CN110804585A - 一种脐带间充质干细胞的分离方法 - Google Patents

一种脐带间充质干细胞的分离方法 Download PDF

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陈杰
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    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Abstract

本发明公开一种脐带间充质干细胞的分离方法。具体方法是：在脐带组织块贴壁法培养过程中，把新鲜的华通氏胶脐带组织块剪成1mm3左右大小后，用胶原酶和透明质酸酶初步解离软化，然后均匀铺于有纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原等包被预处理培养器皿中；通过本发明的方法，组织块贴壁严实，漂浮起的组织块少，脐带中的间充质干细胞可以快速从组织块实质中爬出，大大缩短细胞爬出的时间，同时爬出细胞的组织块较多，收获细胞量大，细胞纯度和活性较好。

Description

一种脐带间充质干细胞的分离方法
技术领域
本发明涉及一种组织块贴壁分离细胞的方法，更涉及脐带间充质干细胞的分离方法，属于细胞生物学领域。
背景技术
脐带间充质干细胞大量存在于脐带沃顿胶 (Wharton 胶，或者又称华尔通胶 )和血 管周围组织中，具有自我更新、增殖和多向分化潜能。目前间充质干细胞已然成为再生医学研究的热门，具有有非常广泛的应用前景。
新生儿脐带中含有丰富的脐带间充质干细胞，同时其周围含有丰富的胶原、透明质酸、硫酸软骨素等基质成分。目前的脐带间充质干细胞分离培养方法有2种，分别是传统酶消化法和组织贴壁法。贴壁法纯度高，操作较酶消化法简单，但细胞爬出时间长，整体细胞培养周期长，培养效率不高；而酶消化法虽然时间短，但操作复杂、酶消化得到的细胞纯度低，并且难以避免的造成细胞的损伤和细胞表型丢失、老化。
组织块贴壁法中，组织中的脐带间充质干细胞由于处在组织块实质内，需要克服各种细胞胞外基质成分和组织成份的黏连，很难马上侵润出周围组织细胞。细胞培养中，细胞的粘附是通过细胞表面的受体与细胞外的基质成份结合实现的，所以用纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原等预处理培养器皿，有利细胞的附着和增殖。
发明内容
针对以上这些缺点和细胞爬出的原理，本发明的目的是提供一种脐带间充质干细胞分离方法。该方法采用组织贴壁法和酶消化的组合方式，使用的酶为胶原酶和透明质酸酶的组合，这样做的目的是通过酶消化法使组织块中基质成分解离软化，有利于组织中脐带间充质干细胞爬出；在瓶底提前包被纤连蛋白、层粘连蛋白以及明胶，有利于脐带间充质干细胞的快速粘附和快速增殖。通过实施本方法，脐带组织间充质干细胞爬出时间大大缩短，1-2天脐带组织贴壁严实，只有少量小的组织块出现漂浮，3-5天就有大量细胞从大部分的组织块周边爬出，6-8天细胞长满80%以上，细胞收获量大，同时细胞纯度和活性较好。
具体实施方式
下面结合具体实施例介对本发明进一步详细说明，而不是对本发明的限制。
实验方法
1、脐带采集和分离准备：合法途径获得脐带一根，脐带来源获得产妇知情同意捐赠所得，胎儿为足月生产且产妇无传染性疾病。无菌采集脐带组织15cm，24小时内完成制备。脐带在超净工作台中，用75%酒精浸泡2-3分钟，放入PBS中剪成2-3cm长度，再次用PBS清洗表面和血管内的血渍，然后撕开脐带，剔除脐带中的两根动脉和一根静脉，取其中的透明华通氏胶成份和血管周成份。最后用组织剪刀剪成0.5-1m3大小的组织块，离心1500rpm,5min,弃去上清，得到待使用的组织块8ml，备用。
2、通过实施例1/2/3，比较以下3个实施方案的优劣：
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
实施方案1：
酶消化法和贴壁法组合分离脐带间充质干细胞，也是本发明的方法，具体步骤如下：
(1) 培养瓶包被：在脐带采集前一天做包被好1个75cm2NUNC培养瓶的，具体包被方法如下：分别将纤连蛋白25ug、层粘连蛋白25ug、明胶50ug溶于5ml干细胞培养基后，然后加入到底面积为75cm2的培养瓶中，最终配置纤连蛋白、层粘连蛋白和明胶浓度分别为5ug/ml、5ug/ml 、10ug/ml。然后摇匀，盖紧盖子放在4℃冰箱中过夜。
(2) 混合酶消化：把10ml移液管前端掰断，取待使用的组织2ml于15ml离心管中，加入相应体积的0.2%的透明质酸酶和0.4%的II型胶原酶混合消化液2ml，充分摇匀放到37℃的二氧化碳培养箱中，消化30分钟。然后取出用2倍体积的PBS洗涤离心1500rpm,5min，最后一遍用1倍体积的干细胞培养基洗涤一遍，离心1500rpm,5min，就得到要组织贴壁的组织块。
(3)组织块贴壁培养：取包4℃包被过夜的培养瓶，吸掉包被液，然后用10ml新的干细胞培养液，混匀以上待贴壁的组织块，全部转移至包被的培养瓶中，充分分散组织块，然后放进37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养，每天观察，第2天组织贴壁严实，3天时有细胞爬出，第6天细胞长满80%以上，酶消化贴壁细胞进行后续的传代培养。
实施案例2：
单纯组织贴壁法分离脐带间充质干细胞，具体步骤如下：
1) 组织块贴壁培养：取以上待使用的组织块，用10ml前端掰断的移液管，吸取2ml组织块于一个没有包被的75cm2NUNC培养瓶中，用10ml干细胞培养基充分分散组织块，然后放入37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养。
2)结果观察：每天观察培养瓶组织块及细胞爬出情况，发现在第1天时，基本上没有贴壁组织块，第5天时才只有50%-70%的组织块贴壁严实，还有大量的组织漂浮，并在第5天时10ml全量换液，换液过程中导致少许贴壁的组织漂浮。在第9天时候有少量组织块周边有细胞爬出、并于第10天进行5ml半量换液。第13天时只有6块组织有细胞爬出，并长满80%左右，然后酶消化贴壁细胞进行后续的传代培养。
实施案例3
单纯酶解法分离脐带间充质干细胞，具体步骤如下：
(1)混合酶消化：把10ml移液管前端掰断，取待使用的组织2ml于15ml离心管中，加入相应体积的0.2%的透明质酸酶和0.4%的II型胶原酶混合消化液2ml，充分摇匀放到37℃的二氧化碳培养箱中，消化直到组织块出现绒绒状，然后用80目的筛网过滤，滤液然后用5倍体积的干细胞培养基洗涤、离心1500rpm,5min，最后一遍用5ml的干细胞培养基洗涤一遍，离心机离心、1500rpm,5min。
(2)细胞培养：底部细胞用10ml新的干细胞培养液重悬，移液管吹打混匀，然后全部转移至一个没有包被的75cm2NUNC培养瓶中，然后放进37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养，每天观察，第2天时有细胞贴壁细胞，并10ml全量换液，第6天时长满80%以上，酶消化贴壁细胞进行后续的传代培养。
本实施例的有益效果是：
本发明的实施案例1中：1-2天脐带组织贴壁严实，只有少量小的组织块出现漂浮，3-5天就有细胞爬出，6-8天细胞长满80%以上。具体如下：
Figure 214153DEST_PATH_IMAGE004

Claims (5)

1.一种脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，脐带组织块先用相关酶进行预消化，然后将消化后的组织块平铺于提前包被过的细胞培养瓶中，最后进行组织贴壁培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养瓶包被的方法和浓度为：纤连蛋白、层粘连蛋白和明胶浓度分别为5ug/ml、5ug/ml 、10ug/ml。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包被时间为 4℃过夜。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：相关酶采用0.2%的透明质酸酶和0.4%的II型胶原酶；脐带组织块为0.5-1mm3大小新鲜组织；消化方法为37℃温度条件下消化30min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，组织块贴壁培养步骤为：消化后的组织块用干细胞培养基进行终止消化，取2次洗涤离心后的组织块3ml于一个75cm2培养瓶中，添加10ml干细胞培养基混匀组织，于37℃、5%的二氧化碳培养箱中静置培养。每天观察组织块周边细胞爬出情况，当整个培养瓶长满80%以上时，进行后续传代培养。
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