CN1735685A - 用未分化的间充质细胞治疗组织 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了矫正受试者的皮肤、软组织和骨中化妆、审美和退变缺陷的组合物和方法。具体地，本发明的方法包括向与缺陷相邻或者亚相邻或者在缺陷部位的组织(例如，皮下组织)注射或者植入自体的UMC、成纤维细胞和/或角质细胞。如本文中提供的注射的细胞与受试者组织相容(例如，自体的)并且已经通过在细胞培养系统中传代而扩增。

Description

用未分化的间充质细胞治疗组织
技术领域
本发明涉及含有未分化的间充质细胞的组合物和用自体的未分化的间充质细胞治疗牙缺陷、皮肤和软组织缺陷，和骨缺陷的方法。
背景
诸如伤口、疾病和衰老的因素可以导致皮肤、骨、软组织和牙组织的缺陷。已经设计了方法用于修复和/或增大受到这些条件影响的组织，但是避免瘢痕形成和加强组织生长的改进方法将是有用的。
这里完整引用美国专利号5,591,444、5,660,850、5,665,372、和5,858,390和共同待决的美国申请序号09/678,047作为参考。
概述
本发明提供了矫正受试者的皮肤、软组织和骨中化妆、审美和退变缺陷的组合物和方法。具体地，本发明的方法包括向与缺陷相邻或者亚相邻或者在缺陷部位的组织(例如，皮内组织)注射或者植入自体的、未分化的间充质细胞(UMC)、成纤维细胞和/或角质细胞。通过该方法可以矫正的缺陷包括，例如，皱纹(rhytids)、妊娠纹、凹陷型疤痕、非创伤起源的皮肤凹陷、寻常痤疮导致的疤痕、唇发育不全、牙周缺陷、软组织缺陷，如腭咽功能不全和皮下萎缩，骨缺陷和烧伤。如此处提供的所注射的细胞与受试者是组织相容的并且通过在细胞培养系统中经传代而扩大。所注射的细胞优选为自体细胞。本发明的特征还在于产生包括UMC的细胞群体的体外方法。
在一个实施方案中，该组合物可以包括经传代的自体UMC和经传代的自体成纤维细胞。这些细胞可以源于，例如，从受试者采集的一种或多种活组织检查样品。在另一实施方案中，该组合物可以包括经传代的自体UMC与生物可降解的非细胞基质，与或者不与经传代的自体成纤维细胞。在再一个实施方案中，该组合物可以包括经传代的自体UMC与生物可降解的非细胞填充剂，与或者不与经传代的自体成纤维细胞。其他实施方案包含经传代的自体角质细胞和经传代的自体成纤维细胞，与或者不与基质或者填充剂。
本发明还提供了使得经传代的自体UMC、成纤维细胞和角质细胞基本上无培养基中存在的免疫原性蛋白质(即，培养基血清-来源的蛋白质)，从而该细胞可用于矫正受试者中的缺陷而不刺激免疫应答的方法。本发明包括将扩大的UMC、成纤维细胞、角质细胞，或者含有一种或多种这些细胞群体的生物可降解的非细胞基质在无血清的培养基中孵育一段时间，随后在含有血清(例如，胎牛血清(FBS))的培养基中培养。在另一实施方案中，仅在无血清的培养基或者含有自体血清的培养基中培养细胞或者含有细胞的生物可降解的非细胞基质。
本发明部分基于发现自体细胞是用于增大组织的理想材料，所述组织为诸如缺陷处或者附近(例如，亚相邻)部位的真皮、皮下组织和骨。本发明还基于认识到通过在治疗缺陷前培养取自受试者的活组织检查样品可以大量提供自体细胞。本发明还基于认识到自体细胞在含有异种血清的组织培养基中扩大后，自体细胞含有来自该异种血清来源的大量免疫原性蛋白质，但是可以在注射到受试者之前除去所述免疫原性蛋白质。
一方面，本发明特征在于制备用于修复组织的细胞组合物的方法，该方法包括：(a)提供含有未经分化的间充质细胞(UMC)的活组织检查样品的组织以得到起始细胞；(b)从所述活组织检查样品分离起始细胞；(c)培养所述起始细胞；和(d)从培养物收获非贴壁衍生细胞群体，该非贴壁衍生细胞含有UMC。该方法可以还包括利用来自前面轮收获的非贴壁衍生细胞群体作为起始细胞进行一或多轮(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95、100、或更多轮)包括重复步骤(c)和(d)的衍生。衍生的一或多个额外轮可以包括，例如，1到20轮。含有UMC的组织可以选自：皮肤组织、脂肪组织、结缔组织、筋膜、固有层和骨髓。该方法可以还包括在酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)的存在下培养所述非贴壁细胞。
一方面，本发明的特征在于用于修复组织的组合物。该组合物可以含有自体的、经传代的UMC，并且可以基本上无培养基血清-来源的蛋白质。该组合物可以还含有自体、经传代的成纤维细胞、该自体成纤维细胞可以来自受试者的牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、骨髓、筋膜、或者脂肪组织。UMC或者成纤维细胞可以用活化化合物处理，该活化化合物为例如，抗坏血酸棕榈酸酯、亚油酸、C-MED100(Optigene-X LLC，Shrewsbury，NJ)、奎尼酸、奎尼酸盐、奎宁内酯、辅酶Q-10、L-羟酸、L-硫辛酸、磷酸二氢钙、三磷酸钙、烟酸、脱氢表雄甾酮(DHEA)、二甲基氨基乙醇(DMAE)、α-生育酚、骨形态发生蛋白质(BMP)、维生素E、维生素C、类胡萝卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉碱、丙炔苯丙胺、番茄红素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、半胱氨酸、前半胱氨酸(procysteine)、pikamilon、长春西汀、视黄酸、抗癌肽类，或者其他刺激性添加剂，如生长因子[例如，人生长激素、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、类胰岛素生长因子-I(IGF-I)、胰岛素和长型R3IGF-1]。UMC或者成纤维细胞在施用于受试者前也可以暴露于低能量激光。该组合物可以还含有生物可降解的非细胞基质，其中UMC和/或成纤维细胞可以整合到基质内或者上。该基质在与UMC和/或成纤维细胞组合前可以含有一种或多种物质，所述物质选自胶原(例如，牛胶原、猪胶原、人胶原、工程化胶原，或者与戊二醛交联的胶原和糖胺聚糖)、糖胺聚糖、明胶、聚乙醇酸、肠线、脱矿质骨、羟基磷灰石、透明质、透明质酸、珊瑚和无机骨。在基质上或者基质内可以整合足够的UMC和/或成纤维细胞以基本上充满细胞可以利用的基质上或者基质内的空间。该组合物可以还或者备选地含有生物可降解的非细胞可注射填充剂。该可降解的非细胞可注射填充剂在与UMC和/或成纤维细胞组合前可以包括一种或多种物质，所述物质选自：(a)自体胶原纤维的可注射的分散剂；(b)胶原(例如，牛胶原、重构的与戊二醛交联的牛胶原纤维，或者自体胶原)；(c)经溶解的明胶；(d)经溶解的聚乙醇酸；(e)经溶解的肠线；(f)分散在氯化钠溶液和受试者的血浆等分试样中的猪明胶粉和氨基己酸；和(g)透明质酸。
另一方面，本发明的特征在于制备用于修复的，由于受试者中疾病、失调或者缺陷导致该受试者中退变组织的组合物。该方法包括：(a)提供来自该受试者的含有UMC的组织的活组织检查样品；(b)从该活组织检查样品分离自体UMC；(c)在产生基本上没有培养基血清来源的蛋白质的自体UMC的条件下培养该自体UMC；和(d)将经培养的自体UMC暴露于导致UMC悬浮的条件。该含有UMC的组织可以选自：牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。该UMC的培养可以包括：(1)在含有0.1％到约20％人或者非人血清的培养基中孵育，然后(2)在无血清的培养基中孵育。备选地，UMC的培养可以仅在无血清的培养基中。导致UMC悬浮的条件可以包括使用蛋白水解酶，例如，胰蛋白酶。备选地，蛋白水解酶包括分散酶和胶原酶。导致UMC悬浮的条件可以额外或者备选地包括使用EDTA。该方法可以还包括：(e)提供来自受试者的含有成纤维细胞的组织的活组织检查样品；(f)从该活组织检查样品分离自体成纤维细胞；(g)在产生基本上没有培养基血清来源的蛋白质的成纤维细胞的条件下培养该自体成纤维细胞；(h)将经培养的自体成纤维细胞暴露于导致成纤维细胞悬浮的条件；和(i)将UMC悬浮液与成纤维细胞悬浮液混合。含有自体成纤维细胞的组织可以选自牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。成纤维细胞的培养可以包括：(1)在含有0.1％到约20％人或者非人血清的培养基中孵育，然后(2)在无血清的培养基中孵育。备选地，成纤维细胞的培养可以仅在无血清的培养基中。导致成纤维细胞悬浮的条件可以包括使用蛋白水解酶，例如，胰蛋白酶。备选地，蛋白水解酶包括分散酶和胶原酶。导致UMC的悬浮的条件可以还额外或者备选地包括使用EDTA。在组合前，UMC或者成纤维细胞可以暴露于活化化合物，该活化化合物为例如，抗坏血酸棕榈酸酯、亚油酸、C-MED100、奎尼酸、奎尼酸盐、奎宁内酯、辅酶Q-10、L-羟酸、L-硫辛酸、磷酸二氢钙、三磷酸钙、烟酸、DHEA、DMAE、α-生育酚、BMP、维生素E、维生素C、类胡萝卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉碱、丙炔苯丙胺、番茄红素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、长春西汀、视黄酸、抗癌肽类，或者其他刺激性添加剂，如生长因子[例如，人生长激素、FGF、VEGF、IGF-I、胰岛素和长型R3IGF-1]。UMC或者成纤维细胞可暴露于低能量激光。
另一方面，本发明的特征在于制备用于修复组织的组合物，由于受试者中疾病、失调或者缺陷导致该受试者中所述组织已经退变。该方法可以包括：(a)提供自体的经传代的UMC；(b)提供生物可降解的非细胞基质；和(c)将UMC与生物可降解的非细胞基质孵育从而UMC整合在该生物可降解的非细胞基质上或者内部，其中该孵育导致用于修复组织的组合物，并且其中孵育条件为使得该组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质。提供自体的、经传代的UMC的悬浮液的步骤可以包括：(a)提供来自该受试者的含有UMC的组织的活组织检查样品；(b)从该活组织检查样品分离自体UMC；(c)培养该UMC；和(d)将经培养的UMC暴露于导致UMC悬浮的条件。该含有UMC的组织可以选自：牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。该生物可降解的非细胞基质在与UMC悬浮液组合前可以含有一种或多种物质，所述物质选自胶原(例如，与戊二醛交联的胶原和糖胺聚糖、牛胶原、或者猪胶原)、糖胺聚糖、明胶、聚乙醇酸、肠线、脱矿质骨、羟基磷灰石、珊瑚和无机骨。培养条件可以包括：(1)在含有0.1％到约20％人或者非人血清的培养基中培养，然后(2)在无血清的培养基中培养。备选地，培养可以仅在无血清的培养基中。在该生物可降解的非细胞基质上或者里面可以整合足够的UMC以基本上充满细胞可以利用的该生物可降解的非细胞基质上或者里面的空间。
该方法可以还包括提供自体的、经传代的成纤维细胞，将该成纤维细胞与生物可降解的基质孵育从而该成纤维细胞整合到该生物可降解的非细胞基质上或者内部，其中该孵育导致用于修复组织的组合物，并且其中孵育条件为使得该组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质。提供自体的、经传代的成纤维细胞的悬浮液的步骤可以包括：(a)提供来自该受试者的含有成纤维细胞的组织的活组织检查样品；(b)从该活组织检查样品分离自体成纤维细胞；(c)培养该成纤维细胞；和(d)悬浮该成纤维细胞。该含有成纤维细胞的组织可以选自：牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。在该生物可降解的非细胞基质上或者里面可以整合足够的UMC和成纤维细胞以基本上充满细胞可以利用的该生物可降解的非细胞基质上或者里面的空间。在与该生物可降解的非细胞基质孵育前，UMC和/或者成纤维细胞可以暴露于活化化合物，该活化化合物为例如，抗坏血酸棕榈酸酯、亚油酸、C-MED100、奎尼酸、奎尼酸盐、奎宁内酯、辅酶Q-10、L-羟酸、L-硫辛酸、磷酸二氢钙、三磷酸钙、烟酸、DHEA、DMAE、α-生育酚、BMP、维生素E、维生素C、类胡萝卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉碱、丙炔苯丙胺、番茄红素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、长春西汀、视黄酸、抗癌肽类，或者其他刺激性添加剂，如生长因子[例如，人生长激素、FGF、VEGF、IGF-I、胰岛素和长形式R3IGF-1]。UMC或者成纤维细胞可暴露于低能量激光。UMC和成纤维细胞可以一起与该生物可降解的非细胞基质孵育，或者UMC和成纤维细胞可以分别加入该生物可降解的非细胞基质。
另一方面，本发明的特征在于制备用于修复组织的组合物，由于受试者中疾病、失调或者缺陷导致该受试者中所述组织已经退变。该方法可以包括：(a)提供自体的、经传代的UMC，其中该UMC基本上无培养基血清来源的蛋白质；(b)提供生物可降解的非细胞填充剂；和(c)将该自体的、经传代的UMC与该生物可降解的非细胞填充剂组合。提供自体的、经传代的UMC的悬浮液的步骤可以包括：(a)提供来自该受试者的含有UMC的组织的活组织检查样品；(b)从该活组织检查样品分离自体UMC；(c)在产生基本上没有培养基血清来源的蛋白质的自体UMC的条件下培养该自体UMC；和(d)将经培养的UMC暴露于导致UMC悬浮的条件。该含有UMC的组织可以选自：牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。该UMC的培养可以包括：(1)在含有0.1％到约20％人或者非人血清的培养基中孵育，然后(2)在无血清的培养基中孵育。备选地，UMC的培养可以仅在无血清的培养基中。导致UMC悬浮的条件可以包括使用蛋白水解酶，例如，胰蛋白酶。备选地，蛋白水解酶包括分散酶和胶原酶。导致UMC悬浮的条件可以额外或者备选地包括使用EDTA。所述生物可降解的非细胞填充剂在与UMC组合前可以含有一种或多种物质，该物质选自：(a)自体胶原纤维的可注射的分散剂；(b)胶原(例如，牛胶原、重构的与戊二醛交联的牛胶原纤维，或者自体胶原)；(c)经溶解的明胶；(d)经溶解的聚乙醇酸；(e)经溶解的肠线；(f)分散在氯化钠溶液和受试者的血浆等分试样中的猪明胶粉和氨基己酸；和(g)透明质酸。
该方法还包括提供自体的、经传代的成纤维细胞，其中该自体的、经传代的成纤维细胞基本上无培养基血清来源的蛋白质，和将该自体的、经传代的成纤维细胞与该生物可降解的非细胞填充剂组合。提供自体的、经传代的成纤维细胞的悬浮液的步骤可以包括：(a)提供来自该受试者的含有成纤维细胞的组织的活组织检查样品；(b)从该活组织检查样品分离自体成纤维细胞；(c)在产生基本上没有培养基血清来源的蛋白质的自体成纤维细胞的条件下培养该自体成纤维细胞；和(d)将经培养的自体成纤维细胞暴露于导致成纤维细胞悬浮的条件。该含有成纤维细胞的组织可以选自：牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。该成纤维细胞的培养可以包括：(1)在含有0.1％到约20％人或者非人血清的培养基中孵育，然后(2)在无血清的培养基中孵育。备选地，成纤维细胞的培养可以仅在无血清的培养基中。导致成纤维细胞悬浮的条件可以包括将该成纤维细胞与蛋白水解酶，例如，胰蛋白酶接触。备选地，蛋白水解酶包括分散酶和胶原酶。导致成纤维细胞悬浮的条件可以额外或者备选地包括使用EDTA。在与UMC和生物可降解的非细胞填充剂组合前，UMC或者成纤维细胞可以暴露于活化化合物，该活化化合物为例如，抗坏血酸棕榈酸酯、亚油酸、C-MED100、奎尼酸、奎尼酸盐、奎宁内酯、辅酶Q-10、L-羟酸、L-硫辛酸、磷酸二氢钙、三磷酸钙、烟酸、DHEA、DMAE、α-生育酚、BMP、维生素E、维生素C、类胡萝卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉碱、丙炔苯丙胺、番茄红素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、长春西汀、视黄酸、抗癌肽类，或者其他刺激性添加剂，如生长因子[例如，人生长激素、FGF、VEGF、IGF-I、胰岛素和长形式R3IGF-1]。UMC或者成纤维细胞可暴露于低能量激光。
再一方面，本发明提供了修复受试者中组织的方法。该方法可以包括：(a)提供含有自体的、经传代的UMC的组合物，其中该组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质；(b)鉴定受试者中组织缺陷或者组织退变的部位；和(c)将该组合物置于该部位从而组织缺陷或者退变得到修复。该组织缺陷或者组织退变可以包括软组织缺陷、口腔粘膜缺陷、口腔粘膜创伤、牙周病、骨缺陷、糖尿病、皮肤溃疡、静脉停滞，或者皮肤的美容缺陷。软组织缺陷可以选自面部凹陷、乳腺发育不全、乳腺缺乏、乳腺重建、声带缺陷、腭咽功能不全、Poland氏综合征、雄性生殖器(例如，阴茎)发育不全、唇发育不全，和皮下萎缩或者肌肉萎缩。口腔粘膜的创伤可以是牙拔除导致的拔除牙槽。牙周病可以包括牙周退变、牙龈炎，或者腭粘膜或者齿龈粘膜的非愈合伤口。骨缺陷可以选自半面矮小症、骨的创伤后非愈合、眼球陷没、Romberg氏病、颅钻孔缺陷、头骨损失、钝器创伤导致的缺陷、和关节炎导致的缺陷。美容缺陷可以选自：皱纹、凹陷型疤痕、非创伤起源的皮肤凹陷、笑纹、妊娠纹、皱纹、创伤疤痕、痤疮疤痕、和皮下萎缩。组织缺陷可以是唇发育不全或者或者唇皱褶。自体UMC可以来自受试者的牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、或脂肪组织。该组合物可以还含有生物可降解的基质，其中UMC整合在该基质的内部或者上面。该组合物可以还含有生物可降解的非细胞填充剂。该组合物可以还含有自体的、经传代的成纤维细胞。
另一方面，本发明提供了修复受试者中组织的方法。该方法可以包括：(a)提供含有自体的、经传代的UMC和自体的、经传代的成纤维细胞的组合物，其中该组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质；(b)鉴定受试者中组织缺陷或者组织退变的部位；和(c)将该组合物置于该部位从而组织缺陷或者退变得到修复。
另一方面，本发明提供了修复受试者中组织缺陷的方法。该方法可以包括：(a)提供含有：(1)自体的、经传代的UMC，(2)自体的、经传代的成纤维细胞，和(3)药学上可接受的载体的药物组合物；其中该药物组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质；(b)鉴定受试者中组织缺陷或者组织退变的部位，所述缺陷或者退变选自：牙或者牙周缺陷、皮肤的美容缺陷，和骨缺陷；和(c)将治疗有效量的该药物组合物注射到该组织缺陷或者退变的部位，其中该注射导致所述组织缺陷或者退变的修复。该含有UMC和成纤维细胞的组织可以选自：牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。该UMC或者成纤维细胞可以已经：(1)在含有0.1％到约20％人或者非人血清的培养基中培养，然后(2)在无血清的培养基中培养。该UMC或者成纤维细胞可以已经在无血清的培养基中培养。
另一方面，本发明的特征在于修复受试者中退变的组织的方法，该退变的组织是由于该受试者中疾病、失调或者缺陷导致。该方法可以包括将组合物置于受试者中退变部位上，从而所述组织得到修复。该组合物可以含有(1)自体的、经传代的UMC，(2)自体的、经传代的成纤维细胞，和(3)生物可降解的基质，其中该UMC或者成纤维细胞整合到该基质内或者上面，并且其中该药物组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质。
本发明的特征还在于修复由于受试者中疾病、失调，或者缺陷导致的该受试者中已经退变的组织的方法。该方法可以包括将含有(1)基本上无培养基血清来源的蛋白质的自体的、经传代的UMC和(2)生物可降解的非细胞填充剂的组合物注射到该受试者中退变部位从而该组织得到修复。该组合物还可以含有自体的、经传代的成纤维细胞。
另一方面，本发明的特征还在于修复由于受试者中疾病、失调，或者缺陷导致的该受试者中已经退变的组织的方法。该方法可以包括步骤：(a)将自体的、经传代的UMC注射到受试者中组织退变部位，其中UMC基本上无培养基血清来源的蛋白质；(b)将自体的、经传代的成纤维细胞注射到组织缺陷或者所希望的组织增大的部位，其中该成纤维细胞基本上无培养基血清来源的蛋白质；和(c)将生物可降解的非细胞填充剂注射到该部位。所述疾病、失调或者缺陷可以是选自：牙或者牙周缺陷、皮肤的美容缺陷、和骨缺陷的缺陷。该自体UMC和成纤维细胞可以来自受试者的牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、或脂肪组织。UMC和成纤维细胞可以同时注射。UMC和成纤维细胞、和生物可降解的填充剂可以同时注射。UMC和成纤维细胞可以单独注射。UMC和成纤维细胞可以与生物可降解的填充剂分开注射。UMC和成纤维细胞注射到受试者和生物可降解的填充剂注射到受试者之间的时间间隔可以为约两周。
另一方面，本发明的特征在于修复受试者中烧伤伤口的方法。该方法可以包括提供自体的、经传代的角质细胞和自体的、经传代的成纤维细胞的悬浮液并将该悬浮液注射到被烧伤的伤口中。提供自体的、经传代的角质细胞和自体的、经传代的成纤维细胞的悬浮液可以包括：(a)提供来自该受试者的含有角质细胞的组织的活组织检查样品；(b)从该活组织检查样品分离自体角质细胞；(c)在产生基本上没有培养基血清来源的蛋白质的自体角质细胞的条件下培养该自体角质细胞；和(d)将角质细胞暴露于导致角质细胞悬浮的条件；(e)提供来自该受试者的含有成纤维细胞的组织的活组织检查样品；(f)从该活组织检查样品分离自体成纤维细胞；(g)在产生基本上没有培养基血清来源的蛋白质的自体成纤维细胞的条件下培养该自体成纤维细胞；和(h)将成纤维细胞暴露于导致成纤维细胞悬浮的条件；和(i)将悬浮的角质细胞和悬浮的成纤维细胞组合。所述含有角质细胞的组织可以选自皮肤、口腔粘膜、牙床、颊组织、食管组织、外宫颈组织，和结膜组织。角质细胞的培养可以包括：(1)在含有0.1％到约20％人或者非人血清的培养基中孵育，然后(2)在无血清的培养基中孵育。备选地，角质细胞的培养可以仅在无血清的培养基中。该含有成纤维细胞的组织可以选自：牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。成纤维细胞的培养可以包括：(1)在含有0.1％到约20％人或者非人血清的培养基中孵育，然后(2)在无血清的培养基中孵育。备选地，成纤维细胞的培养可以仅在无血清的培养基中。导致成纤维细胞悬浮的条件可以包括将该成纤维细胞与蛋白水解酶，例如，胰蛋白酶接触。备选地，蛋白水解酶包括分散酶和胶原酶。导致成纤维细胞悬浮的条件可以额外或者备选地包括使用EDTA。在与角质细胞组合前，成纤维细胞可以暴露于活化化合物，该活化化合物为例如，抗坏血酸棕榈酸酯、亚油酸、C-MED100、奎尼酸、奎尼酸盐、奎宁内酯、辅酶Q-10、L-羟酸、L-硫辛酸、磷酸二氢钙、三磷酸钙、烟酸、DHEA、DMAE、α-生育酚、BMP、维生素E、维生素C、类胡萝卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉碱、丙炔苯丙胺、番茄红素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、长春西汀、视黄酸、抗癌肽类，或者其他刺激性添加剂，如生长因子[例如，人生长激素、FGF、VEGF、IGF-I、胰岛素和长形式R3IGF-1]。成纤维细胞在施用于受试者之前还可暴露于低能量激光。该悬浮液可以含有比例为约1∶3的自体角质细胞和自体成纤维细胞。所述注射可以包括将该悬浮液注射到烧伤伤口的中心区域。该悬浮液可以还含有自体的、经传代的UMC。该方法可以还包括将强化化合物注射到伤口。
本发明还提供了未分化的间充质细胞(UMCs)的用途，用于生产治疗组织退变或者组织缺陷的药物，所述组织退变或者组织缺陷选自软组织缺陷、口腔粘膜缺陷、口腔粘膜创伤、牙周病、糖尿病、皮肤溃疡、静脉停滞，其中该药物含有自体的、经传代的UMCs，其基本上无培养基血清来源的蛋白质。优选地，该组合物基本上无不同于经传代的自体UMC、经传代的自体成纤维细胞和，任选地经传代的自体角质细胞的细胞。
本发明还提供了未分化的间充质细胞的用途，用于生产同时、顺序或者单独施用用以修复组织的药物，所述组织由于所述受试者中疾病、失调或者缺陷而退变，其中所述UMC为基本上无培养基血清来源的蛋白质的经传代的UMC；所述成纤维细胞为基本上无培养基血清来源的蛋白质的经传代的自体的、经传代的成纤维细胞。
本发明还提供了用作药物的组合物，其中所述组合物含有自体的、经传代的UMC和自体的、经传代的成纤维细胞，并且其中所述组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质。还提供了用于组织的美容修复的组合物，其中所述组合物含有自体的、经传代的UMC和自体的、经传代的成纤维细胞，并且其中所述组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质。
本发明还提供了自体的、经传代的角质细胞和自体的、经传代的成纤维细胞的用途，用于生产药物，该药物用于受试者中烧伤伤口的修复。
除非另外限定，文中所用的所有技术和科学术语具有和本发明所属的领域中技术人员通常理解的相同的含义。尽管可以用与本文中描述的那些相似或者等价的方法和材料来实施本发明，但是下面描述适宜的方法和材料。这里完整引用所有出版物、专利申请、专利和此处提到的其他参考文献作为参考。如果出现冲突，由本申请(包括定义)支配。此外，材料、方法和实施例仅是阐明性的并且不打算限制。
本发明的一种或多种实施方案的细节在附图和下面的描述中给出。根据该说明书和权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将是显而易见的。
发明详述
本发明提供了治疗导致受试者中组织退变的失调或者缺陷的组合物和方法。这些失调或者缺陷包括口腔粘膜缺陷、口腔粘膜创伤(例如，牙拔除导致的拔除牙槽)、口腔骨如上颌骨或者下颌骨的创伤、牙周病、糖尿病、皮肤溃疡、或静脉停滞。可导致组织退变的牙周病的实例包括，但不限于，牙周退变、牙龈炎，或者腭粘膜或者齿龈粘膜的非愈合伤口，或者骨退变。用本文提供的组合物和方法可以治疗的其他缺陷包括，但不限于，皮肤缺陷如疤痕、皱纹、笑纹、妊娠纹、凹陷型疤痕、非创伤起源的皮肤凹陷、痤疮、创伤、先天性畸形或者老化导致的痤疮疤痕或者皮下萎缩。此外，本发明的组合物和方法可用于治疗缺陷，如唇发育不全、唇褶、或者骨缺陷，例如，骨的缺陷，例如，面部骨，包括眼窝、颧骨、颅骨、颚裂骨缺陷，和鼻骨，以及脊柱骨和长骨缺陷。骨缺陷包括，例如，半面矮小症、任何骨(例如，手、腕、褪、脊柱或者脸的骨)的创伤后非愈合、眼球陷没、Romberg氏病、颅钻孔缺陷、和头骨损失。本发明的组合物和方法还可用于帮助任何骨的手术后愈合。本发明还可用于改善软组织缺陷，包括面部凹陷、乳腺发育不全、乳腺缺乏、声带缺陷、腭咽功能不全、Poland氏综合征，和任何皮下萎缩或者肌肉萎缩，包括小儿麻痹症后萎缩和臀、腓，或者雄性生殖器发育不全。
1.含有细胞的组合物
本发明提供了含有细胞的组合物，所述细胞为例如，自体的、经传代的UMC；任何来源的自体的、经传代的成纤维细胞，和/或自体的、经传代的角质细胞。本发明的组合物基本上无免疫原性蛋白质(例如，培养基血清来源的蛋白质)。本文中，如应用于施用于受体的组合物的组分的术语“自体的”指从供体取出并施用于受体的身体组分(例如，细胞或者生物分子，如蛋白质、核酸、碳水化合物或者脂质)，其中供体和受体是同一个体。本文中，“基本上无培养基血清来源的蛋白质”的细胞是这样的细胞，其中该细胞所掺入的流体含有小于0.1％(例如小于0.05％，小于0.01％，小于0.005％，小于0.001％)的异种或者同种异体血清，其中该血清是所述细胞在其中培养的组织培养基中所含有的。类似地，“基本上无培养基血清来源的蛋白质”的组合物是这样的组合物，其中该组合物中细胞周围的流体含有小于0.1％(例如小于0.05％，小于0.01％，小于0.005％，小于0.001％)的异种或者同种异体血清，其中该血清是所述细胞在其中培养的组织培养基中所含有的。
为了得到基本上无培养基血清来源的蛋白质的细胞，可以将所培养的细胞在不含有血清的培养基中扩大。备选地，细胞可以首先在含有血清(例如，0.1％到20％血清)的培养基中培养，随后在无血清的培养基中培养。从而通过这些方法避免了细胞悬浮液中可能的免疫原性血清来源的蛋白质的存在。
此处所用的细胞可来自任何哺乳动物物种(例如，人，非人灵长类、狗、奶牛、马、猪、绵羊、猫、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠，或者沙鼠)，条件是所述细胞是自体的。自体人细胞(例如，自体人UMC、成纤维细胞，和角质细胞)尤其有用。注意到当动物是近交的并且从而是等基因(例如，如在诸如大鼠和小鼠的动物的某些近交实验室品系中)时，“自体的”可指来自相同物种的另一个体。此处所用的细胞可以是非-自体(例如，从不同于受体的受试者或者从细胞系得到的)的。
通常通过从受试者得到组织活检样品，从该活检样品分离所希望的细胞，通过适当次数的传代培养细胞以得到所希望的细胞量，并悬浮细胞来制备此处提供的组合物。本文中，“贴壁”细胞是粘附到标准组织培养容器的材料(例如，塑料)的细胞。本文中，“非贴壁”细胞包括不粘附到标准组织培养容器的材料(例如，塑料)的细胞，以及当空间和营养受到限制时从组织培养容器的表面脱落的细胞。一旦收获这些细胞并将它们置于适宜的条件中，它们可以贴壁并扩大。从而组合物可以含有可以培养扩大的任何细胞。UMC和成纤维细胞可以从例如皮肤组织或者脂肪组织分离。UMC和成纤维细胞还可以从，但不限于，筋膜、固有层、毛囊的球区、骨髓，和结缔组织的任何来源得到。自体角质细胞可以从例如，受试者的完整厚度的皮肤活组织检查样品、头皮或者从毛囊得到。通过差别蛋白水解，例如，胰蛋白酶作用，并富集或者通过梯度纯化或者使用菲可(Ficoll)或者帕可(Percoll)富集可以将贴壁和不贴壁的细胞基本上相互分开。菲可或者帕可可以从Amersham Biosciences(Amersham Place，LittleChalfont，Buckinghamshire，HP79NA，UK)得到。
由于本领域中众所周知的同种异体(或者异种)排斥现象，优选所培养的细胞与受体是组织相容的。通过从所要治疗的受试者得到细胞(例如，外周血单核细胞)并使用这些细胞确定该受试者的主要组织相容性复合体(MHC)单元型确保组织相容性。然而，可以理解，可以从受试者的相同的双胞胎，或者从在MHC与受试者相同的个体得到这些细胞。可以培养从活组织检查样品分离的细胞使得它们基本上无培养基血清来源的蛋白质。该步骤减小了细胞活化受试者中不利的免疫应答的能力。
开始细胞培养前，可以将活组织检查样品用抗生素和抗真菌剂反复洗涤以便减小随后的培养物的污染的可能性。适宜的“洗涤培养基”可以含有例如，组织培养基，如Dulbecco氏改良的Eagle培养基(EMEM)、Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(EMDM)，或者任何适宜的培养基，以及一些或者所有下面的试剂：庆大霉素、两性霉素B(FUNGIZONE)、除支原体剂(MRA；Dianippon PharmaceuticalCompany，日本)、plasmocin和泰乐菌素(可以从例如，Serva，Heidelberg，德国得到)。庆大霉素可以以10到100μg/ml(例如，25到75μg/ml，或者约50μg/ml)的浓度使用。两性霉素B可以以0.5到12.5μg/ml(例如1.0到10.0μg/ml，或者约2.5μg/ml)的浓度使用。MRA可以以0.1到1.5μg/ml(例如，0.25到1.0μg/ml，或者约0.5μg/ml)的浓度使用。Plasmocin可以以1到50μg/ml(例如，10到40μg/ml，或者约25μg/ml)的浓度使用。泰乐菌素可以以0.012到1.2mg/ml(例如，0.06到0.6mg/ml，或者约0.12mg/ml)的浓度使用。
用于细胞培养的生长培养基可以补加抗生素以防止例如，细菌、真菌、酵母和支原体对细胞的污染。支原体污染是组织培养中经常并且尤其麻烦的问题。为了防止或者最小化支原体污染，可以向生长培养基中加入诸如泰乐菌素的试剂。还可以用一种或多种抗生素/抗真菌剂(例如，庆大霉素、环丙沙星、azithromycin、MRA、plasmocin和四环素)。泰乐菌素可以以0.006到0.6mg/ml(例如，0.01到0.1mg/ml或者约0.06mg/ml)的浓度使用。庆大霉素可以以0.01到0.1mg/ml(例如，0.03到0.08mg/ml，或约0.05mg/ml)的浓度使用。环丙沙星可以以0.002到0.05mg/ml(例如，0.005到0.03mg/ml，或约0.01mg/ml)的浓度使用。Alatrofloxacine可以以0.2到5.0μg/ml(例如，0.5到3.0μg/ml，或约1.0μg/ml)的浓度使用。Azithromycin可以以0.002到0.05mg/ml(例如，0.005到0.03mg/ml，或约0.01mg/ml)的浓度使用。MRA可以以0.1到1.5μg/ml(例如，0.2到1.0μg/ml，或约0.75μg/ml)的浓度使用。Plasmocin可以以1到50μg/ml(例如，l0到40μg/ml，或约25μg/ml)的浓度使用。四环素可以以0.004到0.1mg/ml(例如，0.008到0.05mg/ml，或约0.02mg/ml)的浓度使用。抗生素可存在于整个培养期间或者培养期的一部分。
通过琼脂培养方法使用例如，可以从bioMérieux(Marcyl’Etiole，法国)得到的或者可以在室内制备的支原体琼脂板，或者通过PCR测定支原体污染。美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)上市了PCR“支原体检测试剂盒”。含有泰乐菌素(0.06mg/ml)、庆大霉素(0.1mg/ml)、环丙沙星(0.01mg/ml)、alatrofloxacine(1.0μg/ml)、azithromycin(0.01mg/ml)、和四环素(0.02mg/ml)的培养基可尤其用于防止支原体污染。可用于防止支原体污染的另一种试剂是4-氧-喹啉-3-羧酸(OQCA)的衍生物，其可通过商业途径从ICN Pharmaceuticals，Inc.(Costa Mesa，CA)作为“支原体去除剂”得到。该试剂通常以0.1到2.5mg/ml(例如，0.2到2.0mg/ml，或者0.5mg/ml)的浓度使用。抗生素混合物或者其他试剂可以在起始后头两周存在于成纤维细胞培养物中。适宜的培养时间(例如，2周)后，通常将含有抗生素的培养基用无抗生素的培养基替换。一旦培养物中存在足够细胞数，可以检查这些细胞的支原体、细菌和真菌污染。在本发明的方法中仅使用没有检测到污染的细胞。
可以在细胞施用于受试者之前向细胞加入药学上可接受的载体。短语“药学上可接受的”指分子实体和组合物，当将它们施用于人时，它们对细胞无毒，是生理上可耐受的，并且通常不产生变态反应或者类似的不良反应，如反胃、眩晕，等等。这些组合物包括多种缓冲液成分(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的生理上可接受的稀释剂。
备选地，如果细胞不是立即施用，那么收获后可以将它们在约4℃孵育长达24-48小时。对于这种孵育，可以将细胞悬浮在具有适宜的摩尔渗透压浓度并且已经检查了致热原和内毒素的生理溶液中。这种溶液通常不含有酚红pH指示剂，并且任何血清优选为受试者的血清(即，自体血清)而不是胎牛血清(FBS)或者另一种异种血清(例如，马血清或者山羊血清)。可以将细胞悬浮在例如，含有5％右旋糖的Krebs-Ringer溶液，或者任何其他生理溶液中。可以吸出细胞并在孵育培养基中施用于受试者。其中悬浮该细胞的盐水或者孵育培养基的体积通常与一些因素有关，如所要注射的细胞的数目，和由于组织退变或者缺陷导致的损伤程度。
可以将此处所用的细胞在适于保存细胞类型，如UMC、成纤维细胞、和角质细胞的任何培养基(例如，任何通过商业途径可以得到的冷冻培养基)中冷冻。由约70％(v/v)生长培养基，约20％(v/v)FBS和约10％(v/v)二甲亚砜(DMSO)组成的培养基尤其有用。可以用含有5％右旋糖的Krebs Ringer替换FBS，并用例如甘油代替DMSO。经解冻的细胞可用于开始继代培养以制备以后用于同一受试者的另外的悬浮液，从而避免得到另一样品的麻烦。
2.含有自体UMC的组合物
本发明提供了含有自体UMC的组合物。这些组合物可用于治疗病症，所述病症包括例如，牙缺陷(例如，口腔粘膜缺陷、口腔粘膜的创伤，或者牙周病)、骨缺陷和骨移植，和皮肤的美容缺陷(例如，笑纹、妊娠纹、皱纹、伤疤、痤疮疤痕，或者皮下萎缩)。通过开始培养从受试者(例如，人)采集的活组织检查样品可以在体外收获并富集UMC。如本文中所述，可从例如，皮肤活组织检查或者脂肪组织或者骨髓的活组织检查得到UMC。从皮肤组织分离的UMC尤其有用，因为它们易于得到和扩大。本文中所用术语“UMC”指处于完全分化的结缔组织细胞，如成纤维细胞之前的分化的某个“阶段”的细胞。因为UMC不能分化成体细胞的每种类型，所以UMC不同于全能干细胞。除了成纤维细胞，UMC还可分化成脂肪组织、软骨、腱、骨，或者肌肉细胞。
为了产生本发明的组合物，可以从例如，受试者的牙床、头皮、耳后、腭或者皮肤的完全厚度(例如，1-5mm，或者如果可以得到足够组织，5mm以上)的皮肤活组织检查样品开始UMC培养。真皮刚好位于表皮下，并且通常具有0.5到3mm的厚度。使用例如，穿孔活组织检查方法可以得到皮肤样品。可以从例如，耳后的皮肤得到皮肤活组织检查样品。可以通过例如，收获并从皮(例如，皮肤)活组织检查(例如，见实施例1)的培养可以分离UMC。可以观察到旺盛生长的UMC的漂浮(即，不贴壁)的集落在这种培养物中漂浮。通过吸出并从细胞培养物离心培养基可以收获集落并将集落重新接种在新鲜的组织培养基中将集落扩大。当培养中的贴壁细胞汇合或者未汇合时可以收获漂浮的集落。也可以从脂肪组织(例如，通过抽脂或者其他手术去除收获的脂肪)的培养物分离漂浮UMC的集落。可以将组织切成小块，除去膜材料，并将所得组织置于导致UMC从脂肪组织主动脱落的培养条件下。可以导致主动脱落的条件的实例包括，但不限于，使用含有较低浓度的胎牛血清(FBS)的培养基或者含有酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)的培养基。例如，可以存在约0％到约2.5％FBS。例如，可以存在约2.5到10ng/ml aFGF。备选地，从脂肪球除去膜后可以用约0.1％到1％胶原酶将脂肪组织解离。类似地，可以从骨髓的活组织检查样品开始UMC培养(见，例如，Marko等人，(1995)Endocrinol.136：4582-4588)。
可以用适于从活组织检查样品增殖UMC的任何组织培养技术扩增细胞。可用于扩增经培养的细胞的技术可以在例如，R.I.Freshney，编者，Animal Cell Culture：A Practical Approach，(IRL Press，Oxford，英国，1986)和R.I.Freshney，编者，Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Techhiques，(Alan R.Liss & Co.，New York，1987)中发现。
细胞培养基可以是适于原代UMC培养物生长的任何培养基。培养基可以含有抗生素、抗真菌剂，和/或防止支原体生长的试剂，如上述。培养基中存在酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、类胰岛素生长因子-I(IGF-I)、胰岛素，或者任何生长因子可以防止UMC分化成成纤维细胞。该培养基可以无血清，或者可以补加人或者非人血清[例如，自体人血清、非自体人A/B血清、马血清，或者胎牛血清(FBS)]以促进细胞生长。当培养基中包含血清时，该血清的量通常为约0.1％到约20％v/v(例如，约0.5％到约19％，约1％到约15％，约5％到约12％，或约10％)。尤其有用的培养基含有葡萄糖DMEM，其补加约2mM谷氨酰胺，约10mg/L丙酮酸钠、约10％(v/v)FBS，和抗生素(通常称作“完全培养基”)，其中葡萄糖的浓度为约1,000mg/L到约4,500mg/L。UMC还可以在无血清的培养基中扩增；这样，UMC从不暴露于异种或者同种异体血清蛋白质并且不需要在无血清的培养基中额外培养，当细胞在含有非自体血清的培养基中扩增时需要实施所述额外培养。
施用前，可以将UMC与活化化合物孵育。本文中所用的“活化化合物”是可以刺激细胞增殖或者延长细胞寿命(例如，通过刺激导致细胞增殖的特定基因的表达，或者通过激活DNA修复和延长细胞生命或者防止凋亡)的化合物。UMC分化成成纤维细胞后，活化化合物还可以刺激胶原产生。活化化合物也可以与含有UMC的组合物一起或者单独地施用于受试者，并且可以增强含有UMC的组合物所使用的部位中细胞的增殖、寿命或者胶原产生。当细胞组合物和活化化合物单独使用时，该施用可以是同时或者顺序的(以任何顺序)。当顺序施用时，施用可以相隔数分钟(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、或55分钟)，数小时(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、18、22、或23小时)，数天(例如，1、2、3、4、5、或6天)，或数周(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、或更多周)。备选地，不存在经传代的UMC时施用一种或多种活化化合物可以用于体内刺激或者分化UMC。
可以与UMC(和/或其他细胞，如成纤维细胞)施用的其他化合物为强化化合物。本文中所用的“强化化合物”为不一定作用于所施用的细胞本身，但是例如，或者是所要修复的组织的结构组分(例如，任何类型的胶原)或者作用于宿主组分(例如，宿主细胞或者细胞外基质组分)的化合物。从而，强化化合物可用于强化所施用的细胞的修复功效。强化化合物可与含有UMC和/或其他细胞如成纤维细胞的组合物一起或者单独施用于受试者。当细胞组合物和强化化合物单独施用时，该施用可以为同时或者顺序的(以任何顺序)。如上述，顺序施用可以相隔数分钟(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、或55分钟)，数小时(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、18、22、或23小时)，数天(例如，1、2、3、4、5、或6天)，或数周(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、或更多周)。备选地，完全不存在经传代的UMC时施用一种或多种强化化合物可以用于体内刺激或者分化UMC。
可以与UMC一起施用的活化化合物包括，例如，抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、亚油酸、C-MED100(Optigene-X LLC，Shrewsbury，NJ)、奎尼酸、奎尼酸盐、奎宁内酯、辅酶Q-10、L-羟酸、L-硫辛酸、烟酸、脱氢表雄甾酮(DHEA)、二甲基氨基乙醇(DMAE)、α-生育酚、维生素E、维生素C、类胡萝卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉碱、丙炔苯丙胺、番茄红素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、长春西汀、视黄酸、抗癌肽类，和其他刺激性添加剂，如生长因子[例如，人生长激素、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、IGF-I、胰岛素和长形式R3IGF-1和转化生长因子-β(TGF-β)]。如上面指出的，这些活化化合物还可以与UMC一起或者单独施用于受试者。可用作强化化合物的化合物包括氨基己酸、雌三醇、和乙酰胆碱酯酶，例如，这些化合物的一些为抗氧化剂(例如，L-硫辛酸、C-MED100、和辅酶Q-10)，其他的影响DNA修复(例如，维生素E、羧基烷基酯、和类胡萝卜素)，其他的可以诱导骨细胞的发育(例如，三磷酸钙和单磷酸钙)。其他有用的活化剂包括转录因子、组蛋白乙酰基转移酶、甲基结合蛋白、乙酰胆碱前体、细胞膜保护剂，和分化因子。
可以理解当目标活化和强化化合物都是蛋白质时，将要施用于受试者的细胞(例如，UMC或者成纤维细胞)可以受到一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6或更多种)表达载体(例如，质粒或者病毒载体，如牛痘、腺病毒或者逆转录病毒载体)的稳定或者瞬时转染、转导、转化或者感染，每种表达载体含有一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6或更多种)核酸序列，该核酸序列编码一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6或更多种)活化和/或强化化合物(例如，任何类型的胶原(如I型、II型、或III型胶原)，或者转录因子、端粒酶、或者影响DNA甲基化的因子)。
细胞(例如，UMC)在施用于受试者之前可以通过暴露于低能量激光得到激活。例如，细胞可以经氦-氖激光或者砷化镓激光照射，所述激光可以增强成纤维细胞的胶原产生(见，例如，Halcin和Uitto，“低能量激光的生物效应”，″BiolLasers in Cutaneous and AestheticSurgery，第一版(1997)，Arndt和Dover，编者，Lippincott Williams& Wilkins(Philadelphia，PA)，303-328页)。激光处理还可以影响细胞增殖、免疫调节，和伤口愈合中的细胞外基质产生。可以在将细胞施用于受试者前用低水平激光在任何适宜的时间段(例如，数小时到数周)内照射细胞一次或多次(例如，2、3、4、5或5次以上)。
本发明还提供了制备含有自体的、经传代的UMC的组合物的方法。该方法可以包括提供来自受试者的含有UMC的组织的活组织检查样品，从该活组织检查样品分离自体UMC，在一定条件下培养UMC，所述条件导致基本上没有培养基来源的蛋白质的细胞。当在源自例如，皮肤活组织检查的贴壁成纤维细胞的培养中将UMC制备为非贴壁细胞集落时，可以将UMC传代或者通过从培养物除去含有培养基的非贴壁细胞并离心收集UMC。当将要传代UMC时，可以将它们重悬浮在新鲜培养基中并分散到适当的组织培养容器，例如，组织培养瓶中。当UMC将施用于受试者时，可以将UMC重悬浮在适宜的溶液(例如，生理盐水、含有5％右旋糖的Krebs Ringer，无酚红的组织培养基，或者等渗并且适于注射到受试者如哺乳动物或者人的任何其他溶液)中。可以用任一种其他适宜的方法分离并培养UMC，该方法包括美国专利号5,858,390中公开的方法，将该专利完整引用作为参考。
3.含有自体成纤维细胞和UMC的组合物
除了UMC，本发明的组合物可以含有基本上无免疫原性蛋白质(例如，培养基血清来源的蛋白质)的自体的、经传代的成纤维细胞。组合物可以含有可以培养扩大的任何成纤维细胞。从皮肤组织分离的成纤维细胞尤其有用，因为它们容易得到和扩大。然而，可以从含有成纤维细胞的任何组织，例如，受试者的牙床、腭或者皮肤的活组织检查样品得到自体成纤维细胞。此外，可以从，但不限于，筋膜、固有层、毛囊的球区、骨髓，或结缔组织的任何来源得到成纤维细胞。此外，例如，通过细胞培养可以从UMC得到成纤维细胞。可以使用用于培养和分化UMC的任何适宜的方法，例如，如本文中描述的方法。通过，例如，在不存在酸性成纤维细胞生长因子或者本领域中公知的任何其他适宜的分化抑制因子时培养可以将UMC诱导分化成成纤维细胞。
如果希望，可以用无菌显微解剖分离源于含有角质化组织的表皮和含有脂肪细胞的皮下组织的活组织检查中的皮肤组织。然后用例如，解剖刀或者剪刀切碎或剪碎组织，将活组织检查样品分成小块。在一些实施方案中，用蛋白酶(例如，胶原酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、或者木瓜凝乳蛋白酶)消化组织小块。用200-1000U/ml II型胶原酶消化10分钟到24小时尤其有用，尽管可以使用任何类型的胶原酶(例如，0.05％到0.1％IV型胶原酶对于脂肪组织的消化尤其有用)。如果使用酶促消化，那么可以通过离心收集细胞并置于组织培养瓶中。
如果不将组织酶消化，可以将切碎的组织小块单独置于组织培养瓶的干燥表面上并允许粘附约2到约10分钟。可以缓慢加入少量培养基以便不移动所附着的组织碎片。对于经消化的细胞，可以用培养基洗涤细胞以除去残留的酶，将细胞悬浮在新鲜培养基中，并置于一个或多个培养瓶中。孵育约48-72小时后，可以向培养瓶添加额外的培养基。当用T-25瓶开始培养时，培养基的最初量通常为约1.5到2.0毫升。源于活组织检查样品的细胞系的建立需约2到3周，此时可以从最初的培养容器除去细胞用于扩增。
在培养的早期，希望组织碎片保持粘附到培养容器底部。脱落的碎片可以重新移植到新的容器中。根据标准技术，将成纤维细胞短暂暴露于EDTA-胰蛋白酶可以刺激该细胞生长。这种暴露于胰蛋白酶太短暂而不会使成纤维细胞从它们所附着的培养容器壁释放。培养物建立并且接近汇合后，可以立即处理成纤维细胞样品以在例如，液氮中冷冻保存。可以使用冷冻细胞的任何适宜的方法，其包括本领域中公知的关于成功冷冻细胞备用的许多方法的任一种。见，例如，上面公开的冷冻方法。冷冻并保存早传代成纤维细胞而不是晚传代成纤维细胞是优选的，因为正常人成纤维细胞的细胞培养中传代次数是有限的。
可以用适于从活组织检查样品增殖皮肤成纤维细胞的任何组织培养技术扩增细胞。细胞培养基可以是适于生长原代成纤维细胞培养物的任何培养基。培养基可以补加如上述的人或者非人血清(例如，自体人血清、非自体人A/B血清、马血清，或者胎牛血清(FBS)]。成纤维细胞也可以在无血清的培养基中扩增；这样，成纤维细胞从不暴露于异种或者同种异体血清蛋白质并且不需要在无血清的培养基中额外培养，当成纤维细胞在含有非自体血清的培养基中扩增时需要实施所述额外培养。
通过胰蛋白酶化，自体成纤维细胞可以传代到新的培养瓶中。为了扩增，单个瓶可以以例如1∶3到1∶5的比例分开。具有总培养面积450cm2的三底T150瓶适于扩增成纤维细胞。三底T150瓶可以根据细胞大小接种例如，约1×106到约3×106个细胞，或者每平方厘米约8×103个细胞。这种培养瓶通常能够产生约6×106到约1×107个细胞。当达到瓶的容量(这需要培养约5-7天)时，可以用无血清的培养基替换生长培养基。通常可以将细胞在约30℃到约37.5℃孵育至少4小时(例如，过夜或者约18小时)。在无血清的培养基中孵育可以基本上除去源于加入到培养基中的非自体血清(例如，FBS)的蛋白质，如果该蛋白质存在于注射到受试者的组合物中，将会引起不希望的免疫应答。无血清培养基可以含有，例如，补加约2mM谷氨酰胺，与或者不与约110mg/L丙酮酸钠的葡萄糖DMEM，其中葡萄糖的浓度可以为约1,000mg/L到约4,500mg/L。约4,500mg/L的葡萄糖浓度尤其有用。无血清培养基可以还含有一种或多种如上面描述的抗生素。
在无血清的培养基中孵育结束时，可以使用例如，胰蛋白酶-EDTA从组织培养瓶除去细胞。施用于受试者前，通常将成纤维细胞在无血清并且无酚红的培养液或者血清中洗涤2到4次。通过离心或者重悬浮可以洗涤细胞，然后将细胞重悬浮在等体积的可注射的等渗溶液中用以注射，该溶液具有适宜的生理摩尔渗透压浓度并且基本上没有致热原和外源蛋白质。等渗盐水是尤其有用的等渗溶液。生长到容量的5个三底T-150瓶可以产生约3.5×107到约7×107个细胞，这些细胞足够组成约1.2ml到约1.4ml悬浮液。然后可以将药学上可接受的载体加到经传代的自体成纤维细胞以形成药物组合物。
对于UMC，成纤维细胞可以在施用于受试者前与活化化合物孵育(见上文)。适宜的活化化合物包括例如上文中描述的那些。与这些化合物孵育可以刺激成纤维细胞并增强它们的胶原产生。一种或多种活化化合物也可以与含有自体经传代的成纤维细胞的组合一起施用于受试者。备选地，不存在经传代的成纤维细胞时活化化合物的使用可以用于体内刺激成纤维细胞。
此外，与UMC体内使用的上述相同的强化化合物可以与含有UMC和成纤维细胞或者仅成纤维细胞的组合物一起使用。
如上，通过用低能量激光照射可以激活成纤维细胞。
还可以使用任何其他适宜的方法制备含有自体、经传代的成纤维细胞的组合物。见，例如，美国专利号5,858,390；5,665,372；5,660,850；5,591,444；和6,342,710以及国际申请号WO 99/60951，将所有这些文献完整引用作为参考。
本发明提供了制备含有自体、经传代的UMC和自体、经传代的成纤维细胞的组合物的方法。这些方法包括(1)提供来自受试者的含有UMC的组织的活组织检查样品，从该活组织检查样品分离UMC，并培养UMC以传代多次以便得到所希望的细胞量，培养条件为导致基本上无培养基血清来源的蛋白质的UMC的培养条件；(2)提供来自受试者的含有成纤维细胞的组织的活组织检查样品，从该活组织检查样品分离成纤维细胞，并培养成纤维细胞以传代多次以便得到所希望的细胞量，培养条件为导致基本上无培养基血清来源的蛋白质的成纤维细胞的培养条件，并将成纤维细胞暴露于导致该成纤维细胞悬浮的条件(例如，胰蛋白酶)；和(3)将UMC与成纤维细胞合并。注意到UMC和成纤维细胞可以从单个活组织检查样品得到并且，进而可以共同培养。从而最后的合并步骤不是必须的。
4.含有自体角质细胞的组合物
本发明的组合物可以含有经传代的角质细胞。该角质细胞可以是自体或者非自体的(例如，来自另一受试者或者来自细胞系)，尽管自体角质细胞是尤其优选的。自体角质细胞可以从例如，皮肤、牙床、颊组织、食管组织、外宫颈组织、毛囊和结膜组织的活组织检查分离。自体角质细胞通常从容易接近但是从美容立场不是高度可见的部位得到。非自体角质细胞可以来自角质细胞细胞系。这些细胞可以通过商业途径从，例如ATCC得到。此处所用的角质细胞通常为悬浮的并且通过例如，注射施用于受试者。
本发明提供了制备用于修复或者改善受试者中组织缺陷如烧伤伤口的组合物。在典型的愈合过程中，角质细胞从伤口的外边缘向伤口的中心生长，这通常导致形成伤疤。可以将含有角质细胞的悬浮液的组合物施用(例如，注射)于烧伤伤口以促进愈合而减小伤疤形成。角质细胞悬浮液基本上无免疫原性蛋白质(例如，培养基血清来源的蛋白质)。
可以从例如，皮肤活组织检查样品收获角质细胞。可以使用完整厚度或者剖开厚度的人皮肤。该人皮肤可以来自身体的任何部分，包括包皮。如果使用完整厚度的皮肤，可以尽可能地裁减真皮。可以将皮肤在含有抗生素和/或抗真菌剂(例如，青霉素、链霉素，和Fungizone)的培养基或者上述含有抗生素的培养基中洗涤一次或多次。然后可以将该组织切成小(例如，4mm2)块并在胰蛋白酶(例如，磷酸缓冲液中的0.25％胰蛋白酶，没有Ca++或者Mg++)中孵育使真皮与表皮分离[Eisinger(1985)Method in Skin Research，Ed.Skerrow，193页]。胰蛋白酶处理可以在适宜的温度(例如4℃)中进行适宜长的时间(例如，2到18小时)。胰蛋白酶化后，可以使用小镊子小心地将表皮和真皮分开。可以将真皮丢弃或者用于生长成纤维细胞，可以将表皮漂浮在溶液中，该溶液含有例如，8g/L M NaCl，0.4g/L KCl，1g/L右旋糖，0.58g/L NaHCO3，0.5g/L胰蛋白酶，和0.2g/L versene(二钠盐)。
当收集了所有表皮时，通过用镊子机械梳理将表皮细胞相互分离。可以将洗脱到上清液中的细胞转移到新的组织培养皿中并通过，例如，用Pasteur移液器剧烈移液以得到单个细胞的悬浮液，这些细胞可以在显微镜下观察。然后将细胞收集到无菌胎牛血清(FBS)中并通过例如，无菌纱布网过滤除去任何剩余的组织块或小片。将新鲜培养基加到剩余的表皮组织，并且可以重复该过程直到所有组织完全分开。通过离心可以沉淀在FBS中收集的细胞，将其重悬在角质细胞生长培养基中，并以约5×105到8×105个细胞/ml接种在塑料组织培养容器中。该细胞通常在5％CO2和95％空气存在下和80％湿度和35℃到36℃下培养。12到14天后，可以收集角质细胞并且其可用于传代培养或者施用于受试者。
复制的表皮角质细胞培养物可以保持在成纤维细胞饲养层(例如，3T3细胞层)，或者可以在动物血清(例如，FBS)的存在下培养，以建立原代培养物和传代培养。在这些条件下，可以对角质细胞传代培养直到它们实现20到50次群体翻番。可以将细胞培养在例如，最小必需培养基(MEM)中，该培养基含有10％FBS，100U/ml青霉素，100％g/ml链霉素，0.6μg/ml Fungizone，0.5μg/ml氢化可的松，200mM L-谷氨酰胺，和10mM MEM-非必需氨基酸。处理青霉素、链霉素和Fungizone，还可以使用用于UMC和成纤维细胞培养的上述抗生素的混合物。也已开发出不需要血清或者饲养层用于维持克隆生长、连续增殖和表皮角质细胞分化的体外系统[Peehl和Ham(1980)In Vitro 16：516-525；和Tsao等人，(1982)J.Cell.Physiol.110：219-229]。这些系统可以包括使用用于成纤维细胞培养的条件培养基。
可以修饰角质细胞培养条件以增强细胞生长。例如，可以使用更大浓度的氢化可的松(例如，10μg/ml)、腐胺(例如，10-5M)、维生素B12(例如，10-5M)，或者J-雌二醇(例如，3.7×10-6M)以增强非条件培养基中角质细胞的生长[见，例如，Peehl和Ham，如前]。角质细胞生长培养基可以还含有诸如表皮生长因子和/或胰岛素的组分。还可以调节钙浓度以影响角质细胞增殖速度[Hennings等人，(1980)Cell 19：245-265]。在含有0.05到0.1mM Ca++的培养基中培养表皮细胞例如，可以增加增殖速度，而在培养基中通常发现的条件下(例如，1.2mM Ca++)下生长可导致细胞的最终分化。可以用任何其他适宜的分离和培养角质细胞的方法产生此处提供的组合物。这些方法包括例如，美国专利号4,254,226、5,282,859、和6,029,760中公开的方法，本文完整引用这些专利作为参考。
本发明提供了制备含有角质细胞的组合物的方法。这些方法可以包括提供含有角质细胞的组织的活组织检查，从该组织的活组织检查分离角质细胞，通过多次传代培养角质细胞将细胞扩大到所希望的量，培养条件为导致细胞基本上无培养基血清来源的蛋白质的培养条件，并将细胞暴露于导致细胞悬浮的条件(例如，胰蛋白酶)下。
含有角质细胞的组合物也可以含有成纤维细胞(例如，自体的、经传代的成纤维细胞)和/或UMC(例如，自体的、经传代的UMC)。可以分离成纤维细胞并如文中描述的(见上文小节3)制备悬浮液。本文中提供的方法包括得到一种或多种组织活组织检查样品，制备自体的、经传代的角质细胞和自体的、经传代的成纤维细胞的悬浮液，并将该角质细胞和成纤维细胞合并以产生可用于治疗诸如烧伤伤口的病症的组合物。注意到可以从单个活组织检查(例如，完整厚度的皮肤活组织检查)得到和制备角质细胞和成纤维细胞。可以使用成纤维细胞和角质细胞的任何适宜的比例，尽管约3∶1(成纤维细胞∶角质细胞)尤其有用。
5.含有生物可降解的非细胞基质组分的组合物
含有自体、经传代的细胞(例如UMC与或不与成纤维细胞)的本发明组合物还可以包含生物可降解的非细胞基质组分。无细胞基质组分通常完成结构角色。例如，其可以填充组织中缺陷、洞、空间或者腔并提供环境，在该环境中经注射的细胞可以附着到基质或者围绕组织并生长和产生由于新组织生长导致的结构因子和其他因子(如趋化因子)。在许多情况中，基质的缺口填充功能是暂时的并且仅持续到受移植的和/或宿主细胞迁移到该区域并形成新的组织。优选地，无细胞基质是生物可降解的。该基质优选为固态或者半固态物质，其在生理条件下是不可溶的。此外，生物可降解的非细胞基质组分可以包括在含有经传代的角质细胞的任何组合物中。这些组合物适于注射或者移植到受试者中以修复退变的组织。本文中所用的术语“生物可降解的”表示不是生物上有害的并且可以化学降解或者通过自然效应物(例如，天气、土壤细菌、植物、动物)可以分解的组合物。可用于本发明的基质的实例包括，但不限于，含有自体和非自体蛋白质的无细胞基质，和含有生物可降解的聚合物的无细胞基质。
含有非自体蛋白质的许多生物可降解的非细胞基质的任一种都可用于此处提供的组合物中。生物可降解的非细胞基质的实例包括含有任何类型的胶原(例如，牛、猪、人、或者生物工程胶原)，或者具有与例如，戊二醛交联的糖胺聚糖(GAG)的任何类型的胶原的基质。含有胶原的基质包括，但不限于，可吸收的胶原海绵、胶原膜、和骨松质。胶原的有用类型包括，例如，牛胶原(例如，ZYDERM和ZYPLAST，可通过商业途径从McGhan Medical Corporation，SantaBarbara，CA得到)、猪胶原、人尸体胶原(例如，FASCIA(FasciaBiosystems，LLC，Beverly Hills，CA)、CYMETRATM(LifeCellCorp.，Branchburg，NJ)、或DERMALOGENTM(以前由CollagenesisCorp.生产)、生物工程化胶原(例如，FORTAPERMTM，可从Organogenesis，Inc.，Canton，MA得到)，和自体人胶原(AUTOLOGEN，见下文)。FASCIATM尤其有用。该产品可以以5种不同的颗粒大小得到，任一种都可用于此处描述的组合物和方法中。大小为0.25mm的颗粒尤其有用。
可吸收的胶原海绵可从例如，Sulzer Calcitek，Inc.(Carlsbad，CA)购买。这些胶原海绵敷料以COLLATAPE、COLLACOTE和COLLAPLUG的名称销售，从牛深屈肌(Achilles)腱提取的交联胶原和GAG制备。这些产品是软的、易弯、不易碎的并且无致热原的。90％以上的胶原海绵通常由开孔组成。
生物可降解的非细胞基质可以含有形成例如薄膜的胶原(例如，牛或猪I型胶原)。一种这样的膜由Sulzer Calcitek生产并且以BIOMENDTM上市。另一种这样的膜基质由Geistlich Shne AG(Wolhusen，瑞士)以BIO-GIDE上市并且由猪I型和III型胶原生产。BIO-GIDE具有双层结构，其一个表面是多孔的并且允许细胞的向内生长，另一个表面致密并且防止纤维性组织的向内生长。
含有胶原的其他适宜的基质包括COLLAGRAFT，其由NeuCell，Inc.(Campbell，CA)生产，和OSTEOSET硫酸钙α半水合物沉淀，其由Wright Medical Technology(Arlington，TN)生产。
还可以从骨松质制备生物可降解的非细胞基质，将其形成粒剂或者块状体。该材料由动物(例如，人、非人灵长类、牛、绵羊、猪或山羊)的骨组成，其中已经从该骨除去了基本上所有的有机物质(例如，蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物、和小有机分子，如维生素和非蛋白质激素)。该类型的基质在此处称作“非有机基质”。一种这样的基质以BIO-OSS松质粒剂和BIO-OSS块状体上市，由GeistlichShne AG生产。该公司还生产了块状体类型的基质(BIO-OSS胶原)，其含有非有机骨并且还含有按重量计约10％胶原纤维。
其他有用的生物可降解的非细胞基质可以含有明胶、肠线、去矿化骨、非有机骨、珊瑚或者羟基磷灰石、或者这些物质的混合物。从去矿化人骨制备的基质例如，形成小块状体并且由GenSciRegeneration Laboratories，Inc.(Toronto，Ontario)以DYNAGRAFT上市，由Tutogen Medical，Inc.(Clifton，NJ)以TUTOPLAST上市，或者由Osteotech，Inc.(Eatontown，NJ)以GRAFTON去矿化骨基质上市。含有去矿化的骨可以与例如，胶原组合产生海绵、块状体或者膜形式的基质。生物可降解的基质可以含有糖胺聚糖，如粘多糖或者唾液酸。此外，从一种或多种单体制备的合成聚合物可用于生产可用于本文中的生物可降解的非细胞基质。这些合成聚合物包括，例如，聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、和聚(乙醇酸)-聚(乳酸)。合成聚合物还可以与上面提到的物质的任一种组合形成基质。形成单一基质的不同聚合物可以在分开的隔室或者层中。例如，W.L.Gore & Associates，Inc.(Flagstaff，AZ)生产了多孔的生物可降解的非细胞基质(GORE RESOLUT XT再生材料)。该基质由合成的生物可吸收的乙交酯和三亚甲基碳酸酯共聚物纤维组成，细胞可以迁移到该基质内，粘附到由合成的生物可吸收的乙交酯和丙交酯共聚物组成的闭合膜，该膜不允许细胞的向内生长。适宜的生物可降解的基质的其他实例可以在例如，美国专利号5,885,829中发现。
选择了生物可降解的非细胞基质后，细胞(例如，自体经传代的UMC与或不与自体、经传代的成纤维细胞)的浓缩悬浮液可以均匀分布在该基质的表面上。通常使用浓缩悬浮液以避免超出基质吸收液体悬浮液的能力。例如，应用于GORE RESOLUT XT基质的细胞悬浮液通常具有约94μl到约125μl的体积，并且每平方厘米基质含有约2.0×106到约4.0×106个细胞。不进一步加入培养基可以允许细胞粘附到基质。细胞与基质的孵育可以在，例如，约37℃下约1到2小时。孵育约60分钟后，细胞通常附着并均匀地分布到基质中。此时，可以用额外的生长培养基补加含有细胞负荷的基质的培养容器，并且细胞可以在基质中培养约3到4天。因为细胞以高密度加入基质中从而基本上填充了基质内内的空间，在3-4天的培养期间内几乎没有或者没有发生增殖。实际上，在该期间内显著的细胞增殖通常是不希望的，因为正在分裂的成纤维细胞可以分泌能够降解或者部分降解该基质的酶(例如，胶原酶)。
通常用盐水或者没有血清和酚红的培养基洗涤(例如，至少洗涤3次，每次10分钟)洗涤基质与细胞，目的是基本上除去免疫原性蛋白质(例如，如果培养基含有用于基质接种步骤的非自体血清，则为培养基血清来源的蛋白质)，这些蛋白质当施用于受试者时可引起免疫应答。新鲜PBS可用于每次洗涤。然后可以将基质在使用前在新鲜PBS或者无血清的培养基中孵育(例如，长2小时的孵育)。孵育后，含有自体、经传代的UMC与或者不与经传代的成纤维细胞的基质可以置于组织退变或者缺陷区域。
对于胶原海绵基质(例如，COLLACOTE)，可以将约1.5ml生长培养基中的约1.5×107到2.0×107个细胞接种在2cm×4cm的薄(约2.5到3.0mm厚)海绵上。然后该海绵可以不用添加培养基在37℃孵育约1-2小时以允许基本上所有细胞附着到该基质材料。细胞附着后，可以向基质和细胞组合物加入额外的生长培养基，该组合物可以在37℃孵育3-4天，每天更换培养基。如果含有非自体血清的培养基用于细胞接种步骤，那么可以从含有该血清的生长培养基除去该组合物并将其用PBS反复洗涤(例如，3次或更多次)。每次加入PBS后，可以将基质孵育10-20分钟后抛弃PBS。最后洗涤后，该组合物可直接施用于受试者，或者可以转移到含有生理溶液(例如，Kreb’sRinger溶液)的运输小瓶中并在约4℃孵育约24-48小时。
对于膜基质(例如，BIOMENDTM)，将约100μl生长培养基中的约3×106到8×106个细胞(例如，UMC或者UMC与成纤维细胞)接种到15mm×20mm的薄(例如，0.5到1.0mm厚)的膜上。该膜可以不用添加培养基在37℃孵育约30-60分钟以允许基本上所有细胞附着到该基质材料。细胞附着后，可以向基质和细胞组合物加入额外的生长培养基，该组合物可以在37℃孵育2-3天，每天更换培养基。细胞通常以高密度(见上文)加入基质以基本上填充细胞可利用的基质内的空间。洗涤组合物并且可以将其立即使用或者可以如上面关于海绵基质所描述的孵育该组合物。
对于块状基质，如上文描述的非有机基质(例如，BIO-OSS块状体)或者去矿化的骨基质(例如，DYNAGRAFTTM基质)，可以将约100到150μl中约1.2×107到2.0×107个细胞接种在基质材料的1cm×1cm×2cm立方体块中。通常将细胞缓慢接种在块状体表面的一个面上。一旦培养基和细胞被吸收到该块状体，可以以相似的方式接种该块状体的另一个面。可以重复该方法直到该块状体的所有表面都得到接种并且用培养基完全饱和该块状体。应该小心避免加入过量培养基从而导致培养基和细胞从块状体泄漏。然后将该组合物在37℃孵育约60-120分钟而不加入额外的培养基以允许基本上所有细胞都附着到基质材料。细胞粘附后，可以向该基质和细胞组合物加入额外的生长培养基，然后将该组合物在37℃孵育2-3天，每天更换培养基。细胞通常以高密度(见上文)加入基质以基本上填充细胞可利用的基质内的空间，得到与上述相同的结果。洗涤组合物并且可以将其立即使用或者可以如上面关于海绵基质所描述的孵育该组合物。
通过混合组分，例如，将它们来回穿过通过Luer锁紧套口连接的两个注射器可以制备含有自体、经传代的细胞和小颗粒生物可降解的基质(例如，FASCIANTM、CYMETRATM、或DERMALOGENTM)的组合物。例如，通常可以在注射器(例如3cc注射器)中以80mg/注射器得到FASCIANTM。FASCIANTM颗粒可以在使用前直接在注射器中洗涤，通过将小体积(例如，1.5ml)洗涤缓冲液(例如，等渗盐水或者含有右旋糖的Kreb’s Ringers溶液)吸收到注射器中，将第一个注射器通过luer锁紧套口与第二个注射器连接，并将颗粒和洗涤溶液反复穿过两个注射器之间数次可以实现所述洗涤。为了将颗粒与洗涤溶液分离，可以将混合物转移到无菌管中并让FASCIANTM颗粒沉降。可以除去(例如，倒出或者吸出)溶液，并且可以如所希望的通过将颗粒吸到新注射器(例如，通过18号或者20号针头)可以重复洗涤方法。
当适当洗涤颗粒时，可以使用与洗涤相同的方法将颗粒与细胞(例如，UMC，任选地，成纤维细胞)混合。可以将细胞(例如，1×107到3×107个细胞)悬浮在溶液(例如，含有5％右旋糖的1.5ml Kreb’sRingers溶液)并吸到注射器中。含有细胞的注射器可以通过luer锁紧套口连接含有填充剂颗粒的注射器，通过将两种组分反复穿过注射器将它们混合。可以将混合物转移到T-25组织培养瓶或者组织培养皿或者管从而细胞可以附着到填充剂颗粒。备选地，混合物可以保留在注射器中而发生贴壁，尽管这可能对细胞更有害。可以将混合物过夜孵育并转移到容器(例如，小瓶或者管)中以递送给临床医生，或者转移到注射器中以施用于受试者。递送给临床医生的容器可以在递送期间在冰上保持。当使用这种小颗粒无细胞生物可降解的基质时，可以任选地将含有细胞的颗粒悬浮液注射而不是将其植入到组织退变或者缺陷区域。
当含有生物可降解的非细胞基质的组合物中包括两种细胞类型(例如UMC和成纤维细胞)时，可以在将细胞接种到基质前将细胞一起混合。备选地，可以将它们单独接种到基质中。当一种细胞类型(例如，成纤维细胞)在另一种细胞类型(例如，UMC)之前或者之后接种时，可以在第一种接种即刻后或者第一次接种的细胞基本上附着到基质材料之后进行第二种接种。
本发明还提供了制备含有细胞(例如，自体的、经传代的UMC)和基质组分的组合物的方法。这些方法通常包括提供基本上无免疫原性蛋白质(例如，培养基血清来源的蛋白质)的自体的、经传代细胞的悬浮液，提供生物可降解的非细胞基质，将该生物可降解的非细胞基质与该细胞悬浮液孵育使得细胞整合在基质上或者内部，从而形成用于修复或者增大组织的组合物。这些方法还可以包括将细胞(例如，自体、经传代的成纤维细胞)的第二种悬浮液与第一种细胞悬浮液一起或者分别加到基质中。
6.含有填充剂材料的组合物
本发明的组合物可以含有细胞(例如，自体的、经传代的UMC)与一种或多种生物可降解的非细胞可注射的填充剂材料(即，膨胀剂)。该组合物适于注射到受试者中以便修复已经退变的组织。填充剂材料通常完成结构功能。例如，其可以填充组织中缺陷、洞、空间或者腔并提供环境，在该环境中经注射的细胞可以附着到周围组织并生长和产生由于新组织生长导致的结构因子和其他因子(如趋化因子)。在许多情况中，填充剂的缺口填充功能是暂时的并且仅持续到受移植的和/或宿主细胞迁移到该区域并形成新的组织。优选地，填充剂是生物可降解的。通常以粘稠溶液或者悬浮液提供并使用填充剂。填充剂可以与一种或多种细胞类型(例如，UMC和成纤维细胞)组合。细胞通常以约1∶1的体积比与填充剂组合，然而可以使用任何适宜的比例。
多种类型的生物可降解的、非细胞可注射填充剂可加入本发明的组合物。填充剂可以由自体蛋白质组成，该自体蛋白质包括从受试者得到的任一类型的胶原。这种填充剂的实例为Autologen(以前由Collagenesis Corp.(Beverly，MA)生产)。Autologen是源于受试者的自体皮肤胶原纤维的分散剂，因此当与细胞如UMC和任选地，成纤维细胞再施用于该受试者时不引起甚至最小的免疫应答。为了得到Autologen，从受试者得到组织(例如，真皮、胎盘或者脐带)标本并送到Collagenesis Corp.，在那里将该标本加工成富含胶原的分散剂。约1.5平方英寸皮肤组织可以产生1立方厘米(cc)Autologen。可以根据矫正缺陷或者改善受试者中的组织所需的量调节Autologen的浓度。分散剂中Autologen的浓度可以为例如，至少约25mg/L(例如，至少约30mg/L，至少约40mg/L，至少约50mg/L，或至少约100mg/L)。
非细胞可注射的填充剂材料还可以含有非自体蛋白质，包括任何类型的胶原。多种胶原产品是通过商业途径可得到的并且可以用于本发明的组合物。人胶原产品也是通过商业途径可得到的。通过商业途径可得到的胶原的实例包括，但不限于，牛胶原，例如，重构的牛胶原产品，如Zyderm和Zyplast，其含有与戊二醛交联的重构的牛胶原纤维，该胶原纤维悬浮在含有0.3％利多卡因的磷酸缓冲生理盐水中。这些产品由MeGhan Medical Corporation of Santa Barbara，CA生产。猪胶原产品也是通过商业途径可得到的。用于本发明的胶原可以分离自适当物种的组织，或者可以将它们制备成重组蛋白。重组蛋白可以具有与天然发生的蛋白质相同的氨基酸序列，或者它们可以具有含有置换、缺失或者插入的氨基酸序列，所述置换、缺失或者插入提高了该蛋白质的功能。
有用的填充剂材料的其他实例包括，但不限于，经溶解的明胶、聚乙醇酸(例如，经溶解的聚乙醇酸或者聚乙醇酸的颗粒)，或者肠线。适宜的明胶基质植入物，例如，以商标Fibril销售。该填充剂含有等体积的(1)分散在0.9％(体积)氯化钠溶液中的猪明胶粉末和邻氨基己酸，和(2)来自受试者的血浆等分试样。可用作填充剂的其他物质包括透明质、透明质酸、restalyn和parleane。
当含有生物可降解的非细胞填充剂的组合物中包括两种细胞类型(例如，UMC和成纤维细胞)时，这些细胞可以在与填充剂混合前相互混合。备选地，它们可以顺序地与填充剂混合。当一种细胞类型(例如，成纤维细胞)在另一细胞类型(例如，UMC)之前或者之后与填充剂混合，可以在第一种混合即刻后或者适宜的孵育时间后进行第二种混合。
本发明还提供了制备含有细胞(例如，自体、经传代的UMC与或者不与自体、经传代的成纤维细胞)和生物可降解的非细胞填充剂的组合物的方法。这些方法通常包括提供细胞(例如，自体、经传代的UMC和，任选地，成纤维细胞)，其基本上无免疫原性蛋白质(例如，培养基血清来源的蛋白质)，提供一种或多种生物可降解的非细胞填充剂材料，和将该填充剂与该细胞悬浮液合并。备选地，不同细胞类型的单独的悬浮液可以与填充剂合并。
7.使用含有UMC与或者不与成纤维细胞的组合物的方法
本发明的细胞组合物可用于治疗例如，皮肤、骨，或者软组织的缺陷。细胞组合物可用于代替atelocollagen溶液，具有上面提出的优点。可以用本发明组合物治疗的导致组织退变的疾病、失调或者缺陷包括口腔粘膜缺陷、口腔粘膜或者口骨如上颌或者下颌骨的创伤(例如，牙拔除)、牙周病、糖尿病、皮肤溃疡、和静脉停滞。此外，导致组织退变的牙周病的实例包括，但不限于，牙周退变、齿龈炎、或者腭粘膜或者齿龈粘膜的非愈合伤口，或者骨退变。用本发明可以治疗的其他缺陷包括皮肤缺陷，如疤痕、皱纹、笑纹、妊娠纹、凹陷型疤痕、非创伤起源的皮肤凹陷、痤疮疤痕、和痤疮、创伤、先天性畸形或者老化导致的皮下萎缩。此外，本发明的组合物可用于治疗诸如唇发育不全、唇皱褶的缺陷，或者骨缺陷，例如，面部骨，包括眼窝、下颚骨、maxillae、颧骨、颅骨、和鼻骨，以及脊柱骨和长骨缺陷。
本文中所用的“预防”指完全防止疾病症状，延迟疾病症状的发作，或者减轻随后发生的疾病症状的严重性。“防止”应该指疾病(例如，癌症)的症状基本上不存在。本文中所用的“治疗”可以指完全消除疾病的症状或者减轻疾病症状的严重性。
可以对受试者施用本发明的组合物以治疗组织缺陷(例如，上文描述的缺陷)。可通过任何适宜的方法，例如，注射、植入，或者移植进行施用。
可以如下实施本发明的一个实施方案，即治疗细小的浅的面纹。将所要治疗的区域用乙醇准备并拉伸以得到紧绷的表面。用装有细胞悬浮液并用安装30号或者更大(例如，22号、18号、或者12号)针头的注射器注射。针头尽可能浅地插入皮肤部位；斜角的方向不是关键的。可以使用放射性指导。通过轻微的压力进行皮内注射直到看见轻微变白。可以进行多次连续注射。
在其他实施方案中，注射物置于obicularis肌肉组织中以治疗唇发育不全，或者置于皮下组织中以治疗深的皮下缺陷。
在备选实施方案中，通过皮肤磨损到中部或者深处真皮的水平可以治疗痤疮的广泛区域。然后可以形成含有成纤维细胞的凝块以便覆盖被磨损的表面并应用，从而凝块的成纤维细胞接种侧与经磨损的皮肤表面并列。然后所应用的凝块可以经手术敷料，如Xeroform3、Adaptic3或者任何nonocclusive手术敷料覆盖。
在多数情况中，当施用UMC和成纤维细胞时，它们作为单一组合物或者分开的组合物一起使用。然而，可以理解UMC和成纤维细胞可以单独制备并且单独使用。尽管单独施用这两种细胞群体，但是施用可以是同时或者顺序(以任何顺序)的。当顺序施用时，施用可以相隔数分钟(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、或55分钟)，数小时(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、18、22、或23小时)，数天(例如，1、2、3、4、5、或6天)，或数周(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、或更多周)。
8.含有角质细胞和成纤维细胞的组合物的使用方法
角质细胞组成表皮的主要细胞群体，并且在完成受损表皮组织的修复和再生中起主要作用。本发明提供了通过注射含有角质细胞与或者不与成纤维细胞的细胞悬浮液增强组织缺陷(例如，烧伤伤口)的修复。如上文描述，由于角质细胞从伤口的外边缘向中心生长，伤口愈合通常导致疤痕。通过向伤口的中心区域注射角质细胞(例如，自体、经传代的角质细胞)，可以促进愈合并且可以减小或者完全避免疤痕形成。含有角质细胞和成纤维细胞和/或UMC的组合物尤其可用于治疗烧伤(例如，小烧伤或者更大烧伤的残留的、未愈合的部分)，尽管也可以使用含有这些细胞类型的仅一种的组合物。所要治疗的烧伤伤口通常直径约3到5厘米，但是可以是任何大小或者尺寸。该类型的治疗可以用于“填充”和重建创伤如烧伤所破坏的表皮。
9.装置
本发明提供了修复受试者中皮肤缺陷的装置。这些装置可以包括具有注射器腔的皮下注射器、处于注射器腔内的活塞，和与注射器腔连通的孔。该注射器腔可以含有细胞悬浮液，例如，自体、经传代的UMC和自体、经传代的成纤维细胞的悬浮液或者此处公开的任何其他细胞组合物或者细胞混合物的悬浮液。细胞悬浮液可以基本上无培养基血清来源的蛋白质。细胞可以悬浮在培养基(例如，无血清培养基)或者药学上可接受的载体溶液(例如，无菌水或者生理盐水)中。该装置还可以具有固定到与注射器腔连通的孔的皮下注射针头。
本发明还提供了制备上述装置的方法。这些方法可以包括使用本文中描述的任一种方法制备细胞悬浮液，然后将该细胞悬浮液置于注射器的注射腔中。
将通过下面的实施例进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求书中描述的本发明范围。
实施例
实施例1-自体UMC和成纤维细胞的分离
如下从正常健康人类志愿者所得的皮肤活组织检查收获细胞并通过启动培养体外富集细胞。从耳后部位得到约3到5mm3的活组织检查，并且使用含有4500mg/L D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和10％FBS的DMEM如上所述启动成纤维细胞组织培养。传代两次或三次贴壁成纤维细胞达到完全汇合后观察到非贴壁的、旺盛生长的细胞的集落。通过在低血清并存在5ng/ml aFGF时，或者通过在血浆凝块(见实施例2)中生长并加入300mM CaCl2到终浓度15到30mM可以缩短该过程。每个集落含有2到约80个细胞，它们与上皮样细胞相似并且旺盛分裂。通过吸出含有漂浮集落的培养基并离心该培养基收集集落。通过直接接种在含有aFGF和肝素的新鲜培养基(含有4500mg/L D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、2.5％热灭活的FBS、5ng/mL重组人aFGF，和5μg/mL肝素的DMEM)将离心沉淀的细胞转移到新的组织培养容器中。将细胞悬浮液加入新鲜组织培养瓶，将该瓶在37℃孵育。细胞经每周喂饲两次，并当达到汇合时经传代或者差别胰蛋白酶化(通常1到2周内)。在开始培养的约3-6周内观察到鹅卵石样细胞的集落。分离这些集落并在新鲜组织培养容器中培养导致细胞变得贴壁。
如下还从人脂肪组织分离非贴壁细胞的集落。将组织切成小块并除去所有可见的膜。将组织置于含有4500mg/L D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、2.5％热灭活的FBS、1-10ng/mL重组人aFGF，和5μg/mL肝素的DMEM中培养。在这些条件下，鹅卵石样细胞主动地从脂肪组织脱落，并继续生长一段时间。洗涤脂肪组织小块并将其置于新的组织培养容器中。约2周内，通过用胶原酶IV在37℃处理约5-15分钟从组织分离UMC。源于脂肪组织的新细胞保持培养中旺盛生长1年以上，直到结束培养。一旦培养物完全生长，观察到非贴壁细胞群。当将这些细胞再接种在新的组织培养瓶中时，观察到相同细胞类型旺盛生长。
存在aFGF时，来自皮肤和脂肪组织的培养中的细胞在外观上是形态均一的，像上皮样的细胞，具有鹅卵石样形态。然而，当从培养基除去aFGF时，多数细胞完全分化成贴壁成纤维细胞。使用Marko等人(如前)描述的方法在从骨髓开始的培养物中也观察到鹅卵石样的贴壁细胞。推断从皮肤建立的成纤维细胞培养物或者脂肪组织或者骨髓的培养物收获的非贴壁的类似上皮样的细胞的至少一个亚群是UMC。
实施例2血浆凝块中细胞的分离和生长
在血浆凝块凝胶中培养如本文中描述的分离的细胞。该方法用于分离和纯化多种细胞类型。使用自体人血浆、牛血浆或者小牛血浆制备血浆凝块，血纤蛋白或者氯化钙用作凝固剂。制备血浆凝块凝胶，将其预洗涤，然后接种从培养瓶直接转移的所希望的细胞类型。可容易地从凝块凝胶直接分离细胞集落。备选地，通过克隆装置或者孔盘插入物分离细胞，在这种情况下将细胞接种在插入物中并且用于生长因子递送的支持细胞(例如，成纤维细胞或者其他所希望的细胞类型)被接种在插入物下面。
实施例3用成纤维细胞悬浮液治疗烧伤伤口
通过向伤口直接注射无酚红的DMEM中的约30到40×106个成纤维细胞/ml的悬浮液治疗覆盖全部前额的6个月久的非愈合烧伤伤口的患者。以2周间隔类似地再注射烧伤伤口两次，尽管通过第二次注射，伤口几乎完全封闭。该伤口随后愈合，其具有最小的疤痕形成。治疗激光烧伤的其他患者得到类似的成功。第三次注射后，如果需要，将未使用的细胞保存在液氮中备用。含有角质细胞以及成纤维细胞的组合物将至少和只含有成纤维细胞的那些组合物一样有效，可能更有效。此外，考虑到UMC可以分化成成纤维细胞，无论UMC不与或者与成纤维细胞一起施用，都和成纤维细胞一样有效。
实施例4用活化因子优化UMC的治疗
实施体外实验以确定加入到UMC培养中的活化化合物的最佳浓度。将在基质或者单层中的UMC培养物与多种浓度的活化化合物(如本文中公开的那些)孵育。通过评估哪种浓度与细胞增殖的最大水平相关来确定最佳浓度。备选地，最佳浓度为导致胶原产生的最大水平的浓度。胶原被分泌到培养基中，通过免疫学测定法如蛋白质印迹或者ELISA检测胶原。用成纤维细胞试验的活化化合物的最佳浓度对于抗坏血酸为10-5M，抗坏血酸基棕榈酸酯10-7M，和L-硫辛酸为10-6-10-7M。
其他实施方案
可以理解尽管关于本发明的详细描述描述了本发明，但是前面的描述用于阐明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点，和修改在所附权利要求书的范围内。

Claims (62)

1.用于修复组织的组合物，其中所述组合物含有自体的、经传代的UMC和自体的、经传代的成纤维细胞，并且其中所述组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质。
2.权利要求1的组合物，其中所述自体成纤维细胞来自所述受试者的牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、骨髓、筋膜、或者脂肪组织。
3.权利要求1的组合物，其中所述UMC来自皮肤组织、脂肪组织、结缔组织、筋膜、固有层、或骨髓。
4.权利要求1的组合物，其中所述UMC或所述成纤维细胞已经经一种或多种活化化合物处理。
5.权利要求4的组合物，其中所述一种或多种活化化合物选自抗坏血酸棕榈酸酯、亚油酸、奎尼酸、奎尼酸盐、奎宁内酯、辅酶Q-10、L-羟酸、L-硫辛酸、磷酸二氢钙、三磷酸钙、烟酸、脱氢表雄甾酮(DHEA)、二甲基氨基乙醇(DMAE)、E-生育酚、骨形态发生蛋白质(BMP)、维生素E、维生素C、类胡萝卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉碱、丙炔苯丙胺、番茄红素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、长春西汀、视黄酸、抗癌肽类，和生长因子。
6.权利要求1的组合物，其中所述UMC或所述成纤维细胞已经暴露于低能量激光。
7.权利要求1的组合物，其中组合物还含有生物可降解的基质，其中所述UMC和所述成纤维细胞整合到所述基质的内部或者上面。
8.权利要求7的组合物，其中所述基质与所述UMC和所述成纤维细胞组合前，含有选自胶原、糖胺聚糖、明胶、聚乙醇酸、肠线、脱矿质骨、羟基磷灰石和无机骨的一种或多种物质。
9.权利要求1的组合物，其还含有生物可降解的非细胞可注射填充剂。
10.权利要求9的组合物，其中所述生物可降解的非细胞可注射填充剂在与所述UMC组合前，含有选自(a)自体胶原纤维的可注射的分散剂；(b)胶原；(c)经溶解的明胶；(d)经溶解的聚乙醇酸；(e)经溶解的肠线；(f)分散在氯化钠溶液和受试者的血浆等分试样中的猪明胶粉和氨基己酸；和(g)透明质酸的一种或多种物质。
11.修复受试者中组织的方法，其中所述方法包括：
(a)提供含有自体的、经传代的UMC的组合物，其中该组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质；
(b)鉴定受试者中组织缺陷或者组织退变的部位；和
(c)将所述组合物置于所述部位从而组织缺陷或者退变得到修复；
其中所述组织缺陷或者退变包括软组织缺陷、口腔粘膜缺陷、口腔粘膜创伤、牙周病、糖尿病、皮肤溃疡、静脉停滞，或者皮肤的美容缺陷。
12.权利要求11的方法，其中所述软组织缺陷选自面部凹陷、乳腺发育不全、乳腺缺乏、声带缺陷、腭咽功能不全、Poland氏综合征、阴茎发育不全、唇发育不全，和皮下萎缩或者肌肉萎缩。
13.权利要求11的方法，其中所述口腔粘膜创伤是牙拔除导致的拔除牙槽。
14.权利要求11的方法，其中所述牙周病包括牙周退变、牙龈炎，或者腭粘膜或者齿龈粘膜的非愈合伤口。
15.权利要求11的方法，其中所述美容缺陷选自：皱纹、凹陷型疤痕、非创伤起源的皮肤凹陷、笑纹、妊娠纹、皱纹、创伤疤痕、痤疮疤痕、和皮下萎缩。
16.权利要求11的方法，其中所述组织缺陷是唇发育不全或者或者唇皱褶。
17.权利要求11的方法，其中所述自体UMC来自所述受试者的牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、或脂肪组织。
18.权利要求11的方法，其中所述组合物还含有生物可降解的基质，其中所述UMC整合在该基质的内部或者上面。
19.权利要求11的方法，其中所述组合物还含有生物可降解的非细胞填充剂。
20.修复受试者中组织缺陷的方法，其中该方法包括：
(a)提供含有自体的、经传代的UMC和自体的、经传代的成纤维细胞的组合物，其中该组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质；
(b)鉴定受试者中组织缺陷或者组织退变的部位；和
(c)将该组合物置于该部位从而组织缺陷或者退变得到修复。
21.修复受试者中组织缺陷的方法，其中所述方法包括：
(a)提供含有：(1)自体的、经传代的UMC，(2)自体的、经传代的成纤维细胞，和(3)其药学上可接受的载体的药物组合物；其中所述药物组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质；
(b)鉴定所述受试者中组织缺陷或者组织退变的部位，所述缺陷或者退变选自：牙或者牙周缺陷、皮肤的美容缺陷、和骨缺陷；和
(c)将治疗有效量的所述药物组合物注射到所述组织缺陷或者退变的邻近部位，其中所述注射导致所述组织缺陷或者退变的修复。
22.修复受试者中由于所述受试者的疾病、失调或者缺陷导致的退变的组织的方法，所述方法包括将权利要求9的组合物注射到所述受试者中所述退变部位以便所述组织得到修复。
23.修复受试者中由于所述受试者中疾病、失调或者缺陷导致的退变的组织的方法，所述方法包括将权利要求7的组合物置于所述受试者中所述退变部位以便所述组织得到修复。
24.修复受试者中由于所述受试者中疾病、失调或者缺陷导致的退变的组织的方法，所述方法包括步骤：
(a)将自体的、经传代的UMC注射到所述受试者中组织退变部位，其中所述UMC基本上无培养基血清来源的蛋白质；
(b)将自体的、经传代的成纤维细胞注射到所述受试者中组织缺陷或者所希望的组织增大的部位，其中该成纤维细胞基本上无培养基血清来源的蛋白质；和
(c)将生物可降解的非细胞填充剂注射到该部位。
25.制备用于修复组织的细胞组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供含有未经分化的间充质细胞(UMC)的组织的活组织检查样品以得到起始细胞；
(b)从所述活组织检查样品分离起始细胞；
(c)培养所述起始细胞；和
(d)从所述培养物收获非贴壁衍生细胞群体，
其中所述非贴壁衍生细胞含有UMC。
26.权利要求25的方法，其还包括利用来自前面轮收获的非贴壁衍生细胞群体作为起始细胞重复步骤(c)和(d)的一轮或多轮衍生。
27.权利要求26的方法，其中所述一轮或多轮衍生包括1到20轮。
28.权利要求25的方法，其中所述含有UMC的组织选自：皮肤组织、脂肪组织、结缔组织、筋膜、固有层和骨髓。
29.权利要求25的方法，其还包括在酸性成纤维细胞生长因子的存在下培养所述非贴壁细胞。
30.制备修复受试者中由于所述受试者中疾病、失调或者缺陷导致的退变的组织的组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供来自所述受试者的含有UMC的组织的活组织检查样品；
(b)从所述活组织检查样品分离自体UMC；
(c)在产生基本上没有培养基血清来源的蛋白质的自体UMC的条件下培养所述自体UMC；
(d)将所述经培养的自体UMC暴露于导致所述UMC悬浮的条件；
(e)提供来自所述受试者的含有成纤维细胞的组织的活组织检查样品；
(f)从所述活组织检查样品分离自体成纤维细胞；
(g)在产生基本上没有培养基血清来源的蛋白质的成纤维细胞的条件下培养所述自体成纤维细胞；
(h)将所述经培养的自体成纤维细胞暴露于导致所述成纤维细胞悬浮的条件；和
(i)将所述UMC悬浮液与所述成纤维细胞悬浮液混合。
31.权利要求30的方法，其中所述含有UMC的组织选自牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。
32.权利要求30的方法，其中所述含有自体成纤维细胞的组织选自牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。
33.权利要求30的方法，其中在所述组合前，所述UMC或者所述成纤维细胞暴露于一种或多种活化化合物。
34.权利要求33的方法，其中所述一种或多种活化化合物选自抗坏血酸棕榈酸酯、亚油酸、奎尼酸、奎尼酸盐、奎宁内酯、辅酶Q-10、L-羟酸、L-硫辛酸、磷酸二氢钙、三磷酸钙、烟酸、DHEA、DMAE、E-生育酚、BMP、维生素E、维生素C、类胡萝卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉碱、丙炔苯丙胺、番茄红素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、长春西汀、视黄酸、抗癌肽类，和生长因子。
35.权利要求30的方法，其中所述UMC或所述成纤维细胞暴露于低能量激光。
36.制备修复受试者中由于所述受试者中疾病、失调或者缺陷导致的退变的组织的组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供自体的经传代的UMC；
(b)提供自体的经传代的成纤维细胞；
(c)提供生物可降解的非细胞基质；和
(d)将所述UMC和所述成纤维细胞与所述生物可降解的非细胞基质孵育从而所述UMC和/或成纤维细胞整合在所述生物可降解的非细胞基质上或者内部，
其中该孵育导致用于修复组织的组合物，并且其中所述孵育的条件为使得所述组合物基本上无培养基血清来源的蛋白质的条件。
37.权利要求36的方法，其中提供自体的经传代的UMC的步骤包括：
(a)提供来自所述受试者的含有UMC的组织的活组织检查样品；
(b)从所述活组织检查样品分离自体UMC；
(c)培养所述UMC；和
(d)将所述经培养的UMC暴露于导致所述UMC悬浮的条件。
38.权利要求37的方法，其中所述含有UMC的组织选自：牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。
39.权利要求36的方法，其中所述生物可降解的非细胞基质在与所述UMC和所述成纤维细胞组合前含有一种或多种物质，所述物质选自胶原、糖胺聚糖、明胶、聚乙醇酸、肠线、脱矿质骨、羟基磷灰石、珊瑚和无机骨。
40.权利要求36的方法，其中提供自体的经传代的成纤维细胞的步骤包括：
(a)提供来自所述受试者的含有成纤维细胞的组织的活组织检查样品；
(b)从所述活组织检查样品分离自体成纤维细胞；
(c)培养所述成纤维细胞；和
(d)悬浮所述成纤维细胞。
41.权利要求40的方法，其中所述含有成纤维细胞的组织选自牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。
42.权利要求36的方法，其中在与所述生物可降解的非细胞基质的所述孵育前，所述UMC或者所述成纤维细胞暴露于一种或多种活化化合物。
43.权利要求42的方法，其中所述一种或多种活化化合物选自抗坏血酸棕榈酸酯、亚油酸、奎尼酸、奎尼酸盐、奎宁内酯、辅酶Q-10、L-羟酸、L-硫辛酸、磷酸二氢钙、三磷酸钙、烟酸、DHEA、DMAE、E-生育酚、BMP、维生素E、维生素C、类胡萝卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉碱、丙炔苯丙胺、番茄红素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、长春西汀、视黄酸、抗癌肽类，和生长因子。
44.权利要求36的方法，其中所述UMC或所述成纤维细胞暴露于低能量激光。
45.制备修复受试者中由于所述受试者中疾病、失调或者缺陷导致的退变的组织的组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供自体的、经传代的UMC，其中所述UMC基本上无培养基血清来源的蛋白质；
(b)提供自体的、经传代的成纤维细胞，其中所述自体的、经传代的成纤维细胞基本上无培养基血清来源的蛋白质；
(c)提供生物可降解的非细胞填充剂；和
(d)将所述自体的、经传代的UMC、所述自体的、经传代的成纤维细胞与所述生物可降解的非细胞填充剂组合。
46.权利要求45的方法，其中提供自体经传代的UMC的步骤包括：
(a)提供来自所述受试者的含有UMC的组织的活组织检查样品；
(b)从所述活组织检查样品分离自体UMC；
(c)在导致基本上无培养基血清来源的蛋白质的UMC的条件下培养所述自体UMC；和
(d)将所述经培养的UMC暴露于导致所述UMC悬浮的条件。
47.权利要求46的方法，其中所述含有UMC的组织选自牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。
48.权利要求45的方法，其中所述生物可降解的非细胞填充剂在与所述UMC和所述成纤维细胞组合前，含有选自：(a)自体胶原纤维的可注射的分散剂；(b)胶原；(c)经溶解的明胶；(d)经溶解的聚乙醇酸；(e)经溶解的肠线；(f)分散在氯化钠溶液和受试者的血浆等分试样中的猪明胶粉和氨基己酸；和(g)透明质酸的一种或多种物质。
49.权利要求46的方法，其中提供自体经传代的成纤维细胞的步骤包括：
(a)提供来自所述受试者的含有成纤维细胞的组织的活组织检查样品；
(b)从所述活组织检查样品分离自体成纤维细胞；
(c)在导致基本上无培养基血清来源的蛋白质的成纤维细胞的条件下培养所述自体成纤维细胞；和
(d)将所述经培养的自体成纤维细胞暴露于导致所述成纤维细胞悬浮的条件。
50.权利要求49的方法，其中所述含有成纤维细胞的组织选自牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。
51.权利要求45的方法，其中在与所述生物可降解的非细胞填充剂的所述组合前，所述UMC或者所述成纤维细胞暴露于一种或多种活化化合物。
52.权利要求51的方法，其中所述一种或多种活化化合物选自抗坏血酸棕榈酸酯、亚油酸、奎尼酸、奎尼酸盐、奎宁内酯、辅酶Q-10、L-羟酸、L-硫辛酸、磷酸二氢钙、三磷酸钙、烟酸、DHEA、DMAE、E-生育酚、BMP、维生素E、维生素C、类胡萝卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉碱、丙炔苯丙胺、番茄红素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、长春西汀、视黄酸、抗癌肽类，和生长因子。
53.权利要求45的方法，其中所述UMC或所述成纤维细胞暴露于低能量激光。
54.修复受试者中烧伤伤口的方法，所述方法包括提供自体的、经传代的角质细胞和自体的、经传代的成纤维细胞的悬浮液并将所述悬浮液注射到所述烧伤伤口中。
55.权利要求54的方法，其中所述提供自体的、经传代的角质细胞和自体的、经传代的成纤维细胞的悬浮液包括：
(a)提供来自所述受试者的含有角质细胞的组织的活组织检查样品；
(b)从所述活组织检查样品分离自体角质细胞；
(c)在产生基本上没有培养基血清来源的蛋白质的自体角质细胞的条件下培养所述自体角质细胞；
(d)将所述角质细胞暴露于导致所述角质细胞悬浮的条件；
(e)提供来自所述受试者的含有成纤维细胞的组织的活组织检查样品；
(f)从所述活组织检查样品分离自体成纤维细胞；
(g)在产生基本上没有培养基血清来源的蛋白质的自体成纤维细胞的条件下培养所述自体成纤维细胞；
(h)将所述成纤维细胞暴露于导致所述成纤维细胞悬浮的条件；和
(i)将所述悬浮的角质细胞和悬浮的成纤维细胞组合。
56.权利要求54的方法，其中所述含有角质细胞的组织选自皮肤、口腔粘膜、牙床、颊组织、食管组织、外宫颈组织，和结膜组织。
57.权利要求54的方法，其中所述含有成纤维细胞的组织选自：牙床、腭区、皮肤、固有层、结缔组织、筋膜、骨髓、和脂肪组织。
58.权利要求54的方法，其中在与所述角质细胞组合前，所述成纤维细胞暴露于一种或多种活化化合物。
59.权利要求58的方法，其中所述一种或多种活化化合物选自抗坏血酸棕榈酸酯、亚油酸、奎尼酸、奎尼酸盐、奎宁内酯、辅酶Q-10、L-羟酸、L-硫辛酸、磷酸二氢钙、三磷酸钙、烟酸、DHEA、DMAE、E-生育酚、BMP、维生素E、维生素C、类胡萝卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉碱、丙炔苯丙胺、番茄红素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、长春西汀、视黄酸、抗癌肽类，和生长因子。
60.权利要求54的方法，其中所述成纤维细胞暴露于低能量激光。
61.权利要求54的方法，其中所述悬浮液还含有自体的、经传代的UMC。
62.权利要求54的方法，其还包括将强化化合物注射到所述伤口。
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