KR20160022470A - 조류 콜라겐을 포함하는 인공피부 및 이의 제조방법 - Google Patents

조류 콜라겐을 포함하는 인공피부 및 이의 제조방법 Download PDF

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dermal
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Abstract

본 발명은 조류 콜라겐을 포함하는 인공피부 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 인공피부를 배양하여 제조함에 있어서, 알레르기 반응과 같은 부작용이 적고 글루탐산과 아스파트산과 같은 아미노산이 풍부한 조류 콜라겐을 포함시킴으로써, 진피 속 섬유아세포의 증식을 유도하고 그로 인한 표피 속 각질형성세포의 증식을 높이는 인공피부에 대한 것이다. 본 발명에 따른 조류 콜라겐을 포함하는 인공피부는 각질형성세포의 증식, 분화 또는 기저막 형성을 촉진하는 효과가 우수하므로 진피 키트, 피부 치료, 의학적 이식, 피부접촉물질에 대한 피부독성 검사 및 화장품 효능 검사에 사용될 수 있을 뿐 아니라 생리학적, 분자학적 연구에도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

조류 콜라겐을 포함하는 인공피부 및 이의 제조방법 {Skin equivalent comprising avian collagen and the method preparing the same}
본 발명은 조류 콜라겐(avian collagen)을 포함하는 인공 피부 및 이의 제조방법으로서, 보다 구체적으로는 조류 콜라겐을 진피 대체물의 성분으로 사용하여 진피 속 섬유아세포의 증식을 유도하고 그로 인한 표피 속 각질형성세포의 증식을 높이는 인공피부에 관한 것이다.
피부는 인체 체표면 전체를 덮고 있는 가장 큰 장기로서 성인의 경우 그 면적이 약 1.2 ∼ 2.3 m2에 이른다. 또한, 피부는 상층부의 표피(epidermis), 표피층 하단부의 기저막(basement membrane), 및 진피(dermis)로 구성되며, 진피의 두께는 부위에 따라 많은 차이가 있지만 표피의 약 3배로 알려져 있다. 표피 조직은 생화학적/형태학적 특성에 따라 구분된 4개의 세포층으로 구성되어 있는데, 기저막에 접한 제일 하단부로부터 기저층(stratum basalis, basal cell layer), 유극층(stratum spinosum, spinous cell layer), 과립층(stratum granulosum, granular cell layer), 및 각질층(stratum corneum)으로 계층화되어 있어 피부 표면에는 최종 분화된 죽은 세포가 여러 겹으로 쌓여 보호막 기능을 수행하게 된다.
구체적으로, 기저막은 제4형 콜라겐 lattice에 라미닌 및 여러 세포외기질 물질이 침착된 얇은 막 형태로 기저층의 세포가 부착하고 있으며, 상처가 나면 기저막의 분해가 동반되어 기저층의 세포가 진피의 제1형 콜라겐과 접하게 되며 이때 α2β1 integrin 등을 이용하여 표피세포가 측면으로 이동하여 재상피화 (re-epithelialization)를 유도하게 된다. 또한, 진피는 상층부의 섬유아세포(fibroblast)가 풍부하고 미세 혈관이 분포하는 유두층(papillary layer)과 두꺼운 콜라겐 섬유가 풍부한 세망 결합 조직(reticular connective tissue)으로 구성되어 있으며, 모낭 및 여러 피부 부속 기관은 진피 깊숙이 위치하고 있어, 부분층 피부손상(partial thickness wound)처럼 표피층이 소실된 경우에도 모낭에서부터 표피세포가 자라 나와서 재상피화를 유도하게 된다.
인공피부는 피부 기능의 일부를 대신할 수 있도록 인체에 적응시킨 인공 장기라고 말할 수 있는데, 임상학적으로 볼 때 일시적으로 손상된 부위의 보호를 목적으로 하는 창상피복제(wound dressing)와 정상피부에서 채취한 섬유아세포 혹은 표피 세포를 생체 내에서 배양한 배양 피부(cultured skin equivalent)라고 하는 두 가지로 크게 나눌 수 있다.
구체적으로, 창상피복제는 화상이나 외상 등에 의해 손상을 입은 피부가 회복할 때까지 일시적으로 환부를 보호하는 것으로, 체내로부터의 수분 누출을 방지하고 삼출액을 흡수하며, 외부로부터 잡균의 침입 및 감염을 방지하는 역할을 한다. 창상 피복제로는 겔을 응용한 것 이외에 폴리우레탄막 또는 천연 다당류인 키틴 등을 이용한 다공성 막이나 돼지가죽의 동결건조물 등으로 제조되어 여러 가지 제품이 임상적으로 사용되고 있다.
한편, 배양피부는 기저막을 완전하게 보존하고 있는 상태로 이식이 가능하기 때문에 이식 후에 빠른 시일 내에 기저막의 재건이 기대되고, 통상 1회 시술로 자가이식하는 면적은 체표면적의 15% 정도이기 때문에 배양피부의 공급이 가능하지만, 그 안전성에 있어서 많은 검토가 필요하며, 제조회사에 따라 약간의 차이는 있지만, 안전성 평가(박테리아, 진균류)와 내독성 및 mycoplasma 시험을 통해 안정성 및 안전성을 검증해야 한다.
인공피부로 연구되고 있는 것 중에는 실리콘 가아제, 가교 폴리비닐알코올 스폰지, 특수직물(폴리아미드 섬유, 폴리에스테르 섬유, 폴리프로필렌 섬유, 레이온 섬유 등을 재료로 한 velour), 또한, 이와 같은 특수직물에 특정 단백질을 피복한 것, 실리콘 고무로 된 막, 피브린 막, 셀룰로오스 막 등이 있으나 생체와의 거부반응, 기계적 성질, 및 밀착성의 결여 등의 문제점으로 인공피부로서의 충분한 기능을 발휘하지 못하고 있다.
한편, 인공피부는 주위의 자가 세포에 의한 재생능력을 상실한 광범위한 3도 이상의 화상이나, 당뇨병 등으로 인한 피부 궤양, 의약품 또는 화장품의 효능 실험 등에 사용된다. 인공피부는 손상된 인간의 피부를 대체할 수 있는 피부 대용품으로써 피부 치료나 이를 위한 의약품개발 또는 화장품의 효능을 시험하기 위한 실험재료로 매우 중요하다.
따라서, 이와 같은 활용을 위해서는 자연 피부층을 모방한 구조를 갖는 인공피부의 개발이 요구되며, 현재까지 개발된 인공피부 모델 중 대표적인 방법으로는 표피가 제거된 진피위에 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(reconstructed epidermis on de-epidermized dermis, RE-DED)과 섬유아세포가 포함된 콜라겐 기질 위에서 인체 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법이 있다. 특히, 유럽의 경우 2013년부터 동물실험을 통해 만든 화장품의 판매가 전면 금지되었기 때문에, 유명 해외 화장품업체들은 인공피부 개발에 많은 투자를 하고 있는 실정이다. 예를 들면, 프랑스의 로레알이 자체 개발한 '에피스킨'은 동물실험을 완전히 대체가능한 인공피부로 유럽 표준을 통과했으며, 미국 '마텍'에서 개발한 '에피덤'은 실제 사람 피부에 비해 너무 민감한 반응을 보여 조건부 승인을 받은 상태이다.
그러나, 지금까지 개발된 인공피부의 경우 진피를 모방한 콜라겐 겔과 표피를 모방한 표피층 사이에 기저막이 충분히 형성되지 못하는 단점이 있으며, 초대배양(primary culture) 을 실시함으로써 비용이 많이 들고, 대량 생산이 어렵다는 점 등의 문제점을 안고 있는 바, 효과적인 인공피부의 개발이 주요한 과제의 대상(한국 특허공개번호 10-2011-0032381)이 되고 있으나, 이에 대한 연구는 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물 및 인공피부에서 섬유아세포 증식, 생존률 증가, 및 각질형성세포 증식을 각각 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는, 인공피부를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기의 인공피부를 포함하는 피부독성 테스트용 분석키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 콜라겐 기질에 섬유아세포를 첨가하여 진피 대체물을 준비하는 단계; 상기 준비된 진피 대체물을 배양하여 굳히는 단계; 및 상기 제조된 진피 대체물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하여 중층화하는 단계를 포함하는, 인공피부의 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 진피 대체물은 쥐꼬리 콜라겐 및 섬유아세포를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는, 인공피부를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 진피 대체물은 쥐꼬리 콜라겐 및 섬유아세포를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 진피 대체물은 콜라겐 기질 1 mL당 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 진피 대체물상에 배양된 각질형성세포의 수는 진피 대체물 6cm2 당 10,000 내지 100,000,000 개일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 인공피부는 피부 연구 또는 피부 독성 검사에 사용되는 것이거나, 의학적 이식용으로 적용되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 인공피부를 포함하는 피부독성 테스트용 분석키트를 제공한다.
본 발명은 a) 조류 콜라겐 기질에 섬유아세포를 첨가하여 진피 대체물을 준비하는 단계; b) 상기 준비된 진피 대체물을 배양하여 굳히는 단계; 및 c) 상기 제조된 진피 대체물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하여 중층화하는 단계를 포함하는 인공피부의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 a) 단계에서, 상기 진피 대체물은 쥐꼬리 콜라겐 및 섬유아세포를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 a) 단계에서, 상기 진피 대체물은 콜라겐 기질 1 mL 당 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 c) 단계에서는 b) 단계를 통하여 제조된 진피 대체물 6 cm2당 각질형성세포 10,000 내지 100,000,000개를 접종 및 배양하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 조류 콜라겐(avian collagen)을 포함하는 진피 대체물 및 인공피부는 제조비용이 저렴할 뿐만 아니라, 종래 인공피부와 비교하여, 알레르기 반응과 같은 부작용이 적고 글루탐산과 아스파트산과 같은 아미노산이 풍부한 조류 콜라겐을 사용하여, 진피 속 섬유아세포의 증식을 유도하고, 그로 인한 표피 속 각질 형성세포의 증식을 높이는 우수한 효과를 확인하였는바, 진피 키트, 피부 치료, 의학적 이식, 피부접촉물질에 대한 피부독성 검사 및 화장품 효능 검사에 사용될 수 있을 뿐 아니라 생리학적, 분자학적 연구에도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물(1% avian, 10% avian)과 대조군(control)간 섬유아세포의 증식률을 비교한 결과이다.
도 2는 조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물(1% avian, 10% avian)과 대조군(control)간 섬유아세포의 생존률을 비교한 결과이다.
도 3은 동결 전(A)과 동결 후 녹인(B) 조류 콜라겐을 포함하는 인공피부(1% avian, 10% avian)와 대조군을 육안으로 관찰한 결과이다.
도 4는 동결 전(A)과 동결 후 녹인(B) 조류 콜라겐을 포함하는 인공피부(1% avian, 10% avian)와 대조군(control)을 Hematocylin & Eosin　(H&E) 염색하여 200배율로 관찰한 결과이다.
도 5는 동결 전 조류 콜라겐을 포함하는 인공피부(1% avian, 10% avian)와 대조군(control)간 PCNA, involucrin, p63, integrin α6 및 integrin β1의 발현양상을 관찰한 결과이다.
도 6은 동결 후 녹인 조류 콜라겐을 포함하는 인공피부(1% avian, 10% avian)와 대조군(control)간 PCNA, involucrin 및 integrin β1의 발현양상을 관찰한 결과이다.
본 발명자들은, 조류 콜라겐(avian collagen)을 포함하는 진피 대체물을 제조하였으며, 상기 진피 대체물에서의 우수한 섬유아세포 증식률과 생존률을 확인하였다. 또한, 상기 진피 대체물 위에 각질형성세포를 배양시킴으로써, 조류콜라겐을 포함하는 인공피부를 제조하였으며, 상기 인공피부에서의 우수한 각질형성세포 증식 및 증식과 관련 사이토카인의 증가 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물과 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는 인공피부를 제공한다.
본 발명의 진피 대체물 및 인공피부에 있어서, 상기 콜라겐은 그 종류에 제한은 없으나, I형, III형 또는 IV형 콜라겐이 바람직하고, 이 중에서도 진피의 대부분을 차지하는 I형 콜라겐이 제일 바람직하다. 또한, 조류 콜라겐이 포함됨으로써 섬유아세포의 성장을 촉진할 수 있으며, 이에 각질형성세포 성장을 위한 사이토카인을 분비하여 각질형질세포 증식을 촉진하므로 생체 피부와 유사한 성상의 인공 피부 제조를 위한 재료로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 진피 대체물은 쥐꼬리 콜라겐 및 섬유아세포를 더 포함할 수 있으며, 상기 진피 대체물 제조 시, 섬유아세포는 바람직하게는 10,000 내지 100,000,000 개, 보다 바람직하게는 100,000 내지 10,000,000 개가 접종되어 배양될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 인공 피부는 상기 진피 대체물 및 배양된 각질형성세포를 포함할 수 있으며, 상기 인공피부 제조 시, 각질형성세포는 상기 진피 대체물상에 배양되며, 생체 피부와 동등 내지 유사한 성상의 피부를 만들기 위하여, 상기 진피 대체물 6 cm2 당 각질형성세포 10,000 내지 100,000,000 개, 보다 바람직하게는 100,000 내지 10,000,000 개가 접종되어 배양될 수 있다.
한편, 본 발명의 일실시예에서는 조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물을 제조하여(실시예 1 참조), 섬유아세포의 증식률과 생존률 증가를 확인하였고(실시예 2 참조), 상기 진피 대체물 위에 각질형성세포를 배양시킨 인공피부를 제조하여(실시예 3 참조), 동결 전 또는 동결 후 녹인 인공피부에서의 각질형성 세포 증식 촉진 효과와 이와 관련된 사이토카인인 PCNA, involucrin, p63, integrinα6 및 integrin β1의 발현 증가를 확인하였는바(실시예 4 참조), 피부 연구 또는 피부접촉 물질에 대한 피부 독성 검사에 사용될 수 있을 뿐 아니라, 의학적 이식에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다. 상기 피부접촉물질은 외용 제재, 화장품, 섬유, 또는 세제 등의 피부에 접촉하는 모든 물질을 총칭한다.
이에 더하여, 본 발명은 상기 인공피부를 포함하는 피부독성 테스트용 분석키트를 제공한다. 상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 키트를 이용함으로써 검증하려는 시료에 대한 진피 또는 표피에 미치는 영향을 간이 신속하게 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명은 콜라겐 기질에 조류 콜라겐을 더하고 섬유아세포가 포함된 진피 대체물 상에 각질형성세포를 배양하는 단계를 포함하는 인공피부의 제조 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 제조 방법은 콜라겐과 조류콜라겐으로 구성된 기질에 섬유아세포를 첨가하여 진피 대체물을 제조하고, 상기 진피 대체물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 섬유아세포와 각질형성세포에는 통상적으로 사용되는 세포주가 사용될 수 있고, 바람직하게는 인간의 피부조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 세포의 분리 및 배양 방법에는 특별한 제한이 없으며, 통상적으로 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 진피 대체물 상에서의 각질형성세포 배양시, 배양 온도는 35 내지 40 ℃, 바람직하게는 약 37℃로 할 수 있으며, 초기 16 내지 24 시간동안은 배지에 침지시켜 배양하고, 그 후 12 내지 14일 동안은 공기중에 노출시켜 배양할 수 있다. 이와 같이 침지 배양 후 공기 중에 노출하여 배양함으로써, 각질형성세포가 중층화되어 여러 층을 이루게 되고, 실제 피부와 유사한 중층화된 형태의 인공 피부를 얻을 수 있다. 상기 배양에 사용된 배지는 상기 세포 배양에 통상적으로 사용되는 모든 배지를 사용할 수 있으며, 본 발명의 구체예에 있어서, KGM, 또는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물의 제조 및 배양
조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물을 제조하기 위해서, 쥐꼬리에서 분리한 콜라겐을 농도가 10 mg/ml이 되도록 4℃의 0.1% acetic acid에 넣고 일주일 동안 교반하여 Ⅰ형 콜라겐을 추출하였다. 또한, 조류 콜라겐은 닭발 3 kg을 물 10 L와 120℃에서 7시간 30분 동안 중탕을 한 후, 48 시간 동안 저온에서 진공농축을 하여 냉동 보관을 하였으며(시원생약 (주), 충북 진천), 조류 콜라겐은 각각 부피농도 1%와 10% 되도록 4℃의 0.1% acetic acid에 넣고 똑같이 일주일 동안 교반하여 Ⅰ형 콜라겐을 추출하였다.
이후, 쥐꼬리에서 분리한 콜라겐과 10 x 완충액 (0.05 N NaOH, 0.26 mM NaHCO3,200 mM HEPES)과 10 x 배양액 (DMEM:Ham's nutrient mixture F12 = 3 : 1)을 준비하여 8 : 1 : 1 (Control)의 부피비율로, 쥐꼬리에서 분리한 콜라겐과 10 x 완충액과 10 x 배양액과 1% 조류콜라겐을 7 : 1 : 1 : 1 (1% avian)의 부피비율로, 쥐꼬리에서 분리한 콜라겐과 10 x 완충액과 10 x 배양액과 10% 조류콜라겐을 7 : 1 : 1 : 1 (10% avian)의 부피비율로 혼합하여 세 종류의 진피 기질을 준비하였다. 또한, 각각 다른 조성의 기질 3 ml에 3 x 105개의 섬유아세포를 각각 혼합하여 24 mm transwell (Corning, Inc., USA)에 분주하고, 37℃, 5% CO2로 설정한 배양기에 넣어 굳힘으로써, 진피 대체물을 제조하였다.
실시예 2. 진피 대체물에서의 섬유아세포의 증식률과 생존률 확인
실시예 1에 의한 세 종류의 기질 1 ml에 1x105개의 섬유아세포를 함께 섞어 일주일 동안 배양 후 5 mg/ml의 MTT 시약을 100 ㎕/well 넣어 4 시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 이 후, 1 ml의 DMSO로 추출하고 540 nm의 파장에서 측정을 하여 증식률을 확인하였다. 또한, 상기 세 종류의 진피 대체물을 -70℃에서 5 일간 동결 후, 녹여서 마찬가지로 MTT 측정을 하여 생존률을 확인하였다.
상기 실시예에서 섬유아세포 배양을 위하여, 섬유아세포주 CCD-25Sk cells을 사용하였으며, 10% FBS(소 태아 혈청)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, N.Y., USA) 배양액에서 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 7일 내지 10일로 하여 각각 배양하였다.
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 조류 콜라겐을 포함한 진피 대체물(1% avian, 10% avian)에서 대조군과 비교하여 유의적인 세포 증식률 및 생존률의 증가를 확인하였다. 또한, 10% 조류콜라겐을 포함하는 진피 대체물(10% avian)은 가장 높은 세포 증식률과 생존률을 나타내었다.
실시예 3. 조류 콜라겐을 포함하는 인공피부의 제조 및 배양
조류 콜라겐을 포함하는 인공피부를 제조하기 위해서, 실시예 2에서 제조한 세 종류의 진피 대체물 위에 1 x 106개의 각질형성세포를 각각 접종하여 인공피부를 제조하여 1일간은 침지시키고, 저농도 EGF (Recombinant Human Epidermal Growth Factor, Invitrogen Co., calsbad, CA) 1 ng/ml를 첨가하여 배양하였다. 이후, 12일 동안은 인공피부의 바닥을 제외하고 윗부분만을 공기에 노출시켜 배양하였다. 배양액으로는 DMEM과 햄스 영양 혼합물 F12 (Ham's nutrient mixture F12)를 3 : 1의 비율로 혼합한 용액에 5% FBS, 0.4 mg/ml 하이드로코르티손, 1 mg/ml 이소프로테레놀, 25 mg/ml 아스코르빈산, 5 mg/ml 인슐린이 포함된 혼합 용액에 고농도의 EGF (InvitrogenCo.,calsbad,CA) 10 ng/ml를 첨가하여 사용하였으며, 배양액은 일주일에 3회 교환하였다. 또한, 동결되었던 3종류의 진피 대체물도 녹여서 상기와 동일한 방법으로 제조 및 배양을 하여 인공피부를 제조하였다
상기 실시예에서 각질형성세포의 배양을 위하여, 각질형성 세포주 HaCaT cells을 사용하였으며, 10% FBS(소 태아 혈청)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, N.Y., USA) 배양액에서 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 7일 내지 10일로 하여 각각 배양하였다.
실시예 4. 인공피부에서의 각질형성세포 증식 확인
실시예 3에 의한 인공피부를 13일간 배양 후, 수축여부 등의 외관을 육안으로 확인하였으며, 10% 포름알데하이드에 고정시키고, 파라핀 블록으로 제조하였다. 이를 Hematocylin & Eosin　(H&E) 염색을 하여, 각질층 발달 및 기저막 형성을 확인하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 조류 콜라겐을 포함하는 인공피부(1% avian, 10% avian)는 동결 전(A)과 동결 후 녹인(B)경우 모두 대조군과 비교하여 육안 상에서 큰 변화가 없었으며, 1% 조류콜라겐을 포함하는 인공 피부는 10% 조류콜라겐을 포함하는 인공 피부(10% avian)와 비교하여, 상대적으로 수축이 적게 일어남을 확인하였다.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 조류 콜라겐이 포함된 인공피부(1% avian, 10% avian)는 대조군과 비교하여, 상피의 중층화, 각질층의 발달, 및 기저막 형성이 우수한 것으로 나타났다.
실시예 5. 인공피부에서의 면역조직화학 염색
실시예 3에 의한 인공피부의 각질형성세포 증식과 관련된 사이토카인의 발현양상을 확인하기 위하여, 면역조직화학 염색의 일차항체로서 동결 전 조류 콜라겐이 포함된 인공피부에 대해서는 세포증식 표지자인 PCNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-56, Santa Cruz, CA), 세포분화의 표지자인 involucrin (Sigma chemical, St. Louis, I9018, USA), 표피줄기세포의 표지자인 p63(Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-8431, Santa Cruz, CA), integrin α6 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-6597, Santa Cruz, CA) 및 integrin β1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-9970, Santa Cruz, CA) 항체를 이용하였으며, 동결 후 녹인 조류 콜라겐이 포함된 인공피부에 대해서는 PCNA, p63, integrin β1 항체를 이용하였다. 이후, 면역조직화학 염색은 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합 기법 (UltraVision Detection System Anti-Polyvalent, HRP/DAB, Thermo Scientific, Inc., Fremont, CA)을 사용하여 수행하였다.
도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 동결 전 조류 콜라겐을 포함하는 인공피부(1% avian, 10% avian)에서 대조군과 비교하여 표피관련 인자인 PCNA, involucrin, p63, integrin α6 및 integrin β1의 증가를 확인하였으며, 동결 후 녹인 조류 콜라겐을 포함하는 인공피부(1% avian, 10% avian)에서 대조군과 비교하여 표피관련 인자인 PCNA, involucrin 및 integrin β1의 증가를 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

  1. 조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 진피 대체물은 쥐꼬리 콜라겐 및 섬유아세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 진피 대체물.
  3. 조류 콜라겐을 포함하는 진피 대체물 및 상기 진피 대체물 상에 배양된 각질형성세포를 포함하는, 인공피부.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 진피 대체물은 쥐꼬리 콜라겐 및 섬유아세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 인공피부.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 진피 대체물은 콜라겐 기질 1 mL당 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인공피부.
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 진피 대체물상에 배양된 각질형성세포의 수는 진피 대체물 6cm2 당 10,000 내지 100,000,000 개인 것을 특징으로 하는, 인공피부.
  7. 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인공피부는 피부 연구 또는 피부 독성 검사에 사용되는 것을 특징으로 하는, 인공피부.
  8. 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인공피부는 의학적 이식용으로 적용되는 것을 특징으로 하는, 인공 피부.
  9. 제 3항의 인공피부를 포함하는 피부독성 테스트용 분석키트.
  10. a) 조류 콜라겐 기질에 섬유아세포를 첨가하여 진피 대체물을 준비하는 단계;
    b) 상기 준비된 진피 대체물을 배양하여 굳히는 단계; 및
    c) 상기 제조된 진피 대체물 상에 각질형성세포를 접종하고 배양하여 중층화하는 단계를 포함하는, 인공피부의 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 a) 단계에서, 상기 진피 대체물은 쥐꼬리 콜라겐 및 섬유아세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 a) 단계에서, 상기 진피 대체물은 콜라겐 기질 1 mL 당 섬유아세포 10,000 내지 100,000,000 개를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 c) 단계에서는 b) 단계를 통하여 제조된 진피 대체물 6 cm2당 각질형성세포 10,000 내지 100,000,000개를 접종 및 배양하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.














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