分分离流程对比分析优化结果。

1材料

1.1脐血来源

同第一部分。

1.2主要试剂

人淋巴细胞分离液，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。其余同第一部分。

1.3主要仪器设备

同第一部分。

2方法

采用两步法分离脐血干细胞：第一步，6％羟乙基淀粉沉淀红细胞；第二步，密度1.073g/L分离液分离MNC。

2.1羟乙基淀粉沉淀红细胞及其沉淀时间观察

取抗凝脐血80-100ml，无菌操作加入500ml圆形沉降瓶中，加脐带血量2倍体积的生理盐水，与脐血充分混匀。加脐带血量2倍体积6％中分子羟乙基淀粉，充分混匀，盖盖(不要盖紧)，20℃，静置20、30、40、50、60、70min，比较沉淀的效果，以沉降界面最高、沉降时间最短为最佳沉淀红细胞之效果。

2.2密度梯度分离MNC及不同离心时间和离心力的分离效果

吸取羟乙基淀粉沉淀红细胞后的上清液，缓慢加至分离液液面上(上清液∶淋巴细胞分离液为1∶1)。置水平离心机上，分别以800、700、600、500、400g/min，离心30、25、20min，离心温度4℃。离心后对分层效果进行拍照，测量含单个核细胞液层高度。用移液管插到单个核细胞(云雾层混浊带)层，轻轻吸出，加入到PBS液中，洗涤细胞。置离心机中，4℃，洗3次。第一遍2000rpm、5min，第二遍1800rpm、5min，第三遍1600rpm、5min，以去掉混杂的血小板、细胞碎片等。最后按一定比例稀释后于血细胞计数板上细胞计数。计算每毫升的细胞数，作为细胞得率。

2.3细胞活力检测

台盼蓝拒染法检测细胞活性。取2滴细胞悬液加1滴2％台盼蓝染液，5～10min后取样作湿片，高倍镜检。死细胞被染成蓝色，活细胞不着色。计数200个细胞，活细胞百分率＝活细胞数/总细胞数×100％。

3结果

3.1羟乙基淀粉沉淀红细胞最佳时间

脐血与羟乙基淀粉混合后，在不同时间内羟乙基淀粉促进红细胞沉降，测量上清液面高度，结果见表1。

表1.不同时间红细胞沉淀效果

从表1可见，从20min到50min沉降液面逐渐增高，至60min后增高不明显，说明沉淀60min时间短，效果最好。

3.2离心力和离心时间对单个核细胞活力和得率的影响

本研究按预实验结果筛选了400～800g/min 5个离心力、20～30min 3个离心时间。用MNC云雾层厚度、细胞得率、细胞存活率和混有红细胞数4个指标分析最佳分离效果，结果见表2。

表2.离心力及离心时间对MNC得率和活力的影响

从表2可见，在不同离心力条件下，离心力越小，获得的细胞总数越多，但混有红细胞数也越多，甚至肉眼即可见红细胞。3个不同离心时间，离心时间越长，MNC层厚度越大，获得的细胞总数越少，混有红细胞数也越少。不同离心力和离心时间对细胞活力影响不大。综合比较，在离心力700g/min、离心30min时，获得的MNC层厚度最大，细胞得率较多、纯度最高，显微镜下观察MNC背景中混杂红细胞及其他杂质细胞最少。细胞得率也随离心力的加大或者减小而降低。

4讨论

本研究在前期工作基础上，结果证实：①脐带血与生理盐水的最佳稀释比例为1∶2。②脐带全血与羟乙基淀粉混合，15～20℃时，沉淀红细胞的时间60min最佳。③密度梯度离心前，富含单个核细胞的上清液与淋巴细胞分离液容积比按1∶1加入，可获得最佳分离单个核细胞效果。④密度梯度离心时，4℃，700g/min，30min所得单个核细胞效果最好。体现在分层后MNC层较厚，洗涤细胞后管底细胞沉淀中红细胞较少，MNC背景中混杂细胞如红细胞及其他细胞碎片也少，平均细胞密度和细胞活力也很高。离心分层时，温度控制在4℃为最佳，否则MNC层很薄、影响细胞得率，此温度的细胞活力在97％以上。

在实践中，人们常用离心转速表述离心力。由于使用不同型号离心机，离心半径是不一样的，用不同半径转子的离心机离心同一样品时，其离心力是不一样的，所以应选择相同离心力(RCF)，而不是相同转速(rpm)，需要根据使用的离心机的具体条件进行离心力(RCF)和转速(rpm)的换算。离心力和离心转速的换算公式为：RCF＝1.118×10-5×N2×R，RCF表示相对离心力，单位为g，N表示转速，单位为rpm转/分，R表示离心半径，单位为cm。

在干细胞分离提取过程中，还应注意以下事项。首先，使用新鲜脐带血，避免溶血、冷冻和冷藏。第二，羟乙基淀粉、分离液启封后宜4℃避光保存，用之前需提前从4℃冰箱中拿出，待温度升至室温后再使用。第三，脐带血加至分离液层面上时动作应该缓慢，并且要注意保持界面清晰，分离液事先要浸润管壁，在吸取单个核细胞层时尽量避免多吸，否则会吸出其他的混杂细胞；根据MNC云雾状层的厚度来确定洗涤细胞所用PBS液的量。第四，所有试剂应使用医用级的；所有耗材应无菌、除热源；严格筛选脐血来源并具有可溯源性；脐血干细胞在应用前要有质量和检验标准。我国脐血干细胞的临床应用，应建立一套完善地标准操作流程(SOP)文件；建立质量控制标准和体系；推荐第三方检测机构鉴定脐血干细胞质量。方能使脐血干细胞临床试验和临床应用走向良性发展轨道。

附图说明

图1.密度1.073，1.075和1.077g/L三的分离液分离脐带MNC中CD34+CD45+，CD14+，CD3+，CD73+，CD105+，CD29+和CD90+细胞表达(％)直方图

从图1可知，三种密度的分离液所分离的MNC，以CD29+，CD105+，CD3+和CD14+四个细胞组分所占比例较大；CD73+、CD90+、CD34+CD45+三个细胞组分所占比例较小。在三种密度的分离液中，密度为1.073g/L(本品)分离液获得CD29+、CD105+和CD3+三个细胞群，CD29+比例最大；密度为1.075、1.077g/L分离液获得CD14+、CD3+和CD29+、CD105+四个细胞群，CD29+比例均低于密度为1.073g/L分离液。

具体实施方式

实施例1：人脐带血间充质干细胞分离液(密度1.073±0.001g/L)。其配法为：药用级聚蔗糖干粉，分子量400 000，先用灭菌无热源蒸馏水配置成40±1％(w/v)水溶液，备用。应用时，用蒸馏水配置9％溶液。60％泛影葡胺溶液(医用造影剂)。应用时取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml即为33.9％泛影葡胺。在室温(18～20℃)下，取9％聚蔗糖26.88份、33.9％泛影葡胺10份充分混匀，用波美比重计测混合液比重或适当调整两者体积，即得1.073±0.001g/L脐带血间充质干细胞分离液。分装成100ml/瓶，过滤除菌，室温避光保存，可保存1年。

实施例2：两步法分离脐带血间充质干细胞。第一步：羟乙基淀粉沉淀红细胞。取枸橼酸钠抗凝脐血80～100ml，无菌操作加入500ml圆形沉降瓶中，加脐带血量2倍体积的PBS，充分混匀。加脐带血量2倍体积的医用6％中分子羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液，充分混匀，盖盖(不要盖紧)，20℃，静置60min。

第二步：应用密度1.073g/L分离液密度梯度离心法分离间充质干细胞。吸取羟乙基淀粉沉淀红细胞后的上清液，缓慢加至分离液液面上(上清液∶分离液为1∶1)。置水平离心机上，4℃，离心力700g，离心30min。离心后用移液管伸到单个核细胞(云雾层混浊带)层，轻轻吸出，加入到PBS液中，4℃，洗涤细胞3遍。即得到脐带血间充质干细胞。取少量样品做细胞计数、检测细胞活性，完成质检和质控。

Claims (2)

1.一种人脐带血间充质干细胞分离液，其特征在于所述的分离液是由9％聚蔗糖液26.88份和33.9％泛影葡胺10份混合制成，密度为1.073±0.001的应用液。其中分离液的密度有别于其它同类产品。

2.两步法分离脐带血间充质干细胞流程：第一步，6％羟乙基淀粉沉淀红细胞；第二步，根据权利要求1所述的分离液分离间充质干细胞。其特征在于：第一步：羟乙基淀粉沉淀红细胞。取枸橼酸钠抗凝脐血80～100ml，无菌操作加入500ml圆形沉降瓶中，加脐带血量2倍体积的PBS，充分混匀。加脐带血量2倍体积的医用6％中分子羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液，充分混匀，盖盖(不要盖紧)，20℃，静置60min。第二步：应用密度1.073g/L分离液密度梯度离心法分离间充质干细胞。吸取羟乙基淀粉沉淀红细胞后的上清液，缓慢加至分离液液面上(上清液∶分离液为1∶1)。置水平离心机上，4℃，离心力700g，离心30min。离心后用移液管伸到单个核细胞(云雾层混浊带)层，轻轻吸出，加入到PBS液中，4℃，洗涤细胞3遍。即得到脐带血间充质干细胞。其中分离流程中的如下操作要点有别于其它同类产品所述方法：第一步：脐带血量∶PBS＝1∶2；稀释脐带血：6％中分子羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液＝1∶2；盖盖(不要盖紧)；20℃，静置60min。第二步：羟乙基淀粉沉淀红细胞后的上清液：权利要求1所述的分离液＝1∶1；置水平离心机上，4℃，离心力700g，离心30min。

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