CN111593015A - 一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法 - Google Patents

一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，所述方法包括无菌条件下获取废弃的口腔黏膜，除去肉眼可见下的多余黏膜组织，置于含有10％血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡5‑8min，切成大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗3‑5次；将黏膜组织块消化1h；用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；用PBS轻轻冲洗上皮层，然后置入消化液内消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，贴壁培养；所述方法保证了胰蛋白酶活性的基础上，提高了分离率，降低了成纤维细胞的污染率。

Description

一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法
技术领域
本发明属于细胞分离培养技术领域，特别涉及一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法。
背景技术
口腔颌面的疾病治疗(例如肿瘤的切除)，创伤及修复会有大面积口腔黏膜缺损。利用自体黏膜移植修复是弥补口腔黏膜缺损的主要手段，但是自体黏膜来源有限，无法实现大面积口腔内创面的修复。随着细胞培养工程技术的发展，利用自体口腔黏膜上皮细胞在体外培养扩增而合成的口腔黏膜实现对创面的修复成为一种趋势。
口腔黏膜上皮细胞的培养多采用酶解培养法，即用胰蛋白酶或DispassⅡ酶酶解方法分离口腔黏膜上皮细胞，然后利用血清培养液进行培养。现有技术采用的酶解培养法无论是利用胰蛋白酶或DispassⅡ酶酶解的分离方法存在分离率低且培养后的细胞存在成纤维细胞污染的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种新的口腔黏膜上皮细胞分离培养方法。
本发明其中一个技术方案提供一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，所述分离培养方法包括如下步骤：
1)无菌条件下获取废弃的口腔黏膜，除去肉眼可见下的多余黏膜组织，置于含有10％血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡5-8min，切成大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗3-5次；
2)将黏膜组织块消化1h；
3)用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后置入消化液内消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，贴壁培养。
进一步改进的方案中，所述将黏膜组织块消化1h具体为：将黏膜组织块放入第一消化液在二氧化碳培养箱中消化20-30min，取出，利用PBS冲洗5次；再放入第二消化液于4℃消化10-12h。
进一步改进的方案中，所述第一消化液为含有0.125％氯化钠、0.125％胰蛋白酶且pH为6.8的磷酸盐缓冲液。
进一步改进的方案中，所述第二消化液为含有0.25％胰蛋白酶且pH为7.8的磷酸盐缓冲液。
进一步改进的方案中，步骤4)所述的消化液为第二消化液。
进一步改进的方案中，所述贴壁培养的具体方法为：
将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。
进一步改进的方案中，所述血清培养液为含有体积分数为x％的胎牛血清、浓度为y％的谷氨酰胺和0.2y％的谷氨酸的DMEM培养液，其中，x％+y％＝12％，7.5％≤x％≤10％。
进一步改进的方案中，所述贴壁培养方法还包括：
培养前2天时，x％＝10％；
从培养第三天开始换液，吸取全部血清培养液，然后加入全新的血清培养液，其中，x％＝9.5％；
从培养第四天开始，每12h，吸取一半的血清培养基，加入新的血清培养基后，每加入一次新的血清培养基后，使得x％按照0.5％的速率递减，直至x％＝7.5％，继续培养。
进一步改进的方案中，所述方法还包括：
6)当细胞达到80-90％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液37℃消化30min，反复吹打成细胞悬液；
7)将细胞悬液接种于培养瓶中，以1：2进行传代培养。
与现有技术相比，本发明所提供的一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法的优点在于：该分离方法采用了两步消化处理过程，并且对两次消化过程的采用的消化液的pH进行了限定，保证了胰蛋白酶活性的基础上，提高了分离率，降低了成纤维细胞的污染率。
附图说明
图1为培养后的口腔黏膜上皮细胞的形态图。
具体实施方式
实施例1
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入第一消化液于二氧化碳培养箱中消化30min，取出，利用PBS冲洗5次；再放入第二消化液于4℃消化12h；
其中，第一消化液为含有0.125％氯化钠、0.125％胰蛋白酶且pH为6.8的磷酸盐缓冲液；
第二消化液为含有0.25％胰蛋白酶且pH为7.8的磷酸盐缓冲液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；其中血清培养液为含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养液；
6)当细胞达到85％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养。
实施例2
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取唇裂整复术切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗3次；
2)将黏膜组织块放入第一消化液于二氧化碳培养箱中消化20min，取出，利用PBS冲洗5次；再放入第二消化液于4℃消化10h；
其中，第一消化液为含有0.125％氯化钠、0.125％胰蛋白酶且pH为6.8的磷酸盐缓冲液；
第二消化液为含有0.25％胰蛋白酶且pH为7.8的磷酸盐缓冲液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；其中血清培养液为含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养液；
6)当细胞达到90％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养。
对照例1
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入0.25％的胰蛋白酶中在4℃消化过液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；其中血清培养液为含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养液；
6)当细胞达到90％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养。
对照例2
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入0.4％的Di spase中在4℃消化过液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；其中血清培养液为含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养液；
6)当细胞达到90％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养。
对照例3
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入第一消化液在二氧化碳培养箱中消化1h；
其中，第一消化液为含有0.125％氯化钠、0.125％胰蛋白酶且pH为6.8的磷酸盐缓冲液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；其中血清培养液为含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养液；
6)当细胞达到90％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养。
对照例4
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取唇裂整复术或颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入第二消化液在4℃消化过液；
第二消化液为含有0.25％胰蛋白酶且pH为7.8的磷酸盐缓冲液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；其中血清培养液为含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养液；
6)当细胞达到90％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养。
对照例5
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取唇裂整复术或颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入第一消化液在二氧化碳培养箱中消化30min，取出，利用PBS冲洗5次；再放入第二消化液在4℃消化12h；
其中，第一消化液为含有0.125％胰蛋白酶且pH为7.2的磷酸盐缓冲液；
第二消化液为含有0.25％胰蛋白酶且pH为7.8的磷酸盐缓冲液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；其中血清培养液为含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养液；
6)当细胞达到90％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养。
对照例6
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取唇裂整复术或颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入第一消化液在二氧化碳培养箱中消化30min，取出，利用PBS冲洗5次；再放入第二消化液在4℃消化12h；
其中，第一消化液为含有0.125％氯化钠、0.125％胰蛋白酶且pH为6.8的磷酸盐缓冲液；
第二消化液为0.25％胰蛋白酶；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；其中血清培养液为含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养液；
6)当细胞达到90％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养。
分离效果检测
检测不同实施例和对照例中步骤2)中的消化方法对上皮层的分离率(分离率＝成功分离出上皮层的个数/样品数*100％，样品数为22)和成纤维细胞污染率(成纤维细胞污染率＝成功分离出且含有成纤维细胞的上皮层的个数/成功分离出上皮层的个数*100％)的考察，结果见表1。
表1 不同消化方法对上皮层分离率和污染率的影响结果
Figure BDA0002535234480000111
从表中可以看出，本发明提供的消化方法对上皮层的分离效果好，分离率高，并且分离后的成纤维细胞污染率低，与对比例1和对比例2相比，较现有技术采用的0.25％的胰蛋白酶和0.4％的Dispase消化的分离率高且污染率低；与对照例3和对照例4相比，当利用第一消化液消化或第二消化液消化一次时，成纤维细胞的污染率升高，对照例3的分离率显著降低，对照例4的分离率有所降低；与对照例5相比，当第一消化液的pH升高时，成纤维细胞的污染率显著升高；与对照例6相比的，当第二消化液仅为0.25％胰蛋白酶，不对其pH进行限定时，分离率有所降低，但成纤维细胞的污染率显著升高。
实施例3
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入第一消化液于二氧化碳培养箱中消化30min，取出，利用PBS冲洗5次；再放入第二消化液于4℃消化12h；
其中，第一消化液为含有0.125％氯化钠、0.125％胰蛋白酶且pH为6.8的磷酸盐缓冲液；
第二消化液为含有0.25％胰蛋白酶且pH为7.8的磷酸盐缓冲液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；培养前2天时，x％＝10％；从培养第三天开始换液，吸取全部血清培养液，然后加入全新的血清培养液，其中，x％＝9.5％；从培养第四天开始，每12h，吸取一半的血清培养液，加入新的血清培养液后，每加入一次新的血清培养液后，使得x％按照0.5％的速率递减，直至x％＝7.5％，继续培养，继续培养指每12h换液，保证血清培养液的x％一直为7.5％；其中所述血清培养液为含有体积分数为x％的胎牛血清、浓度为y％的谷氨酰胺和0.2y％的谷氨酸的DMEM培养液，其中，x％+y％＝12％；
6)当细胞达到85％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养，其中，所述血清培养液为含有体积分数7.5％的胎牛血清、4.5％的谷氨酰胺和0.9％谷氨酸的DMEM培养液。
对照例7
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入第一消化液于二氧化碳培养箱中消化30min，取出，利用PBS冲洗5次；再放入第二消化液于4℃消化12h；
其中，第一消化液为含有0.125％氯化钠、0.125％胰蛋白酶且pH为6.8的磷酸盐缓冲液；
第二消化液为含有0.25％胰蛋白酶且pH为7.8的磷酸盐缓冲液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；培养前2天时，x％＝10％；从培养第三天开始换液，吸取全部血清培养液，然后加入全新的血清培养液，其中，x％＝9.5％；从培养第四天开始，每12h，吸取一半的血清培养液，加入新的血清培养液后，每加入一次新的血清培养液后，使得x％按照0.5％的速率递减，直至x％＝7.5％，继续培养；其中所述血清培养液为含有体积分数为x％的胎牛血清、浓度为y％的谷氨酰胺的DMEM培养液，其中，x％+y％＝12％；
6)当细胞达到85％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养，其中，所述血清培养液为含有体积分数7.5％的胎牛血清、4.5％的谷氨酰胺和0.9％谷氨酸的DMEM培养液。
对照例8
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入第一消化液于二氧化碳培养箱中消化30min，取出，利用PBS冲洗5次；再放入第二消化液于4℃消化12h；
其中，第一消化液为含有0.125％氯化钠、0.125％胰蛋白酶且pH为6.8的磷酸盐缓冲液；
第二消化液为含有0.25％胰蛋白酶且pH为7.8的磷酸盐缓冲液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；培养前2天时，x％＝10％；从培养第三天开始换液，吸取全部血清培养液，然后加入全新的血清培养液，其中，x％＝9.5％；从培养第四天开始，每12h，吸取一半的血清培养液，加入新的血清培养液后，每加入一次新的血清培养液后，使得x％按照0.5％的速率递减，直至x％＝7.5％，继续培养；其中所述血清培养液为含有体积分数为x％的胎牛血清、浓度为y％的谷氨酰胺和0.2y％的谷氨酸的DMEM培养液，其中，x％+y％＝10％，7.5％≤x％≤10％；
6)当细胞达到85％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养，其中，所述血清培养液为含有体积分数7.5％的胎牛血清、4.5％的谷氨酰胺和0.9％谷氨酸。
对照例9
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入第一消化液于二氧化碳培养箱中消化30min，取出，利用PBS冲洗5次；再放入第二消化液于4℃消化12h；
其中，第一消化液为含有0.125％氯化钠、0.125％胰蛋白酶且pH为6.8的磷酸盐缓冲液；
第二消化液为含有0.25％胰蛋白酶且pH为7.8的磷酸盐缓冲液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；培养前2天时，x％＝10％；从培养第三天开始换液，吸取全部血清培养液，然后加入全新的血清培养液，其中，x％＝9％；从培养第四天开始，每12h，吸取一半的血清培养液，加入新的血清培养液后，每加入一次新的血清培养液后，使得x％按照1％的速率递减，直至x％＝5％，继续培养；其中所述血清培养液为含有体积分数为x％的胎牛血清和0.7％的谷氨酸的DMEM培养液；
6)当细胞达到85％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养，其中，所述血清培养液为含有体积分数7.5％的胎牛血清、4.5％的谷氨酰胺和0.9％谷氨酸。
对照例10
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入第一消化液于二氧化碳培养箱中消化30min，取出，利用PBS冲洗5次；再放入第二消化液于4℃消化12h；
其中，第一消化液为含有0.125％氯化钠、0.125％胰蛋白酶且pH为6.8的磷酸盐缓冲液；
第二消化液为含有0.25％胰蛋白酶且pH为7.8的磷酸盐缓冲液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；从培养第三天开始换液，吸取全部血清培养液，然后加入全新的血清培养液，其中所述血清培养液为含有体积分数为x％的胎牛血清、浓度为y％的谷氨酰胺和0.2y％的谷氨酸的DMEM培养液，其中，所述血清培养液为含有体积分数8.5％的胎牛血清、3.5％的谷氨酰胺和0.7％谷氨酸；
6)当细胞达到85％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养，其中，所述血清培养液为含有体积分数8.5％的胎牛血清、3.5％的谷氨酰胺和0.7％谷氨酸。
对照例11
一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)无菌条件下，取颌面外科手术中切除的多余口腔黏膜组织，置于含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡8min，切成0.3cm*1cm大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗5次；
2)将黏膜组织块放入第一消化液于二氧化碳培养箱中消化30min，取出，利用PBS冲洗5次；再放入第二消化液于4℃消化12h；
其中，第一消化液为含有0.125％氯化钠、0.125％胰蛋白酶且pH为6.8的磷酸盐缓冲液；
第二消化液为含有0.25％胰蛋白酶且pH为7.8的磷酸盐缓冲液；
3)取出后，用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后放入第二消化液中37℃消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；培养前2天时，x％＝10％；从培养第三天开始换液，吸取全部血清培养液，然后加入全新的血清培养液，其中，x％＝9.5％；从培养第四天开始，每12h，吸取一半的血清培养液，加入新的血清培养液后，每加入一次新的血清培养液后，使得x％按照0.5％的速率递减，直至x％＝7.5％，继续培养；其中所述血清培养液为含有体积分数为x％的胎牛血清、浓度为y％的谷氨酰胺和0.2y％的谷氨酸的DMEM培养液，其中，x％+y％＝12％；
6)当细胞达到85％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液消化，反复吹打，离心，重悬细胞沉淀；
7)细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，以1：2进行传代培养，其中，所述血清培养液为含有体积分数10％的胎牛血清的DMEM培养液。
培养效果考察
考察实施例3和对照例7至11的方法培养过程中，原代培养(即贴壁培养)贴壁率、细胞成活率和细胞培养传代的次数，结果见表2。检测24h细胞贴壁率，细胞贴壁率＝贴壁细胞数/单细胞悬液内细胞数量*100％。细胞成活率＝(细胞总数-死细胞数)/细胞总数*100％。
表2 贴壁率和传代次数的实验结果
Figure BDA0002535234480000191
从表中可以看出，与实施例1、对照例1和对照例2相比，采用本发明提供的贴壁培养的培养方法基血清培养液可以显著提高细胞贴壁率和贴壁培养后细胞的成活率及细胞传代次数；与对照例7相比，血清培养液中不含有谷氨酸时，细胞贴壁率显著降低；与对照例8相比，当血清培养液中胎牛血清和谷氨酰胺的浓度低于12％时，细胞贴壁率和成活率显著降低；与对照例9相比，当血清培养液中不包括谷氨酰胺且胎牛血清培养终浓度低于7.5％时，细胞贴壁率和成活率显著降低，传代次数也降低；与对照例10相比，当血清培养换液后的浓度一直不发送变化，细胞贴壁率显著降低；与对照例11相比，当传代培养基为10％的胎牛血清的DMEM培养液，传代次数显著降低。

Claims (9)

1.一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，其特征在于，所述分离培养方法包括如下步骤：
1)无菌条件下获取废弃的口腔黏膜，除去肉眼可见下的多余黏膜组织，置于含有10％血清的DMEM中，用PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡5-8min，切成大小均匀的组织块，用含有双抗的PBS冲洗3-5次；
2)将黏膜组织块消化1h；
3)用眼科镊轻轻提拉上皮层和上皮下层，将上皮层剥下，弃去上皮下层；
4)用PBS轻轻冲洗上皮层，然后置入消化液内消化30min后终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液；
5)将单细胞悬液接种于含有血清培养液的培养瓶中，贴壁培养。
2.如权利要求1所述的口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，其特征在于，所述将黏膜组织块消化1h具体为：将黏膜组织块放入第一消化液在二氧化碳培养箱中消化20-30min，取出，利用PBS冲洗5次；再放入第二消化液于4℃消化10-12h。
3.如权利要求2所述的口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，其特征在于，所述第一消化液为含有0.125％氯化钠、0.125％胰蛋白酶且pH为6.8的磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求2所述的口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，其特征在于，所述第二消化液为含有0.25％胰蛋白酶且pH为7.8的磷酸盐缓冲液。
5.如权利要求4所述的口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，其特征在于，步骤4)所述的消化液为第二消化液。
6.如权利要求1所述的口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，其特征在于，所述贴壁培养的具体方法为：
将单细胞悬液以2.5*105个/cm2的密度接种于含有血清培养液的培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。
7.如权利要求6所述的口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，其特征在于，所述血清培养液为含有体积分数为x％的胎牛血清、浓度为y％的谷氨酰胺和0.2y％的谷氨酸的DMEM培养液，其中，x％+y％＝12％，7.5％≤x％≤10％。
8.如权利要求7所述的口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，其特征在于，所述贴壁培养方法还包括：
培养前2天时，x％＝10％；
从培养第三天开始换液，吸取全部血清培养液，然后加入全新的血清培养液，其中，x％＝9.5％；
从培养第四天开始，每12h，吸取一半的血清培养基，加入新的血清培养基后，每加入一次新的血清培养基后，使得x％按照0.5％的速率递减，直至x％＝7.5％，继续培养。
9.如权利要求8所述的口腔黏膜上皮细胞分离培养方法，其特征在于，所述方法还包括：
6)当细胞达到80-90％汇合时，吸去血清培养液，利用第二消化液37℃消化30min，反复吹打成细胞悬液；
7)将细胞悬液接种于培养瓶中，以1：2进行传代培养。
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