JP2006510399A - 未分化間葉細胞を用いた組織の治療 - Google Patents

未分化間葉細胞を用いた組織の治療 Download PDF

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Abstract

本発明は、被験者の皮膚、軟部組織、および骨における美容上の、審美上の、および変性した欠陥を修復するための組成物および方法を提供する。特に、本発明の方法は、欠陥に隣接したもしくは準隣接した組織(例えば皮下組織)に、または欠陥の部位の組織に、自己由来のUMC、繊維芽細胞および／またはケラチノサイトを注入または移植することを含んでなる。本発明において提供する、注入される細胞は、被験者と組織適合性であり(例えば自己由来であり)、細胞培養系での継代により増殖させたものである。

Description

本発明は、未分化の間葉細胞を含有する組成物、ならびに、自己由来の未分化間葉細胞を用いた歯の欠陥、皮膚や軟部組織の欠陥、および骨の欠陥の治療方法に関する。
皮膚、骨、軟部組織、および歯の組織の欠陥は、創傷、疾病および加齢などの要因により引き起こされ得る。このような症状に冒されている組織を修復および／または増強するためにいくつかの方法が設計されているが、瘢痕化を避けると同時に組織増殖を可能にする改善された方法が有用であろう。
米国特許第5,591,444号、第5,660,850号、第5,665,372号および第5,858,390号ならびに同時係属中の米国特許出願第09/678,047号は、参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする。
概略
本発明は、被験者の皮膚、軟部組織、および骨における、美容上の、審美上の、および変性した欠陥を修復するための組成物および方法を提供する。特に本発明の方法は、欠陥に隣接または準隣接する組織(例えば皮内組織)に、または欠陥の部位の組織に、自己由来の未分化間葉細胞(undifferentiated mesenchymal cell: UMC)、繊維芽細胞、および／またはケラチノサイトを注入または移植することを含んでなる。本方法により修復できる欠陥は、例えば、しわ、皮膚萎縮線条、陥没した瘢痕、外傷に起因しない皮膚の陥没、尋常性座瘡による瘢痕、口唇の形成不全、歯周欠陥、軟部組織欠陥（例えば、口蓋帆咽頭不全および皮下萎縮）、骨の欠陥、ならびに熱傷を含む。本明細書において提供する、注入される細胞は、被験者と組織適合性であり、細胞培養系での継代により増殖させたものである。注入される細胞は、好ましくは自己由来細胞である。本発明はまた、UMCを含有する細胞集団を作製するためのin vitro方法を提供する。
１つの実施形態において、本発明の組成物は、継代した自己由来UMCおよび継代した自己由来繊維芽細胞の両方を含むことができる。このような細胞は、例えば、被験者から得られた１つ以上の生検標本の培養から誘導することができる。別の実施形態では、組成物は、継代した自己由来UMCを生分解性無細胞性マトリックスとともに含み、継代した自己由来繊維芽細胞は含んでも含まなくてもよい。さらなる実施形態では、組成物は、継代した自己由来UMCを生分解性無細胞性充填剤とともに含み、継代した自己由来繊維芽細胞は含んでも含まなくてもよい。別の実施形態は、継代した自己由来ケラチノサイトおよび継代した自己由来繊維芽細胞を、マトリックスまたは充填剤の存在下または不在下で、含有する。
本発明は、さらに、継代した自己由来UMC、繊維芽細胞およびケラチノサイトが、培地に存在する免疫原性タンパク質(すなわち培地血清由来のタンパク質)を実質的に含まないようにする方法を提供するが、このことにより免疫応答を刺激することなく該細胞を用いて、被験者における欠陥を修復することができる。この方法は、増殖させたUMC、繊維芽細胞、ケラチノサイト、またはこれらの細胞集団の１種以上を含有する生分解性無細胞性マトリックスを、血清(例えば、ウシ胎仔血清(FBS))含有培地で培養した後、無血清培地で一定期間インキュベートすることを含む。別の実施形態では、細胞または細胞を含有する生分解性無細胞性マトリックスを、無血清培地または自己由来血清含有培地でのみ、培養する。
本発明は、一部には、自己由来細胞が、欠陥の部位または欠陥に近い(例えば準隣接)部位における組織(例えば真皮、皮下組織、および骨)を補強するのに理想的な材料であるという知見に基づく。本発明はまた、自己由来細胞の豊富な供給量が、欠陥の治療前に被験者から取得した生検標本を培養することにより得られるという認識に基づく。本発明はさらに、自己由来細胞が、異種血清含有組織培養培地での増殖の後に異種血清に由来するかなりの量の免疫原性タンパク質を含有するものの、免疫原性タンパク質は被験者への注入前に除去できるという認識に基づく。
１つの態様において本発明は、組織修復のための細胞性組成物の調製方法を提供するが、その方法は、(a) 出発細胞を得るために、未分化間葉細胞(UMC)含有組織の生検材料を用意すること；(b)前記生検材料から出発細胞を分離すること；(c)出発細胞を培養すること；および(d)該培養物からUMCを含有する非付着性誘導細胞の集団を回収すること、を含んでなる。この方法はさらに、前のラウンドで回収した非付着性誘導細胞の集団を出発細胞として利用して工程(c)および(d)を繰り返すことを含む誘導体化を１ラウンド以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95、100またはそれ以上のラウンド)含んでもよい。前記誘導体化の１以上の追加のラウンドは、例えば1〜20ラウンドを含んでもよい。UMC含有組織は、真皮組織、脂肪組織、結合組織、筋膜、粘膜固有層、および骨髄からなる群より選択することができる。本方法はさらに、非付着性細胞を酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)の存在下で培養することを含んでもよい。
別の態様において本発明は、組織修復のための組成物を提供する。この組成物は、自己由来の継代したUMCを含有し、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものでありうる。組成物はさらに、自己由来の継代した繊維芽細胞を含んでもよい。自己由来繊維芽細胞は、被験者の歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄、筋膜、または脂肪組織からのものでありうる。UMCまたは繊維芽細胞は、活性化化合物(例えば、アスコルビルパルミテート、リノール酸、C-MED 100(登録商標)(Optigene-X LLC, Shrewsbury, NJ)、キナ酸、キナ酸塩、キナ酸ラクトン、コエンザイムQ-10、L-ヒドロキシ酸、L-リポ酸、カルシウム一リン酸、カルシウム三リン酸、ナイアシン、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)、ジメチルアミノエタノール(DMAE)、α-トコフェロール、骨形成タンパク質(BMP)、ビタミンE、ビタミンC、カロテノイド、グリコール酸、カルボキシアルキルエステル、エストリオール、アセチル-L-カルニチン、デプレニル、リコペン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)、システイン、プロシステイン、ピカミロン、ビンポセチン、レチノイン酸、アンチネオプラストン、または他の刺激性添加剤、例えば増殖因子(例：ヒト成長ホルモン、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、インスリン様増殖因子(IGF-I)、インスリン、および長鎖型(longform) R3 IGF-I))で処理することができる。UMCまたは繊維芽細胞はまた、被験者に投与する前に低エネルギーレーザー光に曝露してもよい。組成物はさらに、生分解性の無細胞性マトリックスを含有することができ、ここでUMCおよび／または繊維芽細胞はマトリックス内にまたは上に組み込まれている。UMCおよび／または繊維芽細胞と組み合わせる前のマトリックスは、コラーゲン(例えばウシコラーゲン、ブタコラーゲン、ヒトコラーゲン、遺伝子操作コラーゲン、またはグルタルアルデヒドで架橋したグリコサミノグリカンとコラーゲン)、グリコサミノグリカン、ゼラチン、ポリグリコール酸、腸線(cat gut)、脱灰骨、ヒドロキシアパタイト、ヒアルロン、ヒアルロン酸、サンゴおよび非有機質骨からなる群より選択される物質を１以上含有しうる。細胞が利用可能なマトリックス上または内の空間を実質的に満たすのに十分なUMCおよび／または繊維芽細胞をマトリックス上にまたは内に組み込むことができる。組成物はさらに、またはこれとは別に、注入可能な生分解性無細胞性充填剤を含有しうる。UMCおよび／または繊維芽細胞と組み合わせる前の注入可能な前記生分解性無細胞性充填剤は、(a)自己由来コラーゲン繊維の注入可能な分散体、(b)コラーゲン(例えばウシコラーゲン、グルタルアルデヒドで架橋した再構成ウシコラーゲン繊維、または自己由来コラーゲン)、(c)可溶化ゼラチン、(d)可溶化ポリグリコール酸、(e)可溶化腸線、(f)塩化ナトリウム溶液中に分散させたブタゼラチン粉末とアミノカプロン酸、および被験者由来の血漿のアリコート、ならびに(g)ヒアルロン酸からなる群から選択される物質を１つ以上含むことができる。
別の態様において、本発明は、被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した被験者の組織を修復するための組成物の調製方法を提供する。この方法は、(a)被験者由来のUMC含有組織の生検材料を用意すること、(b)前記生検材料から自己由来UMCを分離すること、(c)培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない自己由来UMCを産生する条件下で自己由来UMCを培養すること、ならびに(d)培養した自己由来UMCを、UMCの懸濁物が得られる条件にさらすこと、を含んでなる。UMC含有組織は、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄、筋膜、および脂肪組織からなる群より選択することができる。UMCの培養は、(1)0.1〜約20%のヒト血清または非ヒト血清を含有する培地でインキュベートし、次いで(2)無血清培地でインキュベートすることを含みうる。これとは別に、UMCの培養を無血清培地のみで行うこともできる。UMCの懸濁物が得られる条件は、トリプシンなどのタンパク質分解酵素の使用を含み得る。これとは別のタンパク質分解酵素としては、ディスパーゼおよびコラゲナーゼが挙げられる。UMCの懸濁物が得られる条件は、さらに、またはこれとは別にEDTAの使用を含んでもよい。この方法はさらに、(e)被験者由来の繊維芽細胞含有組織の生検材料を用意すること、(f)前記生検材料から自己由来繊維芽細胞を分離すること、(g)培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない繊維芽細胞を産生する条件下で自己由来繊維芽細胞を培養すること、(h)繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件に、前記培養した自己由来繊維芽細胞をさらすこと、ならびに(i)前記UMC懸濁物を前記繊維芽細胞懸濁物と混合することを含みうる。自己由来繊維芽細胞含有組織は、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、筋膜、骨髄および脂肪組織からなる群より選択することができる。繊維芽細胞の培養は、(1)0.1〜約20%のヒト血清または非ヒト血清を含有する培地でインキュベートし、次いで(2)無血清培地でインキュベートすることを含む。これとは別に、繊維芽細胞の培養を無血清培地のみで行ってもよい。繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件は、トリプシンなどのタンパク質分解酵素の使用を含み得る。これとは別のタンパク質分解酵素としては、ディスパーゼおよびコラゲナーゼが挙げられる。繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件はさらに、またはこれとは別に、EDTAの使用を含んでもよい。混合する前に、UMCまたは繊維芽細胞を活性化化合物(例えば、アスコルビルパルミテート、リノール酸、C-MED 100(登録商標)、キナ酸、キナ酸塩、キナ酸ラクトン、コエンザイムQ-10、L-ヒドロキシ酸、L-リポ酸、カルシウム一リン酸、カルシウム三リン酸、ナイアシン、DHEA、DMAE、α-トコフェロール、BMP、ビタミンE、ビタミンC、カロテノイド、グリコール酸、カルボキシアルキルエステル、エストリオール、アセチル-L-カルニチン、デプレニル、リコペン、NADH、システイン、プロシステイン、ピカミロン、ビンポセチン、レチノイン酸、アンチネオプラストン、または他の刺激性添加剤、例えば増殖因子(例えばヒト成長ホルモン、FGF、VEGF、IGF-I、インスリン、および長鎖型 R3 IGF-I))に曝露することができる。UMCまたは繊維芽細胞はまた、低エネルギーレーザー光に曝露してもよい。
別の態様において、本発明は、被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した被験者の組織を修復するための組成物の調製方法を提供する。この方法は、(a)自己由来の継代したUMCを得ること、(b)生分解性無細胞性マトリックスを用意すること、ならびに(c)UMCが生分解性無細胞性マトリックス上にまたは内に組み込まれるように、UMCを生分解性無細胞性マトリックスとともにインキュベートすること、を含んでなり、ただしここで、前記インキュベーションが組織修復のための組成物をもたらし、インキュベーションの条件は、前記組成物が培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないようなものである。自己由来の継代したUMCの懸濁物を調製する工程は、(a)被験者由来のUMC含有組織の生検材料を用意すること、(b)前記生検材料から自己由来UMCを分離すること、(c)前記UMCを培養すること、ならびに(d)UMCの懸濁物が得られるような条件に、培養したUMCを曝露すること、を含みうる。UMC含有組織は、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、筋膜、骨髄、および脂肪組織からなる群より選択することができる。UMCの懸濁物と混合する前の生分解性無細胞性マトリックスは、コラーゲン(例えばグルタルアルデヒドで架橋したグリコサミノグリカンとコラーゲン、ウシコラーゲン、またはブタコラーゲン)、グリコサミノグリカン、ゼラチン、ポリグリコール酸、腸線、脱灰骨、ヒドロキシアパタイト、サンゴおよび非有機質骨からなる群より選択される物質を１以上含有することができる。インキュベーション条件は、(1)0.1〜約20%のヒト血清または非ヒト血清を含有する培地で培養し、次いで(2)無血清培地で培養することを含み得る。これとは別に、培養は無血清培地のみで行うこともできる。細胞が利用可能な生分解性無細胞性マトリックス上または内の空間を実質的に満たすのに十分なUMCをマトリックス上にまたは内に組み込むことができ。
本方法はさらに、自己由来の継代した繊維芽細胞を用意し、繊維芽細胞を生分解性無細胞性マトリックスとともにインキュベートすることにより、繊維芽細胞が生分解性無細胞性マトリックス上にまたは内に組み込まれるようにする、ことを含んでなり、ここで前記インキュベーションが組織修復のための組成物をもたらし、インキュベーションの条件は、前記組成物が培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないようなものである。自己由来の継代した繊維芽細胞を調製する工程は、(a)被験者由来の繊維芽細胞含有組織の生検材料を用意すること、(b)前記生検材料から自己由来繊維芽細胞を分離すること、(c)前記繊維芽細胞を培養すること、(d)繊維芽細胞を懸濁させる、ことを含みうる。繊維芽細胞含有組織は、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、筋膜、骨髄および脂肪組織からなる群から選択してもよい。細胞が利用可能な生分解性無細胞性マトリックス上または内の空間を実質的に満たすのに十分なUMCおよび繊維芽細胞を、生分解性無細胞性マトリックス上にまたは内に組み込むことができる。生分解性無細胞性マトリックスとともにインキュベートする前に、UMCおよび／または繊維芽細胞は、活性化化合物(例えば、アスコルビルパルミテート、リノール酸、C-MED 100(登録商標)、キナ酸、キナ酸塩、キナ酸ラクトン、コエンザイムQ-10、L-ヒドロキシ酸、L-リポ酸、カルシウム一リン酸、カルシウム三リン酸、ナイアシン、DHEA、DMAE、α-トコフェロール、BMP、ビタミンE、ビタミンC、カロテノイド、グリコール酸、カルボキシアルキルエステル、エストリオール、アセチル-L-カルニチン、デプレニル、リコペン、NADH、システイン、プロシステイン、ピカミロン、ビンポセチン、レチノイン酸、アンチネオプラストン、または他の刺激性添加剤、例えば増殖因子(例えばヒト成長ホルモン、FGF、VEGF、IGF-I、インスリン、および長鎖型 R3 IGF-I))に曝露することができる。UMCまたは繊維芽細胞は、低エネルギーレーザー光に曝露してもよい。UMCと繊維芽細胞を一緒にして、生分解性無細胞性マトリックスとともにインキュベートしてもよく、または、UMCおよび繊維芽細胞を別々に生分解性無細胞性マトリックスに添加してもよい。
別の態様において、本発明は、被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した被験者の組織を修復するための組成物の調製方法を提供する。この方法は、(a)自己由来の継代したUMCを調製すること、ただしここでUMCは培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものであること、(b)生分解性無細胞性充填剤を用意すること、ならびに(c)前記自己由来の継代したUMCと前記生分解性無細胞性充填剤とを組み合わせること、を含んでなる。自己由来の継代したUMCの懸濁物を調製する工程は、(a)被験者由来のUMC含有組織の生検材料を得ること、(b)前記生検材料から自己由来のUMCを分離すること、(c)培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないUMCが得られる条件下で自己由来UMCを培養すること、ならびに(d)UMCの懸濁物が得られる条件下に培養したUMCを曝露すること、を含んでなる。UMC含有組織は、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄、筋膜、および脂肪組織からなる群より選択することができる。UMCの培養は、(1)0.1〜約20%のヒト血清または非ヒト血清を含有する培地で培養し、次いで(2)無血清培地で培養することを含みうる。UMCの培養は、無血清培地で培養することを含んでいてよい。UMCの懸濁物が得られる条件は、トリプシンなどのタンパク質分解酵素の使用を含むことができる。これとは別のタンパク質分解酵素としては、ディスパーゼおよびコラゲナーゼが挙げられる。UMCの懸濁物が得られる条件は、さらに、またはこれとは別にEDTAの使用を含みうる。UMCと組み合わせる前の、生分解性無細胞性充填剤は、(a) 注入可能な自己由来コラーゲン繊維の分散体、(b)コラーゲン(例えばウシコラーゲン、グルタルアルデヒドで架橋した再構成ウシコラーゲン繊維、または自己由来コラーゲン)、(c)可溶化ゼラチン、(d)可溶化ポリグリコール酸、(e)可溶化腸線、(f)塩化ナトリウム溶液中に分散させたブタゼラチン粉末とアミノカプロン酸、および被験者由来の血漿のアリコート、ならびに(g)ヒアルロン酸からなる群から選択される物質を１つ以上含むことができる。
本方法はさらに、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない自己由来の継代した繊維芽細胞を調製すること、および、前記自己由来の継代した繊維芽細胞と生分解性無細胞性充填剤とを組み合わせること、を含みうる。自己由来の継代した繊維芽細胞の懸濁物を調製する工程は、(a)被験者由来の繊維芽細胞含有組織の生検材料を用意すること、(b)前記生検材料から自己由来繊維芽細胞を分離すること、(c)培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない繊維芽細胞が得られる条件下で自己由来繊維芽細胞を培養すること、ならびに(d)培養した自己由来繊維芽細胞を、繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件に曝露すること、を含みうる。繊維芽細胞含有組織は、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄、筋膜、および脂肪組織からなる群より選択することができる。繊維芽細胞の培養は、(1)0.1〜約20%のヒト血清または非ヒト血清を含有する培地で培養し、続いて(2)無血清培地で培養することを含みうる。これとは別に、繊維芽細胞の培養を無血清培地のみで行ってもよい。繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件は、繊維芽細胞を、タンパク質分解酵素、例えばトリプシンと接触させることを含み得る。これとは別のタンパク質分解酵素にはディスパーゼおよびコラゲナーゼが含まれる。繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件は、さらに、またはこれとは別に、EDTAの使用を含んでもよい。UMCおよび生分解性無細胞性充填剤との混合の前に、UMCまたは繊維芽細胞は、活性化化合物(例えば、アスコルビルパルミテート、リノール酸、C-MED 100(登録商標)、キナ酸、キナ酸塩、キナ酸ラクトン、コエンザイムQ-10、L-ヒドロキシ酸、L-リポ酸、カルシウム一リン酸、カルシウム三リン酸、ナイアシン、DHEA、DMAE、α-トコフェロール、BMP、ビタミンE、ビタミンC、カロテノイド、グリコール酸、カルボキシアルキルエステル、エストリオール、アセチル-L-カルニチン、デプレニル、リコペン、NADH、システイン、プロシステイン、ピカミロン、ビンポセチン、レチノイン酸、アンチネオプラストン、または他の刺激性添加剤、例えば増殖因子(例えばヒト成長ホルモン、FGF、VEGF、IGF-I、インスリン、およびロナグフォーム R3 IGF-I))に曝露することができる。UMCまたは繊維芽細胞は、低エネルギーレーザー光に曝露してもよい。
別の態様において、本発明は、被験者における組織の修復方法を提供する。この方法は、(a)培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない組成物である、自己由来の継代したUMCを含有する組成物を調製すること、(b)被験者における組織欠陥または組織変性の部位を同定すること、ならびに(c)組織欠陥または組織変性が修復されるように前記部位に前記組成物を配置すること、を含みうる。組織欠陥または組織変性としては、軟部組織欠陥、口腔粘膜の欠陥、口腔粘膜への外傷、歯周病、骨の欠陥、糖尿病、皮膚潰瘍、静脈鬱滞、または皮膚の美容上の欠陥が含まれる。軟部組織欠陥は、顔面のくぼみ、乳房の発育不全、乳房の不在、乳房復元、声帯欠陥、口蓋帆咽頭不全、ポーランド症候群、男性の性器(例、ペニス)の発育不全、唇の形成不全、および皮下萎縮または筋肉萎縮からなる群から選択することができる。口腔粘膜への外傷は、抜歯の結果生じる抜歯窩でありうる。歯周病は、歯周の変性、歯肉炎、または口蓋粘膜もしくは歯肉炎粘膜の非治癒性創傷を伴い得る。骨の欠陥は、片側顔面小人症、骨の外傷後の非治癒、眼球陥没、ロンベルク病、穿頭孔（バーホール）の欠陥、頭蓋骨の欠損、鈍的外傷に起因する欠陥、および関節炎に起因する欠陥からなる群より選択することができる。美容上の欠陥は、しわ(rhytid)、陥没した瘢痕、外傷に起因しない皮膚の陥没、笑いじわ、皮膚萎縮線条、しわ(wrinkle)、創傷瘢痕、にきびの瘢痕、および皮下萎縮からなる群より選択することができる。組織の欠陥は、唇または唇のひだの形成不全でありうる。自己由来のUMCは、被験者の歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄、筋膜、または脂肪組織からのものでありうる。前記組成物はさらに、生分解性マトリックスを含み得るが、ここでUMCは前記マトリックス上にまたは内に組み込まれている。前記組成物はまた、生分解性無細胞性充填剤を含み得る。前記組成物はさらに自己由来の継代した繊維芽細胞を含み得る。
別の態様において、本発明は、被験者における組織の修復方法を提供する。この方法は、(a)自己由来の継代したUMCおよび自己由来の継代した繊維芽細胞を含有する組成物を調製すること、ただしここで前記組成物が培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものであること、(b)被験者における組織欠陥または組織変性の部位を同定すること、および(c)組織欠陥または組織変性が修復されるように前記部位に前記組成物を配置すること、を含みうる。
別の態様において、本発明は、被験者における組織欠陥の修復方法を提供する。この方法は、(a)、(1)自己由来の継代したUMC、(2)自己由来の継代した繊維芽細胞、および(3)製薬上許容される担体を含有する医薬組成物を提供すること、ただしここで前記医薬組成物は、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものであること、(b)歯もしくは歯周の欠陥、皮膚の美容上の欠陥、および骨の欠陥からなる群より選択される被験者における組織欠陥または組織変性の部位を同定すること、ならびに(c)治療に有効な量の前記医薬組成物を、組織欠陥または組織変性の部位に隣接したところに注入すること、ただしここで注入は結果的に組織欠陥または組織変性の修復をもたらすものであること、を含みうる。UMC含有および繊維芽細胞含有組織は、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄、筋膜、および脂肪組織からなる群より選択することができる。UMCおよび繊維芽細胞は、(1)0.1〜約20%のヒト血清または非ヒト血清を含有する培地で培養し、次いで(2)無血清培地で培養したものであってよい。UMCまたは繊維芽細胞は、無血清培地で培養したものであってもよい。
別の態様において、本発明は、被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した被験者の組織の修復方法を提供する。この方法は、組織が修復されるように、被験者の変性した部位に前記組成物を配置することを含む。この組成物は、(1)自己由来の継代したUMC、(2)自己由来の継代した繊維芽細胞、ならびに(3)生分解性マトリックスを含有し得るが、ただしここでUMCまたは繊維芽細胞はマトリックス上にまたは内に組み込まれており、かつここで前記組成物は、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものである。
本発明はまた、被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した被験者の組織の修復方法を提供する。この方法は、(1)培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない自己由来の継代したUMC、および(2)注入可能な生分解性無細胞性充填剤を含有する組成物を、組織が修復されるように被験者の変性の部位に注入することを含んでなる。組成物は自己由来の継代した繊維芽細胞をさらに含んでもよい。
別の態様において、本発明は、被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した被験者の組織の修復方法を提供する。この方法は、(a)被験者の組織変性部位に自己由来の継代したUMCを注入すること、ただしここで前記UMCは培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものであること、(b)被験者の組織欠陥の部位または所望の組織増強の部位に自己由来の継代した繊維芽細胞を注入すること、ただしここで前記繊維芽細胞は培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものであること、ならびに(c)生分解性無細胞性充填剤を前記部位に注入すること、の各工程を含んでなる。疾患、障害または欠陥は、歯もしくは歯周の欠陥、皮膚の美容上の欠陥、および骨の欠陥からなる群より選択することができる。自己由来のUMCおよび繊維芽細胞は、被験者の歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄、筋膜、および脂肪組織からのものであってよい。UMCおよび繊維芽細胞は同時に注入することができる。UMC、繊維芽細胞、および生分解性無細胞性充填剤を同時に注入してもよい。UMCおよび繊維芽細胞を別々に注入することもできる。UMCおよび繊維芽細胞を、生分解性無細胞性充填剤とは別に注入してもよい。UMCおよび繊維芽細胞を被験者に注入することと、生分解性無細胞性充填剤を被験者に注入することの間の時間的間隔は、約２週間とすることができる。
別の態様において、本発明は、被験者の熱傷の修復方法を提供する。この方法は、自己由来の継代したケラチノサイトおよび自己由来の継代した繊維芽細胞の懸濁物を調製し、熱傷に前記懸濁物を注入することを含んでなる。自己由来の継代したケラチノサイトおよび自己由来の継代した繊維芽細胞の懸濁物を調製することは、(a)被験者由来のケラチノサイト含有組織の生検材料を用意すること、(b)前記生検材料から自己由来ケラチノサイトを分離すること、(c)培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないケラチノサイトを産生する条件下で前記自己由来ケラチノサイトを培養すること、(d)ケラチノサイトの懸濁物が得られる条件に前記ケラチノサイトを曝露すること、(e)前記被験者由来の繊維芽含有組織の生検材料を用意すること、(f)前記生検材料から自己由来繊維芽細胞を分離すること、(g)培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない自己由来繊維芽細胞を産生する条件下で自己由来繊維芽細胞を培養すること、(h)繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件に前記繊維芽細胞を曝露すること、ならびに(i)懸濁したケラチノサイトおよび懸濁した繊維芽細胞を混合することを含んでなる。ケラチノサイト含有組織は、皮膚、口腔粘膜、歯肉、口内組織、食道組織、子宮頸部外(exocervical)組織、および結膜組織からなる群より選択することができる。ケラチノサイトの培養は、(1)0.1〜約20%のヒト血清または非ヒト血清を含有する培地でインキュベートし、次いで(2)無血清培地でインキュベートすることを含みうる。これとは別に、ケラチノサイトの培養は無血清培地のみで行うこともできる。繊維芽細胞含有組織は、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄、筋膜、および脂肪組織からなる群より選択することができる。繊維芽細胞の培養は、(1)0.1〜約20%のヒト血清または非ヒト血清を含有する培地でインキュベートし、次いで(2)無血清培地でインキュベートすることを含みうる。これとは別に、繊維芽細胞の培養は無血清培地のみで行うこともできる。繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件は、繊維芽細胞をタンパク質分解酵素、例えばトリプシンと接触させることを含んでなる。これとは別のタンパク質分解酵素として、ディスパーゼおよびコラゲナーゼを挙げることができる。繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件は、さらに、またはこれとは別に、EDTAの使用を含んでもよい。ケラチノサイトと組み合わせる前に、繊維芽細胞を、活性化化合物(例えば、アスコルビルパルミテート、リノール酸、C-MED 100(登録商標)、キナ酸、キナ酸塩、キナ酸ラクトン、コエンザイムQ-10、L-ヒドロキシ酸、L-リポ酸、カルシウム一リン酸、カルシウム三リン酸、ナイアシン、DHEA、DMAE、α-トコフェロール、BMP、ビタミンE、ビタミンC、カロテノイド、グリコール酸、カルボキシアルキルエステル、エストリオール、アセチル-L-カルニチン、デプレニル、リコペン、NADH、システイン、プロシステイン、ピカミロン、ビンポセチン、レチノイン酸、アンチネオプラストン、または他の刺激性添加剤、例えば増殖因子(例えばヒト成長ホルモン、FGF、VEGF、IGF-I、インスリン、および長鎖型 R3 IGF-I))に曝露することができる。また、被験者に投与する前に繊維芽細胞を低エネルギーレーザー光に曝露してもよい。懸濁物は、自己由来ケラチノサイトと自己由来繊維芽細胞を約1:3の比率で含有しうる。注入は、懸濁物を熱傷の中心部位に注入することを含む。懸濁物はさらに、自己由来の継代したUMCを含有しうる。この方法ではさらに、熱傷に増強化合物を注入してもよい。
本発明はさらに、軟部組織欠陥、口腔粘膜の欠陥、口腔粘膜への外傷、歯周病、糖尿病、皮膚潰瘍、および静脈鬱滞から選択される組織変性または組織欠陥の治療に用いる医薬の製造における未分化間葉細胞(UMC)の使用を提供するが、ここで前記医薬は、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない自己由来の継代したUMCを含む医薬である。好ましくは、組成物は、継代した自己由来UMC、継代した自己由来繊維芽細胞、および任意の継代した自己由来ケラチノサイト以外の細胞を実質的に含まない。
本発明はさらに、被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した被験者の組織の修復に使用するために同時、順次、または別々に投与するための医薬の製造における未分化間葉細胞の使用を提供するが、ここで前記UMCは培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない継代したUMCであり、前記繊維芽細胞は培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない自己由来の継代した繊維芽細胞である。
本発明はまた、医薬として使用するための組成物を提供するが、ここで前記組成物は、自己由来の継代したUMCおよび自己由来の継代した繊維芽細胞を含み、かつ培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものである。組織の美容上の修復のための組成物であって、自己由来の継代したUMCおよび自己由来の継代した繊維芽細胞を含み、かつ培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない前記組成物もまた提供される。
本発明はまた、被験者の熱傷の修復に使用するための医薬の製造における、自己由来の継代したケラチノサイトおよび自己由来の継代した繊維芽細胞の使用を提供する。
別に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料と類似のまたは均等な方法および材料を用いて本発明を実施することができるが、以下に適当な方法および材料を記載する。全ての出版物、特許出願、特許、および本明細書に記載する他の参考文献は、参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする。矛盾が生じた場合、定義を含めて本明細書が優先する。さらに材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定的であることを全く意図しない。
本発明の１以上の実施形態の詳細を以下に説明する。本発明の他の構成、目的および効果は明細書および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
詳細な説明
本発明は、被験者において組織の変性をもたらす障害または欠陥を治療するための組成物および方法を提供する。このような障害または欠陥は、口腔粘膜の欠陥、口腔粘膜への外傷(例えば抜歯の結果生じる抜歯窩)、口内の骨(例えば上顎または下顎骨)への外傷、歯周病、糖尿病、皮膚潰瘍または静脈鬱滞を含む。結果的に組織変性をもたらし得る歯周病の例は、制限するものではないが、歯周変性、歯肉炎、または口蓋粘膜もしくは歯肉粘膜の非治癒性創傷、あるいは骨の変性を含む。本明細書において提供する組成物および方法を用いて治療できる他の欠陥は、制限するものではないが、皮膚の欠陥、例えば瘢痕、しわ、笑いじわ、皮膚萎縮線条、陥没した瘢痕、外傷に起因しない皮膚の陥没、にきびの瘢痕もしくはにきびによる皮下萎縮、外傷、先天性奇形または加齢を含む。さらに、本発明の組成物および方法は、唇の形成不全、唇のしわ、または骨の欠陥(例えば眼窩、頬骨、頭蓋骨、口蓋破裂骨欠陥、および鼻骨を含む顔面骨ならびに背骨および長骨などの骨の欠陥)などの欠陥を治療するために使用することができる。骨の欠陥は、例えば片側顔面小人症、あらゆる骨(例：手、手首、足、脊椎または顔面の骨)の外傷後の非治癒、眼球陥没、ロンベルク病、穿頭孔の欠陥、および頭蓋骨の欠損を含み得る。本発明の組成物および方法はまた、あらゆる骨への手術後の治癒を助けるために使用することができる。本発明はまた、顔面のくぼみ、乳房の発育不全、乳房の不在、乳房復元、声帯欠陥、口蓋帆咽頭不全、ポーランド症候群、ならびに、急性灰白髄炎後萎縮および尻、ふくらはぎ、または男性性器の形成不全を含むあらゆる皮下萎縮または筋肉萎縮を含む軟部組織欠陥を増強するために使用することができる。
１．細胞を含有する組成物
本発明は、例えば、自己由来の継代したUMC、任意の供給源からの自己由来の継代した繊維芽細胞、および／または自己由来の継代したケラチノサイトなどの細胞を含有する組成物を提供する。本発明の組成物は、免疫原性タンパク質(例えば培地血清由来のタンパク質)を実質的に含まない。本明細書において用いる、被移植者に投与する組成物の構成成分に適用される「自己由来」という用語は、提供者と被移植者が同一の個体である場合における、提供者から摘出し、被移植者に投与される身体の構成成分(例えば、細胞またはタンパク質、核酸、炭水化物もしくは脂質などの生物学的分子)を意味する。本明細書において用いる「培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない」細胞とは、細胞を添加する流体が、前記細胞を培養した組織培養培地に含有される異種のまたは同種異系の血清を0.1％未満(例えば0.05％未満、0.01％未満、0.005％未満または0.001％未満)しか含有しない細胞である。同様に、「培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない」組成物とは、組成物中の細胞を取り囲む流体が、前記細胞を培養した組織培養培地に含有される異種のまたは同種異系の血清を0.1％未満(例えば0.05％未満、0.01％未満、0.005％未満または0.001％未満)しか含有しない組成物である。
培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない細胞を取得するために、培養した細胞は、血清を含有しない培地で増殖させることができる。これとは別に、細胞はまず血清を含有する培地(例、0.1〜20％血清)で培養し、次いで無血清培地で培養することができる。従って、これらの方法により、免疫原性でありうる血清由来のタンパク質が細胞懸濁物中に存在することを回避することができる。
本発明で用いる細胞は、細胞が自己由来であるという前提のもとに、任意の哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはアレチネズミ)からのものであってよい。自己由来ヒト細胞(例えば、自己由来ヒトUMC、繊維芽細胞およびケラチノサイト)はとりわけ有用である。動物が近交であり、従って同遺伝子型である場合(例えば、ラットおよびマウスなどの動物の一部の近交実験室系統における場合)、「自己由来」は同じ種の別の個体に由来することを意味しうることに留意されたい。本発明で用いる細胞はまた、非自己由来(例えば、被移植者とは別の被験者、または細胞系から取得されるもの)であってもよい。
本発明において提供する組成物は、典型的には、被験者由来の組織生検材料を取得し、その生検材料から所望の細胞を分離し、好適な数の継代により細胞を培養して所望の細胞量を取得し、細胞を懸濁することにより調製する。本明細書において用いる「付着性」細胞とは、標準的組織培養容器の材料(例えばプラスチック)に付着する細胞を言う。本明細書において用いる「非付着性」細胞は、標準的組織培養容器の材料(例えばプラスチック)に付着しない細胞のみならず、空間および栄養素が限界になった場合に組織培養容器の表面から離れる細胞をも含む。ひとたびこのような細胞を回収して好適な条件下に置くと、それら細胞は付着して増殖することができる。このように、組成物は培養下で増殖することができる任意の細胞を含有し得る。UMCおよび繊維芽細胞は、例えば真皮組織または脂肪組織から分離することができる。UMCおよび繊維芽細胞はまた、限定するものではないが、筋膜、粘膜固有層、毛嚢の球状領域、骨髄、または結合組織のあらゆる供給源から取得することができる。自己由来ケラチノサイトは、例えば、被験者の全層皮膚生検材料、頭皮または毛嚢から取得することができる。付着性および非付着性細胞は、選択的(differential)タンパク質分解(例えばトリプシン処理)および富化により、または、フィコールもしくはパーコールを用いた勾配精製および富化により、互いから実質的に分離することができる。フィコールまたはパーコールは、他にもあるがとりわけ、Amersham Biosciences社 (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA, UK)から入手可能である。
当業者によく知られている、同種移植(または異種移植)拒絶の現象ゆえに、培養細胞は被移植者と組織適合性であることが好ましい。組織適合性は、治療する被験者から細胞(例えば末梢血単核細胞)を取得し、それらの細胞を用いて前記被験者の主要組織適合複合体(MHC)のハプロタイプを決定することにより確実にすることができる。しかしながら、そのような細胞はまた、被験者の一卵性双生児から、または被験者とMHCが同一である個体から取得しうることが分かっている。生検標本から分離した細胞は、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないように培養しうる。この工程は、被験者において不都合な免疫応答を活性化させる細胞の能力を低減させる。
細胞培養の開始前に、生検材料は、その後の培養の汚染の可能性を減少させるために、抗生剤および抗真菌剤を用いて繰り返し洗浄することができる。好適な「洗浄媒体」は、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、イスコフ変法ダルベッコ培地または好適な培地などの組織培養培地を、下記の薬剤のいくつかまたは全てと共に含有しうる：ゲンタマイシン、アンフォテリシンB(ファンギゾン(登録商標))、マイコプラズマ除去剤(MRA；大日本製薬株式会社、日本)、プラスモシンおよびチロシン(例えばServa, Heidelberg, Germanyより入手可能)。ゲンタマイシンは、10〜100μg/mlの濃度(例えば、25〜75μg/ml、または約50μg/ml)で使用することができる。アンフォテリシンBは、0.5〜12.5μg/mlの濃度(例えば、1.0〜10μg/ml、または約2.5μg/ml)で使用することができる。MRAは0.1〜1.5μg/mlの濃度(例えば0.25〜1.0μg/mlまたは約0.5μg/ml)で使用することができる。プラスモシンは、1〜50μg/mlの濃度(例えば、10〜40μg/ml、または約25μg/ml)で使用することができる。チロシンは、0.012〜1.2mg/mlの濃度(例えば0.06〜0.6mg/ml、または約0.12mg/ml)で使用することができる。
細胞培養に用いる増殖培地は、例えば細菌、真菌、酵母、およびマイコプラズマによる細胞の汚染を防止するために、抗生物質を添加することができる。マイコプラズマ汚染は、細胞培養において頻繁に生じ、また特に煩わしい問題である。マイコプラズマ汚染を防止するかまたは最小限に食い止めるために、増殖培地にチロシンなどの薬剤を添加することができる。培地にはさらに、１種以上の抗生剤／抗カビ剤(例えば、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、アラトロフロキサシン、アジスロマイシン、MRA、プラスモシン、およびテトラサイクリン)を添加することができる。チロシンは、0.006〜0.6mg/mlの濃度(例えば、0.01〜0.1mg/ml、または約0.06mg/ml)で使用することができる。ゲンタマイシンは、0.01〜0.1mg/mlの濃度(例えば、0.03〜0.08mg/ml、または約0.05mg/ml)で使用することができる。シプロフロキサシンは、0.002〜0.05mg/mlの濃度(例えば、0.005〜0.03mg/ml、または約0.01mg/ml)で使用することができる。アラトロフロキサシンは、0.2〜5.0μg/mlの濃度(例えば、0.5〜3.0μg/ml、または約1.0μg/ml)で使用することができる。アジスロマイシンは、0.002〜0.05mg/mlの濃度(例えば、0.005〜0.03mg/ml、または約0.01mg/ml)で使用することができる。MRAは、0.1〜1.5μg/mlの濃度(例えば、0.2〜1.0μg/ml、または約0.75μg/ml)で使用することができる。プラスモシンは、1〜50μg/mlの濃度(例えば、10〜40μg/ml、または約25μg/ml)で使用することができる。テトラサイクリンは、0.004〜0.1mg/mlの濃度(例えば、0.008〜0.05mg/ml、または約0.02mg/ml)で使用することができる。抗生物質は、培養期間の全体にわたって存在させても、一部にわたって存在させてもよい。
マイコプラズマ汚染は、例えばbioMerieux (Marcy l’Etiole, France)から入手可能な、もしくは、実験室で調製できるマイコプラズマ寒天プレートなどの培養系を用いた寒天培養法により、またはPCRにより、アッセイすることができる。The American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)は、PCR「マイコプラズマ検出キット」を販売している。チロシン(0.06mg/ml)、ゲンタマイシン(0.1mg/ml)、シプロフロキサシン(0.01mg/ml)、アラトロフロキサシン(1.0μg/ml)、アジスロマイシン(0.01mg/ml)およびテトラサイクリン(0.02mg/ml)を含有する培地は、マイコプラズマ汚染を防ぐのに特に有用である。マイコプラズマ汚染を防ぐのに有用であり得る別の薬剤は4-オキソ-キノリン-3-カルボン酸(OQCA)の誘導体であり、この薬剤は例えばICN Pharmaceuticals, Inc. (Costa Mesa, CA)から「マイコプラズマ除去剤」として市販されている。この薬剤は、典型的には0.1〜2.5mg/mlの濃度(例えば0.2〜2.0mg/ml、または0.5mg/ml)で使用する。抗生物質混合物または他の薬剤は、開始後の最初の２週間、繊維芽細胞培養物中に存在させてもよい。培養下での適切な時間(例えば２週間)後、抗生物質含有培地を、典型的には抗生物質不含培地で置き換える。ひとたび培養物中に十分な数の細胞が存在したら、それらの細胞をマイコプラズマ、細菌、および真菌汚染について検査することができる。検出可能な汚染を含まない細胞のみが、本発明の方法において有用である。
被験者に投与する前に、製薬上許容される担体を細胞に加えてもよい。「製薬上許容される」という語句は、ヒトに投与した場合、細胞に有害ではない、生理学的に許容される、ならびに典型的にはアレルギー反応または同様の有害反応（例えば、異常亢進、めまいなど）を引き起こさない分子種および組成物を意味する。このような組成物は、様々なバッファー内容物(例えば、トリス-塩酸、酢酸塩、リン酸塩)、pH、およびイオン強度の生理学的に許容される希釈剤を含む。
これとは別に、細胞を直ちに投与するのでなければ、それら細胞は、回収後24〜48時間までの間、約4℃で氷上でインキュベートすることができる。その様なインキュベーションのために、前記細胞は、適切な容量オスモル濃度を有し、かつ発熱物質および内毒素レベルについて検査済みの生理学的溶液に懸濁することができる。そのような溶液は、典型的にはフェノールレッドpH指示薬を含まず、また血清は、ウシ胎仔血清(FBS)や他の異種血清(例えばウマ血清またはヤギ血清)ではなく、被験者の血清(すなわち自己由来血清)とすることが好ましい。細胞は、例えば5％デキストロースを含有するクレブス-リンガー溶液、または他の生理学的溶液に懸濁させることができる。細胞を吸引して、インキュベーション媒体に含まれた状態で被験者に投与してもよい。細胞を懸濁させる生理食塩水またはインキュベーション媒体の容量は、典型的には注入すべき細胞数や組織変性または欠陥に起因する損傷の程度などといった要因に関連する。
本発明で用いる細胞はまた、UMC、繊維芽細胞およびケラチノサイトなどの細胞型を保存するのに好適な媒体(例えば、市販の冷凍用媒体)中で凍結させることができる。約70％(v/v)増殖培地、約20％(v/v)FBSおよび約10％(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)からなる媒体は特に有用である。FBSは例えば5％デキストロース含有クレブス-リンガー溶液で置き換えてもよく、DMSOは例えばグリセロールで置き換えてもよい。解凍した細胞を用いて、同一被験者に後で使用するための追加の懸濁物を調製するための二次的培養を開始させることができ、このことにより第二の標本を取得する不便が回避される。
２．自己由来UMCを含有する組成物
本発明は自己由来UMCを含有する組成物を提供する。これらの組成物は、例えば、歯の欠陥(例えば、口腔粘膜の欠陥、口腔粘膜への外傷、または歯周病)、骨の欠陥および骨移植、ならびに皮膚の美容上の欠陥(例えば、笑いじわ、皮膚萎縮線条、しわ、創傷瘢痕、にきびの瘢痕、または皮下萎縮)を含む症状を治療するのに有用である。UMCは被験者(例えばヒト)から取得した生検材料から培養を開始することで、in vitroで回収および富化することができる。本明細書に記載する通り、UMCは、例えば、皮膚生検または脂肪組織もしくは骨髄の生検から取得することができる。真皮組織から分離されるUMCは、それらの取得および増殖が容易であるために特に有用である。本明細書に記載する「UMC」という用語は、繊維芽細胞のような完全に分化した結合組織細胞となる前の、分化の「段階」にある細胞を意味する。あらゆるタイプの体細胞へと分化できるわけではないため、UMCは多能性幹細胞とは異なる。繊維芽細胞に加えて、UMCは脂肪組織、軟骨、腱、骨または筋肉細胞へと分化することができる。
本発明の組成物を調製するために、UMC培養は、例えば患者の歯肉、頭皮、後耳介、口蓋、または皮膚の全層(例えば1〜5mm、または十分な組織が得られるなら5mmより多く)真皮生検標本から開始することができる。真皮は、表皮の直下に位置し、典型的には0.5〜3mmの範囲の厚さを有する。真皮標本は、例えばパンチ生検法を用いて取得することができる。皮膚標本は、例えば耳の後ろにある皮膚から取得することができる。UMCは、例えば真皮(例えば皮膚)生検から回収して培養を開始することにより分離できる(例えば、実施例１を参照のこと)。活発に増殖しているUMCの浮遊性(つまり、非付着性)コロニーは、そのような培養物中で浮遊しているところを観察することができる。コロニーは、細胞培養物からの培地の吸引および遠心分離により回収することができ、また、新鮮な組織培養培地に再播種することにより増やすことができる。浮遊しているコロニーは、培養物中の付着性細胞がコンフルエントまたは非コンフルエントである場合に回収することができる。浮遊しているUMCのコロニーはまた、脂肪組織(例えば、脂肪吸引または他の外科的切除により回収した脂肪)の培養物から分離することができる。脂肪組織を小片に切り刻み、膜性の物質を取り除き、その結果得られる組織を、脂肪組織からのUMCの活発な放出(shedding)をもたらす条件下で培養することができる。UMCの活発な放出をもたらす条件の例は、限定するものではないが、減少した濃度のウシ胎仔血清(FBS)を含有する培地または酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)を含有する培地の使用を含む。例えば、約0％〜約2.5％のFBSが存在してもよい。例えば、約2.5〜10ng/mlのaFGFが存在してもよい。これとは別に、脂肪組織は、脂肪小球から膜を取り除いた後、約0.1％〜1％コラゲナーゼで解離させることができる。同様に、UMC培養は、骨髄の生検材料から開始させることができる(例えばMarkoら (1995) Endocrinol. 136:4582-4588を参照のこと)。
生検標本からのUMCの増殖に適した組織培養技術はどれも、細胞を増やすために使用できる。培養した細胞を増やすのに有用な技術は、例えば、R.I. Freshney, 編, Animal Cell Culture: A Practical Approach, (IRL Press, Oxford, England, 1986) およびR.I. Freshney, 編, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, (Alan R. Liss & Co., New York, 1987)に記載されている。
細胞培養培地は、一次UMC培養物の増殖に好適などのような培地であってもよい。培地は、上述の通り、抗生剤、抗カビ剤、および／またはマイコプラズマの増殖を防止する試薬を含有することができる。培地中に酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)、インスリン様増殖因子(IGF-I)、インスリンまたはいずれかの増殖因子を存在させると、UMCの繊維芽細胞への分化を防ぐことができる。培地は、無血清であってよく、または、細胞の増殖を促進するためにヒトもしくは非ヒト血清(例えば、自己由来ヒト血清、非自己由来ヒトA/B血清、ウマ血清、またはウシ胎仔血清(FBS))を添加したものであってもよい。培地に添加する場合、血清は典型的には、約0.1％〜約20％v/vの量(例えば、約0.5〜約19％、約1％〜約15％、約5％〜約12％、または約10％)とする。特に有用な培地は、約2mMグルタミン、約10mg/Lピルビン酸ナトリウム、約10%(v/v)FBS、および抗生剤を添加したグルコースDMEM(しばしば「完全培地」と呼ばれる)を含有するが、ここでのグルコース濃度は約1000mg/L〜約4500mg/Lである。UMCはまた、無血清培地で増やすことができるが、この方法では、UMCが異種または同種異系の血清タンパク質に決して曝露されないので、細胞を非自己由来血清を含有する培地で増やした場合に実施される無血清培地での余分な培養を必要としない。
投与前に、UMCを活性化化合物とともにインキュベートすることができる。本明細書において用いる「活性化化合物」とは、細胞増殖を刺激しうるか、または(例えば、細胞増殖をもたらす特定の遺伝子の発現を刺激するか、またはDNA修復を活性化し細胞寿命を延長するかもしくはアポトーシスを防ぐことにより) 細胞寿命を向上させうる化合物である。UMCが繊維芽細胞へと分化した後に、活性化化合物はまたコラーゲン産生をも刺激することができる。活性化化合物はまた、UMCを含有する組成物と一緒にまたは別々に被験者に投与することができ、UMC含有組成物を投与する部位における細胞の増殖、寿命、またはコラーゲン産生を増強することができる。細胞組成物と活性化化合物を別々に投与する場合は、投与を同時に行なっても、連続して(任意の順序で)行なってもよい。連続して行う場合は、投与を分単位の間隔(例えば、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, または55分)、時間単位の間隔(例えば1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 18, 22, または23時間)、日単位の間隔(例えば1, 2, 3, 4, 5, または6日)、または週単位の間隔(例えば1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50またはより多くの週)で行なうことができる。これとは別に、in vivoでUMCを刺激するかまたは分化させるために、継代したUMCの不在下で１以上の活性化化合物を投与することもできる。
UMC(および／または繊維芽細胞などの他の細胞)とともに投与してもよい他の化合物は、増強化合物である。本明細書で用いる「増強化合物」とは、投与される細胞それ自体に必ずしも作用しないが、例えば、修復すべき組織の構造的構成成分(例えば、いずれかのタイプのコラーゲン)であるか、または宿主構成成分(例えば宿主細胞または細胞外マトリックス構成成分)に作用する化合物のことである。それゆえ、増強化合物は、投与される細胞の修復効率を増強する役割を果たし得る。増強化合物は、UMCおよび／または繊維芽細胞など他の細胞を含有する組成物と一緒にまたは別々に、被験者に投与することができる。細胞組成物と増強化合物を別々に投与する場合は、これらの投与を同時に行なっても、連続して(任意の順序で)行なってもよい。上述の通り、連続投与は、分単位の間隔(例えば、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, または55分)、時間単位の間隔(例えば1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 18, 22, または23時間)、日単位の間隔(例えば1, 2, 3, 4, 5, または6日)、または週単位の間隔(例えば1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50またはより多くの週)で行なうことができる。これとは別に、in vivoでUMCを刺激するかまたは分化させるために、継代したUMCの完全な不在下で１種以上の増強化合物を投与することもできる。
UMCとともに投与できる活性化化合物としては、例えば、以下のものが含まれる：アスコルビン酸、アスコルビルパルミテート、リノール酸、C-MED 100(登録商標)(Optigene-X LLC, Shrewsbury, NJ)、キナ酸、キナ酸塩、キナ酸ラクトン、コエンザイムQ-10、L-ヒドロキシ酸、L-リポ酸、ナイアシン、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)、ジメチルアミノエタノール(DMAE)、α-トコフェロール、ビタミンE、ビタミンC、カロテノイド、グリコール酸、カルボキシアルキルエステル、エストリオール、アセチル-L-カルニチン、デプレニル、リコペン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)、システイン、プロシステイン、ピカミロン、ビンポセチン、レチノイン酸、アンチネオプラストン、ならびに他の刺激性添加剤、例えば増殖因子(例えばヒト成長ホルモン、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、IGF-I、インスリン、長鎖型 R3 IGF-I、およびトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β))。上述の通り、これらの活性化化合物はまた、UMCと一緒にまたは別々に被験者に投与することができる。増強化合物として有用な化合物には、例えばアミノカプロン酸、エストリオール、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。これらの化合物のうちのいくつかは抗酸化剤であり(例えばL-リポ酸、C-MED 100(登録商標)、およびコエンザイムQ-10)、他はDNA修復に影響する(例えばビタミンE、カルボキシアルキルエステル、およびカロテノイド)と考えられており、他は骨細胞の発達を促すことができる(例えばカルシウム三リン酸およびカルシウム一リン酸)。他の有用な活性化剤には、転写因子、ヒストン・アセチル基転移酵素、メチル基結合タンパク質、アセチルコリン前駆体、細胞膜保護剤、および分化因子が含まれる。
関心のある活性化化合物または増強化合物がタンパク質である場合は、被験者に投与する細胞(例えばUMCまたは繊維芽細胞)を、１以上(例えば1、2、3、4、5、6またはそれより多く)の発現ベクター(例えばプラスミドまたはワクシニア、アデノウイルス、もしくはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクター)で安定的にまたは一過性にトランスフェクト、形質導入、形質転換または感染しうることが知られているが、ここで各ベクターは、１以上(例えば1、2、3、4、5、6またはそれより多く)の活性化および／または増強化合物(例えば、任意の型のコラーゲン(例えばI型、II型、またはIII型コラーゲン)、転写因子、テロメラーゼ、またはDNAメチル化に影響を及ぼす因子)をコードする核酸配列を１以上(例えば1、2、3、4、5、6またはそれより多く)含有する。
細胞(例えばUMC)はまた、被験者に投与する前に、低エネルギーレーザー光に曝露することにより活性化することができる。例えば、細胞はヘリウム-ネオンレーザーまたはガリウム-ヒ素レーザーで照射することができるが、これは繊維芽細胞によるコラーゲン産生を増加させ得る(例えば、Halcin およびUitto, Lasers in Cutaneous and Aesthetic Surgeryの中の “Biologic Effects of Low-Energy Lasers,” 第一版(1997), Arndt およびDover, 編, Lippincott Williams & Wilkins (Philadelphia, PA), pp. 303-328を参照のこと)。レーザーでの処理はまた、創傷治癒における細胞増殖、免疫調節および細胞外マトリックス産生に影響を及ぼし得る。細胞は、被験者に投与する前に、低レベルレーザーで適当な時間(例えば数時間〜数週間)にわたり１回以上(例えば2、3、4、5回またはそれ以上)照射することができる。
本発明はまた、自己由来の継代したUMCを含有する組成物の調製方法を提供する。この方法は、被験者由来のUMC含有組織の生検材料を用意すること、その生検材料から自己由来UMCを分離すること、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない細胞が得られる条件下でUMC細胞を培養することを含みうる。UMCを、付着性繊維芽細胞(例えば皮膚生検から誘導されたもの)の培養物中の非付着性細胞コロニーとして調製する場合、前記UMCは、培養物からの非付着性細胞含有培地の取り出しおよび遠心分離により、継代または回収することができる。UMCを継代する場合は、それらUMCを新鮮な培地に再懸濁し、適切な組織培養容器、例えば組織培養フラスコに分注する。UMCを被験者に投与する場合は、それらUMCを適切な溶液(例えば、生理食塩水、5％デキストロース含有クレブス-リンガー溶液、フェノールレッド不含組織培養培地、または等張性であって哺乳動物やヒトなどの被験者に注入するのに好適な他の溶液)に再懸濁する。UMCを分離して培養するために、他のどのような適当な方法を用いてもよく、そうした方法には米国特許第5858390号に開示されている方法も含まれ、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
３．自己由来繊維芽細胞およびUMCを含有する組成物
本発明の組成物は、UMCを含有することができるのみならず、免疫原性タンパク質(例えば、培地血清由来のタンパク質)を実質的に含まない自己由来の継代した繊維芽細胞を含有することができる。組成物は、培養して増やすことができるどのような繊維芽細胞を含有してもよい。真皮組織から分離した繊維芽細胞は、容易に取得して増やすことができるため、特に有用である。また一方、自己由来繊維芽細胞は、繊維芽細胞を含有するあらゆる組織(例えば被験者の歯肉、口蓋または皮膚の生検材料など)から取得してもよい。さらに、繊維芽細胞は、制限するものではないが、筋膜、粘膜固有層、毛嚢の球状領域、骨髄、または結合組織の任意の供給源から取得してもよい。さらに、繊維芽細胞は、例えば細胞培養によりUMCから誘導することができる。例えば本明細書に記載するものなど、UMCを培養して分化させるのに適した方法はどれも使用することができる。UMCは、例えば酸性繊維芽細胞増殖因子または当技術分野で公知の他の適当な分化阻害因子の不在下で培養することにより、繊維芽細胞に分化するよう促すことができる。
所望により、角化組織含有表皮および脂肪細胞含有皮下組織から生検で真皮組織を分離するために、無菌の顕微鏡的切開を用いることができる。次いで生検標本を、例えば組織を微細に切り刻むための外科用メスまたはハサミを用いて、小片に分離することができる。いくつかの実施形態においては、これら組織の小片をプロテアーゼ(例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、またはキモパパイン)で消化する。200〜1000U/mlのII型コラゲナーゼを用いて10分〜24時間消化することが特に有用であるが、どのような型のコラゲナーゼを用いてもよい(例えば、0.05％〜0.1％のIV型コラゲナーゼは脂肪組織の消化に特に有用であり得る)。酵素による消化を用いる場合は、細胞を遠心分離により回収し、組織培養フラスコにプレートしてもよい。
組織を酵素消化に供しない場合は、切り刻んだ組織の小片を、組織培養フラスコの乾燥表面に個別に配置して、約2〜約10分かけて付着させる。付着した組織切片を動かさないよう、少量の培地をゆっくり添加する。消化済み細胞の場合には、残留酵素を除去するために細胞を培地で洗浄し、新鮮な培地に懸濁させて、１つ以上のフラスコに配置する。約48〜72時間のインキュベーション後、フラスコに追加の培地を供給してもよい。培養を開始するためにT-25フラスコを用いる場合、培地の初期量は典型的には約1.5〜2.0mlである。生検標本からの細胞系の樹立には約2〜3週間かかるが、その時点で、細胞を増やすために初期培養容器から細胞を取り出すことができる。
初期培養段階では、組織切片が培養容器の底に付着したままで存在することが望ましい。容器から離れた切片は新しい容器に再度植え付けることができる。繊維芽細胞は、標準手法に従い、EDTA-トリプシンに短期間さらすことにより増殖するよう刺激することができる。このようなトリプシンへの曝露は短時間であるので、繊維芽細胞が培養容器壁への付着から遊離することはない。培養物が樹立されて、コンフルエント状態に近づいた後直ちに、繊維芽細胞のサンプルを、例えば液体窒素中での、冷凍保存のために処理してもよい。細胞を凍結させるのに適した方法はどれも用いることができ、例えば、その後の使用のためにうまく細胞を凍らせるための当技術分野で公知の方法が数多く存在する。例えば、上記に開示した凍結方法を参照のこと。正常なヒト繊維芽細胞の細胞培養における継代の数は限られているため、後期よりもむしろ初期の継代繊維芽細胞の凍結と保存が好ましい。
生検標本からの真皮繊維芽細胞の増殖に適した組織培養法はどれも、細胞を増やすために使用できる。細胞培養培地は、一次繊維芽細胞培養物の増殖に適したどのような培地であってよい。培地には、上述の通り、ヒトまたは非ヒト血清(例えば自己由来ヒト血清、非自己由来ヒトA/B血清、ウマ血清、もしくはウシ胎仔血清(FBS))を添加することができる。繊維芽細胞はまた、無血清培地でも増やすことができるが、この方法では、繊維芽細胞が異種または同種異系の血清タンパク質に曝露されることが全くなく、繊維芽細胞を非自己由来血清を含有する培地で増殖させた場合に行う無血清培地での余分な培養を必要としない。
自己由来繊維芽細胞はトリプシン処理により新しいフラスコに継代することができる。増殖させるには、個々のフラスコを例えば1:3〜1:5の割合で分割することができる。450cm2の総培養面積を有する三つ底のT-150フラスコは、繊維芽細胞を増やすのに適している。三つ底T-150フラスコには、細胞の大きさによって、例えば約1×106〜3×106個の細胞、または1平方センチメートルあたり約8×103個の細胞を播種することができる。このようなフラスコは、典型的には約6×106〜約1×107個の細胞を生じるだけの容量を有する。フラスコの容量に達したら(それには5〜7日間の培養が必要)、増殖培地を無血清培地で置き換えてもよい。細胞は、典型的には約30℃〜約37.5℃で少なくとも4時間(例えば一晩または約18時間)インキュベートする。無血清培地での細胞のインキュベーションは、培地に添加された非自己由来血清(例えばFBS)に由来するタンパク質(そのタンパク質が被験者に注入される組成物中に存在する場合、望ましくない免疫応答を引き出すと考えられる)を実質的に除去することができる。無血清培地は、例えば約110mg/Lのピルビン酸ナトリウムを含むまたは含まない、約2mMグルタミンを添加したグルコースDMEMを含有しうるが、ここでグルコースの濃度は約1000mg/L〜約4500mg/Lである。約4500mg/Lのグルコース濃度が特に有用である。無血清培地はまた、上記に記載したような抗生物質を１種以上含有してもよい。
無血清培地でのインキュベーションの最後に、例えばトリプシン-EDTAを用いて、組織培養フラスコから細胞を取り出すことができる。被験者に投与する前に、繊維芽細胞を典型的には無血清かつフェノールレッド不含である培地または生理食塩水で2〜4回洗浄する。細胞を遠心分離および再懸濁により洗浄してから、妥当な生理学的浸透圧を有しかつ発熱物質および外来タンパク質を実質的に含まない等容量の注入可能な等張溶液中に、注入のために懸濁することができる。等張生理食塩水は特に有用な等張液である。収容量にまで増殖させた５個の三つ底T-150フラスコは、約3.5×107〜約7×107個の細胞をもたらすことができ、これは約1.2 ml〜1.4 mlの懸濁物を調製するのに十分な量である。次いで製薬上許容される担体を継代した自己由来の繊維芽細胞に添加して医薬組成物とする。
UMCの場合と同様に、繊維芽細胞は、被験者に投与する前に活性化化合物とともにインキュベートしてもよい(上記を参照のこと)。適当な活性化化合物には、例えば上記に記載したものが含まれる。このような化合物とのインキュベーションは、繊維芽細胞を刺激することができ、またそれら繊維芽細胞のコラーゲン産生を増強することができる。また、１以上の活性化化合物を、自己由来の継代した繊維芽細胞を含有する組成物とともに被験者に投与してもよい。これとは別に、in vivoで繊維芽細胞を刺激するために、継代した繊維芽細胞の不在下で活性化化合物を投与してもよい。
さらに、UMCの場合にin vivoで使用するための上述の増強化合物は、UMCおよび繊維芽細胞を含有する組成物、または繊維芽細胞のみを含有する組成物にさえも使用することができる。
上述の通り、繊維芽細胞は、低エネルギーレーザーで照射することにより活性化することができる。
自己由来の継代した繊維芽細胞を含有する組成物を調製するために、他のどのような適当な方法を使用してもよい。例えば、米国特許第5858390号、第5665372号、第5660850号、第5591444号および第6342710号ならびに国際出願番号WO 99/60951号を参照されたい。参照によりこれらの全内容を本明細書に組み入れる。
本発明は、自己由来の継代したUMCおよび自己由来の継代した繊維芽細胞を含有する組成物の調製方法を提供する。この方法は、(1)被験者由来のUMC含有組織の生検材料を用意し、その生検材料からUMCを分離し、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないUMCが得られる条件下で所望の量の細胞を取得するのに適当な数の継代にわたり前記UMCを培養すること、(2)被験者由来の繊維芽細胞含有組織の生検材料を用意し、その生検材料から繊維芽細胞を分離し、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない繊維芽細胞が得られる条件下で所望の量の細胞を取得するのに適当な数の継代にわたり前記繊維芽細胞を培養し、そして繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件(例えばトリプシン)に前記繊維芽細胞を曝露すること、ならびに(3)前記UMCを前記繊維芽細胞と組み合わせること、を含んでなる。UMCおよび繊維芽細胞は単一の生検標本から取得してもよく、さらには、共培養してもよいことに留意されたい。従って最後の組合せ工程は必要ない場合がありうる。
４．自己由来のケラチノサイトを含有する組成物
本発明の組成物は継代したケラチノサイトを含有し得る。ケラチノサイトは自己由来または非自己由来(例えば別の被験者由来、または別の細胞系由来)であってよいが、自己由来のケラチノサイトが特に有用である。自己由来ケラチノサイトは、例えば皮膚、歯肉、口内組織、食道組織、子宮頸部外(exocervical)組織、毛嚢、または結膜組織の生検から分離することができる。自己由来ケラチノサイトは、典型的には、容易に入手しやすいが美容上の観点からあまり目立たない部位から取得する。非自己由来ケラチノサイトはケラチノサイト細胞系からのものであってもよい。このような細胞は、例えばATCCから市販されている。本発明で用いるケラチノサイトは、典型的には懸濁状態のものであり、被験者に例えば注入により投与することができる。
本発明は、被験者における組織欠陥、例えば熱傷など、を修復または補強するための組成物の調製方法を提供する。典型的な治癒過程において、ケラチノサイトは、創傷の外縁から創傷の中心に向かって増殖し、これはしばしば瘢痕化という結果を招く。ケラチノサイトの懸濁物を含有する組成物は、瘢痕化を減少さながら治癒を促進するために、熱傷に投与(例えば注入)しうる。ケラチノサイト懸濁物は、免疫原性タンパク質(例えば培地血清由来のタンパク質)を実質的に含まない。
ケラチノサイトは、例えば皮膚生検から回収することができる。ヒト皮膚の全層または中間層を利用することができる。皮膚は、身体のどのような部位(包皮を含む)から取得してもよい。全層皮膚を用いる場合、真皮を可能な限り取り除いてもよい。皮膚は、抗生剤ならびに／もしくは抗カビ剤(例えばペニシリン、ストレプトマイシン、およびファンギゾン(登録商標))を含有する培地(例えばMEM)で、または上記の抗生剤含有培地で、１回以上洗浄してもよい。次いで組織を小片(例えば4 mm2)に切断し、真皮を表皮から分離するためにトリプシン(例えばCa++やMg++を含まないリン酸緩衝溶液中の0.25％トリプシン)中でインキュベートすることができる(Eisinger (1985) Method in Skin Research, 編 Skerrow, pp. 193)。トリプシン処理は適当な温度(例えば4℃)で適当な時間(例えば2〜18時間)にわたり行うことができる。トリプシン処理後、表皮は、微細なピンセットを用いて真皮から注意深く分離する。真皮は、廃棄するかまたは繊維芽細胞の増殖に用いてもよく、表皮は例えば、8g/L NaCl、0.4g/L KCl、1g/L デキストロース、0.58g/L NaHCO3、0.5g/L トリプシン、および0.2g/L ヴェルセン(2ナトリウム塩)を含有する溶液に浮遊させることができる。
全ての表皮を回収したら、表皮細胞をピンセットで機械的に薄くそぐことで互いに分離させる。上清中に溶出した細胞は、新しい組織培養ディッシュに移してかえて、顕微鏡下で観察できる単細胞の懸濁物を取得するために、例えばパスツールピペットを用いて激しくピペッティングすることでさらに分離させてもよい。次いで細胞を無菌のウシ胎仔血清(FBS)中に回収し、例えば無菌ガーゼメッシュを通して濾過し、残っているあらゆる組織の塊または小片を除去する。残った表皮組織に新鮮な培地を添加し、そして全ての組織が完全に解離するまでこの手順を繰り返すことができる。FBSに回収した細胞は、遠心分離によりペレット化し、ケラチノサイト増殖培地に再懸濁し、約5×105〜約8×105個/mlでプラスチック製組織培養容器に播種する。細胞は、典型的には5％ CO2および95％大気の存在下で、湿度80％、温度35℃〜36℃で培養する。ケラチノサイトは12〜14日後には回収できるようになり、継代培養にまたは被験者への投与に使用することができる。
増殖している表皮ケラチノサイト培養物は、繊維芽細胞支持細胞層(例えば3T3細胞の層)上で維持することができ、または動物血清(例えばFBS)の存在下で培養することができるが、いずれも一次培養物を樹立するためおよび継代培養を行うためである。これらの条件下で、ケラチノサイトは、20〜50の集団倍加を達成するまで継代培養することができる。細胞は、例えば10％ FBS、100 U/mlペニシリン、100 g/mlストレプトマイシン、0.6μg/mlファンギゾン(登録商標)、0.5μg/mlヒドロコルチゾン、200mM L-グルタミン、および10mM MEM-非必須アミノ酸を含有する最小必須培地(MEM)で培養することができる。ペニシリン、ストレプトマイシン、およびファンギゾン(登録商標)のかわりに、上述のUMCおよび繊維芽細胞培養に用いた抗生剤混合物もまた使用することができる。また、表皮ケラチノサイトのクローン増殖、連続増殖、および分化を支援するための、血清または支持細胞層を必要としないin vitro系も開発されている(Peehl およびHam (1980) インビトロ 16:516-525; ならびにTsao ら(1982) J. Cell. Physiol. 110:219-229)。このような系には、繊維芽細胞培養物からの馴らし培地の使用が含まれる。
ケラチノサイト培養条件は、細胞増殖を高めるために変更することができる。例えば、増加したヒドロコルチゾン濃度(例えば10μg/ml)、プトレッシン(例えば10-5M)、ビタミンB12(例えば10-5M)、またはJ-エストラジオール(例えば3.7×10-6M)を、非馴らし培地でのケラチノサイト増殖を高めるために使用することができる(例えば上記のPeehlおよびHamを参照のこと)。ケラチノサイト増殖培地はまた、表皮増殖因子および／またはインスリンなどの成分を含有してもよい。また、ケラチノサイトの増殖速度に影響を及ぼすためにカルシウム濃度を調整してもよい(Henningsら(1980) Cell 19:245-265)。例えば0.05〜0.1 mM Ca++を含有する培地で表皮細胞を培養すると、増殖速度を速めることができる。一方、培地中に通常存在する条件(例えば1.2 mM Ca++)下で増殖させると、細胞の最終分化が起こりうる。ケラチノサイトを分離および培養するための他のどのような適当な方法も、本発明が提供する組成物を調製するために使用することができる。これらの方法には、例えば米国特許第4254226号、第5282859号、および第6029760号に開示されている方法が含まれ、参照によりこれらの全内容を本明細書に組み入れる。
本発明は、ケラチノサイトを含有する組成物の調製方法を提供する。この方法は、ケラチノサイト含有組織の生検材料を用意すること、その組織生検材料からケラチノサイトを分離すること、所望の量へと該細胞を増やすのに適当な数の継代によりケラチノサイトを培養すること、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない細胞が得られる培養条件下で前記細胞を培養すること、および前記細胞の懸濁物が得られる条件(例えばトリプシン)に前記細胞を曝露することを含んでなる。
ケラチノサイトを含有する組成物はまた、繊維芽細胞(例えば自己由来の継代した繊維芽細胞)および／またはUMC(例えば自己由来の継代したUMC)を含有してもよい。本明細書に記載の通りに、繊維芽細胞を分離して、その懸濁物を調製することができる(上記のサブセクション３．を参照のこと)。本発明が提供する方法は、１以上の組織生検材料を取得すること、自己由来の継代したケラチノサイトおよび自己由来の継代した繊維芽細胞の懸濁物を調製すること、ならびにケラチノサイトと繊維芽細胞とを組み合わせて熱傷などの症状を治療するために使用できる組成物を調製することを含む。ケラチノサイトおよび繊維芽細胞は、単一の生検(例えば全層皮膚生検)から取得し調製することができることに留意されたい。繊維芽細胞とケラチノサイトのどのような適当な比を用いてもよいが、約3:1(繊維芽細胞対ケラチノサイト)の比が特に有用である。
５．生分解性無細胞性マトリックス成分を含有する組成物
自己由来の継代した細胞(例えば繊維芽細胞存在下または不在下のUMC)を含有する本発明の組成物はまた、生分解性無細胞性マトリックス成分を含んでもよい。無細胞性マトリックス成分は通常、構造的な役割を果たす。例えばそれは組織の欠陥、穴、空隙または腔を埋めることができ、そして注入した細胞がマトリックスまたは周囲の組織に付着して増殖し、新しい組織の増殖の結果生じる構造因子および他の因子(例えば化学走化性因子)を産生することができる環境を提供する。多くの場合、マトリックスの隙間充填機能は、一時的なものであり、移植細胞および／または宿主細胞がその隙間に移動して、新しい組織を形成するまで持続するにすぎない。無細胞性マトリックスは生分解性であることが好ましい。マトリックスは、好ましくは生理学的条件下で不溶性の、固体または半固体材料である。さらに、生分解性無細胞性マトリックス成分はまた、継代したケラチノサイトを含有する組成物のいずれにも含めることができる。そのような組成物は、変性した組織を修復するために被験者に注入または移植するのに適している。本明細書において用いる「生分解性」という用語は、生物学的に有害でなく、かつ自然界の作用因子(例えば気象、土壌細菌、植物、動物)により化学的に分解または腐敗させることができる組成物を意味する。本発明において使用することができるマトリックスの例は、限定するものではないが、自己由来および非自己由来タンパク質を含有する無細胞性マトリックス、ならびに生分解性ポリマーを含有する無細胞性マトリックスを含む。
非自己由来タンパク質を含有する生分解性無細胞性マトリックスのいずれも、本発明において提供する組成物に使用することができる。生分解性無細胞性マトリックスの例は、任意のタイプのコラーゲン(例えばウシ、ブタ、ヒトまたは生物工学的に操作されたコラーゲン)を含有するマトリックス、または、グリコサミノグリカン(GAG)を例えばグルタルアルデヒドで架橋させた任意のタイプのコラーゲンを含有するマトリックスを含む。コラーゲンを含有するマトリックスとしては、限定するものではないが、吸収性コラーゲンスポンジ、コラーゲンメンブレン、および骨海綿体が挙げられる。有用なタイプのコラーゲンには、例えばウシコラーゲン(例えばMcGhan Medical Corporation, Santa Barbara, CAより市販されているZYDERM(登録商標)およびZYPLAST(登録商標))、ブタコラーゲン、ヒト死体コラーゲン(例えばFascia Biosystems, LLC, Beverly Hills, CA からのFASCIAN(商標)、LifeCell Corp., Branchburg, NJ からのCYMETRA(商標)、または以前the Collagenesis Corp.により製造されていたDERMALOGEN(商標))、生物工学的に操作されたコラーゲン(例えばOrganogenesis, Inc., Canton, MA より入手可能なFORTAPERM(商標))、および自己由来ヒトコラーゲン(AUTOLOGEN(登録商標)、下記参照)が含まれる。FASCIAN(商標)は特に有用である。この製品は５種の異なる大きさの粒子として入手可能であり、そのいずれもが本明細書において記載する組成物および方法に使用することができる。大きさが0.25mmの粒子は特に有用である。
吸収性コラーゲンスポンジは、例えばSulzer Calcitek, Inc. (Carlsbad, CA)より購入することができる。COLLATAPE(登録商標)、COLLACOTE(登録商標)、およびCOLLAPLUG(登録商標)の名称で販売されているこれらのコラーゲンスポンジ包帯剤は、ウシ深屈筋(アキレス)腱から抽出された架橋コラーゲンおよびGAGから製造されている。これらの製品は、柔軟であり、成形しやすく、もろくなく、そして非発熱性である。コラーゲンスポンジの90％を超える部分は、典型的には開口気孔から構成される。
生分解性無細胞性マトリックスは、例えば薄膜へと成形されたコラーゲン(例えばウシまたはブタI型コラーゲン)を含有しうる。このような膜の１種は、Sulzer Calcitek により製造されておりBIOMEND(商標)として販売されている。別のこのような膜性マトリックスは、ブタI型およびIII型コラーゲンから作られており、Geistlich Sohne AG (Wolhusen, Switzerland)よりBIO-GIDE(登録商標)として販売されている。BIO-GIDE(登録商標)は二重層構造を有しており、１つの表面は多孔性であって細胞の内方成長を可能にし、２つ目の表面は密であって繊維組織の内方成長を妨げる。
他の適当なコラーゲン含有マトリックスとしては、NeuCell, Inc. (Campbell, CA)により製造されているCOLLAGRAFT(登録商標)、およびWright Medical Technology (Arlington, TN)から販売されているOSTEOSET(登録商標)の硫酸カルシウムα半水和物ペレットがある。
生分解性無細胞性マトリックスはまた、顆粒またはブロックに成形された骨海綿体(bone spongiosa)から作ることができる。この材料は、実質的に全ての有機物質(例えば、タンパク質、脂質、核酸、炭水化物および小さい有機分子(例えばビタミンおよび非タンパク質ホルモン))が取り除かれた、動物(例えばヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタまたはヤギ)骨からなる。このタイプのマトリックスは、本明細書において「非有機質マトリックス」(anorganic matrix)と呼ばれる。このようなマトリックスの１つは、BIO-OSS(登録商標)海綿状顆粒およびBIO-OSS(登録商標)ブロックとして販売されている、Geistlich Sohne AGにより製造されているものである。この会社はまた、非有機質骨を含有し、さらに約10重量％のコラーゲン繊維を含有する、ブロック型マトリックス(BIO-OSS(登録商標)コラーゲン)を製造している。
他の有用な生分解性無細胞性マトリックスは、ゼラチン、腸線、脱灰骨、非有機質骨、サンゴもしくはヒドロキシアパタイトまたはこれらの物質の混合物を含有してもよい。例えばヒト脱灰骨から作られたマトリックスは、小さなブロックに成形され、GenSci Regeneration Laboratories, Inc. (Toronto, Ontario)によりDYNAGRAFT(登録商標)として販売され、Tutogen Medical, Inc. (Clifton, NJ)によりTUTOPLAST(登録商標)として販売され、またはOsteotech, Inc. (Eatontown, NJ)によりGRAFTON(登録商標)脱灰骨マトリックスとして販売されている。脱灰骨を、例えばコラーゲンと混ぜ合わせて、スポンジ、ブロックまたは膜の形のマトリックスを製造することができる。生分解性マトリックスは、ムコ多糖またはヒアルロン酸などのグリコサミノグリカンを含有してもよい。さらに、１種以上のモノマーから作られる合成ポリマーを、本明細書において有用な生分解性無細胞性マトリックスを作るために使用してもよい。このような合成ポリマーとしては、例えばポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸)、およびポリ(グリコール酸)-ポリ(乳酸)が含まれる。合成ポリマーはまた、マトリックスを形成するために、上述の材料のいずれとも組み合わせることができる。単一のマトリックスを形成する異なるポリマーが、別々の区画または層に含まれていてもよい。例えば、W. L. Gore & Associates, Inc. (Flagstaff, AZ)は、多孔性の生分解性無細胞性マトリックス(GORE RESOLUT XT 再生材料)を製造している。このマトリックスは、合成の生物吸収性グリコリドおよびトリメチレンカーボネートコポリマー繊維(そこへの細胞の移動を可能にする)が、合成の生物吸収性グリコリドおよびラクチドコポリマーから構成される閉塞性の膜(細胞の内方成長を可能にしない)に結合されているマトリックスである。適当な生分解性マトリックスの他の例は、例えば米国特許第5885829号に見られる。
生分解性無細胞性マトリックスが選択されたら、細胞の濃縮懸濁物(例えば自己由来の継代した繊維芽細胞含有または不含の自己由来の継代したUMC)を、そのマトリックスの表面に、均一に分布させることができる。液体懸濁物を吸収するマトリックスの収容量を超過することを避けるために、典型的には濃縮懸濁物を使用する。例えば、GORE RESOLUT XTマトリックスに適用される細胞懸濁物は、一般に約94μl〜約125μlの容量を有し、マトリックス1平方センチメートル当たり約2.0×106〜約4.0×106個の細胞を含有することができる。細胞は、培地をさらに追加することなく、マトリックスに付着させることができる。細胞とマトリックスとのインキュベーションは、例えば約37℃で1〜2時間行なえばよい。細胞は、一般的に、約60分のインキュベーション後にはマトリックスに付着して、マトリックス材料全体に均一に分布している。この時点で、細胞負荷マトリックスを含有する培養容器に追加の増殖培地を補充し、細胞をマトリックスにおいて約3〜4日間培養することができる。細胞はマトリックスの隙間を実質的に満たしてしまうような高密度でマトリックスに加えられるため、増殖は前記3〜4日の培養期間の間にほとんどまたはまったく起こらない。分裂している繊維芽細胞はマトリックスを分解または部分分解する酵素(例えばコラゲナーゼ)を分泌することがあるので、実際、この期間における著しい細胞増殖は一般に望ましくない。
細胞を含むマトリックスは、被験者に投与した場合に免疫応答を引き出しうるような免疫原性タンパク質(例えばマトリックス播種工程において非自己由来血清を含有する培地が用いられた場合には、培地血清由来のタンパク質)を実質的に除去するために、典型的には例えば生理食塩水、または、血清およびフェノールレッドを含まない培地で洗浄する(例えば10分ずつ、少なくとも3回洗浄する)。各洗浄に新鮮なPBSを使用してもよい。次いでマトリックスは、使用前に、新鮮なPBSまたは無血清培地中でインキュベート(例えば２時間のインキュベーション)することができる。インキュベートした後、継代した繊維芽細胞含有または不含の自己由来の継代したUMCを含有するマトリックスを、組織変性または欠陥の領域に配置することができる。
コラーゲンスポンジマトリックス(例えばCOLLACOTE(登録商標))の場合は、増殖培地約1.5ml中の約1.5×107〜2.0×107個の細胞を、2cm×4cmの薄い(厚さにして約2.5〜3.0mm)スポンジ上に播種することができる。次いで、さらなる培地を追加することなく、スポンジを37℃で約1〜2時間インキュベートして、実質的に全ての細胞をマトリックス材料に付着させる。細胞の付着後、マトリックスおよび細胞組成物に追加の増殖培地を添加し、次いで培地を毎日換えながら37℃で3〜4日間インキュベートする。細胞播種工程に非自己由来血清を含有する培地を使用した場合は、組成物を、そのような血清を含有する増殖培地から取り出してPBSで繰り返し(例えば３回以上)洗浄してもよい。各PBS添加の後に、マトリックスを10〜20分間インキュベートしてから、PBSを廃棄する。最後の洗浄の後、組成物を直ちに被験者に投与してもよいし、または生理学的溶液(例えばクレブス-リンガー溶液)を含有する輸送用バイアルに移し替えて約4℃で最大約24〜48時間インキュベートしてもよい。
膜性マトリックス(例えばBIOMEND(商標))の場合は、約100μlの増殖培地中の約3×106〜8×106個の細胞(例えばUMC、または繊維芽細胞を含むUMC)を、15mm×20mmの薄い膜(厚さにして約0.5〜1.0mm)上に播種することができる。さらなる培地を追加することなく膜を37℃で約30〜60分インキュベートして、マトリックス材料に実質的に全ての細胞を付着させる。細胞の付着後、マトリックスおよび細胞組成物に追加の増殖培地を添加し、次いで培地を毎日換えながら37℃で2〜3日間インキュベートする。細胞に利用されるマトリックス内の空間を実質的に満たすように、典型的には細胞を高密度(上記参照)でマトリックスに添加する。組成物を洗浄すること、ならびに、直ちに使用するかまたはインキュベートするかのいずれかについては、スポンジマトリックスについて上述した通りである。
ブロックマトリックス(例えば、上述の非有機質マトリックス、例えばBIO-OSS(登録商標)ブロック、または、脱灰骨マトリックス、例えばDYNAGRAFT(商標)マトリックス)の場合は、約100〜150μlの増殖培地中の約1.2×107〜2.0×107個の細胞を、1cm×1cm×2cmの立方体マトリックスブロック中に播種することができる。典型的には、細胞をブロックの１つの面にゆっくり播種する。培地と細胞がブロックに吸収されたら、ブロックの別の面に同様にして播種する。ブロックの全ての面が播種されて、ブロックが培地で完全に飽和されるまで、この手順を繰り返すことができる。過剰の培地を添加することによりブロックから細胞および培地が漏出するのを避けるために、注意を払わなければならない。次いで、さらなる培地を追加することなく、組成物を37℃で約60分〜120分間インキュベートして、マトリックス材料に実質的に全ての細胞を付着させる。細胞の付着後、マトリックスおよび細胞組成物に追加の増殖培地を添加し、次いで培地を毎日換えながら37℃で2〜3日間インキュベートすることができる。上述と同じ結果でもって細胞に利用されるマトリックス内の空間を実質的に満たすために、典型的には細胞を高密度(上記参照)でマトリックスに添加する。組成物を洗浄すること、ならびに、直ちに使用するかまたはインキュベートするかのいずれかについては、スポンジマトリックスについて上述した通りである。
自己由来の継代した細胞および生分解性マトリックスの小さい粒子(例えばFASCIAN(商標)、CYMETRA(商標)、またはDERMALOGEN(商標))を含有する組成物は、例えばルアーロック(luer lock)により接続された2つのシリンジの間でそれらを行ったり来たりさせながら成分を混合することで調製することができる。例えばFASCIAN(商標)は、一般的に1シリンジ当たり80mgでシリンジ(例えば3ccのシリンジ)に入った状態で入手できる。FASCIAN(商標)粒子は、使用前にシリンジ内で直接洗浄することができるが、それは次のように行なう。シリンジ内に少量(例えば1.5ml)の洗浄バッファー(例えば等張性生理食塩水またはデキストロース含有のクレブス-リンガー溶液)を吸い上げ、ルアーロックにより第一のシリンジを第二のシリンジに接続し、粒子および洗浄溶液を、2つのシリンジの間で数回行ったり来たりさせる。粒子を洗浄溶液から分離するには、混合物を無菌チューブに移して、FASCIAN(商標)粒子を沈降させる。溶液を取り除いてもよいし(例えばデカントするかまたは吸引する)、粒子を新しいシリンジに吸い上げる(例えば18または20ゲージ針により)ことで、所望によりこの洗浄工程を繰り返してもよい。
粒子を適当に洗浄したら、それら粒子は、洗浄のための手順と同じ方法を用いて、細胞(例えばUMCおよび場合により繊維芽細胞)と混合することができる。細胞(例えば1×107〜3×107個)を溶液(例えば5％デキストロースを含むクレブス-リンガー溶液1.5ml)中に懸濁させて、シリンジに吸い上げる。細胞が入っているシリンジを、ルアーロックにより充填粒子が入っているシリンジに接続して、2つの成分をこれらのシリンジ間で行ったり来たりさせることで混合することができる。次いで、細胞が充填粒子に付着できるように、T-25組織培養フラスコまたは組織培養ディッシュもしくはチューブに混合物を移し替える。これとは別に、混合物をシリンジに残しておいて、その間に付着を起こさせてもよいが、これは細胞にとつてより有害であり得る。混合物は、一晩インキュベートしてから、医師に送達するための容器(例えばバイアルまたはチューブ)に移し替えてもよく、または被験者に投与するためのシリンジに移し替えてもよい。医師に送達される容器は、送達の間中、氷上に保持することができる。このような小さな粒子の無細胞性生分解性マトリックスを用いる場合は、細胞含有粒子の懸濁物を、組織変性または欠陥の部位に埋め込む代わりに、任意で注入してもよい。
生分解性無細胞性マトリックスを含有する組成物中に2種の細胞(例えばUMCおよび繊維芽細胞)が含まれる場合には、前記2種の細胞を、マトリックスに播種する前に一緒に混合することができる。これとは別に、前記2種の細胞を、別々にマトリックスに播種してもよい。1つの細胞型(例えば繊維芽細胞)を、別の細胞型(例えばUMC)の前または後に播種する場合は、第2の播種を、第1の播種の直後に、または第1の播種の細胞がマトリックス材料に実質的に付着した後に行なうことができる。
本発明はまた、細胞(例えば自己由来の継代したUMC)およびマトリックス成分の両方を含有する組成物の製造方法を提供する。これらの方法は、典型的には免疫原性タンパク質(例えば培地血清由来のタンパク質)を実質的に含まない自己由来の継代した細胞の懸濁物を用意すること、生分解性無細胞性マトリックスを用意すること、細胞がマトリックス上にまたは内に組み込まれるように生分解性無細胞性マトリックスを細胞懸濁物とインキュベートすること、これにより組織を修復または補強するための組成物を形成すること、を含んでなる。これらの方法はまた、第2の細胞懸濁物(自己由来の継代した繊維芽細胞)を、第1の細胞懸濁物と一緒にまたは別々に、マトリックスに加えることを含んでもよい。
６．充填材料を含有する組成物
本発明の組成物は、細胞(例えば自己由来の継代したUMC)を、1以上の注入可能な生分解性無細胞性充填材料(例えば、充填剤または増量剤)と一緒に含有することができる。かかる組成物は、変性した組織を修復するために被験者に注入するのに適している。充填材料は通常、構造的な役割を果たす。例えば、充填材料は組織の欠陥、穴、空間または腔を埋めることができ、また注入した細胞が周囲の組織に付着して増殖し、また新しい組織の増殖の結果生じる構造的および他の因子(例えば化学走化性因子)を産生することができる環境を提供する。多くの場合、充填剤の隙間を埋める機能は、一時的なものであり、移植細胞および／または宿主細胞がその領域に移動して、新しい組織を形成するまで持続するにすぎない。充填剤は好ましくは生分解性である。充填剤は、典型的には粘性の溶液または懸濁液として提供され、使用される。充填剤を１以上の細胞型(例えばUMCおよび繊維芽細胞)と組み合わせることができる。細胞は、典型的には容積にして約1:1の比率で充填剤と組み合わされるが、どのような適当な比率を用いてもよい。
多くのタイプの注入可能な生分解性無細胞性充填剤を、本発明の組成物に加えることができる。充填剤は、被験者から取得した任意の型のコラーゲンを含めて、自己由来のタンパク質でありうる。このような充填剤の例は、以前Collagenesis Corp. (Beverly, MA)により製造されていたAutologen(登録商標)である。Autologen(登録商標)は、被験者からの自己由来真皮コラーゲン繊維の分散体であり、そのため被験者にUMCや場合により繊維芽細胞などの細胞と共に再投与しても、最小限の免疫応答をも引き起こさない。Autologen(登録商標)を取得するには、組織(例えば真皮、胎盤、または臍帯)の標本を被験者から取得し、それをCollagenesis Corp.に送り、そこでその標本をコラーゲンに富んだ分散体へと加工してもらう。約1.5平方インチの真皮組織から1立方センチメートル(cc)のAutologen(登録商標)を得ることができる。Autologen(登録商標)の濃度は、被験者における欠陥を修復するかまたは組織を補強するために必要な量に応じて調節することができる。分散体中のAutologen(登録商標)の濃度は、例えば少なくとも25mg/L(例えば少なくとも約30gm/L、少なくとも約40mg/L、少なくとも約50mg/L、または少なくとも約100mg/L)とすることができる。
注入可能な無細胞性充填材料はまた、任意の型のコラーゲンを含めて、非自己由来のタンパク質を含有してもよい。無数のコラーゲン製品が市販されており、本発明の組成物に使用可能である。ヒトコラーゲン製品もまた市販されている。市販のコラーゲンの例としては、限定するものではないが、ウシコラーゲン、例えばZyderm(登録商標)およびZyplast(登録商標)(これらは0.3％リドカインを有するリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁された、グルタルアルデヒドで架橋した再構成ウシコラーゲン繊維を含有する)などの再構成ウシコラーゲン製品がある。これらの製品はSanta Barbara, CA.のMcGhan Medical Corporation により製造されている。ブタコラーゲン製品もまた市販されている。本発明において有用なコラーゲンは、適切な生物種の組織から分離することができるか、または組換えタンパク質として製造することができるものである。組換えタンパク質は、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有してもよく、またはタンパク質の機能を向上させる置換、欠失もしくは挿入を含有するアミノ酸配列を有してもよい。
有用な充填材料の他の例は、限定するものではないが、可溶化ゼラチン、ポリグリコール酸(例えば可溶化ポリグリコール酸もしくはポリグリコール酸の粒子)または腸線縫合糸を含む。例えば、特定のゼラチンマトリックス移植片がFibril(登録商標)の登録商標で販売されている。この充填剤は、(1)0.9体積％の塩化ナトリウム溶液中に分散させたブタゼラチン粉末およびo-アミノカプロン酸、ならびに(2)前記被験者由来の血漿のアリコートを等容量で含有する。充填剤として有用な他の物質には、ヒアルロン、ヒアルロン酸、レスタリン(restalyn)およびパーレーン(parleane)が含まれる。
生分解性無細胞性充填剤を含有する組成物中に2種の細胞型(例えばUMCおよび繊維芽細胞)が含まれる場合、前記2種の細胞を、充填剤との混合前に一緒に混合してもよい。これとは別に、これらの細胞を充填剤と順次混合してもよい。1つの細胞型(例えば繊維芽細胞)を、別の細胞型(例えばUMC)の前または後に充填剤と混合するとき、第2の混合は第1の混合の直後に、または適当なインキュベーション期間後に行ってもよい。
本発明はまた、細胞(例えば自己由来の継代した繊維芽細胞含有または不含の、自己由来の継代したUMC)および生分解性無細胞性充填剤を含有する組成物を調製する方法を提供する。これらの方法は、典型的には免疫原性タンパク質(例えば培地血清由来のタンパク質)を実質的に含まない細胞(例えば自己由来の継代したUMCおよび場合により繊維芽細胞)の懸濁物を用意すること、１以上の生分解性無細胞性充填材料を用意すること、ならびに充填剤を細胞懸濁物と組み合わせることを含んでなる。これとは別に、異なる細胞型の別々の懸濁物を充填剤と組み合わせてもよい。
７．繊維芽細胞含有または不含のUMCを含有する組成物の使用方法
本発明の細胞組成物は、例えば皮膚、骨または軟部組織の欠陥の治療に用いることができる。細胞組成物は、上述の効果を有するようアテロコラーゲン溶液の代わりに用いることができる。本発明で治療することができる、疾患、障害または欠陥に起因する組織の変性は口腔粘膜の欠陥、口腔粘膜への外傷(例えば抜歯)または口内の骨(例えば上顎または下顎骨)への外傷、歯周病、糖尿病、皮膚潰瘍または静脈鬱滞の欠陥を含む。さらに、結果的に組織変性をもたらし得る歯周病の例は、制限するものではないが、歯周変性、歯肉炎、または口蓋粘膜もしくは歯肉粘膜の非治癒性創傷、あるいは骨の変性を含む。本明細書によって治療することができる他の欠陥は、皮膚の欠陥、例えば、創傷、しわ、笑いじわ、皮膚萎縮線条、陥没した瘢痕、外傷に起因しない皮膚の陥没、にきびの瘢痕またはにきびによる皮下萎縮、外傷、先天性奇形または加齢を含む。さらに、本発明の組成物は、唇の形成不全、唇のしわ、または骨の欠陥(例えば眼窩、頬骨、頭蓋骨、口蓋破裂骨欠陥、および鼻骨を含む顔面骨、ならびに、背骨および長骨などの骨の欠陥)などの欠陥の治療に使用することができる。
本明細書において用いる「予防」は、疾患の症状の完全な防止、疾患の症状の発症の遅延、または発症後に発現する疾患の重症度を軽減させることを意味しうる。「防止」は疾患(例えば癌)の症状が実質的に不在であることを意味するのが妥当である。本明細書において用いる「治療」は、疾患の症状が完全になくなること、または疾患の重症度が軽減することを意味しうる。
本発明の組成物は、組織欠陥(例えば上述の欠陥)を治療するために被験者に投与することができる。投与は、適当な方法、例えば注入、移植または植え継ぎ(grafting)によるものであってよい。
本発明の１つの実施形態である、顔の表面的なしわの治療は、以下の通り実施することができる。治療する部位にアルコール消毒を施し、ピンと張った表面となるよう引き延ばす。シリンジに細胞懸濁物を充填し、注入のために30ゲージ以上(例えば22ゲージ、18ゲージ、または12ゲージ)の針を取り付ける。可能な限り表面的に、皮膚部位に針を挿入する；針を傾斜させる方向は特に決まっていない。放射性医学的誘導(radiologic guidance)を使用してもよい。皮内注射は、かすかに白くなるまで、穏やかな圧力のもとで行う。複数の注入を連続的に行ってもよい。
別の実施形態において、被注入物は、唇の形成不全を治療するために輪筋系に、または深い皮下の欠陥を治療するために皮下組織に配置してもよい。
別の実施形態においては、広い範囲のにきびの瘢痕を、中間または深層真皮のレベルまでの皮膚削り術によって治療することができる。次いで繊維芽細胞含有クロットを、削った表面を覆うように形造り、クロットの繊維芽細胞を播種した面が削った真皮表面に並置されるように貼り付ける。その後、貼り付けたクロットを、例えばXeroform3もしくはAdaptic3などの包帯、または非密閉性包帯で覆ってもよい。
UMCおよび繊維芽細胞を投与する場合のほとんどにおいて、これらは単一の組成物としてまたは別々の組成物として、一緒に投与される。しかしながら、UMCと繊維芽細胞を別々に調製して、別々に投与してもよいことが理解されよう。前記2つの細胞集団を別々に投与する場合、投与は同時であっても連続的(任意の順序で)であってもよい。連続的に行う場合、投与は分単位の間隔(例えば、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, または55分)、時間単位の間隔(例えば1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 18, 22, または23時間)、日単位の間隔(例えば1, 2, 3, 4, 5, または6日)、または週単位の間隔(例えば1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50またはより多くの週)で行なうことができる。
８．ケラチノサイトおよび繊維芽細胞を含有する組成物の使用方法
ケラチノサイトは、表皮の主な細胞集団を構成し、傷ついた表皮組織の修復および再生を成し遂げるのに主要な役割を果たす。本発明は、繊維芽細胞含有または不含のケラチノサイトを含有する細胞懸濁物を注入することにより、組織欠陥(例えば熱傷)の修復を増強する方法を提供する。上述のように、創傷の外縁から創傷の中心に向かうケラチノサイトの増殖のために、創傷の治癒は多くの場合瘢痕化という結果に終わる。創傷の中心部位にケラチノサイト(自己由来の継代したケラチノサイト)を注入することで、治癒を円滑にすることができ、瘢痕化を減少させるかまたはそもそも回避することができる。ケラチノサイトならびに繊維芽細胞および／またはUMCを含有する組成物は、熱傷(例えば小さい熱傷、またはより大きな熱傷の残ってしまった非治癒部分)を治療するために特に有用であるが、これらの細胞型のうちの1種のみを含有する組成物もまた使用することができる。治療する熱傷は、典型的には直径約3〜5センチメートルであるが、どのような大きさまたは寸法のものであってもよい。この種の治療は、創傷たとえば熱傷によって傷つけられた真皮を「埋める」と同時に復元する役割を果たすことができる。
９．デバイス
本発明は、被験者における真皮欠陥を修復するためのデバイスを提供する。このようなデバイスは、シリンジチャンバーを伴った皮下注射用シリンジ、シリンジチャンバー内に配置されたピストン、およびシリンジチャンバーと連絡しているオリフィスを含みうる。シリンジチャンバーは、細胞の懸濁物、例えば自己由来の継代したUMCおよび自己由来の継代した繊維芽細胞、または本明細書に開示する他の細胞組成物または細胞混合物を含有してもよい。細胞懸濁物は、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものである。細胞は、培地(例えば無血清培地)に、または製薬上許容される担体溶液(例えば滅菌水または生理食塩水)に懸濁されていてもよい。デバイスはまた、シリンジチャンバーと連絡しているオリフィスに固定される皮下注射用針を有してもよい。
本発明はまた、上述のデバイスの製造方法を提供する。この方法は、本明細書に記載する方法を用いて細胞懸濁物を調製すること、そして次に細胞懸濁物をシリンジのシリンジチャンバーに配置することを含む。
本発明を以下の実施例においてさらに詳述するが、それら実施例は特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１ 自己由来UMCおよび繊維芽細胞の分離
細胞は、以下の手順で健常者のボランティアから取得した皮膚生検材料からの培養を開始することにより、in vitroで回収および富化した。後耳介部位から約3〜5mm3の生検材料を取得し、4500 mg/L D-グルコース、2 mM L-グルタミン、非必須アミノ酸、および10％FBSを含有するDMEMを用いて上述のように繊維芽細胞組織培養を開始した。非付着性の活発に増殖する細胞のコロニーは、付着性の繊維芽細胞が第2または第3の継代において全面的なコンフルエント状態に達した後に観察された。この過程は、低血清中で培養を開始すること、および5ng/mlのaFGFを存在させることにより、または最終濃度15〜30mMとなるまで300mM CaCl2を添加した血漿クロット中で細胞を増殖させることにより(実施例２を参照)、短縮することができた。各コロニーは、類上皮細胞と外見が似ていて活発に分裂する2〜約80個の細胞を含有していた。コロニーは、浮遊コロニーを含有する培地を吸引して、この培地を遠心分離することにより回収した。遠心分離によりペレット化した細胞は、aFGFおよびヘパリンを含有する新鮮な培地(4500 mg/L D-グルコース、2 mM L-グルタミン、および2.5％熱不活化FBS、5 ng/mL 組換えヒトaFGF、および5μg/mL ヘパリンを含有するDMEM)に直接播種することにより、新しい組織培養容器に移し換えた。細胞懸濁物を新鮮な組織培養フラスコに添加して37℃でインキュベートした。細胞に週2回供給し、コンフルエント状態に達したら(通常1〜2週間内)、継代するかまたは選択的トリプシン処理を施した。丸石様細胞のコロニーは、培養の開始から約3〜6週間のうちに観察された。これらのコロニーを分離して新鮮な組織培養容器で培養すると、細胞が付着性となった。
非付着性細胞のコロニーもまた、以下のようにしてヒト脂肪組織から分離された。組織を小片に切り、肉眼で見える膜を全て取り除いた。この組織を、4500 mg/L D-グルコース、2 mM L-グルタミン、および2.5％熱不活化FBS、1〜10 ng/mL 組換えヒトaFGF、および5μg/mLヘパリンを含有するDMEMの培地に配置した。こうした条件下では、丸石様細胞が脂肪組織から活発に放出され、長期間にわたり増殖し続けた。脂肪組織の小片を洗浄し、新鮮な組織培養容器に入れた。約2週間のうちに、コラゲナーゼIVを用いて約5〜15分間37℃で処理することによりUMCを組織から分離した。脂肪組織からの新しい細胞は、培養を終わらせるまで1年にわたり、培養下で活発に増殖する状態を保ち続けた。培養物が十分に増殖したら、非付着性細胞のクラスターが観察された。これらの細胞を新鮮な組織培養フラスコに再播種したところ、同じタイプの細胞が活発に増殖することが観察された。
aFGFの存在下では、皮膚および脂肪組織の両方からの培養物中の細胞は、外見が形態学的に均質であり、丸石様形態を有する類上皮細胞に似ていた。しかしながら、培地からaFGFを取り除くと、ほとんどの細胞は付着性繊維芽細胞へと完全に分化した。丸石様非付着性細胞はまた、Markoら(前掲)によって記載された方法を用いて、骨髄から開始させた培養物中にも観察された。真皮から樹立された繊維芽細胞培養物または脂肪組織もしくは骨髄の培養物から回収された非付着性類上皮様細胞の少なくとも亜集団はUMCである、と結論づけられる。
実施例２ 血漿クロット中での細胞の分離および増殖
本明細書に記載する方法で分離した細胞は、血漿クロットゲル(plasma clot gel)中で培養した。この方法は各種細胞型を分離して精製するのに有用である。血漿クロットは、フィブリンまたは塩化カルシウムを凝固剤として、自己由来のヒト血漿、ウシ血漿、または仔ウシ血漿を用いて調製した。血漿クロットゲルを調製し、予備洗浄し、プレインキュベートし、次いで培養フラスコから直接移し換えた所望の細胞型を播種した。細胞のコロニーは、クロットゲルから直接、簡単に分離した。これとは別に、クローニング装置により、またはウェルプレートインサート(well plate insert)により細胞を分離したが、その場合には細胞をインサートに播種し、また、増殖因子送達のための支持細胞(例えば繊維芽細胞または他の所望の細胞型)をインサートの下に播種した。
実施例３ 繊維芽細胞懸濁物を用いた熱傷治療
額全体を覆う6ヶ月経過した非治癒性熱傷を有する患者を、フェノールレッド不含DMEM 1 ml当たり30〜40×106個の繊維芽細胞の懸濁物を創傷に直接注入することにより治療した。2週間の間隔を空けて熱傷に同じようにさらに2回注入を行ったが、2回目の注入までに傷はほぼ完全に閉じていた。その後熱傷は最小限の瘢痕を残すのみで治癒した。レーザー熱傷を有する他の患者を、同じように治療して同様の成功を収めた。3回の注入後、未使用細胞は、必要に応じて将来使用するために液体窒素中に貯蔵した。繊維芽細胞のみを含有する組成物と比較して、繊維芽細胞のみならずケラチノサイトをも含有する組成物は少なくとも同程度効果的であり、おそらくより効果的であろう。さらに、UMCが繊維芽細胞に分化できるという事実を考慮すると、UMCは、繊維芽細胞含有または不含で投与したとしても、繊維芽細胞と同程度効果的であろう。
実施例４ 活性化因子を用いたUMC処理の最適化
UMC培養物に添加する活性化化合物の最適濃度を決定するために、in vitro実験を実施した。マトリックスまたは単層中で培養したUMCを、さまざまな濃度の活性化化合物(例えば本明細書に開示したもの)とともにインキュベートした。最適濃度は、どの濃度が最大レベルの細胞増殖に結びつくかを評価することにより決定した。これとは別に、最適濃度は、最大レベルのコラーゲン産生をもたらす濃度である。コラーゲンは培地に分泌され、例えば免疫学的アッセイ(ウェスタンブロットまたはELISAなど)で測定しうる。繊維芽細胞を用いて試験した活性化化合物の最適濃度は、アスコルビン酸については10-5M、アスコルビルパルミテートについては10-7M、およびL-リポ酸については10-6〜10-7Mであった。
他の実施形態
本発明はその詳細な説明と関連して記載したが、上述の記載は、本発明を例示することを意図したにすぎず、本明細書に添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定することを意図したものではない、と理解すべきである。他の態様、効果、および変更は、本明細書に添付の特許請求の範囲内にある。

Claims (62)

  1. 自己由来の継代したUMCおよび自己由来の継代した繊維芽細胞を含み、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない、組織を修復するための組成物。
  2. 前記自己由来の繊維芽細胞が、被験者の歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄、筋膜、または脂肪組織からのものである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記UMCが真皮組織、脂肪組織、結合組織、筋膜、粘膜固有層または骨髄からのものである、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記UMCまたは前記繊維芽細胞が、１以上の活性化化合物で処理したものである、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記１以上の活性化化合物が、アスコルビルパルミテート、リノール酸、キナ酸、キナ酸塩、キナ酸ラクトン、コエンザイムQ-10、L-ヒドロキシ酸、L-リポ酸、カルシウム一リン酸、カルシウム三リン酸、ナイアシン、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)、ジメチルアミノエタノール(DMAE)、α-トコフェロール、骨形成タンパク質(BMP)、ビタミンE、ビタミンC、カロテノイド、グリコール酸、カルボキシアルキルエステル、エストリオール、アセチル-L-カルニチン、デプレニル、リコペン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)、システイン、プロシステイン、ピカミロン、ビンポセチン、レチノイン酸、アンチネオプラストン、および増殖因子からなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記UMCまたは前記繊維芽細胞が、低エネルギーレーザー光に曝露されたものである、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記組成物がさらに生分解性マトリックスを含み、前記UMCおよび前記繊維芽細胞が前記マトリックス内にまたは上に組み込まれている、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記UMCおよび前記繊維芽細胞と組み合わせる前の前記マトリックスが、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ゼラチン、ポリグリコール酸、腸線、脱灰骨、ヒドロキシアパタイト、および非有機質骨からなる群より選択される物質を1以上含む、請求項７に記載の組成物。
  9. 注入可能な生分解性無細胞性充填剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記UMCと組み合わせる前の前記注入可能な生分解性無細胞性充填剤が、(a)自己由来コラーゲン繊維の注入可能な分散体；(b)コラーゲン；(c)可溶化ゼラチン；(d)可溶化ポリグリコール酸；(e)可溶化腸線；(f)塩化ナトリウム溶液中に分散させたブタゼラチン粉末とアミノカプロン酸、および前記被験者からの血漿のアリコート；ならびに(g)ヒアルロン酸からなる群より選択される物質を1以上含む、請求項９に記載の組成物。
  11. 被験者における組織の修復方法であって、以下の工程：
    (a)自己由来の継代したUMCを含み、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない組成物を調製すること、
    (b)前記被験者における組織欠陥または組織変性の部位を同定すること、
    (c)前記組織欠陥または変性が修復されるように、前記部位に前記組成物を配置すること、
    を含んでなり、ここで、前記組織欠陥または変性は、軟部組織欠陥、口腔粘膜の欠陥、口腔粘膜への外傷、歯周病、糖尿病、皮膚潰瘍、静脈鬱滞、または皮膚の美容上の欠陥を含むものである、前記方法。
  12. 前記軟部組織の欠陥が、顔面のくぼみ、乳房の発育不全、乳房の不在、声帯欠陥、口蓋帆咽頭不全、ポーランド症候群、男性性器の発育不全、唇の形成不全、および皮下萎縮または筋肉萎縮からなる群から選択されるものである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記口腔粘膜への外傷が、抜歯により生じる抜歯窩である、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記歯周病が、歯周変性、歯肉炎、または口蓋粘膜もしくは歯肉粘膜の非治癒性創傷を含む、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記美容上の欠陥が、しわ、陥没した瘢痕、外傷に起因しない皮膚の陥没、笑いじわ、皮膚萎縮線条、創傷瘢痕、にきびの瘢痕、および皮下萎縮からなる群より選択されるものである、請求項１１に記載の方法。
  16. 前記組織の欠陥が、唇または唇のひだの形成不全である、請求項１１に記載の方法。
  17. 前記自己由来のUMCが、前記被験者の歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、筋膜、骨髄、または脂肪組織からのものである、請求項１１に記載の方法。
  18. 前記組成物がさらに生分解性マトリックスを含み、前記UMCが前記マトリックス内にまたは上に組み込まれている、請求項１１に記載の方法。
  19. 前記組成物がさらに生分解性無細胞性充填剤を含む、請求項１１に記載の方法。
  20. 被験者における組織欠陥を修復する方法であって、以下の工程：
    (a)自己由来の継代したUMCおよび自己由来の継代した繊維芽細胞を含み、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない組成物を調製すること、
    (b)前記被験者における組織欠陥または組織変性の部位を同定すること、
    (c)前記組織欠陥または変性が修復されるように、前記部位に前記組成物を配置すること、
    を含んでなる前記方法。
  21. 被験者における組織欠陥を修復する方法であって、以下の工程、
    (a)(1)自己由来の継代したUMC、(2)自己由来の継代した繊維芽細胞、および(3)製薬上許容される担体を含み、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない医薬組成物を調製すること、
    (b)歯もしくは歯周の欠陥、皮膚の美容上の欠陥、および骨の欠陥からなる群より選択される、被験者における組織欠陥または組織変性の部位を同定すること、
    (c)治療上有効な量の前記医薬組成物を、組織欠陥または組織変性の部位に隣接したところに注入すること、ただし、前記注入は結果的に組織欠陥または組織変性の修復をもたらすものであること、
    を含んでなる前記方法。
  22. 被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した被験者の組織を修復する方法であって、前記組織が修復されるように、請求項９に記載の組成物を前記被験者の変性部位に注入することを含んでなる、前記方法。
  23. 被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した被験者の組織を修復する方法であって、前記組織が修復されるように、請求項７に記載の組成物を前記被験者の変性部位に配置することを含んでなる、前記方法。
  24. 被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した被験者の組織を修復する方法であって、以下の工程：
    (a)前記被験者の組織変性の部位に自己由来の継代したUMCを注入すること、ただし、前記UMCは培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものであること、
    (b)前記被験者の組織欠陥または所望の組織増強の部位に自己由来の継代した繊維芽細胞を注入すること、ただし、前記繊維芽細胞は培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものであること、
    (c)生分解性無細胞性充填剤を前記部位に注入すること、
    を含んでなる、前記方法。
  25. 組織修復のための細胞性組成物の調製方法であって、
    (a)出発細胞を取得するために未分化間葉細胞(UMC)含有組織の生検材料を用意すること、
    (b)前記生検材料から前記出発細胞を分離すること、
    (c)前記出発細胞を培養すること、
    (d)前記培地から非付着性誘導細胞の集団を回収すること、ただし、前記非付着性誘導細胞はUMCを含有するものであること、
    を含んでなる前記方法。
  26. 前のラウンドで回収した非付着性誘導細胞の集団を出発細胞として利用して工程(c)および(d)を繰り返すことを含む誘導体化をさらに１ラウンド以上含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記１ラウンド以上の追加の誘導体化が、1〜20ラウンドを含むものである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記UMC含有組織が、真皮組織、脂肪組織、結合組織、筋膜、粘膜固有層、および骨髄からなる群より選択されるものである、請求項２５に記載の方法。
  29. 前記非付着性細胞を酸性繊維芽細胞増殖因子の存在下で培養することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  30. 被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した前記被験者の組織を修復するための組成物の調製方法であって、
    (a)前記被験者由来のUMC含有組織の生検材料を用意すること、
    (b)前記生検材料から自己由来UMCを分離すること、
    (c)培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない自己由来UMCを産生する条件下で前記自己由来UMCを培養すること、
    (d)前記培養した自己由来UMCを、前記UMCの懸濁物が得られる条件にさらすこと、
    (e)前記被験者由来の繊維芽細胞含有組織の生検材料を用意すること、
    (f)前記生検材料から自己由来繊維芽細胞を分離すること、
    (g)前記自己由来繊維芽細胞を、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない繊維芽細胞を産生する条件下で培養すること、
    (h)前記培養した自己由来繊維芽細胞を、前記繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件にさらすこと、
    (i)前記UMC懸濁物を前記繊維芽細胞懸濁物と混合すること、
    を含んでなる前記方法。
  31. 前記UMC含有組織が、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄、筋膜、および脂肪組織からなる群より選択されるものである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記自己由来繊維芽細胞含有組織が、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄、筋膜、および脂肪組織からなる群より選択されるものである、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記混合の前に、前記UMCまたは前記繊維芽細胞を１以上の活性化化合物に曝露する、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記１以上の活性化化合物が、アスコルビルパルミテート、リノール酸、キナ酸、キナ酸塩、キナ酸ラクトン、コエンザイムQ-10、L-ヒドロキシ酸、L-リポ酸、カルシウム一リン酸、カルシウム三リン酸、ナイアシン、DHEA、DMAE、α-トコフェロール、BMP、ビタミンE、ビタミンC、カロテノイド、グリコール酸、カルボキシアルキルエステル、エストリオール、アセチル-L-カルニチン、デプレニル、リコペン、NADH、システイン、プロシステイン、ピカミロン、ビンポセチン、レチノイン酸、アンチネオプラストン、および増殖因子からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記UMCまたは前記繊維芽細胞を低エネルギーレーザー光に曝露する、請求項３０に記載の方法。
  36. 被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した前記被験者の組織を修復するための組成物の調製方法であって、
    (a)自己由来の継代したUMCを得ること、
    (b)自己由来の継代した繊維芽細胞を得ること、
    (c)生分解性無細胞性マトリックスを用意すること、
    (d)前記UMCおよび／または繊維芽細胞が前記生分解性無細胞性マトリックス上にまたは内に組み込まれるように、前記UMCおよび前記繊維芽細胞を前記生分解性無細胞性マトリックスとともにインキュベートすること、ここで、前記インキュベーションが組織修復のための組成物をもたらし、前記インキュベーションの条件は、前記組成物が培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないようにする条件であること、
    を含んでなる前記方法。
  37. 自己由来の継代したUMCを得る工程が、
    (a)前記被験者由来のUMC含有組織の生検材料を用意すること、
    (b)前記生検材料から自己由来UMCを分離すること、
    (c)前記UMCを培養すること、
    (d)前記培養したUMCを、前記UMCの懸濁物が得られる条件に曝露すること、
    を含んでなる、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記UMC含有組織が、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、筋膜、骨髄および脂肪組織からなる群より選択されるものである、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記UMCおよび前記繊維芽細胞と混合する前の前記生分解性無細胞性マトリックスが、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ゼラチン、ポリグリコール酸、腸線、脱灰骨、ヒドロキシアパタイト、サンゴおよび非有機質骨からなる群より選択される物質を１以上含有する、請求項３６に記載の方法。
  40. 自己由来の継代した繊維芽細胞を得る工程が、
    (a)前記被験者由来の繊維芽細胞含有組織の生検材料を用意すること、
    (b)前記生検材料から自己由来繊維芽細胞を分離すること、
    (c)前記繊維芽細胞を培養すること、
    (d)前記繊維芽細胞を懸濁させること、
    を含んでなる、請求項３６に記載の方法。
  41. 前記繊維芽細胞含有組織が、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、筋膜、骨髄および脂肪組織からなる群より選択されるものである、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記生分解性無細胞性マトリックスとのインキュベーションの前に、前記UMCまたは前記繊維芽細胞を１以上の活性化化合物に曝露する、請求項３６に記載の方法。
  43. 前記１以上の活性化化合物が、アスコルビルパルミテート、リノール酸、キナ酸、キナ酸塩、キナ酸ラクトン、コエンザイムQ-10、L-ヒドロキシ酸、L-リポ酸、カルシウム一リン酸、カルシウム三リン酸、ナイアシン、DHEA、DMAE、α-トコフェロール、BMP、ビタミンE、ビタミンC、カロテノイド、グリコール酸、カルボキシアルキルエステル、エストリオール、アセチル-L-カルニチン、デプレニル、リコペン、NADH、システイン、プロシステイン、ピカミロン、ビンポセチン、レチノイン酸、アンチネオプラストン、および増殖因子からなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記UMCまたは前記繊維芽細胞を低エネルギーレーザー光に曝露する、請求項３６に記載の方法。
  45. 被験者における疾患、障害または欠陥の結果として変性した前記被験者の組織を修復するための組成物の調製方法であって、
    (a)自己由来の継代したUMCを得ること、ただし、前記UMCは培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものであること、
    (b)自己由来の継代した繊維芽細胞を得ること、ただし、前記自己由来の継代した繊維芽細胞は培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものであること、
    (c)生分解性無細胞性充填剤を用意すること、
    (d)前記自己由来の継代したUMC、前記自己由来の継代した繊維芽細胞、および前記生分解性無細胞性充填剤を組み合わせること、
    を含んでなる前記方法。
  46. 自己由来の継代したUMCを得る工程が、
    (a)前記被験者由来のUMC含有組織の生検材料を用意すること、
    (b)前記生検材料から自己由来UMCを分離すること、
    (c)前記自己由来UMCを、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないUMCが得られる条件下で培養すること、
    (d)前記培養したUMCを、前記UMCの懸濁物が得られる条件に曝露すること、
    を含んでなる、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記UMC含有組織が、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、筋膜、骨髄および脂肪組織からなる群より選択されるものである、請求項４６に記載の方法。
  48. UMCおよび前記繊維芽細胞と組み合わせる前の前記生分解性無細胞性充填剤が、(a)自己由来コラーゲン繊維の注入可能な分散体、(b)コラーゲン、(c)可溶化ゼラチン、(d)可溶化ポリグリコール酸、(e)可溶化腸線、(f)塩化ナトリウム溶液中に分散させたブタゼラチン粉末とアミノカプロン酸、および被験者からの血漿のアリコート、ならびに(g)ヒアルロン酸からなる群から選択される物質を１以上含む、請求項４５に記載の方法。
  49. 自己由来の継代した繊維芽細胞を得る工程が、
    (a)前記被験者由来の繊維芽細胞含有組織の生検材料を用意すること、
    (b)前記生検材料から自己由来の繊維芽細胞を分離すること、
    (c)前記自己由来の繊維芽細胞を、培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない繊維芽細胞が得られる条件下で培養すること、
    (d)前記培養した自己由来の繊維芽細胞を、前記繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件に曝露すること、
    を含む、請求項４６に記載の方法。
  50. 前記繊維芽細胞含有組織が、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、筋膜、骨髄および脂肪組織からなる群より選択されるものである、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記生分解性無細胞性充填剤と組み合わせる前に、前記UMCまたは前記繊維芽細胞を１以上の活性化化合物に曝露する、請求項４５に記載の方法。
  52. 前記１以上の活性化化合物が、アスコルビルパルミテート、リノール酸、キナ酸、キナ酸塩、キナ酸ラクトン、コエンザイムQ-10、L-ヒドロキシ酸、L-リポ酸、カルシウム一リン酸、カルシウム三リン酸、ナイアシン、DHEA、DMAE、α-トコフェロール、BMP、ビタミンE、ビタミンC、カロテノイド、グリコール酸、カルボキシアルキルエステル、エストリオール、アセチル-L-カルニチン、デプレニル、リコペン、NADH、システイン、プロシステイン、ピカミロン、ビンポセチン、レチノイン酸、アンチネオプラストン、および増殖因子からなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記UMCまたは前記繊維芽細胞を低エネルギーレーザー光に曝露する、請求項４５に記載の方法。
  54. 自己由来の継代したケラチノサイトおよび自己由来の継代した繊維芽細胞の懸濁物を調製し、前記懸濁物を熱傷に注入することを含む、被験者における熱傷の修復方法。
  55. 前記自己由来の継代したケラチノサイトおよび自己由来の継代した繊維芽細胞の懸濁物を調製することが、
    (a)前記被験者由来のケラチノサイト含有組織の生検材料を用意すること、
    (b)前記生検材料から自己由来ケラチノサイトを分離すること、
    (c)培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない自己由来ケラチノサイトを産生する条件下で、前記自己由来ケラチノサイトを培養すること、
    (d)前記ケラチノサイトを、前記ケラチノサイトの懸濁物が得られる条件に曝露すること、
    (e)前記被験者由来の繊維芽細胞含有組織の生検材料を用意すること、
    (f)前記生検材料から自己由来繊維芽細胞を分離すること、
    (g)培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない自己由来繊維芽細胞を産生する条件下で、前記自己由来繊維芽細胞を培養すること、
    (h)前記繊維芽細胞の懸濁物が得られる条件に、前記繊維芽細胞を曝露すること、
    (i)前記懸濁させたケラチノサイトと前記懸濁させた繊維芽細胞とを組み合わせること、
    を含んでなる、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ケラチノサイト含有組織が、皮膚、口腔粘膜、歯肉、口内組織、食道組織、子宮頸部外組織、および結膜組織からなる群より選択されるものである、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記繊維芽細胞含有組織が、歯肉、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、筋膜、骨髄および脂肪組織からなる群より選択されるものである、請求項５４に記載の方法。
  58. 前記ケラチノサイトと組み合わせる前に、前記繊維芽細胞を１以上の活性化化合物に曝露する、請求項５４に記載の方法。
  59. 前記１以上の活性化化合物が、アスコルビルパルミテート、リノール酸、キナ酸、キナ酸塩、キナ酸ラクトン、コエンザイムQ-10、L-ヒドロキシ酸、L-リポ酸、カルシウム一リン酸、カルシウム三リン酸、ナイアシン、DHEA、DMAE、α-トコフェロール、BMP、ビタミンE、ビタミンC、カロテノイド、グリコール酸、カルボキシアルキルエステル、エストリオール、アセチル-L-カルニチン、デプレニル、リコペン、NADH、システイン、プロシステイン、ピカミロン、ビンポセチン、レチノイン酸、アンチネオプラストン、および増殖因子からなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記繊維芽細胞を低エネルギーレーザー光に曝露する、請求項５４に記載の方法。
  61. 前記懸濁物が自己由来の継代したUMCをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
  62. 前記熱傷に増強化合物を注入することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
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