CN103160462B - 一种优秀冰雪运动员脐带血间充质干细胞的分离方法 - Google Patents

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一种优秀冰雪运动员脐带血间充质干细胞的分离方法，其特征在于，先将优秀冰雪运动员脐带血中的单个核细胞进行粗分离，再运用羟乙基淀粉沉降结合淋巴缓冲液密度梯度离心法分离，最后运用直接贴壁法进行进一步分离纯化。该方法，操作简单，经济实用且分离效率高，能得到大量目的细胞，大大缩短了原代培养时间。优秀冰雪运动员脐带血间充质干细胞可作为一种新的替代细胞来源，用于优秀冰雪运动员遗传资源保存及优秀冰雪运动员各系统疾病的细胞移植和基因治疗，为以细胞水平研究优秀冰雪运动员提供了优良的材料。

Description

一种优秀冰雪运动员脐带血间充质干细胞的分离方法
技术领域
 本发明涉及一种优秀冰雪运动员脐带血间充质干细胞的分离方法，属于细胞生物学领域。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种多潜能干细胞。目前，MSCs主要取自骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染或其他污染的可能，且随着年龄的不断增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，而且对优秀冰雪运动员进行骨髓分离会对运动员造成伤害，几乎是不可行的。因此，寻找一种能替代骨髓MSCs并可弥补其缺陷的间充质干细胞来源，已越来越受到各国学者的关注。人脐带血(Human umbilical cord blood， HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞和祖细胞，主要包含造血干细胞和MSCs。HUCB优势在于:(1)脐血从分娩后的胎盘、脐带残端收集，其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单。对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，易于接受。(2)脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的几率低。(3)脐血免疫系统的原始性，降低了移植后受体的排斥反应。(4)脐血包含丰富的MSCs不仅可用于造血系统疾病治疗，也可用于非造血系统疾病的治疗。(5)脐血中含有MSCs更为原始，具有更强的分化能力。(6)不涉及社会、伦理及法律方面的诸多争论。(7)收集的脐血不仅可做异基因移植的供体，而且还可将之低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病。(8)随着世界各国脐血库的建立完善及脐血体外扩增技术的成熟，为脐血的临床应用奠定了坚实的基础。故脐血干细胞的作用越来越突出，可用于优秀冰雪运动员遗传资源保存及优秀冰雪运动员各系统疾病的细胞移植和基因治疗，为以细胞水平研究优秀冰雪运动员提供了优良的材料。
目前常用的MSCs的分离方法有:(1)密度梯度离心法:用Ficoll Hypaque或Percoll分离液进行密度梯度离心分离MSCs，此方法简单有效，成本低廉，其中用后者分离的MSCs大小均匀，细胞纯度较前者高;(2)贴壁筛选法:依据MSCs易贴附在塑料培养物上生长的特性将其与非贴壁细胞分离;有学者直接使用贴壁筛选法，但标本中的大量红细胞据了MSCs所需的贴壁空间，影响MSCs的获得率。(3)流式细胞仪分选术:根据MSCs体积小、相对缺少颗粒这一特性，采用流式细胞仪对其进行分选，能获得较纯的MSCs，但它不方便用于大量获得MSCs，因此没有广泛的使用;(4)单细胞克隆的方法分离MSCs，实验条件要求高，所需标本量较大。也不利于推广使用。以上多种脐带血间充质干细胞的分离方法，均存在一定的弊端，不利于推广和使用，本发明对已有实验方法进行总结，提出了一种操作简单，经济实用且分离效率较高的优秀冰雪运动员脐带血间充质干细胞的分离方法。
发明内容
一种优秀冰雪运动员脐带血间充质干细胞的分离方法，其特征在于，先将脐带血中的单个核细胞进行粗分离，再运用羟乙基淀粉沉降结合淋巴缓冲液密度梯度离心法分离优秀冰雪运动员脐带血间充质干细胞，最后运用直接贴壁法进行进一步分离纯化。
具体实施方式
脐血源间充质干细胞（Cord blood derived mesenchymal stem cells,CB-MSCs）分离、培养与鉴定。
1 优秀冰雪女运动员脐带血的采集
跟踪优秀女性优秀冰雪运动员，经产妇及其家属同意，在其胎儿分娩时(胎盘仍在宫腔内)，在距胎儿5~7cm的脐带处进行双结扎，剪断脐带，消毒母侧脐带断端，穿刺脐静脉抽取脐带血30~50ml，加入抗凝剂（肝素浓度为20U/ml）抗凝，4℃冰箱保存，并于12 h内进行分离。
2 优秀冰雪女运动员脐带血干细胞的分离
用PBS溶液与脐带血按2∶1体积比混合，3000r/min离心10min，去除上清，加入细胞基础培养基重悬细胞并收集在一个离心管内混匀，控制总体积在20ml以内，用6%羟乙基淀粉与脐带血按1∶6体积比混合，常温下静置30min，取上清液，1000r/min离心10min，去除上清液，用基础培养基重悬细胞沉淀，经200目不锈钢筛网过滤后缓慢将其叠加到15ml淋巴细胞分离液上(勿扰乱液面)，稀释脐血与淋巴细胞分离液的高度比小于2∶1。以2000r/min离心20min，小心吸取界面层白色云雾状单个核细胞，基础培养基重悬2000r/min离心洗涤1次，1200r/min离心洗涤1次。
3 优秀冰雪女运动员脐带血干细胞培养、分离
沉积细胞用含15％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM高糖培养基悬浮，调整细胞密度为1×109L-1，放置在37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养，并进行传代分离。
4 鉴定
CB-MSCs在体外培养过程中不表达 CD14，CD34和CD45，而表达CD106，CD54，SH2，SH3 和SH4。电子光学显微镜下观察可以看到CB-MSCs中某些间质标记物表达阳性，如SMA、波形蛋白、巢蛋白及结蛋白。CB-MSCs还表达一种特殊的标记HOX，尤其是HOXA9，HOXB7，HOXC10及HOXD8被称为间充质干细胞的“生物学指纹”，这是从脐血中分离间充质干细胞的特异性标记之一，可用以鉴定脐带血间充质干细胞。

Claims (1)

1.一种优秀冰雪运动员脐带血间充质干细胞的分离方法，其特征在于，步骤如下：
（1）取脐带血30~50ml，加入肝素抗凝剂；
（2）先将脐带血中的单个核细胞进行粗分离，用PBS与脐带血按2∶1体积比混合，3000r/min离心10min，去除上清，加入基础培养基重悬细胞并收集，再运用6%羟乙基淀粉与脐带血按1:6体积比混合，常温下静置30min，取上清，1000r/min离心10min，去除上清液，用基础培养基重悬细胞沉淀，经200目筛网过滤后缓慢叠加到15ml淋巴细胞分离液上，稀释脐带血与淋巴细胞分离液的高度比小于2:1，以2000r/min离心20min，小心吸取界面层白色云雾状单个核细胞，基础培养基重悬2000r/min离心洗涤1次，1200r/min离心洗涤一次获得脐血间充质干细胞；
（3）将获得的脐带血间充质干细胞用含15％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM高糖培养基悬浮，调整细胞密度为1×109/L，放置在37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养，并进行传代分离。
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人脐带血间充质干细胞分离培养体系的优化筛选;刘岱 等;《中国组织工程研究与临床康复》;20090305;第13卷(第10期);第1840页"羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法"部分 *

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