CN110317777A - 一种口腔黏膜上皮细胞的分离和培养方法 - Google Patents

一种口腔黏膜上皮细胞的分离和培养方法 Download PDF

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秦晓东
何祥一
曾飒
张志东
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Abstract

本发明公开了一种口腔黏膜上皮细胞的分离和培养方法，具体涉及细胞培养技术领域，具体分离和培养步骤如下：无菌条件下取唇裂整复术中切除的多余口腔黏膜组织，用PBS反复冲洗，用眼科剪除去黏膜下组织，剪成小块，置于DispaseⅡ酶中，4℃过夜消化18h，用眼科镊分离上皮层，PBS液冲洗上皮层，将上皮剪切成小片加入混合消化液中，37℃消化7分钟，加胎牛血清终止消化，用吸管反复吹打至单细胞悬液，离心弃上清，加入无血清培养基，接种于培养瓶中倒置培养，当原代培养的细胞汇合率达70％‑80％时，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化并以1:2传代。本发明整个培养过程简单，得到的原代培养细胞成活率高，并且不易出现双核、多核、畸形核细胞。

Description

一种口腔黏膜上皮细胞的分离和培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术技术领域，更具体地说，本发明涉及一种口腔黏膜上皮细胞的分离和培养方法。
背景技术
大多数口腔黏膜疾病的病因复杂，致病机理不详，为进一步研究口腔黏膜上皮细胞(Oralmucosaepithelialcells,OMECs)多因素、多步骤致病机制，建立人永生化OMECs细胞系是非常必要的。正常情况下，OMECs在体外仅能传代培养5-6代，无法满足研究需求。
因此，有学者进行了人永生化OMECs细胞系的探索，如HPV16E6E7诱导的永生化口腔粘膜上皮细胞系，但HE染色可见细胞大小不均一，出现双核、多核、畸形核细胞，结果不甚理想。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种口腔黏膜上皮细胞的分离和培养方法，采用德国Merck Millipore公司提供的Human Epidermal KeratinocyteComplete Medium Kit无血清培养基培养，成功分离培养了原代OMECs，无成纤维细胞混杂，原代细胞接种3天后即可长满，细胞形态均一，密集排列呈“铺路石”样生长，符合上皮细胞体外培养的形态特征，且生长迅速。证实了此培养基可在短期内获得大量具有增殖能力的OMECs，能够满足后续实验需求，整个培养过程简单，得到的原代培养细胞成活率高，并且不易出现双核、多核、畸形核细胞。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，具体分离步骤如下：
S101、在无菌条件下，取唇裂整复术中切除的多余口腔黏膜组织，将其放入烧杯容器内，然后使用50ml含1％双抗的PBS反复冲洗5遍，去除口腔黏膜组织表面的污垢和杂质；
S102、用眼科剪除去冲洗后的黏膜下组织，然后将剩余的黏膜上组织剪成2mm×1mm的小块，然后置于盛有2.5g/LDispaseⅡ酶的容器中，过夜消化；
S103、将步骤S102中过夜消化的黏膜组织用眼科镊分离上皮层，再用含1％双抗的PBS液冲洗上皮层，将口腔黏膜组织上皮层剪切成小片，然后再加入盛有混合消化液的容器中进行消化；
S104、向步骤S103的容器中加胎牛血清终止消化，再用吸管反复吹打至单细胞悬液；
S105、将单细胞悬液取出，将其倒入离心机内，对溶液进行离心，得到离心基液。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S101中，取多余口腔黏膜组织的唇裂整复术患者年龄为3个月。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S102中，口腔黏膜上组织过夜消化的环境温度为3-5℃，过夜消化时间为18h。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S103中，混合消化液具体为0.25％胰酶和0.02％EDTA，且0.25％胰酶：0.02％EDTA＝1：1。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S103中，口腔黏膜组织上皮层消化的环境温度为36-38℃，消化时间为7分钟。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S105中，单细胞悬液在离心机800rpm的速度下离心5min。
本发明还提供了一种口腔黏膜上皮细胞的培养方法，具体培养步骤如下：
S201、单细胞悬液离心结束后，得到的离心基液弃上清，加入无血清培养基HumanEpidermalKeratinocyteCompleteMediumKit，并接种于25cm2培养瓶中，倒置培养3d；
S202、当步骤S201中原代培养的细胞汇合率达70％-80％时，用0.25％胰蛋白酶消化，并以1：2传代。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S202中，原代培养的细胞还可以用0.02％EDTA进行消化。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明采用德国Merck Millipore公司提供的Human Epidermal KeratinocyteComplete Medium Kit无血清培养基培养，成功分离培养了原代OMECs，无成纤维细胞混杂，原代细胞接种3天后即可长满，细胞形态均一，密集排列呈“铺路石”样生长，符合上皮细胞体外培养的形态特征，且生长迅速。证实了此培养基可在短期内获得大量具有增殖能力的OMECs，能够满足后续实验需求；
2、通过在无菌条件下取唇裂整复术中切除的多余口腔黏膜组织，用PBS反复冲洗5遍，用眼科剪除去黏膜下组织，剪成小块，置于DispaseⅡ酶中，4℃过夜消化18h，用眼科镊分离上皮层，PBS液冲洗上皮层，将上皮剪切成小片加入混合消化液中，37℃消化7分钟，加胎牛血清终止消化，使得分离后的口腔黏膜上皮细胞便于进行培养，提高了口腔黏膜上皮细胞在后期培养过程中的成活率；
3、通过用吸管反复吹打至单细胞悬液，800rpm离心5min，弃上清，加入无血清培养基HumanEpidermalKeratinocyteCompleteMediumKit，接种培养瓶中倒置培养3d，当原代培养的细胞汇合率达70％-80％时，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化并以1:2传代，整个培养过程简单，得到的原代培养细胞成活率高，并且不易出现双核、多核、畸形核细胞。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，具体分离步骤如下：
S101、在无菌条件下，取唇裂整复术中切除的多余口腔黏膜组织，患者年龄为3个月，将其放入烧杯容器内，然后使用50ml含1％双抗的PBS反复冲洗5遍，去除口腔黏膜组织表面的污垢和杂质；
S102、用眼科剪除去冲洗后的黏膜下组织，然后将剩余的黏膜上组织剪成2mm×1mm的小块，然后置于盛有2.5g/LDispaseⅡ酶的容器中，过夜消化，且过夜消化的环境温度为3℃，过夜消化时间为18h；
S103、将步骤S102中过夜消化的黏膜组织用眼科镊分离上皮层，再用含1％双抗的PBS液冲洗上皮层，将口腔黏膜组织上皮层剪切成小片，然后再加入盛有混合消化液的容器中进行消化，消化的环境温度为36℃，消化时间为7分钟，混合消化液具体为0.25％胰酶和0.02％EDTA，且0.25％胰酶：0.02％EDTA＝1：1；
S104、向步骤S103的容器中加胎牛血清终止消化，再用吸管反复吹打至单细胞悬液；
S105、将单细胞悬液取出，将其倒入离心机内，800rpm的速度下离心5min，对溶液进行离心，得到离心基液。
一种口腔黏膜上皮细胞的培养方法，具体培养步骤如下：
S201、单细胞悬液离心结束后，得到的离心基液弃上清，加入无血清培养基HumanEpidermalKeratinocyteCompleteMediumKit，并接种于25cm2培养瓶中，倒置培养3d；
S202、当步骤S201中原代培养的细胞汇合率达70％时，用0.25％胰蛋白酶消化，并以1：2传代。
实施例2：
一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，具体分离步骤如下：
S101、在无菌条件下，取唇裂整复术中切除的多余口腔黏膜组织，患者年龄为3个月，将其放入烧杯容器内，然后使用50ml含1％双抗的PBS反复冲洗5遍，去除口腔黏膜组织表面的污垢和杂质；
S102、用眼科剪除去冲洗后的黏膜下组织，然后将剩余的黏膜上组织剪成2mm×1mm的小块，然后置于盛有2.5g/LDispaseⅡ酶的容器中，过夜消化，且过夜消化的环境温度为4℃，过夜消化时间为18h；
S103、将步骤S102中过夜消化的黏膜组织用眼科镊分离上皮层，再用含1％双抗的PBS液冲洗上皮层，将口腔黏膜组织上皮层剪切成小片，然后再加入盛有混合消化液的容器中进行消化，消化的环境温度为37℃，消化时间为7分钟，混合消化液具体为0.25％胰酶和0.02％EDTA，且0.25％胰酶：0.02％EDTA＝1：1；
S104、向步骤S103的容器中加胎牛血清终止消化，再用吸管反复吹打至单细胞悬液；
S105、将单细胞悬液取出，将其倒入离心机内，800rpm的速度下离心5min，对溶液进行离心，得到离心基液。
一种口腔黏膜上皮细胞的培养方法，具体培养步骤如下：
S201、单细胞悬液离心结束后，得到的离心基液弃上清，加入无血清培养基HumanEpidermalKeratinocyteCompleteMediumKit，并接种于25cm2培养瓶中，倒置培养3d；
S202、当步骤S201中原代培养的细胞汇合率达75％时，用0.25％胰蛋白酶消化，并以1：2传代。
实施例3：
一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，具体分离步骤如下：
S101、在无菌条件下，取唇裂整复术中切除的多余口腔黏膜组织，患者年龄为3个月，将其放入烧杯容器内，然后使用50ml含1％双抗的PBS反复冲洗5遍，去除口腔黏膜组织表面的污垢和杂质；
S102、用眼科剪除去冲洗后的黏膜下组织，然后将剩余的黏膜上组织剪成2mm×1mm的小块，然后置于盛有2.5g/LDispaseⅡ酶的容器中，过夜消化，且过夜消化的环境温度为5℃，过夜消化时间为18h；
S103、将步骤S102中过夜消化的黏膜组织用眼科镊分离上皮层，再用含1％双抗的PBS液冲洗上皮层，将口腔黏膜组织上皮层剪切成小片，然后再加入盛有混合消化液的容器中进行消化，消化的环境温度为38℃，消化时间为7分钟，混合消化液具体为0.25％胰酶和0.02％EDTA，且0.25％胰酶：0.02％EDTA＝1：1；
S104、向步骤S103的容器中加胎牛血清终止消化，再用吸管反复吹打至单细胞悬液；
S105、将单细胞悬液取出，将其倒入离心机内，800rpm的速度下离心5min，对溶液进行离心，得到离心基液。
一种口腔黏膜上皮细胞的培养方法，具体培养步骤如下：
S201、单细胞悬液离心结束后，得到的离心基液弃上清，加入无血清培养基HumanEpidermalKeratinocyteCompleteMediumKit，并接种于25cm2培养瓶中，倒置培养3d；
S202、当步骤S201中原代培养的细胞汇合率达80％时，用0.25％胰蛋白酶消化，并以1：2传代。
通过以上三组实施例可以得到三种口腔黏膜上皮细胞，将这三种口腔黏膜上皮细胞分别进行分离培养测试以及使用HE染色，得出以下结果，如表1：
结果得出三组实施例中的口腔黏膜上皮细胞的成活率均有不同的提升，其中实施例2中口腔黏膜上皮细胞的成活率最高，并且不易出现双核、多核、畸形核细胞；
本发明采用德国Merck Millipore公司提供的Human Epidermal KeratinocyteComplete Medium Kit无血清培养基培养，成功分离培养了原代OMECs，无成纤维细胞混杂，原代细胞接种3天后即可长满，细胞形态均一，密集排列呈“铺路石”样生长，符合上皮细胞体外培养的形态特征，且生长迅速。证实了此培养基可在短期内获得大量具有增殖能力的OMECs，能够满足后续实验需求。
实施例4：
一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，具体分离步骤如下：
S101、在无菌条件下，取唇裂整复术中切除的多余口腔黏膜组织，患者年龄为3个月，将其放入烧杯容器内，然后使用50ml含1％双抗的PBS反复冲洗5遍，去除口腔黏膜组织表面的污垢和杂质；
S102、用眼科剪除去冲洗后的黏膜下组织，然后将剩余的黏膜上组织剪成2mm×1mm的小块，然后置于盛有2.5g/LDispaseⅡ酶的容器中，过夜消化，且过夜消化的环境温度为4℃，过夜消化时间为18h；
S103、将步骤S102中过夜消化的黏膜组织用眼科镊分离上皮层，再用含1％双抗的PBS液冲洗上皮层，将口腔黏膜组织上皮层剪切成小片，然后再加入盛有混合消化液的容器中进行消化，消化的环境温度为37℃，消化时间为7分钟，混合消化液具体为0.25％胰酶和0.02％EDTA，且0.25％胰酶：0.02％EDTA＝1：1；
S104、向步骤S103的容器中加胎牛血清终止消化，再用吸管反复吹打至单细胞悬液；
S105、将单细胞悬液取出，将其倒入离心机内，800rpm的速度下离心5min，对溶液进行离心，得到离心基液。
一种口腔黏膜上皮细胞的培养方法，具体培养步骤如下：
S201、单细胞悬液离心结束后，得到的离心基液弃上清，加入无血清培养基HumanEpidermalKeratinocyteCompleteMediumKit，并接种于25cm2培养瓶中，倒置培养3d；
S202、当步骤S201中原代培养的细胞汇合率达75％时，用0.02％EDTA消化，并以1：2传代。
与实施例2不同的是：所述步骤S202中，原代培养的细胞用0.02％EDTA进行消化，消化的效果相同，并且不影响细胞的培养效果。
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种口腔黏膜上皮细胞的分离，其特征在于，具体分离步骤如下：
S101、在无菌条件下，取唇裂整复术中切除的多余口腔黏膜组织，将其放入烧杯容器内，然后使用50ml含1％双抗的PBS反复冲洗5遍，去除口腔黏膜组织表面的污垢和杂质；
S102、用眼科剪除去冲洗后的黏膜下组织，然后将剩余的黏膜上组织剪成2mm×1mm的小块，然后置于盛有2.5g/LDispaseⅡ酶的容器中，过夜消化；
S103、将步骤S102中过夜消化的黏膜组织用眼科镊分离上皮层，再用含1％双抗的PBS液冲洗上皮层，将口腔黏膜组织上皮层剪切成小片，然后再加入盛有混合消化液的容器中进行消化；
S104、向步骤S103的容器中加胎牛血清终止消化，再用吸管反复吹打至单细胞悬液；
S105、将单细胞悬液取出，将其倒入离心机内，对溶液进行离心，得到离心基液。
2.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤S101中，取多余口腔黏膜组织的唇裂整复术患者年龄为3个月。
3.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤S102中，口腔黏膜上组织过夜消化的环境温度为3-5℃，过夜消化时间为18h。
4.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤S103中，混合消化液具体为0.25％胰酶和0.02％EDTA，且0.25％胰酶：0.02％EDTA＝1：1。
5.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤S103中，口腔黏膜组织上皮层消化的环境温度为36-38℃，消化时间为7分钟。
6.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤S105中，单细胞悬液在离心机800rpm的速度下离心5min。
7.基于权利要求1-6任意一项所述的口腔黏膜上皮细胞的分离方法的培养方法，其特征在于，具体培养步骤如下：
S201、单细胞悬液离心结束后，得到的离心基液弃上清，加入无血清培养基HumanEpidermalKeratinocyteCompleteMediumKit，并接种于25cm2培养瓶中，倒置培养3d；
S202、当步骤S201中原代培养的细胞汇合率达70％-80％时，用0.25％胰蛋白酶消化，并以1：2传代。
8.根据权利要求7所述的一种口腔黏膜上皮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤S202中，原代培养的细胞还可以用0.02％EDTA进行消化。
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