CN105176917B - 一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法。本发明将KGF、EGF、谷氨酰胺和NEAA复配添加入基础培养基，所获得的培养基能够选择性的使角质形成细胞得到增殖，能够作为角质形成细胞原代和传代培养的培养基。实验证明，采用本发明提供的酶解方法能够获得大量活力良好的单个细胞，采用本发明提供的培养基进行培养后，可获得角质形成细胞所得细胞数量大、活力高，细胞特性在传代过程中保持良好。另外，本发明采用无血清培养基作为基础培养基，在保证了细胞活力的前提下，避免了异源血清带来的风险。

Description

一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法。

背景技术

角质形成细胞是表皮细胞的主要组成部分，是一种能合成角质蛋白的上皮细胞。在角质形成细胞向角质细胞演变过程中，一般可以分为四层，即基底层、棘层、颗粒层以及角质层。有人把前三层或前二层称为生发层或马尔匹基层。此外，在某些部位，特别在掌跖部位，角质层下方还可见到透明层。从分化机制来看，干细胞并不直接分化成终末分化细胞，而是先分化成定向祖细胞，定向祖细胞经过一定分裂次数后定向分化，进而分化成有丝分裂后细胞及终末分化细胞，实验研究获取的表皮角质形成细胞一般为定向祖细胞。

角质形成细胞的体外培养可为皮肤毒理学、烧伤治疗学、美容学和皮肤病发病机制的研究提供新的途径。但是，皮肤角质形成细胞分离培养中存在细胞易分化、易受成纤维细胞污染、不易贴壁等问题。不仅如此，角质形成细胞繁殖力较低、生活力弱，对生长条件要求较高，传代次数非常有限，培养过程中易被混杂的成纤维细胞过度繁殖而掩盖。因此，建立一种体系稳定、适合于皮肤角质形成细胞细胞生长增殖的培养方法成为了当务之急。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法，本发明提供的培养基能够作为角质形成细胞原代和传代培养的培养基，其具有选择性培养的作用，能够保证角质形成细胞在传代过程中的不被污染，增加传代次数。以本发明提供的角质形成细胞培养方法培养细胞，所得细胞数量大，活力高。

本发明提供的培养基包括基础培养基、KGF、EGF、谷氨酰胺和非必需氨基酸。

在本发明的实施例中，KGF与EGF的质量比为(8～12)：(8～12)。

在一些实施例中，KGF与EGF的质量比为10：10。

在本发明的实施例中，其中各组分的浓度为：KGF 8ng/mL～12ng/mL； EGF 8ng/mL～12ng/mL；谷氨酰胺0.5×～3×；非必需氨基酸0.5×～3×。

在本发明的实施例中，其中各组分的浓度为：KGF 9ng/mL～11ng/mL； EGF 9ng/mL～11ng/mL；谷氨酰胺0.5×～1.5×；非必需氨基酸0.5×～1.5×。

在一些实施例中，其中各组分的浓度为：KGF 10ng/mL；EGF 10ng/mL；谷氨酰胺1×；非必需氨基酸1×。

在本发明的实施例中，基础培养基为KC-FSM无血清培养基。

角质细胞生长因子(Keratinocye Growth Factor，KGF)是成纤维细胞生长因子家族的成员，能偶特异性的促进上皮细胞的增殖、迁移和分化。

表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor，EGF)能促进上皮细胞、成纤维细胞的增值；增强表皮细胞的活力；延缓表皮细胞的老化。高活性的EGF 才能促进皮肤细胞的分裂和生长，此外它还能刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和胶原白等)的合成与分泌。

谷氨酰胺，学名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸，英文Glutamine(Gln)。谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。谷氨酰胺可为自行配置也可为市场购得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的谷氨酰胺为购自sigma的100×谷氨酰胺。

非必需氨基酸(non-essential amino acid，NEAA)，包含7种细胞培养所需非必需氨基酸，即天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸。非必需氨基酸的添加能够增加细胞的繁殖力，延长细胞的生存时间。NEAA可为自行配置也可为市场购得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的NEAA为购自sigma的100× NEAA。

本发明将KGF、EGF、谷氨酰胺和NEAA复配添加入基础培养基，所获得的培养基能够选择性的使角质形成细胞得到增殖。实验证明，采用本发明提供的培养基用于培养角质形成细胞所得细胞数量大、活力高，细胞特性在传代过程中保持良好。另外，本发明采用无血清培养基作为基础培养基，在保证了细胞活力的前提下，避免了异源血清带来的风险。

本发明提供的培养基在培养角质形成细胞中的应用。

本发明还提供了角质形成细胞的分离方法，包括以下步骤：

步骤1：皮肤经中性分散酶I酶解后，取表皮层；

步骤2：将表皮层以VIII型胶原酶酶解后，以本发明提供的培养基培养，获得角质形成细胞。

在本发明的实施例中，皮肤为包皮。

在一些实施例中，皮肤为0岁～12岁儿童的包皮。

在本发明的实施例中，皮肤经清洗、破碎后酶解。

在一些实施例中，清洗采用含有双抗的D-PBS溶液。

在一些实施例中，双抗为青霉素和链霉素，含有双抗的D-PBS溶液中青霉素的浓度为100U/mL，链霉素的浓度为100μg/mL。

在本发明的实施例中，步骤1中酶解的温度为4℃，时间为8h～12h。

在本发明的实施例中，中性分散酶I以D-PBS溶液配制，其中中性分散酶I的浓度为2U/mL～2.4U/mL。

在一些实施例中，中性分散酶I以D-PBS溶液配制，其中中性分散酶I 的浓度为2U/mL0。

在本发明的实施例中，皮肤与中性分散酶I溶液的体积比为1:10。

在本发明的实施例中，步骤2中所述酶解的温度为18℃～30℃，时间为 30min。

在本发明的实施例中，VIII型胶原酶以D-PBS溶液配制，其中VIII型胶原酶的质量分数为0.05％～0.1％。

在一些实施例中，VIII型胶原酶以D-PBS溶液配制，其中VIII型胶原酶的质量分数为0.1％。

在本发明的实施例中，表皮层与VIII型胶原酶溶液的体积比为1:10。

在本发明的实施例中，以本发明提供的培养基培养细胞接种密度为2× 10⁵cell/mL。

在本发明的实施例中，表皮层经VIII型胶原酶酶解后所获得的细胞为单个细胞，经本发明提供的培养基的选择培养后，细胞呈铺路石形态，为角质形成细胞特有形态，纯度良好。获得角质形成细胞。

在本发明的实施例中，D-PBS为杜氏磷酸盐缓冲液，其中不含Ca²⁺或 Mg²⁺；其中各组分的浓度为：KCl 0.2mg/L；KH₂PO₄ 0.2mg/L；NaCl 8.0mg/L Na₂HPO₄ 1.15mg/L；pH值为7.4。

采用本发明提供的酶解方式对皮肤进行处理获取单个细胞，实验表明，以本发明提供的酶解方式处理2cm×2cm包皮，能够获得的总细胞数为1.53× 10⁶个，细胞活率为90.85％，说明本发明处理皮肤所获得的细胞数量大，细胞活力高。

本发明还提供了角质形成细胞的培养方法，包括以下步骤：

步骤1：皮肤经中性分散酶I酶解后，取表皮层；

步骤2：将表皮层以VIII型胶原酶酶解后，以本发明提供的培养基培养后，以本发明提供的培养基传代。

在本发明的实施例中，传代的次数为1次～8次。

在一些实施例中，传代的次数为3次～5次。

在本发明的实施例中，传代培养接种于本发明提供的培养基的细胞密度为1×10⁵cell/mL。

实验表明，将本发明细胞传代8次，仍能保持良好的角质形成细胞的形态，未发生污染。

本发明提供了一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法，本发明将KGF、EGF、谷氨酰胺和NEAA复配添加入基础培养基，所获得的培养基能够选择性的使角质形成细胞得到增殖，能够作为角质形成细胞原代和传代培养的培养基。实验证明，采用本发明提供的酶解方法能够获得大量活力良好的单个细胞，采用本发明提供的培养基进行培养后，可获得角质形成细胞所得细胞数量大、活力高，细胞特性在传代过程中保持良好。另外，本发明采用无血清培养基作为基础培养基，在保证了细胞活力的前提下，避免了异源血清带来的风险。

附图说明

图1示实施例5培养基培养获得的P0代角质形成细胞(放大100倍)；

图2示实施例9培养基传代获得的P2代角质形成细胞(放大100倍)。

具体实施方式

本发明提供了一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中：

1640培养基、KC-FSM完全培养基购自Gibco公司。

D-PBS(不含Ca²⁺、Mg²⁺)购自HyClone公司。

Ⅷ型胶原酶、DispaseI(中性分散酶I)、DispaseII(中性分散酶II)、胰酶购自sigma公司。

100×双抗购自sigma公司。

100×NEAA、100×谷氨酰胺购自sigma公司。

KGF、EGF购自sigma公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1～3

1、试剂及培养基配制：

1)、1×双抗的D-PBS(不含Ca²⁺、Mg²⁺)：10mL100双抗+990mL D-PBS (不含Ca²⁺、Mg²⁺)缓冲液。

2)、DispaseI酶溶液(2U/mL)：25mg DispaseI+100mL D-PBS；

DispaseI酶溶液(2.4U/mL)：30mg DispaseI+100mL D-PBS。

3)、VIII型胶原酶溶液(1％):1g VIII型胶原酶+100mL D-PBS；

VIII型胶原酶溶液(0.05％):0.5g VIII型胶原酶+100mL D-PBS；

2、单个核细胞的分离：

取小孩包皮皮肤2cm×2cm，用含有1×双抗的D-PBS(不含Ca²⁺、Mg²⁺) 清洗3次后，用手术刀对皮肤进行剪切，形成0.5cm×2cm的条状皮肤，

把皮肤入50mL离心管中，加入10倍皮肤体积的DispaseⅠ(各实施例浓度如表1)，轻柔摇匀后横放在4℃环境下酶解过夜。

取出酶解后的皮肤条，转移至15cm玻璃平皿中，用手术刀平刮皮肤上下表面，取去皮肤角质层和脂肪层，取出皮肤表皮层，转移至烧杯中进行剪碎。

加入1×抗生素的D-PBS，重悬皮肤组织后转移至50mL离心管中 1500rpm离心5-10min。

离心后弃上清，加入10倍皮肤组织体积的Ⅷ型胶原酶液(各实施例浓度如表1)，重悬组织沉淀，室温下酶解30min，1500rpm离心5～10min。

表1实施例1～3酶解条件.

	DispaseⅠ浓度	Ⅷ型胶原酶质量分数
			实施例1	2U/mL	0.1％
实施例2	2.4U/mL	0.05％
			实施例3	2.4U/mL	0.1％

用KC-FSM完全培养基重悬酶解获得的单个细胞，调整细胞密度为2× 10⁵cell/mL；按照细胞悬液：0.4％台盼蓝(V:V)＝1:1的比例，取少量细胞悬液进行细胞数量计算及活率检测，结果如表2所示：

表2实施例1～3细胞数量及活率

	活细胞数	总细胞数	细胞活率
				实施例1	1.39×106cell	1.53×106cell	90.85％
实施例2	0.97×106cell	1.06×106cell	91.22％
				实施例3	1.43×106cell	1.67×106cell	85.37％

从上述表格可知，不同酶解液组合所获取的细胞数量和活率不一致。实施例1获得总细胞数为1.53×10⁶个，活率为90.85％，而实施例2获得细胞数量较少，仅有1.06×10⁶，活率为91.22％；实施例3获取的细胞数量为1.67 ×10⁶，活率仅有85.37％。

对比例1～2

1、试剂及培养基配制：

1)、1×双抗的D-PBS(不含Ca²⁺、Mg²⁺)：10mL100双抗+990mL D-PBS (不含Ca²⁺、Mg²⁺)缓冲液。

2)、DispaseII酶溶液(2.4U/mL)：30mg DispaseII+100mL D-PBS。

3)、0.25％胰酶-0.02％EDTA：0.25g胰酶+0.02gEDTA+100mL去离子水；

0.5％胰酶-0.01％EDTA：0.5g胰酶+0.01gEDTA+100mL去离子水。

取小孩包皮皮肤2cm×2cm，用含有1×双抗的D-PBS(不含Ca²⁺、Mg²⁺) 清洗3次后，用手术刀对皮肤进行剪切，形成0.5cm×2cm的条状皮肤，

把皮肤入50mL离心管中，加入10倍皮肤体积的DispaseⅠ(各对比例浓度如表3)，轻柔摇匀后横放在4℃环境下酶解过夜。

取出酶解后的皮肤条，转移至15cm玻璃平皿中，用手术刀平刮皮肤上下表面，取去皮肤角质层和脂肪层，取出皮肤表皮层，转移至烧杯中进行剪碎。

加入1×抗生素的D-PBS，重悬皮肤组织后转移至50mL离心管中 1500rpm离心5-10min。

离心后弃上清，加入10倍皮肤组织体积的胰酶液(各对比例浓度如表3)，重悬组织沉淀，室温下酶解30min，1500rpm离心5～10min。

表3对比例1～2酶解条件.

	酶解皮肤	酶解表皮层
			对比例1	2.4U/mL DispaseⅡ	0.25％胰酶-0.02％EDTA
对比例2	2.0U/mL DispaseⅡ	0.5％胰酶-0.01％EDTA

用KC-FSM完全培养基重悬酶解获得的单个细胞，调整细胞密度为2× 10⁵cell/mL；按照细胞悬液：0.4％台盼蓝(V:V)＝1:1的比例，取少量细胞悬液进行细胞数量计算及活率检测，结果如表4所示：

表4对比例1～2细胞数量及活率

	活细胞数	总细胞数	细胞活率
				对比例1	0.84×106cells	1.02×106cells	82.35％
对比例2	0.75×106cells	1.33×106cells	56.39％

从上述表格可知，对比例1和对比例2分别获取的细胞数量为1.02×10⁶个、1.33×10⁶个，活率分别为82.35％、56.39％，远低于实施例1的细胞活率 90.85％。

实施例4～6

表5实施例4～6培养基

将实施例1制得的单个细胞，以实施例4～6的培养基重悬，调整细胞密度为2×10⁵cell/mL，5％CO₂、37℃、湿度95％条件下培养至融合度达80％时，观察细胞形态，并进行表面抗原检测。

表面抗原检测的方法为：0.25％胰酶常规消化， 制成1×10⁵的细胞悬液，分别取抗人的单克隆抗体TLR2、TLR4各5μL， 加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，同时设立通行对照组，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL PBS重悬后上机检测。

其中实施例5培养基培养后的细胞形态如图1，如图显示，培养所得细胞呈典型上皮样特征，呈铺路石样形态，高核浆比例，细胞紧密排列，轮廓清楚折光性好，具有角质形成细胞的形态特征。实施例4和实施例6培养后的细胞进行观察结果与此相似。

表面抗原检测的结果如表6：

表6表面抗原检测的结果(原代培养)

结果表明：实施例4、5、6的TLR2与同型对照组相比，均维持在低水平表达，低于0.5％％，符合了皮肤角质形成细胞TLR2低表达的一般特征。而TLR4的表达量在12.0％左右，均高于同型对照组的，符合皮肤角质形成细胞表达TLR4的一般特征。

实施例7～9

将实施例5培养基培养至融合度达80％的细胞，用D-PBS对细胞清洗两次，加入1mL0.25％胰酶-0.02％EDTA进行消化传代，待细胞皱缩变圆，部分细胞飘起，加入KC-FSM培养基终止酶解，轻柔吹打直至细胞全部脱落，收集细胞悬液1500rpm/min离心5min，用本发明提供的培养基(如表7)重悬细胞，按1×10⁵cell/mL接种至T25培养瓶中，5mL/瓶，5％CO₂、37℃、湿度95％条件下培养至融合度达80％，即为P1代细胞。将P1代细胞传代至P8 代。每天对培养的细胞进行计数，结果如表8-1、8-2和8-3。

表7实施例7～9培养基(原代培养)

表8-1实施例7细胞数量

表8-2实施例8细胞数量

表8-3实施例9细胞数量

对实施例9的P2代的细胞进行观察，结果如图2，细胞呈典型上皮样特征，呈铺路石样形态，高核浆比例，细胞紧密排列，轮廓清楚折光性好，与原代培养初期可见极少量的成纤维样细胞相比，P2代成纤维样细胞消失，获得了高纯度的角质形成细胞。

对实施例7～9中P1、P3、P5、P7代细胞进行表面抗原检测，表面抗原检测的方法为：0.25％胰酶常规消化， 制成1×10⁵的细胞悬液，分别取抗人的单克隆抗体TLR2、TLR4各5μL， 同时设立同型对照组；加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，同时设立空白对照，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL PBS重悬后上机检测。

表面抗原检测的结果如表9：

表9表面抗原检测的结果(传代培养)

结果表明：采用本发明提供的培养基能够培养获得纯度较高的角质形成细胞。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种角质形成细胞的培养基，其特征在于，由KC-FSM无血清培养基、KGF、EGF、谷氨酰胺和非必需氨基酸组成；其中各组分的浓度为：KGF 8ng/mL～12ng/mL；EGF 8ng/mL～12ng/mL；谷氨酰胺1×～3×；非必需氨基酸1×～3×。

2.权利要求1所述的培养基在培养角质形成细胞中的应用。

3.一种角质形成细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：皮肤经中性分散酶I酶解后，取表皮层；

步骤2：将所述表皮层以VIII型胶原酶酶解后，以权利要求1所述的培养基培养，获得角质形成细胞。

4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，步骤1中所述酶解的温度为4℃，时间为8h～12h。

5.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，步骤2中所述酶解的温度为18℃～30℃，时间为30min。

6.一种角质形成细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：皮肤经中性分散酶I酶解后，取表皮层；

步骤2：将所述表皮层以VIII型胶原酶酶解后，以权利要求1所述的培养基培养后，以权利要求1所述的培养基传代。

7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，所述传代的次数为1次～8次。