CN107041894A - 一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液制备方法 - Google Patents

一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液制备方法，该方法包括如下步骤：将获取的脐带组织清洗后剪碎成1mm3脐带组织块；用Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液和胰蛋白酶对脐带组织块进行消化处理，离心后加入DMEM培养液重悬；将间充质干细胞培养液接种于培养皿中进行原代培养，当细胞密度达到80％后进行传代培养；将传代培养后的脐带间充质干细胞与二甲基氨基乙醇及黄芪混合后制备细胞制剂。本发明通过将脐带间充质干细胞体外分离培养，并将培养的干细胞与二甲基氨基乙醇和黄芪混合后制备细胞制剂，脐带间充质干细胞相具有无肿瘤污染、增殖能力强、采集方便、免疫活性低、无需配型等许多优点，所制备的细胞制剂具有延缓衰老的功效。

Description

一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液制备方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液的制备方法。
背景技术
衰老是指随年龄增长机体发生的功能性和器质性衰退的渐进过程。衰老一方面受机体的基因程序调控，另一方面由内外“磨损”和“消耗”所引起，二者同时作用于细胞和分子水平。皮肤位于体表，是最早显现机体衰老的组织，易于观察，已成为衰老的重要靶器官。
由于皮肤是直接与外界环境接触并长期受到不同外界因素的作用，皮肤与身体的其他器官不同，它不仅随着自然的老化其生物功能发生一系列的变化，而且，老年皮肤生物功能的改变与其他器官不同之处在于，其变化主要体现在生物和物理两方面特性的变化，与青年状态的皮肤相比，老年性皮肤的共振传导速度加快、pH值升高、弹性下降、皮脂分泌明显减少、角质层含水量减少以及表皮通透屏障功能降低。
间充质干细胞是来源于中胚层的一种多能干细胞，最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和免疫调控等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下可分化为多种组织细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液的制备方法，脐带间充质干细胞相具有无肿瘤污染、增殖能力强、采集方便、免疫活性低、无需配型等许多优点，所制备的细胞制剂具有延缓衰老的功效。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液制备方法，该方法包括如下步骤：
S1、将获取的脐带组织清洗后剪碎成1mm3脐带组织块；
S2、用Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液和胰蛋白酶对脐带组织块进行消化处理，离心后加入DMEM培养液重悬；
S3、将间充质干细胞培养液接种于培养皿中进行原代培养，当细胞密度达到80％后进行传代培养；
S4、将传代培养后的脐带间充质干细胞与二甲基氨基乙醇及黄芪混合后制备细胞制剂。
进一步地，S1中所述脐带组织的清洗步骤为：将获取的脐带组织块用含有双抗的磷酸缓冲溶液清洗2-3次后，剪碎成为1-1.5mm3的脐带组织块，所述含有双抗的磷酸缓冲溶液中青霉素浓度为100u/mL，链霉素浓度为100u/mL。
进一步地，S2中所述消化处理的步骤为：将S1中得到的脐带组织块加入Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液中，置于37℃培养箱中消化60-80min，取出脐带组织块用磷酸缓冲溶液清洗2-3次后加入1.25g/L胰蛋白酶溶液中，置于37℃培养箱中消化20min，取出后加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化。
进一步地，所述Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液为2.4mg/mLⅠ型胶原酶和1mg/mL透明质酸酶以体积比1：1混合。
进一步地，S2中离心后重悬的步骤为：取消化后的脐带组织块用200目细胞滤网过滤后，收集滤液于1000-1500r/min离心10min后弃去上清液，收集沉淀加入DMEM培养液制成间充质干细胞悬液。
进一步地，所述DMEM培养液中含有体积分数10％的胎牛血清，100u/mL青霉素和100u/mL链霉素。
进一步地，S3中所述原代培养及传代培养的步骤为：将S2中得到的间充质干细胞悬液接种于无菌培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，培养24h后第一次换液并去除贴壁细胞，之后每隔2d换液一次，当细胞密度达到80％后以1：2比例进行传代培养。
进一步地，S4中所述制备细胞制剂的步骤为：将S3中传代培养的脐带间充质干细胞与生理盐水混合后加入二甲基氨基乙醇和黄芪制备细胞制剂，其中，脐带间充质干细胞的浓度为1x105个/mL，二甲基氨基乙醇浓度为0.2％-0.3％，黄芪浓度0.15％-0.2％。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过将脐带间充质干细胞体外分离培养，并将培养的干细胞与二甲基氨基乙醇和黄芪混合后制备细胞制剂，脐带间充质干细胞相具有无肿瘤污染、增殖能力强、采集方便、免疫活性低、无需配型等许多优点，并且脐带作为医疗废弃物，对供者无不利影响，不受伦理问题的限制，所制备的细胞制剂具有延缓衰老的功效。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液的制备方法，该方法具体步骤如下：
实施例1
S1、将获取的脐带组织清洗后剪碎成1mm3脐带组织块；
具体的，将获取的脐带组织块用含有双抗的磷酸缓冲溶液清洗2次后，剪碎成为1mm3的脐带组织块，所述含有双抗的磷酸缓冲溶液中青霉素浓度为100u/mL，链霉素浓度为100u/mL；
S2、用Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液和胰蛋白酶对脐带组织块进行消化处理，离心后加入DMEM培养液重悬；
具体的，将S1中得到的脐带组织块加入Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液中，置于37℃培养箱中消化60min，取出脐带组织块用磷酸缓冲溶液清洗2次后加入1.25g/L胰蛋白酶溶液中，置于37℃培养箱中消化20min，取出后加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化；
其中，所述Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液为2.4mg/mLⅠ型胶原酶和1mg/mL透明质酸酶以体积比1：1混合；
取消化后的脐带组织块用200目细胞滤网过滤后，收集滤液于1000r/min离心10min后弃去上清液，收集沉淀加入DMEM培养液制成间充质干细胞悬液；
具体的，所述DMEM培养液中含有体积分数10％的胎牛血清，100u/mL青霉素和100u/mL链霉素；
S3、将间充质干细胞培养液接种于培养皿中进行原代培养，当细胞密度达到80％后进行传代培养；
具体的，将S2中得到的间充质干细胞悬液接种于无菌培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，培养24h后第一次换液并去除贴壁细胞，之后每隔2d换液一次，当细胞密度达到80％后以1：2比例进行传代培养；
S4、将传代培养后的脐带间充质干细胞与二甲基氨基乙醇及黄芪混合后制备细胞制剂；
具体的，将S3中传代培养的脐带间充质干细胞与生理盐水混合后加入二甲基氨基乙醇和黄芪制备细胞制剂，其中，脐带间充质干细胞的浓度为1x105个/mL，二甲基氨基乙醇浓度为0.2％，黄芪浓度0.15％。
实施例2
S1、将获取的脐带组织清洗后剪碎成1mm3脐带组织块；
具体的，将获取的脐带组织块用含有双抗的磷酸缓冲溶液清洗3次后，剪碎成为1.5mm3的脐带组织块，所述含有双抗的磷酸缓冲溶液中青霉素浓度为100u/mL，链霉素浓度为100u/mL；
S2、用Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液和胰蛋白酶对脐带组织块进行消化处理，离心后加入DMEM培养液重悬；
具体的，将S1中得到的脐带组织块加入Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液中，置于37℃培养箱中消化80min，取出脐带组织块用磷酸缓冲溶液清洗3次后加入1.25g/L胰蛋白酶溶液中，置于37℃培养箱中消化20min，取出后加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化；
其中，所述Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液为2.4mg/mL Ⅰ型胶原酶和1mg/mL透明质酸酶以体积比1：1混合；
取消化后的脐带组织块用200目细胞滤网过滤后，收集滤液于1500r/min离心10min后弃去上清液，收集沉淀加入DMEM培养液制成间充质干细胞悬液；
具体的，所述DMEM培养液中含有体积分数10％的胎牛血清，100u/mL青霉素和100u/mL链霉素；
S3、将间充质干细胞培养液接种于培养皿中进行原代培养，当细胞密度达到80％后进行传代培养；
具体的，将S2中得到的间充质干细胞悬液接种于无菌培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，培养24h后第一次换液并去除贴壁细胞，之后每隔2d换液一次，当细胞密度达到80％后以1：2比例进行传代培养；
S4、将传代培养后的脐带间充质干细胞与二甲基氨基乙醇及黄芪混合后制备细胞制剂；
具体的，将S3中传代培养的脐带间充质干细胞与生理盐水混合后加入二甲基氨基乙醇和黄芪制备细胞制剂，其中，脐带间充质干细胞的浓度为1x105个/mL，二甲基氨基乙醇浓度为0.3％，黄芪浓度0.2％。
实施例3
S1、将获取的脐带组织清洗后剪碎成1mm3脐带组织块；
具体的，将获取的脐带组织块用含有双抗的磷酸缓冲溶液清洗2-3次后，剪碎成为1.25mm3的脐带组织块，所述含有双抗的磷酸缓冲溶液中青霉素浓度为100u/mL，链霉素浓度为100u/mL；
S2、用Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液和胰蛋白酶对脐带组织块进行消化处理，离心后加入DMEM培养液重悬；
具体的，将S1中得到的脐带组织块加入Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液中，置于37℃培养箱中消化70min，取出脐带组织块用磷酸缓冲溶液清洗2次后加入1.25g/L胰蛋白酶溶液中，置于37℃培养箱中消化20min，取出后加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化；
其中，所述Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液为2.4mg/mL Ⅰ型胶原酶和1mg/mL透明质酸酶以体积比1：1混合；
取消化后的脐带组织块用200目细胞滤网过滤后，收集滤液于1200r/min 离心10min后弃去上清液，收集沉淀加入DMEM培养液制成间充质干细胞悬液；
具体的，所述DMEM培养液中含有体积分数10％的胎牛血清，100u/mL青霉素和100u/mL链霉素；
S3、将间充质干细胞培养液接种于培养皿中进行原代培养，当细胞密度达到80％后进行传代培养；
具体的，将S2中得到的间充质干细胞悬液接种于无菌培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，培养24h后第一次换液并去除贴壁细胞，之后每隔2d换液一次，当细胞密度达到80％后以1：2比例进行传代培养；
S4、将传代培养后的脐带间充质干细胞与二甲基氨基乙醇及黄芪混合后制备细胞制剂；
具体的，将S3中传代培养的脐带间充质干细胞与生理盐水混合后加入二甲基氨基乙醇和黄芪制备细胞制剂，其中，脐带间充质干细胞的浓度为1x105个/mL，二甲基氨基乙醇浓度为0.25％，黄芪浓度0.18％。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、将获取的脐带组织清洗后剪碎成1mm3脐带组织块；
S2、用Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液和胰蛋白酶对脐带组织块进行消化处理，离心后加入DMEM培养液重悬；
S3、将间充质干细胞培养液接种于培养皿中进行原代培养，当细胞密度达到80％后进行传代培养；
S4、将传代培养后的脐带间充质干细胞与二甲基氨基乙醇及黄芪混合后制备细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液的制备方法，其特征在于：S1中所述脐带组织的清洗步骤为：将获取的脐带组织块用含有双抗的磷酸缓冲溶液清洗2-3次后，剪碎成为1-1.5mm3的脐带组织块，所述含有双抗的磷酸缓冲溶液中青霉素浓度为100u/mL，链霉素浓度为100u/mL。
3.根据权利要求1所述的一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液的制备方法，其特征在于：S2中所述消化处理的步骤为，将S1中得到的脐带组织块加入Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液中，置于37℃培养箱中消化60-80min，取出脐带组织块用磷酸缓冲溶液清洗2-3次后加入1.25g/L胰蛋白酶溶液中，置于37℃培养箱中消化20min，取出后加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化。
4.根据权利要求1或3所述的一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液的制备方法，其特征在于：所述Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶混合溶液为2.4mg/mLⅠ型胶原酶和1mg/mL透明质酸酶以体积比1：1混合。
5.根据权利要求1所述的一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液的制备方法，其特征在于：S2中离心后重悬的步骤为，取消化后的脐带组织块用200目细胞滤网过滤后，收集滤液于1000-1500r/min离心10min后弃去上清液，收集沉淀加入DMEM培养液制成间充质干细胞悬液。
6.根据权利要求1或5所述的一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液的制备方法，其特征在于：所述DMEM培养液中含有体积分数10％的胎牛血清，100u/mL青霉素和100u/mL链霉素。
7.根据权利要求1所述的一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液的制备方法，其特征在于：S3中所述原代培养及传代培养的步骤为，将S2中得到的间充质干细胞悬液接种于无菌培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，培养24h后第一次换液并去除贴壁细胞，之后每隔2d换液一次，当细胞密度达到80％后以1：2比例进行传代培养。
8.根据权利要求1所述的一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液的制备方法，其特征在于：S4中所述制备细胞制剂的步骤为，将S3中传代培养的脐带间充质干细胞与生理盐水混合后加入二甲基氨基乙醇和黄芪制备细胞制剂，其中，脐带间充质干细胞的浓度为1x105个/mL，二甲基氨基乙醇浓度为0.2％-0.3％，黄芪浓度0.15％-0.2％。
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