KR100818636B1

KR100818636B1 - 중간엽줄기세포를 포함하는 인공피부 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100818636B1
Application number: KR1020060111165A
Authority: KR
Inventors: 김동석; 김소영; 조현주; 박경찬
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2008-04-01

Abstract

본 발명은 중간엽줄기세포(MSCs, mesenchymal stem cells)을 사용하는 인공피부 제조 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 콜라겐 기질에 섬유아세포와 MSCs가 포함된 진피 대응물; 상기 진피 대응물과 각질형성세포를 포함하는 인공피부; 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인공피부는 표피의 분화상태가 우수하고 기저층의 증식능이 유지되고 있어 생체 피부와 유사하기 때문에, 화상, 창상 및 피부궤양 등의 피부이식에 사용할 경우 생체 피부와 유사한 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

인공피부, 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSC)

Description

중간엽줄기세포를 포함하는 인공피부 및 그의 제조방법 {ARTIFICIAL SKIN CONTAINING MESENCHYMAL STEM CELLS AND CONSTRUCTION METHOD THEREOF}

도 1은 본 발명에 따른 MSCs를 포함한 인공피부를 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 모습을 기존의 섬유아세포(Fb)를 포함하는 인공피부(대조군)의 경우와 비교하여 보여주는 사진이다.

도 2는 본 발명의 MSCs를 포함하는 인공피부에서의 증식 표지자인 PCNA와 p63 및 분화 표지자인 인볼루크린(involucrin)과 필라그린(filaggrin)의 분포를 항원 항체반응으로 염색한 모습을 기존의 섬유아세포(Fb)를 포함하는 인공피부의 경우와 비교하여 보여주는 사진이다.

도 3은 본 발명의 MSCs를 포함하는 인공피부에서의 베타1-인티그린의 분포를 항원항체반응으로 염색한 모습을 기존의 섬유아세포(Fb)를 포함하는 인공피부의 경우와 비교하여 보여주는 사진이다.

도 4는 본 발명의 MSCs를 포함하는 인공피부 및 기존의 섬유아세포(Fb)를 포함하는 인공피부에서의 증식 표지자인 PCNA 및 표피 줄기세포 표지자인 p63의 분포를 공촛점 현미경으로 촬영한 사진이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 중간엽줄기세포(MSCs)를 포함하는 인공피부 제조 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 콜라겐 기질에 MSCs와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물; 상기 진피 대응물과 각질형성세포를 포함하는 인공피부; 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

피부는 최상부의 표피와 표피 아래층에 존재하는 진피로 이루어져 있으며, 표피는 각질형성세포가 대부분을 차지하는 중층 편평상피로 진피위로 기저층, 유극층, 과립층, 각질층 순의 4층으로 이루어져 있다. 기저층에서 각질형성세포의 분열이 일어난 후 각질형성세포는 피부의 표면으로 이동하면서 여러 단계의 분화과정을 거치게 된다.

근래에는 기존의 단층 세포배양방법을 발전시켜 인체 피부의 표피와 유사한 표피조직을 얻을 수 있는 각질형성세포의 삼차원적 배양방법, 즉 인공피부 모델이 개발되었다. 현재 개발되어 있는 인공피부 모델 중에서 대표적인 예로는 표피를 제거한 진피위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(reconstructed epidermis on de-epidermized dermis, RE-DED)과 섬유아세포가 포함된 콜라겐 기질 위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(living skin equivalent, LSE) 등이 있다 (Regnier M et al, Front Matrix Biol. 1981;9:4-35; Bell E et al, J Invest Dermatol. 1983;81:2s-10s.).

인공피부가 개발된 이후 배양조건이 점차 개선됨에 따라 인공피부의 가장 중요한 요소인 표피는 각질층을 포함하여 형태학적으로 인체 피부와 매우 유사할 뿐만 아니라 생화학적으로, 그리고 기능적으로 인체피부의 표피와 상당히 유사해지고 있다.(Asselineau D et al, J Invest Dermatol. 1986;86:181-186; Ponec M. Toxicol in Vitro. 1991;5:597-606 ; Ponec M et al, J Invest Dermatol. 1997;109:348-355).

그러나, 현재까지 개발된 인공피부는 인체 피부와 동일하다고 할 수는 없으며, 대한민국 특허 제0047869호의 젤라틴과 키틴을 함유하는 인공피부, 대한민국 특허 제0148546의 인공피부용 키틴계 상호침투구조 필름의 제조방법, 대한민국 특허 제0195574호에서 생체 적합성 천공막 및 이의 제조방법, 대한민국 특허 제0315168호에서 창상피복용 견 피부로인 단백질 스폰지막의 제조방법, 대한민국 특허 제02776669호에서 하이아론산 스펀지의 제조방법등의 인공피부 제조방법에 대하여 콜라겐을 이용하거나 생분해성 폴리머를 이용하여 제시하고 있으나, 단지 인공피부의 3차원적인 배양에만 국한된 채 인체피부의 성상을 재현 할 수 있는 인공피부를 제공하지 못하고 있다.

또한 배양한 인공피부는 과증식 상태에 있는 것으로 알려져 정상피부와는 다른 성상을 보이고 있다.

따라서 체외에서 배양한 인공피부가 인체 피부의 정상적인 성상을 유지하여 학문적인 연구나, 의학적인 치료용으로 적합한 인공피부 및 그 배양방법의 개발의 필요성이 여전히 존재하고 있는 실정이다.

이와 같은 요구에 따라서, 본 발명은 인체피부의 성상을 그대로 재현할 수 있는 진피 대응물 및 인공피부를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 인체피부의 성상을 그대로 재현할 수 있는 인공피부의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜라겐 기질에 중간엽줄기세포(MSCs)와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물; 상기 진피 대응물과 각질형성세포를 포함하는 인공피부; 및 콜라겐 기질에 MSCs와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물 상에 각질형성세포를 배양하는 것을 포함하는 인공피부 제조 방법을 제공한다.

본 발명자들은 인체피부의 성상을 그대로 재현할 수 있는 인공피부를 제조하기 위하여 연구하던 중, MSCs를 사용하여 인공피부의 진피 대응물을 구축하면, 인공피부의 분화상태가 좋아지고 기저층의 세포들이 과증식상태에서 회복된다는 사실을 확인하고, 이를 이용하여 생체 피부와 유사한 성상을 재현될 수 있다는 사실을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 콜라겐 기질에 MSCs와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물을 제공한다. 본 발명에 따른 진피 대응물은, 생체 피부와 동등 또는 유사한 성상의 인공 피부 제조를 위한 재료로서 유용하게 사용될 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 콜라겐 기질에 MSCs와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물 및 상기 진피 대응물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하고, 분 화능이 개선되고 기저층 세포의 과증식 상태가 회복되어 생체 피부와 동등한 성상을 갖는 인공피부를 제공한다.

MSCs는 성체줄기세포의 한 종류로서, 뼈모세포(osteoblasts), 연골세포(chondrocytes), 근육세포(myocytes), 지방세포(adipocytes), 신경세포(neuronal cells), 및 베타 이자섬 세포(beta-pancreatic islets cells) 등으로 분화할 수 있는 세포이며, 또한 콜로니 형성 단위-섬유아세포 (colony-forming unit-fibroblast, CFU-F)로도 분화할 수 있는 세포로 정의될 수 있다. MSCs는 TGF(transforming growth factors), 특히 BMP(bone morphogenetic protein)가 존재하는 경우에는 연골세포로 분화하고, 혈청과 아스코르브산, 무기인산염, 덱사메타손 등이 배양액 내에 존재하는 경우에는 뼈모세포로 분화한다. 이와 같이 중간엽성체줄기세포는 다양한 중간엽조직으로 분화할 수 있는 능력이 있어 많은 연구자들의 관심을 받고 있다. 중간엽줄기세포는 중간엽줄기세포의 중요한 저장소인 골수로부터 분리될 수 있으나, 채취에 어려움이 있을 수 있으며, 지방조직 등에서도 분리 배양될 수 있다. 본 발명에 있어서, 중간엽줄기세포는 줄기세포능, 즉, 분화능 및 증식능을 갖는 모든 세포일 수 있으며, 예컨대, 포유류, 보다 바람직하게는 인간의 지방조직, 골수, 말초혈액, 또는 제대혈 등에서 분리된 것일 수 있다.

본 발명의 진피 대응물 또는 인공피부에 있어서, 상기 콜라겐은 그 종류에 제한이 없으나, I형, III형 또는 IV형 콜라겐이 바람직하고, 이 중에서도 I형 콜라겐이 더욱 바람직하다. 상기 섬유아세포와 각질형성세포는 포유류의 피부조직으로부터 분리된 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간의 피부조직으로부터 분리된 것일 수 있다.

배양한 인공피부가 생체의 피부와 동등 내지는 유사한 성상을 나타내기에 적절한 분포로 생성되도록 하기 위하여, 콜라겐 1 mL 당 MSCs를 10,000 내지 100,000,000 개 및 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000개가 포함된 것이 바람직하다. 본 발명의 인공피부에 있어서, 각질형성세포는 상기 진피 대응물 상에 배양되며, 생체 피부와 동등 내지 유사한 성상의 피부를 만들기 위하여, 상기 진피 대응물 1 개 (6 cm²) 당 각질형성세포 10,000 내지 100,000,000 개가 접종되어 배양된 것이 바람직하다.

본 발명의 인공피부를 배양하기 위한 목적으로 MSCs와 섬유아세포가 포함된 콜라겐으로 구성된 진피 대응물 위에 각질형성세포를 배양하여 수득한 인공피부는 형태학상으로 인체 피부의 표피와 매우 유사하게 기저층, 유극층, 과립층, 각질층을 갖는 중층의 표피이다. 특히 본 발명의 MSCs를 포함하는 인공피부는 각 층이 우수한 분화능 및 증식능을 보유하면서도 과증식 현상을 보이지 않아서 실제 인체 피부와 매우 유사한 형상을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 인공피부는 인간을 포함하는 포유류와 관련된 피부의 생리학적, 분자학적 연구의 수행에 유용하게 적용될 수 있다. 뿐만 아니라, 통상적인 방법으로 피부접촉물질에 대한 피부독성 검사에도 사용될 수 있다. 상기 피부접촉물질은 외용 제재, 화장품, 섬유, 또는 세제 등의 피부에 접촉하는 모든 물질을 총칭한다. 또한 본 발명의 인공피부는 통상적인 방법에 의하여 인간을 포함하는 포 유류의 화상, 창상, 피부궤양 등으로 피부가 결손된 부위 또는 당뇨병성 족부궤양 부위에 이식하기 위한 치료 목적으로 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 인공 피부는 인체를 대상으로 적용되는 것이 가장 바람직하다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 콜라겐 기질에 MSCs와 섬유아세포가 포함된 진피 대응물 상에 각질형성세포를 배양하는 단계를 포함하는 인공피부의 제조 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 제조 방법은,

콜라겐 기질에 섬유아세포와 MSCs를 첨가하여 진피 대응물을 제조하는 단계; 및

상기 제조된 진피 대응물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 섬유아세포 및 각질형성세포는 인간을 포함하는 포유류의 피부 조직으로부터 분리 및 배양한 것이 바람직하며, 상기 MSCs는 인간을 포함하는 포유류의 골수, 말초혈액, 제대혈, 또는 지방조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 세포의 분리 및 배양 방법에는 특별한 제한이 없으며, 통상적으로 알려진 모든 방법을 사용 가능하다.

상기 진피 대응물 제조 단계에 있어서, 콜라겐 1 mL 당 MSCs를 10,000 내지 100,000,000 개 및 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 혼합하는 것이 바람직하다. 각질형성세포는 상기 진피 대응물 상에 배양하며, 생체 피부와 동등 내지 유사한 성상의 피부를 만들기 위하여, 상기 진피 대응물 1 개 (6 cm²) 당 각질 형성세포 10,000 내지 100,000,000개를 접종 및 배양하는 것이 바람직하다.

상기 각질형성세포 배양 단계에 있어서, 배양 조건은 일반적인 생체 세포 조건을 따르며, 배지 또한 생체 세포 배양에 사용 가능한 것이면 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 배양 온도는 30 내지 40℃, 바람직하게는 37℃로 하고, 배양 기간은 7 내지 10 일 동안으로 할 수 있으며, 배양 배지로서 케라틴 세포 성장 배지(Keratinocyte Growth Media; KGM) 또는 Epi-life (예컨대, Cascade Biologics, Inc, Portland, OR 제품 등) 등으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 각질형성세포의 배양은 초기 16 내지 24 시간 동안은 배지에 침지시켜 배양하고, 그 후 12 내지 14 일 동안은 공기중에 노출시켜 배양하는 것이 좋다. 이와 같이, 배양 후기에 공기에 노출시켜 배양함으로써, 배양된 피부의 적절한 중층화를 유도할 수 있어서, 생체내 피부와 유사한 성상의 인공피부를 얻는데 유리하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 섬유아세포와 각질형성세포의 배양 및 중간엽성체줄기세포의 분리

각질형성세포와 섬유아세포는 어린아이의 포경수술을 통하여 얻어진 포피 에서 분리하였다. 상기 포피의 피부조직에서 잔여 피하지방을 제거 후 잘게 절개하여 터모라이신(thermolysin) 용액 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이와 같이 준비된 피부조직을 핀셋을 이용하여 표피와 진피로 분리하여 각각을 트립신 용액(Gibco, N.Y., USA)에 담아 37℃에서 15분동안 반응시킨 후, 단일 세포로 분리되도록 진탕하였다. 이와 같이 얻어진 세포의 배양은 'Rheinwald and Green (Cell, 1975)'(본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 방법을 따라 수행하였다.

이와 같이 분리된 각질형성세포는 각질형성세포 성장 배지(KGM, Clonetics, San Diego, CA, USA)에서 배양하였고, 섬유아세포는 10% 소의 혈청이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, N.Y., USA)에서 배양하였다. 각질형성세포 및 섬유아세포 배양시, 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 7일 내지 10일로 하였다.

중간엽성체줄기세포는 다음과 같은 방법으로 건강한 성인 28~40세 사이의 후둔부 피하지방조직으로부터 분리하였다. 상기 피하지방조직을 얇게 자르고 인산완충식염수(PBS, Gibco, USA)로 여러 번 세척한 후, 세척된 조직에 조직과 동량의 0.075% 콜라게네이즈 type I (Worthington, NJ, USA )용액을 넣어서 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이와 같이 반응시킨 조직에 상기 조직과 동량의 10% 소의 혈청이 포함된 DMEM(Gibco, N.Y., USA)을 넣은 다음, 2,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 상층액을 제거하였다. 이와 같이 얻어진 세포를 160 mM NH₄Cl에서 10분간 처 리한 후, 다공크기가 100 ㎛인 체를 사용하여 잔해를 제거하여 단일세포로 분리하였다.

중간엽성체줄기세포의 배양은 20% 소의 혈청, 1% 페니실린-스트랩토마이신(Gibco, N.Y., USA)이 포함된 Low-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, N.Y., USA)에서 배양하였다. 중간엽성체줄기세포 배양시, 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 5일로 하였다.

실시예 2: 진피 대응물의 제조

쥐꼬리로부터 분리 채취한 콜라겐 10 g을 4℃의 1/1000 빙초산(glacial acetic acid) 용액 1000 mL에 48시간동안 교반하여 녹인 I형 콜라겐 용액과, 10 x DMEM(Gibco, N.Y., USA)과, 완충액(0.05 N NaOH, 0.26 mM NaHCO₃, 및 200 mM HEPES)을 8:1:1 (부피비)로 혼합하여, 콜라겐 기질을 제조하였다. 이와 같이 얻어진 콜라겐 기질 3.5 mL를 밀리셀(millicell)에 나누어 넣고, 각 밀리셀 당 MSCs를 5x10⁵ 개와 섬유아세포 5x10⁵ 개를 첨가하여 혼합하였다. 그리고 나서, 상기 혼합액을 30 mm의 밀리셀에 3.5 mL씩 넣어 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 굳히는 과정으로 진피 대응물을 제조하였다 (실험군). 대조군으로서, 밀리셀 당 섬유아세포 1x10⁶ 개를 첨가하여 혼합한 콜라겐-섬유아세포 혼합액을 사용하여 상기와 같은 방법으로 진피 대응물을 제조하여 사용하였다.

실시예 3: 인공피부의 구축

상기 실시예 2에서 제조된 진피 대응물 6 cm² 위에 1x10⁶ 개의 각질형성세포를 접종하고, 1일간 배지 침지시켜 배양한 다음 다시 12일간 공기에 노출시켜 배양하였다. 이 때, 배양 온도는 37 ℃로 하고, 상기 배지로는 5 % FBS(Fetal Bovine Serum, Hyclone, Logan, UT, 0.4 mg/ml 하이드로코르티손, 1 mM 이소프로테레놀, 25 mg/ml 아스코르빈산 및 5 mg/ml 인슐린)이 포함된 DMEM 배지(Gibco, N.Y., USA)와 함스 영양 혼합물 F12(Ham's nutrient mixture F12, Gibco, N.Y., USA)이 3:1 (질량비)의 비율로 혼합한 혼합 용액을 사용하였다. 1일간 침지 배양시에는 저농도 EGF (Epidermal Growth Factor, Invitrogen, carlsbad, CA, 1 ng/ml)를 첨가하였고, 12일간의 공기 노출 배양시에는 고농도 EGF (10 ng/ml)를 첨가하였다. 배지는 일주일에 3회 교환하였고, 상기 실험은 동일조건으로 최소 2번 반복 실시하였다.

13일간의 배양 후, 얻어진 세포를 카르노이스 용액(Carnoy's solution, ethanol/chloroform/acetic acid 6:3:1)으로 고정시키고, 파라핀 블록으로 제조하여, 헤마톡실린 & 에오신 염색하였다 (Sigma chemical, St. Louis, USA). 상기 염색 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 섬유아세포와 MSCs가 포함된 경우에는 대조군과 비교하여 표피의 중층화 및 각질층의 발달이 잘 되어 있었으며 기저막도 잘 형성된 것을 확인할 수 있다. 대조군에서는 각질층에 핵이 관찰되어 배양한 인공피부가 과증식 상태에 있음을 알 수 있으며, 또한 과립층이 잘 형성되어 있지 않은 소견을 보이고 있는 반면, 본 발명의 MSCs를 사용하여 배양한 인공피부의 각질층에는 핵이 없어 정상적인 분화상태에 있음을 보여주고 있으며 과립층도 잘 관찰되어 전반적으로 분화상태가 좋음을 보여주고 있다.

실시예 4: 면역조직화학 염색

면역조직화학 염색의 일차항체로서 PCNA, p63, 인볼루크린(involucrin), 필라그린(filaggrin), 및 인테그린 β1(integrin β1) (이상, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)에 대한 항체를 이용하였다. 면역조직화학 염색은 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합 기법 (avidin-biotin-peroxidase complex techniques, LSAB PLUS System-HRP, DakoCytomation, K0690, Carpinteria, CA)을 사용하여 수행하였다.

PCNA, p63, 인볼루크린 및 필라그린을 사용하여 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 MSCs가 포함된 인공피부는 분화표지자인 인볼루크린과 필라그린의 면역조직화학염색에서 필라그린의 발현이 명확하여 분화도가 더 좋음을 알 수 있고, 기저층은 인볼루크린에 염색되지 않아 분화가 일어나지 않은 기저세포들이 존재함을 알 수 있었다. 또한 대조군과는 달리, 증식하는 세포에서 발현하는 증식표지자인 PCNA가 발현되지 않았으며, 대신 줄기세포 표지자로 알려진 p63 양성세포가 많이 발견되어 MSCs가 포함된 인공피부에서 기저층 세포는 과증식 상태에 있지 않음을 알 수 있었다.

한편, 기저막의 중요성분인 인테그린에 대한 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 섬유아세 포와 MSCs가 포함된 실험군에서 강한 양성소견을 관찰할 수 있으며, 표피의 증식, 분화, 기저막 형성 등이 모두 양호한 것을 확인할 수 있다.

실시예 5: 공촛점 현미경

공촛점 현미경으로 시료를 관찰하기 위하여, 상기 실시예 3에서 얻어진 인공피부를 카르노이스 용액(Carnoy's solution, ethanol/chloroform/acetic acid 6:3:1)으로 고정시켰다. 이와 같이 고정된 인공피부에 일차항체로서 PCNA와 p63 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)에 대한 항체를 이용하여 관찰하였다. 이차항체로서, PCNA에 대하여는 로다민이 부착된 goat anti-rabbit IgG(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)을 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin; Sigma chemical, St. Louis, USA)을 사용하여 1:100으로 희석하여 사용하였고, p63에 대하여는 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 부착된 goat anti-mouse IgG(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)을 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin; Sigma chemical, St. Louis, USA)을 사용하여 1:100으로 희석하여 사용하였다. 이와 같이 준비된 시료를 공촛점 현미경(LSM5 PASCAL, Carl Zeiss AG, Germany)을 사용하여 관찰하였다.

상기의 공촛점 현미경 관찰 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군과는 달리, MSCs가 포함된 인공피부에는 증식하는 세포에서 발현하는 PCNA가 발현되지 않았으며, 대신 줄기세포 표지자로 알려진 p63 양성세포가 많이 발견되어, MSCs가 포함된 인공피부에서 기저층 세포는 과증식 상태에 있지 않음을 알 수 있다. 따라서 MSCs를 포함하여 인공피부를 만들 경우 표피의 줄기세 포능을 유지시킬 수 있어 보다 우수한 인공피부를 구축할 수 있음을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 MSCs을 포함하는 인공피부는 기저막의 세포가 증식능을 보존함으로써 실제 인체피부와 유사할 뿐만 아니라 상처회복에 도움을 줄 수 있기 때문에, 화상, 창상 및 피부궤양 더 나아가 당뇨병성 족부궤양 등의 피부이식에 사용할 경우 우수한 효과를 나타낼 수 있어서, 의학적 이식 용도로 매우 유용할 뿐 아니라, 피부 독성 검사 등의 각종 피부 실험용으로도 적용 가능하다.

Claims

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콜라겐 기질, 중간엽성체줄기세포 및 섬유아세포를 포함하는 진피 대응물 및 상기 진피 대응물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부.
제4항에 있어서,

상기 진피대응물은 콜라겐 기질 1 mL 당 중간엽성체줄기세포 10,000 내지 100,000,000 개 및 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000개를 포함하는 것인,

인공피부.
제4항에 있어서,

상기 진피 대응물상에 배양된 각질형성세포의 수는 진피 대응물 6cm² 당 10,000 내지 100,000,000개인,

인공 피부.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

피부 연구 또는 피부 독성 검사에 사용되는 것을 특징으로 하는

인공피부.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

의학적 이식용으로 적용되는 것을 특징으로 하는

인공 피부.
콜라겐 기질에 섬유아세포와 MSCs를 첨가하여 진피 대응물을 제조하는 단계; 및

상기 제조된 진피 대응물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는,

인공 피부의 제조 방법.
제9항에 있어서,

상기 섬유아세포 및 각질형성세포는 피부 조직으로부터 분리된 것이고, 상기 중간엽성체줄기세포는 골수, 말초혈액, 제대혈, 또는 지방조직으로부터 분리된 것인,

인공피부의 제조 방법.
제9항에 있어서,

상기 진피 대응물을 제조하는 단계는 콜라겐 1 mL 당 중간엽성체줄기세포 10,000 내지 100,000,000 개 및 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 첨가하여 수행하는 것인,

인공피부의 제조 방법.
제9항에 있어서,

상기 각질형성세포의 접종 및 배양 단계는 상기 진피 대응물 6 cm² 당 각질형성세포 10,000 내지 100,000,000 개를 접종 및 배양하여 수행하는 것인,

인공피부의 제조 방법.
제9항에 있어서,

상기 각질형성세포 배양 단계는 초기 16 내지 24시간 동안은 배지에 침지시켜 배양하고, 그 후 12 내지 14일 동안은 공기 중에 노출시켜 배양하여 수행하는 것인,

인공피부의 제조 방법.