MXPA05013486A - Metodos para producir neuronas. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona un método para producir neuronas a partir de células mesenquimales no diferenciadas (UMC). También mediante la invención se caracteriza una neurona aislada producida mediante este método, las composiciones que contienen tales neuronas, y un método para reparar los tejidos neuronales dañados o defectuosos usando tales composiciones.

Description

MÉTODOS PARA PRODUCIR NEURONAS CAMPO TÉCNICO Esta invención ¦ se refiere a la producción de composiciones celulares, y más particularmente a composiciones que contienen neuronas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En vista de la ineficiencia y lentitud de la curación del tejido neural, existe una necesidad apremiante de desarrollar métodos para producir composiciones transpl ntables o implantables de neuronas. Naturalmente, como en todo trasplante de órgano, tejido, o células, es crucial que se evite el rechazo inmunologico de injertos de neuronas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El inventor ha descubierto que el cultivo de células mesenquimales no diferenciadas (UMC) en coágulos de plasma da como resultado la excrescencia de neuronas en los coágulos de plasma. Por consiguiente, la invención presenta un método para producir una población de neuronas que involucra cultivar UMC en un coágulo de plasma. La invención también proporciona una neurona producida mediante tal método y una composición que contiene una población aislada de células que incluye neuronas hechas mediante el método de la invención. En otra modalidad, la invención incluye un método para reparar un defecto del tej ido neural o daño a tej ido neural .

Más específicamente, la invención presenta un método para producir neuronas . El método involucra los pasos secuenciales de: (a) proporcionar una fuente de células mesenquimales no diferenciadas (UMC) ; (b) proporcionar un coágulo de plasma que contiene de aproximadamente 6 mM hasta aproximadamente 18 mM Ca2+; (b) incorporar UMC desde la fuente hacia el coágulo de plasma; y (c) incubar el coágulo de plasma. Durante la incubación, una subpoblación de las UMC en el coágulo de plasma se diferencia en neuronas, creando así en el coágulo de plasma una población de células que comprenden neuronas. El método además puede involucrar aislar la población de células del coágulo de plasma y, opcionalmente , cultivar la población aislada de células en un medio de cultivo libre de suero. La fuente de UMC opcionalmente puede haberse obtenido de un individuo a quien se administra la población. La fuente de UMC puede ser, por ejemplo, un fragmento de piel de mamífero o un fragmento de tejido graso de mamífero. Además, la fuente de UMC puede ser una población de células derivadas no-adherentes que contengan UMC, las células derivadas no-adherentes que se producen mediante un proceso que incluye los pasos de: (a) proporcionar un fragmento de tejido que contiene células mesenquimales no diferenciadas (UMC) para obtener células de partida; (b) separar las células de partida del fragmento; (c) cultivar las células de partida; y d) cosechar una población de células derivadas no-adherentes del cultivo, las células derivadas no-adherentes que contienen UMC. El proceso para producir una población de células que contengan UMC, puede incluir además una o más rondas de derivación que implican repetir los pasos (c) y (d) utilizando la población cosechada de células derivadas no-adherentes de la ronda previa como las células de partida. Una o más rondas adicionales de derivación pueden ser desde una hasta veinte rondas. El tejido que contiene UMC puede ser, sin limitación, tejido dérmico, tejido adiposo, tejido conectivo, fascia, lamina propria, o médula ósea. El proceso puede incluir además cultivar las células no-adherentes en la presencia del factor de crecimiento de fibroblastos acídicos. La invención también proporciona: (i) una neurona producida por el método anterior; y (ii) una población celular que incluye neuronas, la población celular que se ha producido mediante el método anterior. La composición puede contener además un portador aceptable farmacéuticamente, y/o una matriz biodegradable acelular en donde las células de la población celular se integran en o sobre la matriz, y/o un relleno biodegradable acelular. Las matrices biodegradables acelulares y rellenos biodegradables acelulares, previo a su combinación con células, están compuestas de cualquier sustancia, o combinación de sustancias, mencionada en la presente como útiles para matrices biodegradables acelulares y rellenos biodegradables acelulares. Además, la composición puede estar sustancialmente libre de proteínas derivadas del suero del medio de cultivo . Otro aspecto de la invención es un método para reparar tejido neural dañado o defectuoso en un sujeto mamífero. El método implica inyectar en, injertar a, o implantar en, el tejido neural la composición de la invención. El tejido neural puede ser un tejido del sistema nervioso central (CNS) , por ejemplo, tejido de espina dorsal o tejido cerebral. El tejido neural también puede ser tejido del sistema nervioso periférico (PNS) . El sujeto mamífero puede ser un paciente humano. El sujeto mamífero puede tener un daño en la espina dorsal o un padecimiento o defecto tal como Padecimiento de Alzheimer, Padecimiento de Parkinson, Padecimiento de Huntington, Padecimiento de Tay-Sachs, esclerosis lateral amilotrófica, apoplejía, degeneración de los nervios faciales, daño periférico de manos, neurofibromatosis , fibromialgia, siringomielia, un padecimiento inmune del sistema nervioso, y un tumor de tejido neural. En este método, la población celular de la composición puede ser autóloga. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por alguien de experiencia ordinaria en la técnica al cual esta invención pertenece. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a aquéllos descritos en la presente para practicar la invención, se describen posteriormente métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, se controlará la presente especificación, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitativos. Los detalles de una o más modalidades de la invención se establecen en los dibujos acompañantes y la descripción posteriormente. Otros aspectos, objetivos, y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un método para generar neuronas in vitro a partir de células mesenquimales no diferenciadas (UMC) . Estas neuronas se pueden utilizar para tratar tejido neural defectuoso o dañado de una variedad de tipos, por ejemplo, tejido del sistema nervioso central (CNS) (por ejemplo, espina dorsal o cerebro) o del sistema nervioso periférico (PNS) (por ejemplo, el sistema nervioso sensorial-somático (por ejemplo, nervios craneales o nervios espinales) o del sistema nervioso autónomo) . Por consiguiente, se pueden utilizar composiciones que contengan neuronas generadas mediante el método de la invención para el tratamiento de, por ejemplo, daños en la espina, Padecimiento de Alzheimer, Padecimiento de Parkinson, Padecimiento de Huntington, Padecimiento de Tay-Sachs, esclerosis lateral amilotrófica, apoplejía, incluyendo parálisis muscular por apoplejía, degeneración de los nervios faciales, daño periférico de manos, neurofibromatosis , fibromialgia, siringomielia, padecimientos autoinmunes del sistema nervioso (por ejemplo, esclerosis múltiple), y tumores de tejido neural malignos y benignos (por ejemplo, astrocitomas o glioblastoma) , por ejemplo, como terapia de reemplazo después de la remoción quirúrgica de tal tumor. Las UMC y neuronas derivadas de los mismos comparten al menos un haplotipo del complejo de histocompatibilidad principal (MHC; HLA en humanos) con el que recibe o receptor de las neuronas. El donador de las UMC y el receptor de las neuronas preferiblemente son MHC idénticos. Óptimamente, el receptor y el donador son gemelos homocigóticos o son el mismo individuo. Cuando los componentes biológicos (por ejemplo, tejidos, células, o moléculas biológicas tales como proteínas, ácidos - nucleicos, carbohidratos, o lípidos) van a ser transplantados o implantados en un receptor a partir del cual se obtuvieron los mismos, o a partir del cual se obtuvieron precursores de los componentes biológicos, los componentes biológicos se mencionan en la presente como "autólogos" . Métodos para Hacer Composiciones que Contengan Neuronas Células mesenquimales no diferenciadas Cuando se utiliza en la presente, el término "UMC" se refiere a células que están en una "etapa" de diferenciación previa a las células del tejido conectivo completamente diferenciadas tales como, por ejemplo, fibroblastos. Debido a que las UMC no se pueden diferenciar en cada tipo de célula somática, las UMC son diferentes de las células madre pluripotentes . Además de los fibroblastos, las UMC pueden diferenciarse en el tejido adiposo, cartílago, tendón, hueso, células musculares, y neuronas. Mientras que las neuronas no se consideran tejido mesenquimal, claramente las neuronas se pueden producir a partir de UMC. El mecanismo mediante el cual esto ocurre no es claro. Una posibilidad es que las células precursoras aparentemente asignadas a una ruta de diferenciación particular (por ejemplo, UMC) no están tan limitadas con respecto al rango de células totalmente diferenciadas en el cual las mismas pueden desarrollarse como se creía previamente; por ejemplo, se sabe que las células cresta neurales pueden desarrollarse no solamente en neuronas sino también, por ejemplo, células de apoyo del PNS, células de pigmento, células de músculo liso, cartílago y huesos de la cara y cráneo. Alternativamente, es posible que al menos algunos tipos de células parcialmente diferenciadas (por ejemplo, UMC) sean capaces, bajo ciertas circunstancias (por ejemplo, aquéllas que se presentan en un coágulo de .plasma) de desdiferenciarse y luego re-diferenciarse a lo largo de una ruta diferente (por ejemplo, neural) . La invención no está limitada por ningún mecanismo particular de desarrollo de neuronas de UMC . Los métodos de la invención involucran el crecimiento de neuronas en coágulos de plasma utilizando como una de las células precursoras de neuronas esencialmente cualquier fuente de UMC. Las UMC pueden estar en tejido fresco (por ejemplo, piel, tejido graso (adiposo), o médula ósea) que no haya sido previamente cultivado o las UMC pueden haber sido cultivadas y/o enriquecidas ín vitro mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, aquéllos en el Ejemplo 1. El cultivo en los coágulos de plasma da como resultado: (a) ya sea la excrescencia selectiva de neuronas ya diferenciadas en las poblaciones de UMC y que tienen, antes del cultivo en el coágulo de plasma, la misma morfología que las UMC; o (b) diferenciación de un subconjunto de UMC en, seguido por el crecimiento de, neuronas. La invención no está limitada por ningún mecanismo particular de acción. Las UMC se pueden obtener de cualquier rango amplio de especies de mamíferos, por ejemplo, humanos, primates no-humanos (por ejemplo, mono, chimpancés, y babuinos), vacas, oveja, caballos, cabras, cerdos, perros, gatos, conejillos de indias, hámsteres, jerbos, ratas, o ratones. Las UMC se pueden cosechar y enriquecer in vitro mediante la iniciación de cultivos de biopsias tomadas de un sujeto (por ejemplo, un humano) . Como se describe en la presente, las UMC se pueden obtener de, por ejemplo, una biopsia de piel o una biopsia de tejido adiposo o médula ósea. Las UMC aisladas de tejido dérmico son particularmente útiles debido a que las mismas se pueden obtener y expandir fácilmente . Para generar UMC seleccionadas in vi tro para la invención, un cultivo se puede iniciar a partir de, por ejemplo, una muestra de biopsia dérmica de grosor total (por ejemplo, 1-5 mm, o más de 5 mm si hay suficiente tejido) de las encías, cuero cabelludo, piel de la post-aurícula, o del paladar de un sujeto. La dermis está localizada justo debajo de la epidermis, y típicamente tiene un grosor que varía desde 0.5 hasta 3 mm. Se puede obtener una muestra dérmica utilizando, por ejemplo, un procedimiento de biopsia mediante perforación. Las biopsias de piel se pueden tomar de la piel que está localizada, por ejemplo, debajo de la oreja. Antes del inicio del cultivo celular una biopsia se puede lavar repetidamente con agentes antibióticos y anti-fúngicos con el fin de reducir el potencial de contaminación de cultivos subsecuentes. Un "medio de lavado" adecuado puede contener, por ejemplo, un medio de cultivo de tejido tal como Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) , Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (1MDM) , o cualquier medio de cultivo adecuado, junto con alguno o todos los siguientes antibióticos: gentamicina, anfotericina B (FUNGIZONE*8) , Agente de remoción de micoplasma (MRA; Dianippon Pharmaceutical Company, Japón) , plasmocina, y tilosina (disponible de, por ejemplo, Serva, Heidelberg, Alemania) . La gentamicina se puede utilizar a una concentración de 10 a 100 µg a 100 /¿g/ml (por ejemplo, 25 a 75 tg/ml, o aproximadamente 50 ug/ml). La anfotericina B se puede utilizar a una concentración de 0.5 a 12.5 g/ml (por ejemplo, 1.0 a 10.0 µg/ml, o aproximadamente 2.5 µg/ml) . El MRA se puede utilizar a una concentración de 0.1 a 1.5 jLtg/ml (por ejemplo, 0-.25 a 1.0 µg/ml, ó aproximadamente 0.5 µg/ml) . La plasmocina se puede utilizar a una concentración de 1 a 50 µg/ml (por ejemplo, 10 a 40 µg/ml, o aproximadamente 25 µg/ml) . La tilosina se puede utilizar a una concentración de 0.012 a 1.2 mg/ml (por ejemplo, 0.06 a 0.6 mg/ml, o aproximadamente 0.12 mg/ml). Si se desea, se puede utilizar disección microscópica estéril para separar el tejido dérmico en una biopsia de epidermis que contenga tejido queratinizado y de tejido subcutáneo que contenga adipocitos . La muestra de biopsia se puede separar entonces en pedazos pequeños utilizando, por ejemplo, un bisturí o tijeras para picar finamente el tejido. En algunas modalidades, los pedazos pequeños de tejido se digieren con una proteasa (por ejemplo, colagenasa, tripsina, quimotripsina, papaína, o quimopapaína) . La digestión con 200-1000 U/ml de colagenasa tipo II durante 10 minutos a 24 horas es particularmente útil, aunque se puede utilizar cualquier tipo de colagenasa (por ejemplo, la colagenasa tipo IV al 0.05% a 0.1% puede ser particularmente útil para la digestión de tejido graso) . Si se utiliza digestión enzimática, las células se pueden recolectar mediante centrifugación y colocarse en placas en matraces con cultivo de tejido. Si el tejido no se somete a digestión enzimática, los pedazos de tej ido picados se pueden colocar individualmente sobre la superficie seca de un matraz con cultivo de tejido y se dejan adherirse durante entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 minutos. Se puede agregar lentamente una pequeña cantidad de medio para no desplazar los fragmentos de tejido adheridos. En el caso de células digeridas, las células se pueden lavar con medio de cultivo para remover la enzima residual, suspender en medio fresco, y colocar en uno o más matraces. Después de aproximadamente 48-72 horas de incubación, los matraces se pueden alimentar con medio adicional. Cuando se utiliza un matraz T-25 para comenzar el cultivo, la cantidad inicial de medio típicamente es de aproximadamente 1.5-2.0 mi. El establecimiento de una línea celular desde la muestra de biopsia puede tomar entre aproximadamente 2 y 3 semanas, tiempo en el cual las células se pueden remover del recipiente del cultivo inicial para su expansión. Durante las etapas tempranas del cultivo, es deseable que los fragmentos de tejido permanezcan adheridos al fondo del recipiente de cultivo. Los fragmentos que se desprenden se pueden reimplantar en nuevos recipientes . Las células se pueden estimular a crecer mediante una breve exposición a EDTA-tripsina, de acuerdo con las técnicas estándar. Tal exposición a la tripsina es demasiado breve para liberar los fibroblastos de su adherencia a la pared del recipiente con el cultivo. Inmediatamente después de que los cultivos se establezcan y se alcance la confluencia, las muestras de las células se pueden procesar para almacenamiento en congelación en, por ejemplo, N2 líquido (ver posteriormente información adicional sobre congelamiento celular) . Cuando se utiliza en la presente células "adherentes" son células que se adhieren al material (por ejemplo, plástico) de un recipiente estándar de cultivo de tejido. Cuando se utiliza en la presente, células "no-adherentes" incluyen células que no se adhieren al material (por ejemplo, plástico) de un recipiente estándar de cultivo de - tejido, así como células que se desprenden de la superficie de un recipiente de cultivo de tejido cuando el espacio y los nutrientes se vuelven limitantes. Una vez que las células han alcanzado condiciones confluentes o casi confluentes, se pueden observar colonias no-adherentes de UMC que crecen activamente flotando en los cultivos descritos anteriormente . Aunque la invención no está limitada por ningún mecanismo particular de acción, es posible que las UMC adherentes inicialmente se desprendan (es decir, se vuelvan no-adherentes) debido a las limitaciones de espacio y/o nutrientes. Estas colonias de UMC no-adherentes se pueden cosechar mediante aspiración y centrifugación del medio de cultivo del cultivo celular, y se pueden utilizar (por ejemplo, para hacer neuronas) , ya sea congeladas y almacenadas, o expandir reimplantándolas en medio de cultivo de tejido fresco. En la reimplantación de las colonias no adherentes en un recipiente de cultivo de tejido fresco, las células se adhieren de nuevo al piso y/o paredes del recipiente de cultivo de tejido y adquieren una morfología similar a la de los guijarros. El proceso de crecimiento celular, y cosecha y reimplantación de colonias no adherentes se puede repetir cada vez que se desee. Se puede llevar a cabo, por ejemplo, solamente una vez o dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 12, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 ó incluso más veces . Las UMC no-adherentes también se pueden aislar de cultivos de tejido adiposo (por ejemplo, grasa cosechada mediante liposucción u otra remoción quirúrgica) . El tejido se puede cortar en pedazos pequeños, el material membranoso se puede remover, y el tejido resultante se puede colocar en cultivo bajo condiciones que conduzcan al despoj amiento activo de las UMC del tejido adiposo. Alternativamente, el tejido adiposo se puede disociar con aproximadamente colagenasa de 0.1% a 1% después de la remoción de las membranas de los glóbulos de grasa. De manera similar, los cultivos de UMC se pueden iniciar a partir de biopsias de médula ósea (ver, por ejemplo, Marko et al. (1995) Endocrinol. 136:4582-4588). El proceso de cosecha y reimplantación es el mismo para las UMC derivadas de grasa y médula ósea como aquéllos descritos para las UMC derivadas de la piel. De hecho, un experto en la técnica apreciará que se pueden realizar procedimientos análogos para obtener UMC de cualquier tej ido descrito en la presente como una fuente potencial de UMC. La invención incluye una célula precursora de neuronas de UMC aisladas, derivadas mediante la metodología de cultivo anteriormente descrita y composiciones que contienen poblaciones celulares derivadas mediante la metodología de cultivo descrita anteriormente y la cual incluye células precursoras de neuronas . Se puede utilizar cualquier técnica de cultivo de tejido que sea adecuada para la propagación de UMC de muestras de biopsia, para expandir las células. Se pueden encontrar técnicas útiles para expandir células cultivadas en, por ejemplo, .I. Freshney, Ed. , Animal Cell Culture: A Practical Approach, (IRL Press, Oxford, England, 1986) y R.I. Freshney, Ed. , Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, (Alan R. Liss & Co . , New York, 1987) . El medio de cultivo celular puede ser cualquier medio adecuado para el crecimiento de cultivos UMC primarios . El medio de cultivo puede contener antibióticos, antimicóticos, y/o reactivos que prevengan el crecimiento del micoplasma, como se describe anteriormente. La presencia de, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos acídicos (aFGF) en el medio de cultivo puede que el UMC se diferencie en fibroblastos. El medio puede estar libre de suero, o puede estar suplementado con suero humano o no-humano [por ejemplo, suero humano autólogo, suero del grupo sanguíneo A/B, humano, no-autólogo, suero del grupo sanguíneo O, humano, no-autólogo, suero de caballo, o suero bovino fetal (FBS) ] para promover el crecimiento de las células. Cuando se incluye en el medio, el suero típicamente está en una cantidad entre aproximadamente 0.1% y aproximadamente 20% v/v (por ejemplo, entre aproximadamente 0.5% y aproximadamente 19%, entre aproximadamente 1% y aproximadamente 15%, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 12%, ó aproximadamente 10%) . Un medio particularmente útil contiene glucosa DMEM que está suplementada con aproximadamente 2 mM de glutamina, aproximadamente 10 mg/L de piruvato de sodio, aproximadamente 10% (v/v) de FBS, y antibióticos (frecuentemente llamados "medio completo")/ en donde la concentración de la glucosa varía desde aproximadamente 1,000 mg/L hasta aproximadamente 4,500 mg/L. Las UMC también se pueden expandir en medio libre de suero,- de esta manera, las UMC nunca están expuesta a proteínas de suero xenogénico o alogénico y no requieren el cultivo extra en medio libre de suero que se lleva a cabo cuando las células se expanden en medio que contiene suero no-autólogo . El medio utilizado para cultivo celular se puede suplementar con antibióticos para prevenir la contaminación de las células por, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, y micoplasma. La contaminación con micoplasma es un problema frecuente y particularmente molesto en el cultivo de tejido. Con el fin de prevenir o minimizar la contaminación con micoplasma, un agente tal como la tilosina se puede agregar al medio de cultivo. El medio se puede suplementar además con uno o más antibióticos/antimicóticos (por ejemplo, gentamicina, ciprofloxacina, alatrofloxacina, azitromicina, MRA, plasmocina, y tetraciclina) . La tilosina se puede utilizar a una concentración de 0.006 a 0.6 mg/ml (por ejemplo, 0.01 a 0.1 mg/ml, ó aproximadamente 0.06 mg/ml) . La gentamicina se puede utilizar a una concentración de 0.006 a 0.1 mg/ml (por ejemplo, 0.03 a 0.08 mg/ml, ó aproximadamente 0.05 mg/ml). La ciprofloxacina se puede utilizar a una concentración de 0.002 a 0.05 mg/ml (por ejemplo, 0.005 a 0.03 mg/ml, ó aproximadamente 0.01 mg/ml). La alatrofloxacina se puede utilizar a una concentración de 0.2 a 5.0 g/ml (por ejemplo, 0.5 a 3.0 µ /t?1, ó aproximadamente 1.0 /¿g/ml) . La azitromicina se puede utilizar a una concentración de 0.002 a 0.05 mg/ml (por ejemplo, 0.005 a 0.03 mg/ml, ó aproximadamente 0.01 mg/ml) . El MRA se puede utilizar a una concentración de 0.1 a 1.5 g/ml (por ejemplo, 0.2 a 1.0 µg/ml, ó aproximadamente 0.75 µg/ml) . La plasmocina se puede utilizar a una concentración de 1 a 50 /¿g/ml (por ejemplo, 10 a 40 µg/ml, ó aproximadamente 25 /xg/ml) . La tetraciclina se puede utilizar a una concentración de 0.004 a 0.1 mg/ml (por ejemplo, 0.008 a 0.05 mg/ml, ó aproximadamente 0.02 mg/ml). Los antibióticos pueden estar presentes durante todo el periodo del cultivo o durante una porción del periodo de cultivo. La contaminación con micoplasma se puede ensayar mediante un método de cultivo de agar utilizando un sistema tal como, por ejemplo, placas de agar con micoplasma que están disponibles de bioMérieux (Marcy l'Etiole, Francia) o se puede preparar en las propias instalaciones, o mediante PCR. La Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC, Manassas, VA) comercializa un "Equipo de Detección de Micoplasma" PCR. El medio de cultivo que contiene tilosina (0.06 mg/ml), gentamicina (0.1 mg/ml), ciprofloxacina (0.01 mg/ml), alatrofloxacina (1.0 µg/ml) , azitromicina (0.01 mg/ml), y tetraciclina (0.02 mg/ml) es particularmente útil para prevenir la contaminación con micoplasma. Otro agente que puede ser útil en la prevención de contaminación con micoplasma, es un derivado de ácido 4-oxo-quinolin-3-carboxilico (OQCA) , el cual está disponible comercialmente como, por ejemplo, "Agente de Remoción de Micoplasma" de ICN Pharmaceuticals , Inc. (Costa Mesa, CA) . Este agente típicamente se utiliza a una concentración de 0.1 a 2.5 mg/ml (por ejemplo, 0.2 a 2.0 mg/ml, ó 0.5 mg/ml) . La mezcla de antibióticos u otros agentes puede estar presente en los cultivos de fibroblasto durante las primeras dos semanas después del inicio. Después de un tiempo adecuado en cultivo (por ejemplo, dos semanas) , el medio que contiene antibióticos típicamente se reemplaza con medio libre de antibióticos. Una vez que está presente un número suficiente de células en el cultivo, las mismas se pueden probar para la contaminación con micoplasma, bacteriana y fúngica. Solamente las células sin contaminación detectable son útiles en los métodos de la invención. Cultivo de UMC en Coágulos de Plasma para Generar Neuronas Los coágulos de plasma para su uso en los métodos de la invención se pueden producir mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica. El plasma se puede preparar, por ejemplo, agregando citrato de sodio o heparina a la sangre recientemente sustraída de un sujeto mamífero apropiado y separando la fracción de plasma de la sangre de componentes celular mediante centrifugación. El plasma se puede obtener en forma líquida o, por ejemplo, en forma liofilizada. Si se obtiene en forma liofilizada, se reconstituye antes de su uso mediante la adición de agua desionizada o, por ejemplo, medio de cultivo de tejido. El plasma se puede obtener del individuo a quien las neuronas se van a administrar (el receptor) , es decir, el mismo puede ser autólogo. Alternativamente, el mismo puede ser de uno o más individuos de la misma especie como el receptor, por ejemplo, el mismo puede ser una acumulación de muestras de plasma preparados a partir de una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ó mas) voluntarios humanos. Además, el plasma se puede aislar de la sangre de adulto, infante, o sangre fetal de uno o más individuos de cualquiera de una variedad de especies de mamíferos, por ejemplo, humanos, primates no-humanos, vacas, oveja, caballos, cabras, cerdos, perros, gatos, conejos, conejillos de indias, hámsteres, jerbos, ratas, o ratones. El plasma obtenido de estas especies se puede utilizar con UMC de las mismas especies u otras especies . Los coágulos se pueden formar en recipientes apropiados (por ejemplo, platos de plástico para cultivo de tejido) mezclando el plasma con una fuente de iones de Ca2+ (por ejemplo, CaCl2) o trombina. Aún cuando se utilice un método para inducir la coagulación diferente al de la adición de iones de Ca2+, no obstante se requiere la producción de neuronas de UMC que sean de una concentración relativamente alta de iones de Ca2+ en el coágulo de plasma. Por consiguiente se prefiere la inducción de coagulación mediante la adición de iones de Ca2+. Si se utiliza algún otro método se deben introducir iones de Ca2+ en el coágulo, por ejemplo, mediante la incubación del coágulo en solución o medio que contenga Ca + antes de la adición de células a los coágulos. La concentración de Ca2+ en los coágulos puede ser de aproximadamente 4 mM - aproximadamente 18 mM, por ejemplo, de aproximadamente 6 mM - aproximadamente 17 mM, de aproximadamente 8 mM - 16 mM; ó aproximadamente 8 mM - 15 mM.

La coagulación se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o, más rápidamente a, por ejemplo, 37 °C. Después de la formación de los coágulos se agrega suficiente medio de cultivo de tejido al recipiente que contiene el coágulo para prevenir el secado del coágulo. Por consiguiente el coágulo se puede cubrir completamente con el medio o el medio puede estar sustancialmente al mismo nivel que la superficie superior del coágulo . El medio de cultivo de tejido puede ser cualquier medio de cultivo adecuado para el crecimiento de neuronas . Tal medio es "FGF" -DMEM" , el cual contiene DMEM que está suplementado con está suplementado con aproximadamente 2 mM de glutamina, aproximadamente 10 mg/L de piruvato de sodio, aproximadamente 2.5% (v/v) de FBS (o cualquiera de los sueros humanos descritos en la presente) , factor de crecimiento de fibroblastos acidicos (aFGF; aproximadamente 5 ng/ml) , heparina (aproximadamente 5 µg/ml) , y antibióticos (frecuentemente llamados "medio completo"), la concentración de glucosa que varía desde aproximadamente 1,000 mg/mL a aproximadamente 4,500 mg/L. Otro medio útil es el "medio N" que contiene medio Neuralbasal (Gibco, Carlsbad, CA) suplementado con aproximadamente 2 mM de glutamina, Suplemento B27 (Gibco; agregado a medio Neuralbasal en una proporción de aproximadamente 1:50), factor de crecimiento epidérmico (EGF; concentración final de aproximadamente 20 ng/ml) , factor de crecimiento similar a la insulina de forma larga R3 (R3 IGF; concentración final de aproximadamente 25 ng/ml) , factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF; concentración final de aproximadamente 10 ng/ml) , y factor inhibidor de la leucemia (LIF; concentración final de aproximadamente 10 ng/ml) . Si se desea, se puede utilizar el Suplemento N-2 (Gibco) en lugar del Suplemento B27. La Patente Norteamericana No. 6,736,238 (cuya descripción se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) describe - varios medios adecuados para el crecimiento in vitro de neuronas. El medio de cultivo para cultivar neuronas se puede suplementar con uno o más factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos acidicos (FGF; aFGF) , FGF básico (bFGF) , factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) , factor de crecimiento similar a la insulina de forma larga (R3 IGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , EGF de forma larga, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento de nervios (NGF) , miembros de la familia del factor de crecimiento de transformación (TGF) (por ejemplo, TFG ) , miembros de la familia de proteínas morfogénicas óseas (BMP) (por ejemplo, cualquiera de BMP 2-8) , FGF-7, FGF-9, factor neurotrófico ciliar (CNTF) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , factor neurotrófico 3 (NT-3) , factor neurotrófico 4 (NT-4) , factor neurotrófico 5 (NT-5) , factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) , ó LIF. Se entiende que también se pueden utilizar fragmentos o variantes (por ejemplo, aquéllos que tienen eliminaciones, adiciones, o sustituciones) de cualquiera de los factores de crecimiento anteriores que tienen al menos el 50% de la actividad de los factores de crecimiento de tipo natural, de longitud completa, para cualquiera de los propósitos de la invención para los cuales se pueden utilizar factores de crecimiento de tipo natural, de longitud completa. También son útiles los compuestos que hayan demostrado mejorar la actividad promotora de crecimiento de neuronas de los factores de crecimiento; tales compuestos se describen en la Patente Norteamericana No. 6,172,086, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Además, se pueden agregar aminoácidos requeridos para, o que mejoran, el crecimiento de neuronas, al medio de cultivo para cultivar neuronas, por ejemplo, L-carnitina, L-prolina, L-alanina, L-asparagina, y L-cisteína. Otros aditivos incluyen la hormona tiroides, vitamina E, etanolamina, insulina, transferrina, dismutasa de superóxido, ácido linoleico, corticosterona, acetato de retinilo, progesterona, y putrescina. Las UMC, UMC que contienen poblaciones celulares, o fragmentos de, o trocitos de, tejido que contiene UMC, se aplican a la superficie del coágulo. Las células, el tejido picado, o los fragmentos de tejido se pueden agregar al medio de cultivo por encima del coágulo y se dejan asentar por la acción de la gravedad sobre la superficie del coágulo. Al ernativamente, el nivel de medio se puede ajustar para que esté al mismo nivel que, o en un nivel un poco inferior al, de la superficie superior del coágulo. Las UMC o fragmentos de tejido se pueden aplicar entonces a la superficie del coágulo e incubarse durante un tiempo suficiente (por ejemplo, a 37°C) para permitir la adherencia de las células o fragmentos de tejido a la superficie del coágulo. Una vez que ha ocurrido la adherencia, se puede agregar medio adicional para cubrir completamente el cuerpo del coágulo . Lo que es importante es que en todo momento haya suficiente medio de cultivo en el recipiente de cultivo de tejido para evitar que se seque el coágulo de plasma. Se entiende que, en vez de estar en contacto las células, el tejido picado, o los fragmentos de tejido con la superficie de un coágulo de plasma, las células, tejido picado, o fragmentos de tejido pueden estar incrustados en el coágulo de plasma. Por consiguiente los mismos se pueden insertar en la formación posterior, o los mismos se pueden agregar al plasma utilizado para hacer el coágulo antes de la formación del coágulo. Después de la aplicación de las células, el tejido en trocitos, o los fragmentos de tejido a los coágulos, el recipiente de cultivo se incuba bajo condiciones de cultivo de tejido estándar, por ejemplo, aproximadamente 37 °C (por ejemplo, 35°C, 36 °C, ó 37°C) en una atmósfera de C02 de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 10% (por ejemplo, C02 de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 6.5%) y a una humedad de aproximadamente 85% hasta aproximadamente 98%. El crecimiento celular y la morfología se pueden monitorear con un microscopio de cabeza. Las neuronas se identifican fácilmente por aquellos expertos en la técnica y se caracterizan por la presencia de un axón y/o una pluralidad de procesos dendítrieos. Naturalmente, la frecuencia de cambios en los medios y el paso de las células dependerán de la velocidad de la división celular en los cultivos. Este factor variará de acuerdo con, por ejemplo, el medio de cultivo utilizado, las especies de las UMC y si se utilizan o no factores que mejoren el crecimiento en los cultivos. Aquellos expertos en la técnica serán capaces de establecer las condiciones factibles para los cultivos de interés. Las neuronas se pueden pasar cortando un coágulo en fragmentos pequeños y incrustando los fragmentos en, o colocándolos sobre la superficie de, los coágulos de plasma fresco. Las neuronas y las UMC migran fuera de los fragmentos de coágulo hacia el nuevo coágulo en el cultivo posterior. Las neuronas migran hacia el nuevo coágulo antes que las UMC y este factor proporciona un método de enriquecimiento para las neuronas en los coágulos. Por consiguiente, por ejemplo, después de un cultivo de un nuevo coágulo que tenga incrustado dentro del mismo, o anexado a su superficie, un fragmento de coágulo que contenga tanto neuronas como UMC durante un periodo lo suficientemente largo para permitir su migración hacia el cuerpo del nuevo coágulo de un número relativamente grande de neuronas aunque no lo suficientemente largo para su migración hacia el cuerpo del nuevo coágulo de un número sustancial de UMC, se puede remover el fragmento de coágulo o el nuevo coágulo se puede cortar en fragmentos pequeños los cuales a su vez se incrustan en nuevos coágulos terciarios. Tal proceso se puede repetir tan frecuentemente como se desee, es decir, hasta que se obtenga una población celular que contenga una proporción deseada de neuronas . Alternativamente, las células en los coágulos se pueden hacer pasar disolviendo los coágulos (ver más adelante) y recolectando las células de los coágulos disueltos. Estas células se pueden agregar entonces a las superficies de los coágulos frescos esencialmente de la misma manera descrita anteriormente para la iniciación del cultivo. Las células se pueden cosechar de los coágulos de plasma mediante la adición de enzimas tales como tripsina, estreptoquinasa, o plasminógeno a los cultivos e incubándolas a temperatura ambiente ó 37 °C. Después de cosechar las células de los coágulos, las mismas se pueden cultivar además en medio libre de suero/plasma durante al menos unas 4 horas adicionales (por ejemplo, durante toda la noche o aproximadamente 18 horas) . La incubación de las células en medio libre de suero puede remover sustancialmente las proteínas derivadas del suero (por ejemplo, FBS) agregado al medio de cultivo, el cual si está presente en una composición inyectada en un sujeto, podría generar una respuesta inmune. El medio libre de suero puede contener, por ejemplo, glucosa DMEM suplementada con aproximadamente 2 mM de glutamina, con o sin aproximadamente 110 mg/L de piruvato de sodio, en donde la concentración de glucosa puede variar desde aproximadamente 1,000 mg/L hasta aproximadamente 4,500 mg/L. Una concentración de glucosa de aproximadamente 4,500 mg/L es particularmente útil. Cualquiera de las poblaciones celulares (por ejemplo, UMC, células que contengan UMC, neuronas, o células que contengan neuronas) se puede congelar y almacenar congeladas en cualquier medio adecuado para congelar tales tipos de células (por ejemplo, cualquier medio de congelamiento disponible comercialmente) y se puede almacenar, por ejemplo, en un congelador a aproximadamente -80 °C ó en N2 líquido. No es necesario que las células recosechen de los coágulos de plasma antes del congelamiento; el coágulo que contiene las células se pueda congelar en un medio de congelamiento. Un medio que consiste de aproximadamente 70% (v/v) de medio, aproximadamente 20% (v/v) de FBS y aproximadamente 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO) , es particularmente útil para congelar cualquiera de los tipos de células descritas en la presente. El FBS se puede reemplazar con, por ejemplo, Krebs Ringer que contenga 5% de dextrosa, y el DMSO también se puede reemplazar con glicerol, por ejemplo. Se pueden utilizar células descongeladas para iniciar los cultivos secundarios para la preparación de suspensiones adicionales para uso posterior en el mismo sujeto, evitando así la inconveniencia de obtener un segundo espécimen.

Neuronas y Composiciones que Contienen Neuronas La invención también proporciona neuronas generadas de UMC mediante el método de coágulo de plasma descrito anteriormente y una composición que contiene una población de células que incluye una pluralidad de las neuronas generadas de UMC mediante el método. En estas poblaciones celulares las neuronas preferiblemente son de al menos 5% (por ejemplo, al menos : 5%; 7%; 9%; 10%; 12%; 15%; 18%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40%; 45%; 50%; 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 97%; 98%; 99%; 99.5% ; 99. 8%; ó 100%) de la población celular.

Otras células en las poblaciones celulares pueden ser, sin limitación, de uno o más de los siguientes tipos de células : UMC, fibroblastos, queratinocitos, adipocitos, preadipocitos , melanocitos, células Langerhans de la piel, o células endoteliales . En una modalidad las composiciones están sustancialmente libres de fibroblastos, queratinocitos, adipocitos, preadipocitos, melanocitos, células Langerhans de la piel, o células endoteliales; las mismas también pueden estar sustancialmente libres de UMC. En una modalidad, tanto las neuronas como las composiciones están sustancialmente libres de proteínas derivadas de suero xenogénico o alogénico del medio de cultivo. Como se utiliza en la presente, las células que están "sustancialmente libres proteínas derivadas de suero xenogénico o alogénico del medio de cultivo" son células en las cuales el fluido que rodea las células contiene menos de 0.1% (por ejemplo, menos de 0.05%, menos de 0.01%, menos de 0.005%, ó menos de 0.001%) de suero xenogénico o alogénico contenido en el medio de cultivo de tejido en el cual las células se cultivaron previamente. De manera similar, una composición que está "sustancialmente libre de proteínas derivadas de suero xenogénico o alogénico del medio de cultivo" , es una composición en la cual el fluido que rodea las células en la composición contiene menos de 0.1% (por ejemplo, menos de 0.05%, menos de 0.01%, menos de 0.005%, ó menos de 0.001%) de suero xenogénico o alogénico contenido en el medio de cultivo de tejido en el cual las células se cultivaron previamente. Para obtener células que estén sustancialmente libres de proteínas derivadas de suero del medio de cultivo xenogénico o alogénico, las células cultivadas se pueden expandir en un medio que no contenga suero alogénico o xenogénico, es decir, en un medio libre de suero o en medio que contenga suero autólogo. Alternativamente, las células se pueden cultivar primero en un medio que contenga suero alogénico o xenogénico (por ejemplo, 0.01% a 20% de suero), y subsecuentemente cultivarse en un medio libre de suero. Por consiguiente mediante estos métodos se evita la presencia de proteínas derivadas de suero potencialmente inmunogénico en una suspensión celular. Se puede agregar un portador aceptable farmacéuticamente por ejemplo, solución salina normal, excipiente, o estabilizador a las células antes deque las mismas se' administren a un sujeto. La frase "aceptable farmacéuticamente" se refiere a entidades moleculares y composiciones que, en la concentración utilizada, no sean nocivas para las células, que sean tolerables fisiológicamente, y que típicamente no produzcan una reacción alérgica o similarmente molesta, tal como trastorno gástrico, mareo y similares, cuando se administren a un humano. Una amplia variedad de portadores aceptables farmacéuticamente, excipientes o estabilizadores son conocidos en la técnica [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Osol , A. Ed. 1980] . Los portadores aceptables, excipientes, o estabilizadores incluyen: amortiguadores, tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos no-tóxicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrosa; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol, o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o agentes de superficie no-iónicos tales como Tween, Pluronics, ó PEG. Alternativamente, si las células no se van a administrar inmediatamente, los mismos se pueden incubar en hielo desde aproximadamente 4°C hasta durante 24-48 horas post-cosecha . Para tal incubación, las células se pueden suspender en una solución fisiológica que tenga una osmolaridad apropiada y que haya sido probada para niveles de pirógenos y endotoxinas . Tal solución típicamente no contiene indicador de pH de rojo de fenol, y cualquier suero preferiblemente es el suero del sujeto (es decir, suero autólogo) en vez de suero bovino fetal (FBS) u otro suero xenogénico (por ejemplo, suero de caballo o suero de cabra) . Las células se pueden suspender en, por ejemplo, solución Krebs-Ringer que contiene 5% de dextrosa, DMEM sin rojo de fenol, o cualquier otra solución fisiológica. Las células se pueden aspirar y administrar a un sujeto en el medio de incubación. El volumen de solución salina o medio de incubación en el cual las células se suspenden, típicamente está relacionado con factores tales como el número de células a ser inyectadas y el grado del daño debido a la degeneración o defecto del tejido. Matrices acelulares biodegradables Las composiciones que contienen las neuronas de la invención también pueden incluir componentes de matriz acelular, biodegradable . Un componente de matriz acelular generalmente cumple un rol estructural. Por ejemplo, el mismo puede llenar un defecto, orificio, espacio o cavidad en el tejido y proporcionar un ambiente en el cual las células inyectadas o implantadas puedan adherirse a la matriz o tejido circundante y desarrollar y producir factores estructuras y otros factores (por ejemplo, factores quimotácticos) que resultan del crecimiento de nuevo tejido. En muchos casos, la función de rellenar huecos de la matriz es temporal y solamente dura hasta que las células implantadas y/u hospederas migran hacia el área y forman nuevo tejido. Preferiblemente, la matriz acelular es biodegradable. La matriz preferiblemente es una sustancia sólida o semi-sólida que es insoluble bajo condiciones fisiológicas. Tales composiciones son adecuadas para su inyección o implante en un sujeto para reparar el tejido que ha sido degenerado. El término "biodegradable" como se utiliza en la presente denota una composición que no es dañina biológicamente y que puede ser degradada químicamente o descompuesta mediante efectores naturales (por ejemplo, clima, bacterias del suelo, plantas o animales) . Los ejemplos de matrices que se pueden utilizar en la presente invención, incluyen, sin limitación, matrices acelulares que contengan proteínas autólogas y no-autólogas , y matrices acelulares que contengan polímeros biodegradables. Se puede utilizar cualquiera de un cierto número de matrices acelulares biodegradables que contengan proteínas no-autólogas en las composiciones provistas en la presente. Los ejemplos de matrices acelulares biodegradables incluyen matrices que contengan cualquier tipo de colágeno (por ejemplo, colágeno bovino, porcino, humano o bio-diseñado por ingeniería) , o cualquier tipo de colágeno con glicosaminoglicanos (GAG) reticulados con, por ejemplo, glutaraldehído . Las matrices que contienen colágeno incluyen, sin limitación, esponjas de colágeno absorbibles, membranas de colágeno, y hueso esponjoso. Los tipos útiles de colágeno incluyen, por ejemplo, colágeno bovino (por ejemplo, ZYDERM® y ZYPLAST08, disponible comercialmente de McGhan Medical Corporation, Santa Barbara, CA) , colágeno porcino, colágeno de cadáver humano (por ejemplo, FASCIAN™ (Fascia Biosystems, LLC, Beverly Hills, CA) , CYMETRA™ (LifeCell Corp., Branchburg, NJ) , ó DERMALOGEN™ (producido anteriormente por Collagenesis Corp.), colágeno bio-diseñado por ingeniería (por ejemplo, FORTAPERM™, disponible de Organogénesis, Inc., Cantón, MA) , y colágeno humano autólogo (AUTOLOGEN5, ver más adelante) . FASCIAN™ puede ser particularmente útil . Este producto está disponible en cinco diferentes tamaños de partícula, cualquiera de los cuales se puede utilizar en las composiciones y métodos descritos en la presente. Las partículas que son de tamaño de 0.25 mm pueden ser particularmente útiles. Otro biopolímero útil para tales matrices es la fibrina. Son de interés para los propósitos de la invención los coágulos de plasma del tipo utilizado para producir neuronas de UMC (ver más adelante) . De hecho, en ciertas modalidades no será necesaria extraer las neuronas del coágulo de plasma utilizado para producir las mismas. El coágulo, opcionalmente cortado a un tamaño y forma apropiados, se puede implantar directamente en, o injertar directamente a, tejido neural dañado o defectuoso. Las esponjas de colágeno absorbibles se pueden comparar de, por ejemplo, Sulzer Calcitek, Inc. (Carlsbad, CA) . Estos apositos de esponja de colágeno, vendidos bajo los nombres COLLATAPE®, COLLACOTE*, y COLLAPLUG®, están hechos de colágeno reticulado extraído del tendón (Aquiles) flexor profundo de bovino, y GAG. Estos productos son suaves, flexibles, no-friables y no-pirogénicos. Más del 90% de una esponja de colágeno típicamente consiste de poros abiertos. Las matrices acelulares biodegradables pueden contener colágeno (por ejemplo, colágeno porcino tipo I) formado en, por ejemplo, una membrana delgada. Tal membrana se fabrica por Sulzer Calcitek y se comercializa como BIOMEND™. Otra matriz membranosa se comercializa como BIO-GIDE° por Geistlich Sóhne AG (Wolhusen, Suiza) , y está hecha de colágeno porcino tipo I y tipo III. BIO-GIDE° tiene una estructura de doble capa, con una superficie que es porosa y que permite el crecimiento hacia adentro de células, y una segunda superficie que es densa y previene el crecimiento hacia adentro de tej ido fibroso . Otras matrices adecuadas que contienen colágeno incluyen COLLAGRAFT®, fabricado por NeuCell, Inc. (Campbell, CA) , y pelotillas alfa hemi-hidratas de sulfato de calcio OSTEOSET® vendido por Wright Medical Technology (Arlington, TN) . Las matrices acelulares biodegradables también se pueden hacer de la parte esponjosa del hueso formado en gránulos o bloques. Este material consiste de hueso animal (por ejemplo, humano, primate no-humano, bovino, oveja, cerdo, o cabra) del cual se ha removido sustancialmente todo el material orgánico (por ejemplo, proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, y moléculas orgánicas pequeñas tales como vitaminas y hormonas no-prote£nicas) . Este tipo de matriz se menciona en la presente como una "matriz anorgánica" . Tal matriz, la cual se comercializa como gránulos de la parte esponjosa BI0-0SS° y bloques BIO-OSS°, se fabrica por Geistlich Sóhne AG. Esta compañía también fabrica una matriz de tipo bloque (colágeno BIO-OSS®) que contiene hueso anorgánico y que además contiene aproximadamente 10% en peso de fibras de colágeno . Otras matrices acelulares, biodegradables, útiles, pueden contener gelatina, intestino de gato, hueso desmineralizado, hueso anorgánico, coral o, hidroxiapatita, o mezclas de estas sustancias. Una matriz hecha de hueso humano desmineralizado, por ejemplo, se forma en bloques pequeños y se comercializa como DYNAGRAFT por GenSci egeneration Laboratories, Inc. (Toronto, Ontario, Canadá), TUTOPLAST0 por Tutogen Medical, Inc. (Clifton, NJ) , ó Matriz de Hueso Desmineralizado GRAFTON° por Osteotech, Inc. (Eatontown, NJ) . El hueso desmineralizado se puede combinar con, por ejemplo, colágeno para producir una matriz en la forma de esponja, bloque, o membrana. Las matrices biodegradables pueden contener glicosaminoglicanos tales como mucopolisac ridos o ácido hialurónico. Son particularmente útiles para los propósitos de la invención los geles biopolímeros (por ejemplo, colágeno de cualquiera de los tipos descritos en la presente o fibrina) formados en la forma de pequeñas varillas. En estas varillas las fibrillas de biopolímero están orientadas en una dirección longitudinal (eje) por medio de un campo magnético. Tales varillas que contienen neuronas, y opcionalmente otras células (tales como células Schwann) , se pueden utilizar para unir el espacio entre los extremos separados de, por ejemplo, un nervio periférico. Las fibrillas alineadas longitudinalmente dentro de la varilla sirven para guiar el crecimiento neural a través del hueco entre los extremos del nervio separado y para promover así la regeneración de la conexión neural original . Estas varillas de biopolímero y métodos para hacer las mismas como se describe con mayor detalle en la Patente Norteamericana No. 6,057,137, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Además, se pueden utilizar polímeros sintéticos hechos de uno o más monómeros para hacer matrices acelulares biodegradables que son útiles en la presente. Tales polímeros sintéticos incluyen, por ejemplo poli (ácido glicólico) , poli (ácido láctico) , y poli (ácido glicólico) -poli (ácido láctico) . Los polímeros sintéticos también se pueden combinar con cualquiera de las sustancias mencionadas anteriormente. Los diferentes polímeros que forman una matriz individual pueden estar en compartimientos o capas separadas. Por ejemplo, W. L. Gore & Associates, Inc. (Flagstaff, AZ) fabrica una matriz acelular, biodegradable , porosa (Material Regenerativo GORE RESOLUT XT) . Esta matriz está compuesta de un glicósido bioabsorbible sintético y fibra de copolímero de carbonato de trimetileno en la cual las células pueden migrar, adherirse a una membrana oclusiva que está compuesta de un glicólido bioabsorbible sintético y copolímero de láctida que no permite el crecimiento hacia adentro de células. Otros ejemplos de matrices biodegradables adecuadas se pueden encontrar en la Patente de Estados Unidos No. 5,885,829, por ejemplo. Son de interés para los propósitos de la invención los biopolímeros conductores eléctricos tales como polipirroles, polianilinas, politiofenos , y derivados de estos polímeros. Los ejemplos de tales derivados incluyen polianilinas 3-sustituidas, polipirroles y politiofenos , por ejemplo, derivados sustituidos con alquilo. Se pueden construir matrices a partir de estos polímeros o los polímeros se pueden cubrir sobre cualquiera de los otros materiales de matriz acelular biodegradable, descritos en la presente. La utilidad de tales matrices para la presente invención se deriva del hallazgo deque las cargas eléctricas mejoran la extensión de neuritas y la regeneración de nervios. Las propiedades que mejoran el crecimiento de nervios de estas matrices, se pueden mejorar además mediante la aplicación, ya sea in vivo o in vitro, de un voltaje o corriente eléctrica a las matrices con neuronas anexadas antes de su colocación en un sujeto. Estos polímeros conductores eléctricamente y su uso se describen con mayor detalle en la Patente Norteamericana No. 6,095,148, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia en su totalidad . La capacidad de las células para adherirse a los matrices acelulares biodegradables , se puede mejorar revistiendo las matrices con una o más moléculas de adherencia conocidos en la técnica. Estas incluyen moléculas naturales (por ejemplo, factores de matriz extracelular tales como laminina y fibronectina) y moléculas sintéticas (por ejemplo, péptidos que contengan los sitios de enlace de fibronectina y/o laminina) . Los ejemplos de agentes útiles son, sin limitación, componentes de membrana base, gelatina, goma arábiga, colágeno tipos I-XII, fibronectina, laminina, trombospondina , entactina, proteoglicanos , glicosaminoglicanos , y mezclas de los mismos. Otras moléculas de adherencia apropiados incluyen carbohidratos simples, carbohidratos complejos, asialoglicoproteínas , lectinas, factores de crecimiento, lipoproteínas de baja densidad, heparina, poli-lisina, poli-ornitina, trombina, vitronectina, y fibrinógeno . Las moléculas sintéticas incluyen péptidos hechos utilizando métodos convencionales para incorporar uno o más sitios de enlace tales como las secuencias de aminoácidos RGD (SEC. ID. NO.: 1; de fibronectina), LIGR T (SEC. ID. NO.: 2; de fibronectina) y YIGSR (SEC. ID. NO.: 3; de laminina). El uso de moléculas de adherencia y métodos para enlazar las mismas a matrices acelulares biodegradables , se describen en la Patente Norteamericana No. 6,095,148. Después de que se ha selecciona una matriz acelular biodegradable, una suspensión concentrada de células (por ejemplo, una suspensión que contiene neuronas producidas de UMC como se describe anteriormente) se puede distribuir uniformemente sobre la superficie de la matriz. Se utiliza una suspensión concentrada típicamente con el fin de evitar exceder la capacidad de la matriz para absorber la suspensión líquida. Por ejemplo, una suspensión celular aplicada a una matriz GORE RESOLUT XT generalmente puede tener un volumen entre aproximadamente 94 µ? y aproximadamente 125 µ? y puede contener entre aproximadamente 2.0 x 10s y aproximadamente 4.0 x 106 células por centímetro cuadrado de la matriz. Se puede permitir a las células adherirse a la matriz sin una adición posterior de medios. La incubación de las células sin la matriz puede ser a, por ejemplo, aproximadamente a 37°C durante aproximadamente 1-2 horas. Las células típicamente se anexan a y se distribuyen uniformemente por toda el material de la matriz después de aproximadamente sesenta minutos de incubación. En este momento, los recipientes de cultivo que contienen las matrices cargadas de células se puede suplementar con medio de cultivo adicional, y las células se pueden cultivar en la matriz durante aproximadamente 3 a 4 días. Debido a que las células se agregan a la matriz a una alta densidad para llenar sustancialmente el espacio entre la matriz, ocurre poca o ninguna proliferación durante 3-4 días del periodo de cultivo. De hecho, típicamente es indeseable una proliferación celular significativa durante este periodo debido a que la división de células puede secretar enzimas (por ejemplo, colagenasa) que pueden degradar o parcialmente degradar las matrices. La matriz con las células adheridas típicamente se lava (por ejemplo, al menos 3 lavados de 10 minutos cada uno) con, por ejemplo, solución salina o medio que está libre de suero y rojo de fenol, con el fin de remover sustancialmente las proteínas inmunogénicas (por ejemplo, se utilizaron proteínas derivadas del suero de medio de cultivo si el medio contenía suero no-autólogo para el paso de sembrado de la matriz) que podrían producir una respuesta inmune cuando se administren a un sujeto. Se puede utilizar PBS fresco para cada lavado. La matriz se puede incubar entonces (por ejemplo, incubaciones de 2 horas) en PBS fresco o medio de cultivo libre de suero antes de usarse. Después de la incubación, la matriz que contiene las células se puede colocar en el área de degeneración o defecto del tejido. Para las matrices de esponja de colágeno (por ejemplo C0LLAC0TE°) , se pueden sembrar aproximadamente 1.5 x 106 a 2.0 x 10s células (o más cuando sea necesario) en aproximadamente 1.5 mi de medio de crecimiento sobre una esponja delgada de 2 cm por 4 ctn (aproximadamente 2.5 a 3.0 mm de grosor). La esponja se puede incubar entonces a 37 °C durante aproximadamente 1-2 horas sin la adición posterior de medio para permitir que sustancialmente todas las células se adhieran al material de la matriz. Después de la adherencia celular, se puede agregar medio de crecimiento adicional a la matriz y a la composición celular, la cual se puede incubar entonces a 37 °C durante 3-4 días con un cambio diario de medio. Si se utilizó medio que contiene suero no-autólogo para el paso de sembrado, la composición se puede remover del medio de crecimiento que contiene suero y se puede lavar repetidamente (por ejemplo, 3 veces o más) con PBS . Después de cada adición de PBS, la matriz se puede incubar durante 10-20 minutos antes de desechar el PBS. Después del lavado final, la composición se puede administrar ya sea inmediatamente a un sujeto, o se puede transferir a- un vial de embarque que contiene unan solución fisiológica (por ejemplo, solución Ringer de Kreb) e incubarse a aproximadamente 4°C hasta durante aproximadamente 24-48 horas. Para una matriz membranosa (por ejemplo BIOME D™) , se pueden sembrar aproximadamente 1.5 x 106 células (o más cuando sea necesario) en aproximadamente 100 µ? de medio de cultivo sobre una membrana delgada de 15 mm x 20 mm (de grosor de aproximadamente 0.5 a 1.0 mm) . La membrana se puede incubar a 37 °C durante aproximadamente 30-60 minutos sin una adición posterior de medio para permitir que sustancialmente todas las células se adhieran al material de matriz. Después de la adherencia celular, se puede agregar medio de crecimiento adicional a la matriz y a la composición celular, el cual se puede incubar entonces a 37 °C durante 2-3 días con un cambio diario de medio. Las células típicamente se agregan a la matriz a una alta densidad (ver anteriormente) para llenar sustancialmente el espacio dentro de la matriz disponible para las células. El lavado de la composición y ya sea el uso inmediato o incubación pueden ser como se describe anteriormente para las matrices de esponja. En el caso de una matriz de bloque tal como la matriz anorgánica descrita anteriormente (por ejemplo, el bloque BIO-OSS°) o una matriz de hueso desmineralizado (por ejemplo, la matriz DYNAGRAFT™) , se pueden sembrar de aproximadamente 1.5 x 106 hasta 2.0 106 células (o más cuando sea necesario) en aproximadamente 100 a 150 µ? de medio de crecimiento en un bloque cúbico de 1 cm x 1 cm x 2 cm de material de la matriz. Las células de manera típica se siembran lentamente sobre una cara de la cara del bloque. Una vez que el medio y las células se han absorbido en el bloque, se puede sembrar otra cara del bloque de manera similar. El procedimiento se puede repetir hasta que todas las caras del bloque se hayan sembrado y el bloque esté totalmente saturado con medio. Se debe tener cuidado de evitar agregar medio en exceso y provocar así la fuga del medio y de las células del bloque. La composición se puede incubar entonces a 37°C durante aproximadamente 60-120 minutos sin la adición posterior de medio para permitir que sustancialmente todas las células se adhieran al material de la matriz. Después de la adherencia celular, se puede agregar medio de crecimiento adicional a la matriz y a la composición celular, el cual se puede incubar entonces a 37°C durante 2-3 días con un cambio diario de medio. Las células típicamente se agregan a la matriz a una alta densidad (ver anteriormente) para llenar sustancialmente el espacio dentro de la matriz disponible para las células con el mismo resultado descrito anteriormente . El lavado de la composición y ya sea el uso inmediato o la incubación pueden son como se describen anteriormente para las matrices de esponja. Se pueden preparar composiciones que contengan las neuronas de la invención y una matriz biodegradable de partículas pequeñas (por ejemplo, FASCIAN™, CYMETRA™, ó DERMALOGEN™) mezclando los componentes, por ejemplo, haciendo pasar los mismos de atrás hacia delante entre dos jeringas que están conectadas a través de un cierre Luer. FASCIAN™, por ejemplo, típicamente está disponible en jeringas (por ejemplo, jeringas de 3 ce) a 80 mg/jeringa. Las partículas de FASCIAN™ se pueden lavar directamente en la jeringa antes de usarse retomando un volumen pequeño (por ejemplo, 1.5 mi) de un amortiguador de lavado (por ejemplo, solución salina isotónica o solución Ringers de Kreb que contiene dextrosa) en la jeringa, conectando la primera jeringa a una segunda jeringa a través de un cierre Luer, y pasando las partículas y la solución de lavado de atrás hacia adelante entre dos jeringas varias veces. Para separar las partículas de la solución de lavado, la mezcla se puede transferir a un tubo estéril y las partículas de FASCIAN™ se dejan asentar. La solución se puede remover (por ejemplo, decantar o aspirar) , y el proceso de lavado se puede repetir cuando se desee retomando las partículas en una jeringa nueva (por ejemplo, a través de una aguja de calibre 18 ó calibre 20) . Cuando las partículas se lavan adecuadamente, las mismas se pueden mezclar con células utilizando el mismo procedimiento que para el lavado. Las células (por ejemplo, 1.5 x 106 a 2 x 106 células) se puede suspender en solución (por ejemplo, 1.5 mi de solución Ringers de Kreb con 5% de dextrosa) y se retoman en una jeringa. La jeringa que contiene las células se puede conectar a una jeringa que contenga las partículas de relleno, a través de un cierre Luer, y los dos componentes se pueden mezclar haciendo pasar los mismos de atrás hacia delante entre las jeringas. Las mezclas se pueden transferir entonces a un matraz de cultivo de tejido T-25 o a un plato de cultivo de tejido o a un tubo de modo que las células se puedan anexar a las partículas de relleno. Alternativamente, la mezcla puede permanecer en las jeringas mientras que ocurre la unión, aunque esto puede der más perjudicial para las células. La mezcla se puede incubar durante la noche y luego transferirse a un contenedor (por ejemplo, un vial o un tubo) para suministrarse un médico, o transferirse a una jeringa para administrarse a un sujeto. Un contenedor a ser suministrado a un médico se puede mantener en hielo durante el suministro. Cuando se utilizan tales matrices biodegradables acelulares, de partículas pequeñas, se puede inyectar opcionalmente una suspensión de partículas que contengan las células en vez de implantarse en un área de degeneración o defecto de tejido. Se entiende que las composiciones de la invención pueden contener, además de células y un portador aceptable farmacéuticamente, y/o una matriz acelular biodegradable (ver más adelante) , cualquier de uno o más de los factores de crecimiento de células nerviosas, listados anteriormente. La invención también proporciona métodos para hacer composiciones que contengan tanto neuronas de la invención como componentes de matriz. Estos métodos típicamente implican proporcionar una población de células que incluyen una pluralidad de neuronas, proporcionar una matriz acelular biodegradable, incubar la matriz acelular biodegradable con la población de células tal que las células se integren sobre o dentro de la matriz, formando así una composición para reparar tejido neural dañado o defectuoso. Materiales de relleno acelulares, biodegradables Las composiciones de la invención pueden contener las neuronas de la invención junto con uno o más materiales de relleno inyectables, acelulares, biodegradables (es decir, agentes de volumen) . Las composiciones son adecuadas para su inyección en un sujeto con el fin de reparar el tejido que se ha degenerado. Un material de relleno generalmente cumple una función estructural. Por ejemplo, el mismo puede llenar un defecto, orificio, espacio o cavidad en el tejido y proporcionar un ambiente en el cual las células inyectadas puedan adherirse al tejido circundante y crecer y producir factores estructurales y otros factores (por ejemplo, factores quimiotácticos) que resultan del crecimiento de nuevo tejido. En muchos casos, la función de llenar huecos del relleno es temporal y solamente dura hasta que las células implantadas y/u hospederas migren hacia el área y forman nuevo tejido. Preferiblemente, el relleno es biodegradable. Los rellenos típicamente se proporcionan y utilizan como una solución o suspensión viscosa. Los rellenos se pueden combinar con una población celular que incluya neuronas de la invención. Se pueden utilizar numerosos tipos de rellenos inyectables, acelulares, biodegradables , en las composiciones de la invención. Un relleno puede consistir de proteínas autólogas, que incluyan cualquier tipo de colágeno obtenido de un sujeto. Un ejemplo de tal relleno es Autologen9, anteriormente producido por Collagenesis Corp. (Beverly, MA) . Autologen0, es una dispersión de fibras de colágeno dérmico, autólogo, de un sujeto y por lo tanto no produce ni siquiera una respuesta inmune mínima cuando se readministra al sujeto con células tales como las UMC y, opcionalmente, fibroblastos. Con el fin de obtener Autologen0, se obtiene una muestra de tejido (por ejemplo, dermis, placenta, o cordón umbilical) de un sujeto y se envía a Collagenesis Corp. donde la misma se procesa en una dispersión rica en colágeno. Aproximadamente una y media pulgada cuadrada de tejido dérmica puede dar un centímetro cúbico (ce) de Autologen*5. La concentración Autologen° se puede ajustar dependiendo de la cantidad requerida para corregir defectos o aumentar el tejido dentro del sujeto. La concentración de Autologen° en la dispersión puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente 25 mg/L (por ejemplo, al menos aproximadamente 30 mg/L, al menos aproximadamente 40 mg/L, al menos aproximadamente 50 mg/L, ó al menos aproximadamente 100 mg/L) . Un material de relleno inyectable, acelular, también puede contener proteínas no-autólogas , que incluyen cualquier tipo de colágeno. Los numerosos productos de colágeno están disponibles comercialmente y se pueden utilizan en composiciones de la invención. Los productos de colágeno humano también están disponibles comercialmente. Los ejemplos de colágeno disponible comercialmente incluyen, sin limitación, colágeno bovino, por ejemplo, productos de ® ® colágeno bovino reconstituidos tales como Zyderm y Zyplast , los cuales contienen fibras de colágeno bovino reconstituido que se reticulan con glutaraldehído y se suspenden en solución salina fisiológica, amortiguada con fosfato, con 0.3% de lidocaína. Estos productos son producidos por McGhan Medical Corporation de Santa Barbara, CA. Los productos de colágeno porcino también están disponibles comercialmente. Los colágenos útiles en esta invención se pueden aislar de tejidos de muestras apropiadas, o los mismos se pueden hacer como proteínas recombinantes . Las proteínas recombinantes pueden tener secuencias de aminoácidos idénticas a aquéllas de las proteínas de origen natural, o las mismas pueden tener secuencias de aminoácidos que contengan sustituciones, eliminaciones, o inserciones de aminoácidos que mejoren la función de las proteínas . Otros ejemplos de materiales de relleno útiles incluyen, pero no están limitados a, gelatina solubilizada, ácido poliglicólico (por ejemplo, ácido poliglicólico solubilizado o partículas de ácido poliglicólico) , o suturas de intestino de gato. Un implante de matriz de gelatina particular, por ejemplo, se vende bajo la marca Fibril^. Este relleno contiene volúmenes iguales de (1) una mezcla de polvo de gelatina de porcino y ácido o-aminocapróico dispersado en una solución de cloruro de sodio al 0.9% (en volumen), y (2) una alícuota de plasma del sujeto. Otras sustancias útiles como rellenos incluyen hialuron, ácido hialurónico, restalina, y parleano. La invención también proporciona métodos para hacer composiciones que contengan neuronas de la invención y rellenos acelulares, biodegradables . Estos métodos típicamente implican proporcionar una población de células que incluyen neuronas de la invención que están sustancialmente libres de proteínas inmunogénicas (por ejemplo, proteínas derivadas de suero de medio de cultivo) , proporcionar uno o más materiales de relleno acelular, biodegradable, y combinar el relleno con la población de células. Métodos para Utilizar las Neuronas de la Invención Las neuronas y composiciones de la invención se pueden utilizar in vi tro o in vivo. Los usos in vitro de las neuronas y composiciones que contienen las neuronas, incluyen su uso como objetivos para seleccionar o probar in vitro de los compuestos de interés, por ejemplo, actividad promotora del crecimiento de neuronas o actividad neurotóxica. Las mismas también se pueden utilizar en estudios tanto in vitro como in vivo de neurobiología básica. Las neuronas son particularmente útiles para el tratamiento de cualquiera de una variedad de condiciones neurológicas (ver anteriormente) . Las neuronas se pueden administrar mediante inyección, implantación, o injerto. Las mismas se pueden implantar durante la cirugía, por ejemplo, para remover un tumor en el sitio de escisión del tumor. Por consiguiente, por ejemplo, una composición que contiene las neuronas de la invención (ver anteriormente) en un portador aceptable farmacéuticamente y/o relleno acelular biodegradable (ver anteriormente) se puede inyectar en una región del CNS (por ejemplo, ventrículo cerebral o espina dorsal) de interés. Alternativamente, las neuronas anexadas a y/o incorporadas en una matriz acelular biodegradable (ver anteriormente) , se pueden implantar en, o injertar a, un tejido dañado o defectuoso del CNS (cerebro o espinal dorsal) o un nervio periférico .

Las administraciones pueden ser individuales o •múltiples. Por consiguiente las mismas se pueden hacer una dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 700, 1000, ó más veces. Cuando se hace una pluralidad de administraciones, las administraciones se pueden separar mediante cualquier periodo de tiempo apropiado, por ejemplo, 30 segundos, un minuto, dos minutos, tres minutos, cuatro minutos, cinco minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, dos horas, tres horas, cuatro horas, cinco horas, ocho horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, dos días, tres días, cuatro días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, ocho meses, diez meses, un año, 18 meses, dos años, tres años, cuatro años, cinco años, seis años, ocho años, diez años, 12 años, 15 años, 18 años, 20 años, 25 años, 30 años, 40 años, 50 años, o incluso un periodo de tiempo más prolongado. También se puede administrar uno o más factores de crecimiento a los receptores de las neuronas de la invención. Estos factores incluyen cualquier de aquéllos listados anteriormente. Se entiende que los factores de crecimiento relevantes pueden actuar directamente para promover el crecimiento de neuronas injertadas o puede facilitar la reparación de tej ido actuando indirectamente sobre otras células por ejemplo mejorando la angiogénesis . Los factores de crecimiento se pueden administrar a un sujeto como componentes de las composiciones que contienen neuronas. Alternativamente, los mismos se pueden administrar por separado o ya sea simultáneamente o en un momento diferente. Además los mismos se pueden administrar en el mismo sitio que la composición celular o en un sitio diferente. Los mismos se pueden administrar sistemática o localmente, por ejemplo, oralmente, transdérmicamente , intra-rectalmente, intravaginalmente, intranasalmente , intragástricamente, intratraquealmente, o intrapulmonarmente, o inyectarse (o infundirse) intravenosamente, subcutáneamente, intramuscularmente, o intraperitonealmente . Las frecuencias de administración son como para las composiciones celulares (ver anteriormente) . Un factor de crecimiento se puede administraren la forma del factor de crecimiento mismo. Alternativamente, el mismo se puede administrar unido a, o encapsulado dentro de, un substrato sólido que actúa como un reservorio o depósito del factor de crecimiento. El substrato sólido puede ser un objeto o una pluralidad de objetos (configurados, por ejemplo, como partículas o hebras) . El factor de crecimiento se libera gradualmente desde el substrato sólido hacia su ambiente. Cuando un substrato sólido está en la forma de perlas, las perlas generalmente tienen una forma aproximadamente esférica con un diámetro de aproximadamente 0.005 - 2.0 mm. Cuando el substrato sólido está en la forma de hebras, las hebras generalmente son de 0.01 - 1.0 mm de diámetro. Las hebras se pueden doblar en una malla o cortar en pedazos pequeños (de aproximadamente 5 - 10 mm) antes de la formación del gel . Cuando la composición que contiene neuronas también contiene una matriz acelular biodegradable, se entiende que la matriz, si se desea, también funciona como un substrato sólido para la lenta liberación de los factores de crecimiento. Las substancias a partir de las cuales los substratos sólidos se pueden fabricar, incluyen colágeno, gelatina, acetato de etilen-vinilo, co-polímero de poliláctida/ácido glicólico, fibrina, octasulfato de sacarosa, dextrano, polietilenglicol , un alginato, poliacrilamida, celulosa, látex, polihidroxietilmetacrilato, nailon, dacrón, politetrafluoro-etileno, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, poliestireno, co-polimero de polivinilcloruro, intestino de gato, algodón, lino, poliéster, y seda. Un substrato sólido puede tener heparina o proteoglicano de sulfato de heparan unido al mismo como un medio para promover el enlace de un factor de crecimiento de enlace de heparina (por ejemplo, bFGF, VEGF, ó PDGF) al mismo. Un ejemplo de tal substrato sólido son las perlas que consisten principalmente de agarosa con heparina unida a las mismas. El substrato sólido puede estar en una variedad de formas físicas, por ejemplo, perlas, partículas irregulares, hojas, o hebras . Cuando el factor de crecimiento está encapsulado en el substrato sólido, el factor de crecimiento se libera gradualmente con el transcurso del tiempo, por ejemplo, debido a las enzimas que actúan en el substrato sólido. Otro medio mediante el cual uno o más factores de crecimiento se pueden suministrar a un sujeto es mediante la administración al sujeto de células recombinantes transfectadas o transformadas con uno o más vectores de expresión que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más factores de crecimiento. Las células pueden ser las neuronas mismas u otros tipos de células, por ejemplo, fibroblastos, UMC, queratinocitos , células endoteliales, o células linfoides. Los mismos requerimientos de histocompatibilidad que son aplicables a las neuronas (ver anteriormente) son aplicables a las células recombinantes utilizadas para suministrar factores de crecimiento; las células preferiblemente se derivarán del receptor, es decir, las mismas serán autólogas. En cuanto a que las neuronas de la invención se derivan de las UMC, se entiende que todas las UMC descritas en la presente (por ejemplo, aquéllas producidas por el método descrito en el Ejemplo 1) se pueden utilizar para tratar las mismas enfermedades neurologicas recitadas aquí como tratables con las neuronas de la invención. Además, las UMC pueden ser componentes de cualquiera de las composiciones descritas en la presente. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar, sin limitar, la invención. EJEMPLOS Ejemplo 1 - Aislamiento de UMC autologas y fibroblastos Las células se cosecharon y enriquecieron in vitro para UMC mediante el inicio de cultivos de una biopsia de piel obtenida de un voluntario humano, normal, saludable, como sigue. Se obtuvieron biopsias de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 mm3 del área de la post-aurícula, y el cultivo de tejido de fibroblastos se inició como se describe anteriormente utilizando DMEM que contiene 4500 mg/L de D-glucosa, 2 mM de L-glutamina, aminoácidos no-esenciales, y 10% de FBS . Se observaron colonias de células no-adherentes , que crecen activamente, después de que los fibroblastos adherentes han alcanzado la confluencia total en el paso dos o tres. Este proceso podría acortarse mediante el inicio del cultivo en suero bajo y mediante la presencia de 5 ng/ml de aFGF, o mediante el cultivo de las células en un coágulo de plasma directamente del tejido (ver el Ejemplo 2) con la adición de 300 mM de CaCl2 a una concentración final de 15 mM. Cada colonia contenía entre 2 y aproximadamente 80 células que tenían una morfología similar a la de los guijarros y se dividía activamente. Las colonias se recolectaron mediante la aspiración del medio de cultivo que contiene las colonias flotantes y mediante la centrifugación de este medio. Las células comprimidas mediante centrifugación se transfirieron a nuevos recipientes de cultivo de tejido sembrándolas directamente en medio de cultivo fresco que contiene aFGF y heparina (DMEM que contiene 4500 mg/L de D-glucosa, 2 mM de L-glutamina, 2.5% de FBS inactivado con calor, 5 ng/mL de aFGF humano, recombinante, y 5 µg/mL de heparina) . La suspensión celular se agrega a matraces con cultivo de tejido fresco, los cuales se incubaron a 37 °C. Las células se alimentaron dos veces a la semana, y se hicieron pasar o se trataron con tripsina diferencialmente cuando se alcanzó la confluencia (generalmente dentro de una a dos semanas) . Se observaron colonias de células similares a guijarros dentro de aproximadamente 3-6 semanas del inicio del cultivo. El aislamiento de las colonias y el cultivo en recipientes de cultivo de tejido fresco provocaron que las células se volvieran adherentes . Las colonias de células no-adherentes también se aislaron del tejido adiposo humano como sigue. El tejido se cortó en pedazos pequeños y se removieron todas las membranas visibles. El tejido se colocó en cultivo en DMEM que contiene 4500 mg/L de D-glucosa, 2 mM de L-glutamina, 2.5% de FBS inactivado con calor, 1 a 10 ng/mL de aFGF humano, recombinante , y 5 g/mL de heparina. Bajo estas condiciones, las células similares a guijarros se vertieron activamente desde el tejido adiposo, y se continúo el cultivo durante un periodo prolongado de tiempo. Los pedazos de tejido adiposo se lavaron y colocaron en recipientes de cultivo de tejido fresco. Dentro de aproximadamente 2 semanas, las UMC se aislaron del tejido mediante el tratamiento con colagenasa IV durante aproximadamente 5-15 minutos a 37 °C. Se continuó cultivando activamente nuevas células del tejido adiposo en el cultivo durante más de un año, hasta que los cultivos se terminaron. Una vez que los cultivos se desarrollaron completamente, se observaron clústeres de células no-adherentes . Cuando estas células se reimplantaron en matraces con cultivo de tejido, se observó que el mismo tipo de células crece activamente . En la presencia de aFGF, las células en los cultivos tanto de piel como de tejido adiposo fueron morfológicamente homogéneas en apariencia y tuvieron una morfología similar a la de los guijarros. Sin embargo, en la remoción del aFGF del medio de cultivo, la mayoría de las células completamente se diferenciaron en fibroblastos adherentes . Las células no-adherentes, similares a guijarros, se observaron en cultivos iniciados de médula ósea, utilizando un método descrito por Marko et al. (supra) . Por consiguiente, parece que al menos las células no-adherentes, similares a epitelioides , se cosechan de cultivos de fibroblastos establecidos de la dermis o de cultivos de tejido adiposo o médula ósea de hecho son UMC. Ejemplo 2- Diferenciación de UMC en neuronas En experimentos preliminares, se encontró que los coágulos preparados de plasma bovino son tan eficientes en el crecimiento celular de apoyo como aquéllos producidos de plasma bovino fetal . La presencia de concentraciones superiores de Ca2+ que normalmente están presentas en medio de cultivo (es decir, aproximadamente 2 mM) fue esencial para el crecimiento de neuronas en los cultivos de UMC en el coágulo de plasma. Se encontró que la diferenciación, crecimiento y migración de células nerviosos en los coágulos de plasma dependen de la concentración de Ca2+ (en la forma de CaCla) utilizada para la producción de coágulos. Se encontró que la concentración óptima de CaCl2 está entre aproximadamente 8 mM y 15 mM. Lo siguiente es una descripción de un experimento típico.

El plasma bovino liofilizado (Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO; Cat . No. P-4639) se reconstituyó con un volumen apropiado de medio de cultivo de tejido que no contiene heparina, por ejemplo, DMEM o medio Neurobasal (ver anteriormente) . Se agregó un volumen apropiado de una solución de reserva de CaCl2 (por ejemplo 300 mM) a una serie de platos de plástico para cultivo de tejido (un conjunto que tiene un diámetro de 30 mm y otro conjunto que tiene un diámetro de 60 mm) para dar una concentración final de 15 mM después de la adición de plasma. Se agregó plasma a los platos de cultivo (1 mi a platos de 30 mm y 2 mi a los platos de 60 mm) , los cuales se remolinaron con el fin de mezclar el CaCl2 y el plasma. Se produjeron coágulos delgados (menos de 1 mm de altura) agregando 0.5 a 0.75 mi de plasma a discos de 30 mm y 1.0 a aproximadamente 1.25 mi de plasma a un plato de 60 mm; se agregaron volúmenes apropiados de solución de CaCl2 para dar una concentración final de 15 mM a los platos como se describe anteriormente . Los platos se incubaron entonces a temperatura ambiente ó 37°C hasta que el plasma se haya coagulado. La coagulación a 37 °C, el cual es más rápido que a temperatura ambiente, toma alrededor de 2-3 horas. Se agregaron aproximadamente 2 mi de medio de cultivo de tejido a los platos de 30 mm de cultivo de tejido y 5 mi a los platos de 60 mm de cultivo de tejido. El medio de cultivo de tejido fue el "medio N" (ver anteriormente) . Los platos se almacenaron entonces en un incubador de cultivo de tejido a 37°C en una atmósfera de C02 al 10% hasta que estén listos para usarse. Se agregó una pequeña cantidad (aproximadamente 5 células hasta aproximadamente 105 células por coágulo) de UMC derivadas de la dermis preparadas como se describe en el Ejemplo 1, a cada plato y las células se dejaron asentar en cada coágulo. El medio de cultivo de tejido en los platos de cultivo se cambió cada 3-4 días; se agregaron 1.5 mi a los platos de 30 mm y 3 mi a los platos de 60 mm después de la remoción del medio gastado. El crecimiento de las células en los coágulos, el cual se observó microscópicamente, se continuó durante aproximadamente un año . Se observó la diferenciación de una subpoblación de las UMC en el coágulo de plasma en neuronas a partir de 2-3 días después del inicio de los cultivos. En la mayoría de los cultivos, las células pequeñas con solamente un axón fueron las primeras células de morfología neuronal que aparecieron. En las últimas etapas, las células que tienen una apariencia dendrítica fueron visibles en los cultivos. La mayoría de las neuronas derivadas de UMC crecieron en la parte superior del coágulo y las células que retuvieron la morfología de las UMC estuvieron cerca de la parte inferior del coágulo.

Cuando las células en los coágulos alcanzaron una alta densidad, uno o más pedazos del coágulo de plasma se transfirieron al coágulo de plasma sobre un coágulo de plasma preparado recientemente. Las células migraron desde el pedazo transferido hacia el nuevo coágulo en 18-24 horas. Las neuronas fueron las primeras células en migrar hacia el nuevo coágulo . Los coágulos de plasma que contienen células se almacenaron en N2 líquido utilizando un medio estándar de congelamiento que contiene DMSO (ver anteriormente) . Si se utiliza un coágulo de plasma delgado (menos de lmm en la dimensión vertical) para la excrescencia de neuronas, las células se podrían cosechar de los coágulos mediante el tratamiento con tripsina utilizando técnicas estándar. Se utilizó plasminógeno (Sigma; Catálogo No. P-9156) para la recuperación de neuronas de coágulos más gruesos de plasma (de aproximadamente 3 mm hasta aproximadamente 4 mm en la dimensión vertical) a una concentración de 1 U/ml. Se requirieron tres tratamientos para liberar las neuronas de los coágulos. Las células liberadas mediante los primeros dos tratamientos fueron casi todas, si no es que todas, UMC y otras células contaminantes . Parece probable que incrementado la concentración de plasminógeno, puede ser posible liberar neuronas mediante uno o posiblemente dos tratamientos.

El crecimiento de neuronas en los coágulos se incrementó incluyendo la mezcla de aditivo de cultivo B27 (ó N-2) (Gibco, Carlsbad, CA) en el medio de cultivo que rodea los coágulos. También se observó el crecimiento mejorado de neuronas humanas utilizando un aFGF como el único factor de crecimiento en el medio de cultivo. Sin embargo, en experimentos paralelos realizados con UMC preparadas a partir de piel de rata, se requirió una combinación de los factores de crecimiento (bFGF, EGF de forma larga, LIF, e IGF de forma larga 3) ; la presencia de estos factores de crecimiento además de los cultivos de células humanas incrementó además el crecimiento de las neuronas . También fue posible generar neuronas en los coágulos de plasma utilizando, en lugar de UMC producidas mediante el método descrito en el Ejemplo 1, pedazos pequeños (por ejemplo, fragmentos aproximadamente cuboides con cada dimensión de aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 5 mm) tanto de piel como de tej ido graso . Los dos tej idos se probaron en experimentos separados . Los pedazos de tej ido se colocaron directamente en la superficie de los coágulos. El nivel de medio de cultivo en el plato de cultivo fue los suficientemente alto para prevenir el secado del coágulo aunque lo suficientemente bajo para prevenir la flotación de los fragmentos de tejido y para permitir su adherencia a la superficie del coágulo de plasma. En' estos cultivos, se previno el crecimiento excesivo por los fibroblastos utilizando medio con una concentración baja de suero (es decir, no mayor del 2.5%) y la inclusión de aPGF humano (5 ng/ml) . También se puede agregar FGF básico (bFGF) al medio. Dentro de los 5-7 días del inicio de estos cultivos, se observaron neuronas creciendo en el coágulo en la cercanía inmediata de los fragmentos de tejido. Los pedazos de tejido (piel o grasa) podrían removerse del coágulo de plasma original y utilizarse para sembrar nuevos coágulos de plasma. Las neuronas recuperadas del tejido graso difirieron en su morfología de las neuronas recuperadas de la piel . Mientras que aquéllas generadas a partir de la piel fueron células dendríticas pequeñas, aquéllas generadas a partir de la grasa fueron células oligodendríticas largas. Después de sembrarlas en coágulos de plasma, las UMC (también mencionadas previamente como preadipocitos) derivadas de médula ósea de humano y rata, dieron lugar a neuronas en los coágulos de plasma. Estos UMC/preadipocitos se describen en la Solicitud Norteamericana co-pendiente No. de Serie 10/330,584 cuya descripción se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En vista de la capacidad para cultivar neuronas a partir de los fragmentos de piel y grasa (ver anteriormente) , es probable que del mismo modo sería posible cultivarlos ya sea a partir de células de médula ósea o de fragmentos de médula ósea colocados en la superficie de coágulos de plasma como se hizo con la piel y los fragmentos de grasa . Una vez que las neuronas se hayan producidas mediante la metodología de coágulo de plasma descrita anteriormente, las mismas se pueden aislar de los coágulos y cultivar bajo condiciones estándar de cultivo liquido. Se ha descrito un cierto número de modalidades de la invención. No obstante, se entenderá que pueden hacerse varias modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. De acuerdo con esto, otras modalidades están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES 1. - Un método para producir neuronas , el método caracterizado porque comprende los pasos secuenciales de: (a) proporcionar una fuente de células mesenquimales no diferenciadas (UMC) ; (b) proporcionar un coágulo de plasma que contenga desde aproximadamente 6 mM hasta aproximadamente 18 mM Ca2+; (b) incorporar UMC desde la fuente hacia el coágulo de plasma; y (c) incubar el coágulo de plasma, en donde, durante la incubación, una subpoblación de las
2. UMC en el coágulo de plasma, se diferencia en neuronas, creando así en el coágulo de plasma una población de células que comprenden neuronas . 2. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de UMC es un fragmento de piel de mamífero.
3. 3.- El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de UMC es un fragmento de tejido grasoso de mamífero .
4. 4. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de UMC es una población de células derivadas no-adherentes que comprenden UMC, las células derivadas no-adherentes producidas mediante un proceso que comprende: (a) proporcionar un fragmento de tejido que contiene células mesenquimales no diferenciadas (UMC) para obtener células de partida; (b) separar las células de partida de dicho fragmento: (c) cultivar las células de partida; y (d) cosechar una población de células derivadas no-adherentes de de dicho cultivo, en donde dichas células derivadas no-adherentes comprenden UMC.
5. 5. - El método de la reivindicación 4, el proceso caracterizado porque comprende además una o más rondas de derivación que comprende pasos de repetición (c) y (c) utilizar la población cosechada de células derivadas no-adherentes de la ronda previa como las células de partida.
6. 6. - El método de la reivindicación 5, caracterizado porque una o más rondas adicionales de derivación comprenden de una a veinte rondas .
7. 7. - El método de la reivindicación 4, caracterizado porque dicho tejido que contiene UMC se selecciona del grupo que consiste de tejido dérmico, tejido adiposo, tejido conectivo, fascia, lámina propria y médula ósea.
8. 8. - El método de la reivindicación 4, caracterizado porque comprende cultivar dichas células no-adherentes en la presencia de factor de crecimiento de fibroblastos acídicos.
9. 9. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porgue comprende además aislar la población de células del coágulo de plasma.
10. 10. - El método de la reivindicación 9, caracterizado porgue comprende además cultivar la población aislada de células en un medio de cultivo libre de suero.
11. 11. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porgue la fuente de UMC se obtuvo de un individuo a guien se administró la población.
12. 12.- Una neurona producida mediante el método de la reivindicación 1.
13. 13. - Una composición gue comprende una población celular gue incluye neuronas, caracterizada porgue la población celular se produjo mediante el método de la reivindicación 1.
14. 14.- La composición de la reivindicación 13, caracterizada porque comprende además un portador aceptable farmacéuticamente .
15. 15. - La composición de la reivindicación 13, caracterizada porgue además una matriz biodegradable acelular en donde las células de la población celular están integradas en o sobre la matriz.
16. 16. - La composición de la reivindicación 13, caracterizada porgue comprende además un relleno biodegradable, acelular.
17. 17. - La composición de la reivindicación 13, caracterizada porque la composición está sustancialmente libre de proteínas derivadas del suero del medio de cultivo.
18. 18. - Un método para reparar tejido neural dañado o defectuoso en un sujeto mamífero, el método caracterizado porque comprende inyectar en, injertar a, o implantar en, el tejido neural la composición de la reivindicación 13.
19. 19. - El método de la reivindicación 18, caracterizado porque el tejido neural es un tejido del sistema nervioso central (CNS) .
20. 20. - El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el tejido CNS es tejido de espina dorsal.
21. 21. - El método de la reivindicación 21, caracterizado porque el tejido CNS es tejido cerebral.
22. 22.- El método de la reivindicación 18, caracterizado porque el tejido neural es tejido del sistema nervioso periférico (PNS) .
23. 23.- El método de la reivindicación 18, caracterizado porque el sujeto mamífero es un paciente humano.
24. 24.- El método de la reivindicación 18, caracterizado porque el sujeto mamífero tiene daño en la espina dorsal.
25. 25.- El método de la reivindicación 18, caracterizado porque el sujeto mamífero tiene un padecimiento o defecto seleccionado del grupo que consiste de Padecimiento de Alzheimer, Padecimiento de Parkinson, Padecimiento de Huntington, Padecimiento de Tay-Sachs, esclerosis lateral amilotrófica, apoplejía, degeneración de los nervios faciales, daño periférico de manos, neurofibromatosis , fibromialgia, siringomielia, un padecimiento inmune del sistema nervioso, y un tumor de tejido neural.
26. 26.- El método de la reivindicación 20, caracterizado porque la población celular de la composición es autóloga.