ES2710577T3 - Modelo de cuero cabelludo reconstruido, y procedimiento para cribar moléculas activas - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para preparar un equivalente de cuero cabelludo, caracterizado por que queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo se siembran y se cultivan en un equivalente dérmico, comprendiendo el mencionado equivalente dérmico colágeno y fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de obtener dichos queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo a partir de una muestra de cuero cabelludo, y retirar previamente los queratinocitos de la vaina epitelial externa.

Description

DESCRIPCION
Modelo de cuero cabelludo reconstruido, y procedimiento para cribar moleculas activas
La presente invencion se refiere a un modelo de cuero cabelludo reconstruido, al procedimiento para prepararlo, y a su uso para evaluar el efecto de productos topicos cosmeticos, farmaceuticos o dermatologicos.
El cuero cabelludo reconstruido segun la invencion tambien se puede usar para la preparacion de injertos destinados a ser transplantados en mairnferos, mas particularmente en pacientes humanos, tales como las personas que sufren quemaduras de tercer grado.
En anos recientes se han desarrollado modelos de piel reconstruida, que son mas o menos similares a la piel humana. Los ejemplos de modelos de piel reconstruida que se pueden mencionar incluyen los modelos descritos en los siguientes documentos: EP 0285471, EP 0285474, EP 0418035, WO 90/02796, WO 91/16010, EP 0197090, EP 0020753, FR 2665175, FR 2689904. Estos modelos hacen posible en primer lugar realizar estudios necesarios para una mejor comprension del papel de la piel tanto en el campo mecanico como en el campo fisiologico, y en segundo lugar constituyen ensayos predictivos de la actividad de agentes activos cosmeticos y/o farmaceuticos o de los efectos secundarios de los ingredientes topicos.
El solicitante ha observado que estos modelos son adecuados para estudios relacionados con la piel del cuerpo humano, pero que no son ideales para estudios relacionados con una piel espedfica, el cuero cabelludo. Segun el conocimiento del solicitante, hasta la fecha no se ha propuesto ningun modelo de cuero cabelludo reconstruido. El cuero cabelludo es la parte de la piel situada bajo el cabello, es decir, sobre el craneo. En un adulto, su area puede oscilar entre 650 y 700 cm2. Tiene una estructura convencional, pero tiene varias caractensticas importantes que lo distinguen de la piel de otras partes del cuerpo humano:
- su epidermis es mas gruesa, debido a una renovacion mas rapida de estas celulas,
- su estrato corneo es mas grueso, pero desorganizado,
- las actividades de sus folfculos capilares son mayores debido a su mayor presencia (alrededor de 200 a 300 folfculos/cm2),
- la produccion de sus glandulas sebaceas es intensa, y la actividad de sus glandulas sudonparas es elevada, lo que permite su colonizacion bacteriana y fungica sustancial.
En general, los modelos de piel reconstruida descritos en los documentos mencionados anteriormente se preparan a partir de fibroblastos de las papilas dermicas o de la vaina conjuntiva y/o celulas tomadas de la vaina epitelial externa (tambien conocida como la ORS por Vaina Radicular Externa) debido a la facilidad de produccion de estas celulas. Espedficamente, estas celulas son eliminadas cuando se tira del cabello, y son capaces de fabricar una epidermis cuando se colocan sobre un soporte, habitualmente un equivalente dermico, y se cultivan en un medio de cultivo adecuado. Sin embargo, el tejido que se obtiene cultivando las celulas de las papilas dermicas muestra una expresion de macromoleculas (especialmente colageno) que no se corresponde con la de un cuero cabelludo in vivo. El tejido que se obtiene cultivando las celulas de la ORS tampoco tiene las caractensticas de un cuero cabelludo. Ademas, no se observara el fenomeno normal de descamacion que tiene lugar en un cuero cabelludo in vivo, puesto que, ya que las celulas de la ORS nunca han estado en contacto con el aire, no se descaman. El modelo asf obtenido no puede ser usado por lo tanto para reproducir in vitro la aparicion de caspa. Finalmente, los tamanos y morfologfas de las epidermis y dermis obtenidas usando estas diversas celulas no seran los mismos que aquellos de las epidermis y dermis del cuero cabelludo: en el caso del cuero cabelludo, la dermis es mas gruesa y esta mas invaginada que en el caso de la piel.
El solicitante ha demostrado, sorprendentemente, que el cultivo de celulas interfoliculares del cuero cabelludo hace posible desarrollar un modelo de cuero cabelludo reconstruido que tiene la mayona de las caractensticas de un cuero cabelludo in vivo.
Una caractenstica de este modelo de cuero cabelludo es la expresion, en las capas suprabasales finales, es decir, en las capas granulares de la epidermis, de involucrina y queratina K10 (vease especialmente la figura 1). Las celulas de la capa granular estan situadas por debajo del estrato corneo. La capa granular (o estrato granuloso) esta formada por tres capas de queratinocitos aplanados, con un nucleo denso con forma oval. La expresion tardfa de involucrina y de queratina K10 se encuentra en un corte en rodaja de cuero cabelludo obtenido a partir de una muestra tomada durante el “lifting", mientras que, en un corte en rodaja de piel reconstruida, la expresion de estos marcadores se observa a lo largo de las capas suprabasales, es decir, en las celulas de la capa de la sustancia mucosa malpigiana (que constituye el estrato espinoso). Esto demuestra que el modelo de cuero cabelludo segun la invencion tiene las especificidades de un cuero cabelludo in vivo.
Estas caractensticas hacen posible, en particular, distinguir un modelo de cuero cabelludo obtenido segun el procedimiento de la invencion con respecto a modelos de piel reconstruida estandar.
De este modo, el solicitante ha desarrollado un nuevo procedimiento para preparar un equivalente de cuero cabelludo.
El solicitante aislo celulas interfoliculares del cuero cabelludo, y tiene la idea de usarlas para desarrollar un equivalente de cuero cabelludo.
La expresion “equivalente de cuero cabelludo”, tambien denominada aqu mas abajo como modelo de cuero cabelludo, significa el montaje de un equivalente epidermico de cuero cabelludo que descansa sobre un equivalente dermico de cuero cabelludo. Esta es una estructura producida in vitro via un procedimiento tecnico.
De este modo, la presente solicitud describe un procedimiento para preparar un equivalente de cuero cabelludo, que comprende una etapa de sembrar y una etapa de cultivar queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo sobre un equivalente dermico, comprendiendo el mencionado equivalente dermico colageno y fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo.
En particular, la presente invencion se refiere a un procedimiento para preparar un equivalente de cuero cabelludo, caracterizado por que se siembran y cultivan sobre un equivalente dermico queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo, comprendiendo el mencionado equivalente dermico colageno y fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de obtener dichos queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo a partir de una muestra del cuero cabelludo de la que se han retirado previamente los queratinocitos de la vaina epitelial externa.
Los equivalentes dermicos se pueden preparar segun diversos procedimientos, por ejemplo aquellos descritos en los documentos EP 0418035, WO 00/29553 o EP 0285471, teniendo cuidado de usar los fibroblastos mencionados anteriormente.
Los equivalentes dermicos que se pueden mencionar incluyen redes mixtas de colageno/fibroblastos, dermis a la que se ha retirado previamente la epidermis, membranas artificiales, por ejemplo filtros de la marca Millipore, sustratos subcutaneos a base de colageno, plastico o cualquier otro soporte que sea compatible con la viabilidad celular. Preferentemente, el equivalente dermico segun la invencion esta en forma de una red de colageno o una esponja de colageno.
La expresion “red de colageno” es bien conocida en la tecnica anterior (Bell et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 76, No. 3, p. 1274-1278), y representa un modelo conocido de equivalente dermico que se ha usado durante decadas.
Preferentemente, segun la invencion, la red se prepara segun el metodo descrito por Asselineau et al., 1987 (Models in dermato., vol. III, Ed Lowe & Maibach, 1-7).
La expresion “esponja de colageno” es tambien conocida para los expertos en la tecnica. Representa biopolfmeros a base de colageno (por ejemplo: Mimedisk®, vendido BASF Beauty Care).
Segun la invencion, el colageno puede ser cualquier tipo de colageno de cualquier origen. A este respecto, se hara referencia a los diversos tipos de colageno mencionados en las revisiones de Van der Rest y Garonne, 1990, Biochem., vol. 72, 473-484 o 1991, Faseb Journal, vol. 5, 2814-2823. De este modo, segun la invencion, el colageno se escoge preferiblemente de colagenos fibrilares de tipo I, III o V.
Preferentemente, segun la invencion, se usa colageno de origen animal, y particularmente colageno de origen bovino.
El colageno usado preferentemente segun la invencion es colageno de tipo I. Lo mas preferente segun la invencion, se usa colageno bovino de tipo I. Obviamente, segun la invencion, se puede usar una mezcla de diferentes tipos de colageno en cualquier proporcion y/o de ongenes diferentes.
Preferentemente, el equivalente dermico es una red de colageno contrafda, y la siembra con queratinocitos se lleva a cabo preferentemente despues de 2 a 6 dfas, mas preferentemente despues de 3 a 5 dfas, e incluso mas preferentemente despues de 3 dfas de contraccion de la red. La contraccion del gel de colageno es debida preferentemente a la accion de los fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo en el colageno.
Los fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo y/o los queratinocitos se afslan preferentemente, de forma respectiva, a partir de la dermis y a partir de la epidermis obtenidas a partir de una muestra de cuero cabelludo. Los queratinocitos de la vaina epitelial externa se habran retirado previamente de esta muestra, por ejemplo depilando el cabello en la mencionada muestra. La depilacion del cabello en la muestra de cuero cabelludo, por ejemplo usando pinzas, se realizara para retirar totalmente de la muestra los queratinocitos de la vaina epitelial externa.
Los queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo se obtienen preferentemente via las siguientes etapas:
- separar la dermis del cuero cabelludo de la epidermis mediante tratamiento proteolftico de una muestra de cuero cabelludo, y en particular colocando una muestra de cuero cabelludo en contacto con dispasa o termolisina,
- recuperar la epidermis del cuero cabelludo,
- colocar la epidermis del cuero cabelludo asf obtenida en contacto con tripsina,
- recuperar los queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo, y
- cultivar los queratinocitos asf obtenidos.
Los queratinocitos se amplifican antes de la siembra segun la tecnica de Rheinwald y Green (Cell, vol. 6, 331-344, 1975) cultivando sobre un soporte nutriente que consiste en fibroblastos en un medio adecuado conocido por los expertos en la tecnica, en presencia de factores de crecimiento, especialmente aminoacidos, suero, toxina del colera, insulina, triyodotironina, y disolucion amortiguadora del pH. En particular, tal medio de cultivo puede contener especialmente al menos un factor de crecimiento mitogenico para queratinocitos (por ejemplo factor de crecimiento epidermico (EGF) y/o factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), en particular KGF), insulina, hidrocortisona, y opcionalmente un antibiotico (por ejemplo: gentamicina o anfotericina B).
Ventajosamente, el mencionado medio tambien puede comprender suero o un extracto de la pituitaria, por ejemplo de origen bovino, epinefrina, transferrina y/o aminoacidos no esenciales.
Los fibroblastos usados para este cultivo seran mas preferentemente fibroblastos 3T3. Los fibroblastos 3T3 son bien conocidos por aquellos expertos en la tecnica. Esta es una estirpe celular fibroblastica que se conoce desde 1962. “3T3” significa “inoculo de 3x105 celulas de 3 dfas de transferencia”.
El cultivo de los queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo es preferentemente un cocultivo con fibroblastos (preferentemente fibroblastos 3T3) cuya proliferacion se ha detenido previamente, preferentemente irradiandolos previamente (por ejemplo con UV) o tratandolos previamente con mitomicina. La mitomicina (en particular mitomicina C) bloquea la proliferacion de estas celulas sin, sin embargo, evitar que produzcan las sustancias nutrientes que son utiles para la proliferacion de queratinocitos.
Segun otra realizacion, los queratinocitos se amplifican antes de la siembra cultivandolos en un medio de cultivo que se ha tratado o suplementado con fibronectina (por ejemplo una caja de cultivo “revestida con fibronectina”) o con colageno (por ejemplo una caja de cultivo “revestida con colageno de tipo I”), o en un medio de cultivo rico tal como el medio Epilife® (Gibco).
La dispasa (tambien conocida como proteasa neutra) es una enzima que pertenece a la familia de proteasas, que tiene la capacidad de escindir fibronectina y colagenos de tipo I y IV.
Los queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo se obtienen preferentemente via las siguientes etapas:
- separar la dermis del cuero cabelludo de la epidermis mediante tratamiento proteolftico de una muestra de cuero cabelludo, y especialmente colocando una muestra de cuero cabelludo en contacto con dispasa o termolisina,
- recuperar la dermis del cuero cabelludo,
- colocar la dermis del cuero cabelludo asf obtenida en contacto con colagenasa y/o tripsina,
- recuperar los fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo, y
- cultivar los fibroblastos asf obtenidos.
Se entiende claramente que las enzimas mencionadas anteriormente se usan en concentraciones, conocidas por los expertos en la tecnica, que les permiten tener los efectos deseados. Preferentemente, sera la dispasa la que se usara para separar la dermis del cuero cabelludo de la epidermis. La tripsina (Gibco) hara posible obtener una suspension de queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo a partir de la epidermis del cuero cabelludo. La colagenasa (Boehringer) y/o la tripsina haran posible obtener una suspension de fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo a partir de la dermis del cuero cabelludo.
La recuperacion de los queratinocitos o fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo se lleva a cabo preferentemente mediante filtracion de la suspension obtenida via la accion de tripsina o colagenasa, seguido de centrifugacion, en las condiciones conocidas por aquellos expertos en la tecnica, y resuspension del pelete de la centrifugacion.
Mas particularmente, el procedimiento segun la invencion incluye:
a - sembrar con los queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo una red de colageno que descansa sobre un soporte inmerso en un medio de cultivo;
b - multiplicar los queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo en la superficie de la mencionada red de colageno;
c - elevar el mencionado soporte de manera que el medio de cultivo no cubra la cara superior del equivalente epidermico durante la produccion.
En particular, el soporte puede ser una rejilla de soporte.
El equivalente dermico segun la invencion se obtiene, en particular, sembrando un medio de cultivo con fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo, seguido de la adicion de colageno.
El procedimiento segun la invencion puede comprender las siguientes etapas de cultivo:
a) celulas contractiles cosechadas, por ejemplo, a partir de cultivos monocapa producidos en un medio nutriente sembrado con fragmentos de tejido animal o humano con
b) un medio nutriente suplementado con componentes de la matriz extracelular dermica, en particular con colageno,
formando la mencionada mezcla un gel que se contrae, que expele el medio nutriente para formar el equivalente dermico, y en particular la red de colageno contrafda.
Como celula contractil, se usaran fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo obtenidos a partir de donantes humanos sanos y cosechados a partir de cultivos monocapa, mediante tripsinizacion controlada o usando colagenasa.
La implementacion del procedimiento de preparacion segun la invencion consiste en sembrar el equivalente dermico - o sustrato dermico - con queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo.
Se mantienen las condiciones que permiten la multiplicacion de los queratinocitos en la superficie de dicho sustrato, promoviendose el desarrollo de este cultivo de queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo mediante el uso de al menos un medio nutriente mmimo, preferiblemente un medio 3F como se describe en el Ejemplo 1, en contacto con los mencionados queratinocitos.
Ventajosamente, tras sembrar los queratinocitos en el sustrato, el sustrato implantado se mantiene, preferiblemente durante un tiempo entre 5 y 7 dfas, mediante inmersion en este medio nutriente que cubre los queratinocitos.
A continuacion, el equivalente dermico se pone en contacto con el aire. Para esto, se coloca sobre una rejilla de soporte que se eleva con respecto a la base del receptaculo, y se ajusta el nivel del medio nutriente, de manera que la rejilla de soporte esta cubierta pero el medio nutriente no cubre la cara superior del equivalente de piel durante la produccion.
Segun el procedimiento de la invencion, el equivalente dermico contrafdo, sembrado con los queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo, se cultiva asf preferentemente durante 5 a 7 dfas por inmersion en un medio de cultivo, seguido de la emersion durante 5 a 7 dfas en un soporte adecuado.
El equivalente de cuero cabelludo segun la invencion asf constituido esta bien diferenciado y bien organizado. Tambien es globalmente homogeneo.
Segun una variante del procedimiento segun la invencion, es posible obtener un equivalente de cuero cabelludo, que comprende cabello, implantando en el mencionado equivalente de cuero cabelludo dermico (en particular en la red de colageno), que se ha contrafdo o que esta en vfas de contraerse, fibroblastos del cabello escogidos de fibroblastos de la papila dermica y/o fibroblastos de la vaina conjuntiva, y/o papilas dermicas completas y/o vainas conjuntivas y/o fracciones de vainas conjuntivas. Esta implementacion puede tener lugar, por ejemplo, usando una jeringuilla. Estos fibroblastos capilares, las papilas dermicas completas, las vainas conjuntivas, y/o las fracciones de vainas conjuntivas, se anadiran despues de que los fibroblastos interfoliculares hayan comenzado su accion sobre el colageno. Por lo tanto, esta adicion no tiene lugar al mismo tiempo que los fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo. Los fibroblastos capilares se anadiran preferentemente en una cantidad de 1000 a 10000 celulas, es decir, una proporcion de aproximadamente 1 a 10 fibroblastos capilares por 100 fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo.
Al implantar los fibroblastos capilares, tales como los fibroblastos de la papila o los fibroblastos de la vaina conjuntiva o de la papila completa o de la vaina conjuntiva o fracciones de la vaina conjuntiva, en el equivalente dermico, los queratinocitos reproduciran la morfogenesis del pelo corporal o del cabello (tallo del cabello) (Reynolds A.J., Lawrence C.M., Jahoda C.A., Human hair follicle germinative epidermal cell culture. J. Invest. Dermatol. 1993 Oct.; 101 (4): 634-8).
La presente solicitud tambien describe un equivalente de cuero cabelludo que se puede obtener via el procedimiento segun la invencion. Este equivalente de cuero cabelludo exhibe la expresion de involucrina y/o de queratina K10 en sus capas granulares, que es una expresion comparable a aquella de un cuero cabelludo in vivo. La expresion “expresion comparable” significa una expresion de los genes que codifican estas protemas, que tiene lugar en las celulas situadas en el mismo sitio como en el tejido in vivo y/o con la misma intensidad.
Dado que el equivalente de cuero cabelludo tiene las caractensticas de un cuero cabelludo in vivo, se puede injertar de la misma manera y con el mismo exito que los injertos tomados de la nuca o de la region occipital del individuo a tratar. Las tecnicas de autoinjerto se describen, por ejemplo, por Bouhanna et al. (Dermatol. Surg.; Nov. 2003, 29(11), 1130-4). Tras un injerto, el equivalente de cuero cabelludo segun la invencion tiene asf la capacidad de sustituir apropiadamente la parte de cuero cabelludo original.
El equivalente de cuero cabelludo tambien encontrara aplicaciones para la preparacion de injertos destinados a tratar un trastorno cutaneo del cuero cabelludo, tal como una quemadura, un defecto de cicatrizacion, o canas, y destinados asf para ser transplantados en mairnferos, y mas particularmente en pacientes humanos, tales como las personas que padecen quemaduras de tercer grado. Un injerto se define como una parte de un tejido destinado al injerto.
De este modo, la presente solicitud describe un equivalente de cuero cabelludo como se define previamente, para su uso para tratar o en el tratamiento de uno de los trastornos cutaneos del cuero cabelludo mencionados anteriormente. Este equivalente de cuero cabelludo o injerto tendra caractensticas, en terminos de expresion de involucrina y de queratina K10, comparables a aquellas de un cuero cabelludo in vivo (es decir, expresion de involucrina y de queratina K10 en las capas granulares finales de la epidermis). La presente solicitud tambien describe asf el uso de un equivalente de cuero cabelludo como se describe previamente, para la fabricacion de un injerto para tratar uno de estos trastornos cutaneos del cuero cabelludo.
Independientemente de la variante del procedimiento adoptada para su preparacion, el equivalente de cuero cabelludo que se ha obtenido es un modelo tridimensional que es util como un ensayo alternativo para cualquier ensayo que requiriese experimentacion con animales, por ejemplo estudios sobre la liberacion de agentes activos, su penetracion cutanea y/o su absorcion y/o su biodisponibilidad, o estudios sobre la tolerancia, compatibilidad o eficacia de agentes activos y/o de ingredientes cosmeticos, farmaceuticos o dermatologicos.
De este modo, la presente solicitud tambien describe el uso de un equivalente de cuero cabelludo como se describe previamente, para ensayar la penetracion y/o absorcion cutaneas y/o biodisponibilidad y/o eficacia de compuestos sobre el cuero cabelludo, y/o para ensayar la tolerancia y/o la compatibilidad de compuestos con respecto al cuero cabelludo.
De este modo, este uso hace posible ver si un compuesto penetra en las diversas capas del cuero cabelludo, o si de hecho tiene el efecto deseado.
Este equivalente de cuero cabelludo es especialmente util para la identificacion de un compuesto que es un modulador del crecimiento capilar, y/o de moleculas que actuan sobre la calidad y homeostasis del cuero cabelludo, y especialmente sobre la descamacion del cuero cabelludo, el tratamiento de la caspa o de un cuero cabelludo sensible.
Ademas, puede permitir la busqueda de biomarcadores ligados al estado normal o patologico del cuero cabelludo. Una ventaja adicional reside en la posibilidad de estudiar la implementacion de folfculos pilosos, glandulas sudonparas o glandulas sebaceas, a fin de parecerse aun mas a un cuero cabelludo in vivo.
Este modelo es necesario a fin de inducir la formacion del cabello mediante inyeccion de celulas madre.
El modelo de cuero cabelludo reconstruido, segun la presente solicitud, puede hacer posible cuantificar la actividad de moleculas que son capaces de inducir la formacion de cabello a partir de celulas madre (por ejemplo, a partir de celulas del bulbo).
Los equivalentes de cuero cabelludo que comprenden folfculos capilares haran posible especialmente llevar a cabo la cinetica de crecimiento del pelo corporal o del cabello, y de este modo permitiran cualquier estudio que requiera numerosos cabellos vivos que sean tan completos como sea posible en un contexto in vivo, tal como el estudio del ciclo capilar o de los factores capaces de influir en este ciclo, hasta el estudio de agentes activos que promuevan el crecimiento del cabello, agentes activos para combatir la perdida del cabello, o agentes activos que ralenticen el crecimiento del cabello.
Los procedimientos de cribado del producto para identificar nuevos agentes activos incluyen una etapa (a) de colocar el mencionado producto de ensayo en contacto con un equivalente de cuero cabelludo segun la invencion, y despues, una etapa (b) de analisis del efecto del mencionado producto sobre al menos un parametro del equivalente de cuero cabelludo, y una etapa (c) de seleccionar el producto que modifique el mencionado parametro.
Preferiblemente, para llevar a cabo la etapa (a), el producto de ensayo se aplica topicamente, por ejemplo formulado en formulaciones topicas estandar, o tambien introducido en el medio de cultivo.
El parametro del equivalente de cuero cabelludo se escoge preferiblemente de la expresion, la produccion y/o la actividad de marcadores escogidos previamente en el equivalente de cuero cabelludo, y/o la descamacion del equivalente de cuero cabelludo.
La etapa (b) se puede llevar a cabo, en particular, via el analisis de la expresion, produccion y/o actividad de marcadores asociados con la calidad y/u homeostasis del cuero cabelludo, por ejemplo marcadores epidermicos y/o dermicos tales como protemas estructurales, especialmente protemas de la diferenciacion epidermica y protemas macromoleculares de la matriz dermica. Los ejemplos de protemas estructurales que se pueden mencionar son queratinas del cabello.
Estos marcadores asociados con la calidad y/u homeostasis del cuero cabelludo pueden ser representativos de la descamacion del cuero cabelludo, o de una afeccion de caspa, o de un cuero cabelludo sensible.
Cuando el modelo de cuero cabelludo segun la presente solicitud comprende fibroblastos capilares, tales como fibroblastos de la papila o fibroblastos de la vaina conjuntiva, o de toda la papila, o de la vaina conjuntiva, o fracciones de la vaina conjuntiva, que se han implantado como se describe anteriormente en el equivalente dermico, las pruebas de cribado tambien pueden estar destinadas a identificar productos capaces de inducir el crecimiento del tallo piloso.
Para esto, la etapa (b) del procedimiento de cribado analizara el efecto sobre el crecimiento del tallo piloso.
Cuando el modelo de cuero cabelludo segun la presente invencion comprende celulas del sistema inmune, tales como celulas de Langerhans, las pruebas de cribado tambien pueden estar destinadas a identificar productos que son capaces de inducir irritacion o reacciones alergicas.
Para esto, la etapa (b) del procedimiento de cribado analizara el efecto del producto sobre al menos uno de los parametros escogido preferentemente de:
- la citotoxicidad;
- la liberacion de mediadores de la inflamacion;
- dano celular revelado por histologfa o por la liberacion de lactato deshidrogenasa (un marcador de la integridad de la membrana queratinodtica) (Roguet et al., J. Tox. In vitro 6:303 (1992) y Ponec M en In Vitro Toxicology. Eds Rougier, Maibach and Golberg p. 107, 1994);
- modificacion de la smtesis y composicion de los lfpidos de la piel, particularmente las ceramidas y fosfolfpidos (JID 86, 598 (1986));
- la estratificacion de celulas epiteliales como un marcador de su diferenciacion (M. Prunieras y R. Roguet Toxicologie cellulaire in vitro methodes et applications, Eds M. Adolphe, A. Guillouzo and F. Marano publicado por INSERM 1995 p. 191-236) (Duffy P.A., Flint O.P.: In vitro dermal irritancy test. En C.K. Atterwill and C.E. Steele (Eds): In vitro methods in Toxicology, Cambridge Univ. Press Cambridge 1987, p. 279-297) (Use of skin cell culture for in vitro assessment of corrosion and cutaneous irritancy, Roguet, Cell Biology and Toxicology, 1999:15, 63-75).
La etapa (b) de analisis del efecto del producto sera preferentemente una comparacion de al menos un parametro medido sobre el equivalente de cuero cabelludo puesto en contacto con el producto de ensayo con aquel o aquellos medidos en un equivalente de cuero cabelludo de control cultivado en las mismas condiciones pero que no ha recibido el producto de ensayo.
La etapa (c) de seleccionar el producto que modifica el parametro del equivalente de cuero cabelludo se realizara como una funcion de un criterio determinado previamente.
La modificacion de este parametro puede ser una estimulacion, una disminucion, o una inhibicion total o parcial de la expresion, produccion y/o actividad de los mencionados marcadores y/o del crecimiento del tallo piloso y/o de la descamacion del equivalente de cuero cabelludo.
El criterio para seleccionar el mencionado producto sera, por ejemplo, tal que este producto tenga un efecto estimulante o inhibidor sobre el parametro medido.
El equivalente de cuero cabelludo segun la presente solicitud tambien se puede usar en procedimientos de cribado automatizados, para compuestos cosmeticos, farmaceuticos o dermatologicos, para identificar nuevos agentes activos.
La Figura 1 ilustra la invencion mas claramente, sin, sin embargo, limitar su alcance.
En esta figura, las fotograffas muestran cortes de piel reconstruida (equivalente de piel) (A), de equivalente de cuero cabelludo segun la invencion (B), y de una muestra de cuero cabelludo (C), tras el inmunomarcaje usando anticuerpo anti-involucrina (I) y anticuerpo anti-K10 (II).
Los ejemplos dados mas abajo se presentan como ilustraciones no limitantes de la invencion.
Ejemplo 1 - Preparacion de un modelo de cuero cabelludo
Los queratinocitos y fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo se afslan de muestras de cuero cabelludo recogidas durante un lifting de la cara (y de este modo obtenidos de mujeres relativamente maduras), o de muestras de cuero cabelludo obtenidas de hombres relativamente jovenes.
Para aislar estas celulas de cuero cabelludo, se lleva a cabo el depilado del cabello para eliminar los queratinocitos de la vaina epitelial externa, y entonces la dermis se separa de la epidermis a fin de extraer las dos poblaciones celulares diana, a saber, los fibroblastos y los queratinocitos interfoliculares.
Protocolo experimental:
Excepto que se indique de otro modo, todos los medios y amortiguadores usados en los ejemplos se describen en Bell et al. 1979 (P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278), Asselineau y Prunieras, 1984, (British J. of Derm., 111, 219-222) o Asselineau et al., 1987, (Models in dermato., vol. III, Ed. Lowe and Maibach, 1-7).
El medio MEM 10% FCS 3F (conocido como medio 3F) tiene la siguiente composicion:
Figure imgf000008_0001
- Coloquense los trozos de la parte “Superior” en una capsula de cultivo de diametro 100 mm que contiene 30­ 40 ml de dispasa (Roche), y almacenense toda la noche (15 horas) a 4°C, o almacenense durante 1 hora 30 minutos a 37°C en una incubadora seca, teniendo mucho cuidado de cortar trozos pequenos.
1. Preparacion del cultivo primario de queratinocitos humanos normales
- Retfrense las muestras del bano de dispasa y coloquense en una capsula de cultivo (diametro 100 mm) que contiene 10 ml de tripsina-EDTA (0,05%-0,02%).
- Llevese a cabo la separacion de la dermis de la epidermis usando pinzas curvadas, y raspese suavemente la superficie de la dermis con la parte posterior de las pinzas, para recuperar los queratinocitos basales.
- Coloquese la epidermis en un tubo conico (50 ml) con los 10 ml de tripsina-EDTA procedentes de la capsula. - Enjuaguese la capsula con 5 ml de tripsina-EDTA.
- Ffltrese a traves de una gasa esteril.
- N eu tra lise con 20 ml de suero fetal de ternera puro (FCS).
- Coloquese la suspension en un tubo conico de 50 ml.
- Centrifuguese la suspension celular durante 10 minutos a 1200 rpm.
- Elimmese el sobrenadante, recoja el pelete con MEM 10% FCS 7F (este medio comprende los mismos compuestos que el medio 3F y cuatro compuestos adicionales: adenina, transferrina, T3, insulina).
- Cuentense las celulas viables.
- Siembrense las capsulas de cultivo con 10000 celulas vivas/cm2
- 24 horas mas tarde, llevese a cabo un cocultivo estandar anadiendo el 3T3 (12000 celulas/cm2) tratado con mitomicina C (Ametycine®), sin cambiar el medio.
2. Protocolo para aislar las celulas dermicas:
a) Preparese una disolucion que comprende 0,1% de glucosa, 0,8% de NaCl y 0,04% de KCl.
- Anadase colagenasa al 0,1% (Worthington).
- Ffltrese la disolucion con un filtro Millipore o Nalgene de 0,22 |im.
b) Coloquese la dermis en forma de trozos pequenos con una longitud lateral de alrededor de 2 mm, 20 ml de disolucion de colagenasa, y una barra esteril, en un vaso de precipitados de 50 ml.
- Agftese a 37°C en 5% de CO2 durante 1 hora 30 minutos.
- Ffltrese la suspension obtenida a traves de un grosor doble de una gasa esteril.
- Centrifuguese la suspension filtrada en las condiciones habituales para la centrifugacion de celulas. c) Resuspendase el pelete en medio de cultivo reciente, cuentense las celulas, y siembrense las capsulas.
3. Preparacion de las redes:
Si el experimento a realizar comprende mas de 25 redes, todos los volumenes anteriores se deben doblar.
MEM 1,76X
17,6 ml de MEM 10X
5,1 ml de NaHCOa 7,5%
0,88 ml de L-glutamina (1,76 mM)
0,88 ml de piruvato sodico (0,88 mM)
0,88 ml de aminoacidos no esenciales 0,88 X (Ref.: K 0293 - Proveedor: Biochrom KG)
0,088 ml de penicilina/estreptomicina 8,8 U/8,8 |ig/ml (0,088%) (Ref.: A2212 - Proveedor: Biochrom KG) 0,044 ml de antibiotico antimicotico 0,04 X (0,04%)
75 ml de agua ultrapura esteril.
MEM HEPES 10% FCS
50 ml de MEM 25 mM HEPES
0,5 ml de L-glutamina (2 mM)
0,5 ml de piruvato sodico (1 mM)
0,5 ml de aminoacidos no esenciales 1 X
0,1 ml de penicilina/estreptomicina 20 U/20 |ig/ml (0,2%)
0,05 ml de antibiotico antimicotico 0,1 X (0,1%)
5 ml de FCS 10%.
NaOH 0,1N
10 ml de NaOH 1N
90 ml de agua ultrapura esteril
Esta disolucion se hace pasar a traves de un filtro Millipore con una membrana GV Durapore de 0,22 |im.
Acido acetico 1/1000
0,5 ml de acido acetico glacial al 100%
499,5 ml de agua ultrapura esteril
Usando el medio asf preparado:
- Preparense en un matraz conico esteril 5 ml de la siguiente disolucion:
3,22 ml de MEM 1,76 X
0,63 ml de FCS
0,35 ml de NaOH 0,1N
0,6 ml de acido acetico 1/1000
0,2 ml de MEM HEPES 10% FCS.
- Anadanse a esta disolucion 0,5 ml de suspension celular de fibroblastos interfoliculares capilares.
- A continuacion, anadase lentamente el volumen necesario de colageno fno (2,1 ml de este colageno es colageno Gattefosse o Symatese, o 1,5 ml si es colageno Coletica).
- Agftese vigorosamente el matraz conico hasta la homogeneizacion (la disolucion rosada fucsia se vuelve de color salmon).
- Vadense los contenidos del matraz conico en una capsula para bacterias de 60 mm Falcon0.
- Coloquese la capsula en un horno (37°C - 5% de CO2) durante alrededor de 1 hora 30 minutos - 2 horas. - Cuando el gel se haya endurecido y el medio haya sido expelido, compruebese el comienzo de la contraccion.
- En la tarde, agftense las redes con regularidad, de manera que no se vuelvan a pegar juntas.
- Dejese transcurrir la contraccion durante 3 dfas.
4. Cultivo-siembra con queratinocitos
La siembra con queratinocitos se lleva a cabo despues de 3 dfas de contraccion de las redes.
a) Preparacion del adhesivo
- Preparense 0,7 ml de la siguiente disolucion, dada para enlazar dos redes:
0,46 ml de MEM 1,76 X
0,09 ml de FCS
0,05 ml de NaOH 0,1N
0,1 ml de MEM HEPES 10% FCS
- Anadanse a este tubo 0,3 ml de colageno dializado. El volumen final es de este modo 1 ml.
Comentarios:
- Los volumenes anteriores se dan para el enlazamiento de dos redes.
- Para varias redes, preparese una disolucion global que corresponde a n+1 muestras a enlazar, en un matraz conico.
- Dispensense, por tubo, 0,7 ml de esta disolucion usando una multipipeta.
- A continuacion, anadanse 0,3 ml por tubo de colageno.
- Trabajense las redes de dos en dos.
b) Enlace de las redes
- Tomese un tubo de 6 ml lleno con disolucion adhesiva.
- Agftese con una mezcladora de vortice.
- Recojase la disolucion mediante una pipeta y coloquese en dos capsulas de cultivo Corning una gota de alrededor de 0,45 ml de esta disolucion en el centro de cada capsula.
- Recojase una red usando pinzas curvadas y un elevador celular.
- Coloquese la red en la tapa de esta capsula original, a fin de eliminar el medio excedente.
- Recojase la red y coloquese en la gota del adhesivo.
- Extiendase uniformemente haciendo girar la capsula de manera que el adhesivo se distribuya alrededor de la red.
- Coloquense las capsulas en un horno (37°C - 5% de CO2) durante 20-30 minutos, para permitir que el adhesivo se endurezca.
c) Siembra con queratinocitos
- Descongelense las celulas tan rapido como sea posible agitando el vial en un bano de agua a 37°C, en caso de que estas celulas estuviesen congeladas.
- Transfieranse los contenidos del vial a un tubo de cultivo Falcon de 50 ml que contiene 35 ml de medio MEM 10% FCS 3F.
- Centrifuguese durante 5 minutos a 1000 rpm.
- Elimmese el sobrenadante.
- Recojase el pelete de la centrifugacion con medio MEM 10% FCS 3F, para obtener una disolucion que contiene 100000 celulas/ml.
- Resuspendanse las celulas mediante succion-eyeccion varias veces.
- Coloquese un anillo de siembra de 14 mm de diametro en las redes enlazadas.
- En este anillo, coloquense 0,5 ml de suspension celular (= 50000 celulas/anillo 1,5 cm2, es decir, alrededor de 33000 celulas por cm2).
- Alrededor del anillo, anadanse suavemente 5 a 7 ml de medio MEM 10% FCS 3F, para no despegar la red. - Paralelamente, siembrense dos “anillos de control” (capsulas con anillos que no contienen red).
- Coloquense las capsulas en un horno a 37°C - 5% de CO2 , durante 2 horas.
- Retfrense los anillos usando pinzas curvadas, despues de las 2 horas de adhesion.
- Devuelvanse las capsulas al horno a 37°C - 5% de CO2.
- Cambiese el medio el miercoles y el viernes (5 a 7 ml de medio MEM 10% FCS 3F por capsula).
- Cultivo-emersion de pieles reconstruidas
Despues de siete dfas de cultivo en inmersion, las pieles se colocan en emersion.
Sin embargo, compruebese que los queratinocitos emergen de la red, observando con un microscopio.
- Coloquese una rejilla de emersion en una capsula Falcon para bacterias.
- Anadanse 7,5 ml de MEM 10% FCS 3F mientras se tiene cuidado de evitar la formacion de burbujas.
- Cortese el adhesivo alrededor de la piel a emerger, usando un escalpelo esteril.
- Transfierase la piel sobre la rejilla con pinzas curvadas y un elevador celular.
- Coloquense las capsulas en el horno a 37°C - 5% de CO2.
- Cambiese el medio el miercoles y el viernes (7 a 7,5 ml de medio MEM 10% FCS 3F).
Despues de siete dfas de emersion, las pieles reconstruidas de cuero cabelludo ya estan listas para ser usadas. Ejemplo 2: Comparacion de la expresion de involucrina y de queratina K10
La expresion de involucrina y de queratina K10 en el equivalente de cuero cabelludo obtenido en el Ejemplo 1 se observa tras el inmunomarcaje usando anticuerpos monoclonales de raton dirigidos contra involucrina o contra K10. Esta expresion tambien se observa en un equivalente de piel estandar y en una muestra de cuero cabelludo.
Preparacion del equivalente de piel estandar y de la muestra de cuero cabelludo:
Para preparar un equivalente dermico estandar, se colocan en un tubo Falcon esteril 3,22 ml de medio MEM 1,76 X, 0,63 ml de suero fetal de ternera, 0,35 ml de hidroxido sodico 0,1 N, y 0,20 ml de una mezcla de medio de MEM/HEPES que contiene 10% de suero fetal de ternera (MEM/HEPES/FCS10).
Entonces se anadieron, a una concentracion de 1x106 celulas por 0,5 ml de medio de cultivo, 0,50 ml de medio MEM/HEPES/FCS10 que contiene fibroblastos obtenidos de cirugfas mamarias humanas preparados previamente segun el metodo descrito por Bell et al. 1979 (P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278), Asselineau y Prunieras, 1984, (British J. of Derm., 111, 219-222) o Asselineau et al., 1987, (Models in dermato., vol. III, Ed. Lowe & Maibach, 1-7).
Entonces se anadieron lentamente, por la pared del tubo, 2 ml de una mezcla volumen/volumen de colageno a una concentracion de 3 mg/ml en acido acetico hasta 1/1000, para observar la aparicion de una turbidez blanquecina. El conjunto se mezcla entonces con cuidado y se coloca en una capsula de Petri de 60 mm de diametro (tipo Falcon 60 mm, referencia. 1016). La capsula de Petri se coloca entonces en un horno a 37°C, y se deja durante alrededor de 2 horas 30 minutos. Cuando se observa la aparicion de dos fases (gel medio), la red se separa con cuidado de su soporte, y la red asf separada de su soporte se deja durante 4 dfas en el horno.
Para preparar un equivalente de piel estandar, el equivalente dermico estandar se extiende en una capsula de cultivo de tipo Corning de 60 mm de diametro sobre una gota de “adhesivo” de colageno (0,6 ml), y entonces se mantiene a 37°C en un horno durante 20-30 minutos.
Se coloca un anillo de acero esteril sobre la red, y dentro del anillo se colocan 0,5 ml de una suspension celular de queratinocitos humanos obtenidos de cirugfas mamarias preparados segun Regnier et al. (Frontier of Matrix Biology, Vol. 9, 4-35, Karger, Basle 1981), en una concentracion de 100000 celulas/ml en medio m Em 10% FCS 3F.
Alrededor de 6 ml de medio (MEM 10% FCS 3F) se colocan alrededor del anillo, y la capsula se coloca en un horno a 37°C durante 2 horas. El anillo se retira entonces, y la capsula se devuelve al horno.
Despues de ocho dfas, el cultivo se coloca entonces en la interfaz aire/lfquido, consistiendo entonces el mencionado lfquido en el mismo medio como previamente.
Entonces se continua el cultivo durante 1 semana hasta que se obtiene un equivalente epidermico histologicamente satisfactorio, es decir, un equivalente epidermico que tiene las cuatro capas celulares estandar, a saber, las capas basal, suprabasal, granular y cornea.
La muestra de cuero cabelludo se recupera tras el lifting, segun los metodos conocidos por aquellos expertos en la tecnica.
Medida de la expresion de involucrina y de queratina K10
Tras la congelacion, los diversos tejidos se cortan en rebanadas de 5 |im de grosor usando un criostato.
Las rebanadas se enjuagan entonces dos veces con PBS, y en cada rebanada se colocan 25 |il de anticuerpo antiinvolucrina (Sigma - Ref.: 19018) y anticuerpo anti-K10 (Immuquest Ltd - Ref. AE20) diluidos 1/50, y se dejan durante 30 minutos a temperatura ambiente (25°C). Las rebanadas se enjuagan entonces dos veces con PBS, y en cada rebanada se depositan 25 |il de anticuerpo conjugado con FITC (anticuerpo de conejo anti-raton conjugado con FITC, Dako F232), y se dejan durante 30 minutos a temperatura ambiente (25°C). Las rebanadas se enjuagan dos veces con PBS y se observan, tras su montaje, en un microscopio de fluorescencia de marca Leica, modelo Leitz DMRB.
La observacion muestra que, en el control (piel reconstruida), involucrina (figura 1, I) y queratina K10 (figura 1, II) estan expresadas en todas las capas suprabasales de la epidermis reconstruida (figura 1, A), mientras que se expresan de forma tardfa, es decir, solamente en las capas granulares, de la epidermis de los equivalentes de cuero cabelludo (figura 1, B) y de las muestras de cuero cabelludo (figura 1, C).
La expresion de estos dos marcadores tiene lugar de forma temprana en la piel reconstruida (A), y de forma tardfa en el modelo de cuero cabelludo reconstruido (B) y en la muestra de cuero cabelludo (C) en los lugares indicados por las flechas en la figura 1.
De este modo, estos resultados hacen posible confirmar que el modelo de cuero cabelludo reconstruido segun la invencion es similar a la estructura y funcionalidad de un cuero cabelludo in vivo.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para preparar un equivalente de cuero cabelludo, caracterizado por que queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo se siembran y se cultivan en un equivalente dermico, comprendiendo el mencionado equivalente dermico colageno y fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de obtener dichos queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo a partir de una muestra de cuero cabelludo, y retirar previamente los queratinocitos de la vaina epitelial externa.
2. Procedimiento segun la reivindicacion anterior, caracterizado por que el equivalente dermico es una red de colageno contrafda, y por que la siembra con queratinocitos se lleva a cabo despues de 2 a 5 dfas de contraccion de la mencionada red.
3. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los mencionados fibroblastos y queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo se afslan, respectivamente, de la dermis y epidermis obtenidas a partir de una muestra de cuero cabelludo.
4. Procedimiento segun la reivindicacion 3, caracterizado por que los queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo se obtienen via las siguientes etapas:
- separar la dermis del cuero cabelludo de la epidermis mediante tratamiento proteolftico de una muestra de cuero cabelludo,
- recuperar la epidermis del cuero cabelludo,
- colocar la epidermis del cuero cabelludo asf obtenida en contacto con tripsina,
- recuperar los queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo, y
- cultivar los queratinocitos asf obtenidos.
5. Procedimiento segun la reivindicacion anterior, caracterizado por que el cultivo de queratinocitos es un cocultivo con fibroblastos tratados previamente con mitomicina o irradiados, o un cultivo en un medio de cultivo suplementado con fibronectina o con colageno.
6. Procedimiento segun la reivindicacion 3, caracterizado por que los fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo se obtienen via las siguientes etapas:
- separar la dermis del cuero cabelludo de la epidermis mediante tratamiento proteolftico de una muestra de cuero cabelludo,
- recuperar la dermis del cuero cabelludo,
- colocar la dermis del cuero cabelludo asf obtenida en contacto con colagenasa y/o tripsina,
- recuperar los fibroblastos interfoliculares del cuero cabelludo, y
- cultivar los fibroblastos asf obtenidos.
7. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el equivalente dermico contrafdo sembrado con los queratinocitos interfoliculares del cuero cabelludo se cultiva durante 5 a 7 dfas mediante inmersion en un medio de cultivo, seguido de la emersion durante 5 a 7 dfas en un soporte adecuado.
8. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende una etapa en la que los fibroblastos capilares, escogidos de fibroblastos de la papila dermica y/o fibroblastos de la vaina conjuntiva, y/o de papilas dermicas completas y/o de vainas conjuntivas y/o de fracciones de vainas conjuntivas, se implantan en el mencionado equivalente dermico que se ha contrafdo o que esta en vfas de contraerse.
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