CN108239621B - 一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法 - Google Patents
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：1)采集样本；2)胎盘亚全能干细胞的分离；3)胎盘亚全能干细胞的原代培养；4)胎盘亚全能干细胞的传代扩增培养；5)冻存；6)复苏。该方法分离得到的胎盘亚全能干细胞纯度高，原代培养的细胞活率高，冻存后的细胞污染率低，同时显著的提高了复苏后的胎盘亚全能干细胞扩增细胞的质量。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法。
背景技术
足月胎儿的胎盘呈盘状，直径约15-20cm，厚度约2.5-3.0cm，重量约450-500g，目前科学发现的胎盘干细胞中含有：胎盘间充质干细胞、胎盘亚全能干细胞、胎盘造血干细胞，亚全能干细胞是指具有三胚层分化潜能的一类干细胞亚群，在特定环境下，理论上可以诱导分化为人体任何一种组织细胞，主要来源于骨髓、脂肪、脐带和胎盘等间充质组织，由于脐带和胎盘来源的亚全能干细胞具有较强的分化能力、低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注，胎盘组织中含有多种亚全能干细胞，其采集部位比较多，比如羊膜、蜕膜、胎盘小叶等等，不同部位来源的亚全能干细胞的生长存在着一定的差异，而将不同的部位混合共同分离胎盘亚全能干细胞时，分离出的细胞的形态和存活率等的差异比较大，研究发现，胎儿面绒毛膜为胎盘亚全能干细胞的富集区域，但胎儿面绒毛膜中也含有大量的间充质干细胞，如果不去除该细胞，在后续培养过程中会影响亚全能干细胞的贴壁生长，胎盘胎盘亚全能干细胞还存在冻存复苏后的细胞容易老化等问题。
中国发明专利CN200810240040.8公开了一种亚全能干细胞、其制备方法及其用途，该方法制备的胎盘亚全能干细胞来源于剪断的人类脐带或胎盘，其在培养容器中贴壁生长，能向人体内、中、外胚层组织分化，该方法提供的胎盘亚全能干细胞需要扩增到四代以上，才能获得足够的细胞用于建立亚全能干细胞种子库，增殖能力较弱，增殖速度较缓慢，随着细胞传代次数增加，细胞活力下降，且将获得的细胞冻存后，经处理后再培养时，细胞易染菌。
发明内容
针对以上胎盘亚全能干细胞扩增过程中存在的增殖速度慢等问题，本发明提供了一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，该方法分离培养的胎盘亚全能干细胞纯度高，增殖块，细胞活率高，同时，该方法培养得到的胎盘亚全能干细胞纯度高，多次传代后的干细胞具有多向分化的潜能。
本发明具体技术方案如下：
一种胎盘亚全能干细胞分离培养方法，该方法包括如下步骤：
1)采集样本：取健康胎盘，去除羊膜和淤血，使用生理盐水对胎盘进行消毒处理，剪取胎儿面绒毛膜于玻璃皿中，剪碎至0.5mm3的小块，放置于采集瓶中，向采集瓶中添加200-400IU/mL的硫酸链霉素，24h内分离；
2)胎盘亚全能干细胞的分离：将步骤1)采集的样本进行细胞分离，获得胎盘亚全能干细胞；
3)胎盘亚全能干细胞的原代培养：将步骤2)获得的胎盘亚全能干细胞进行原代培养，获得原代胎盘亚全能干细胞；
4)胎盘亚全能干细胞的传代扩增培养：将步骤3)获得原代胎盘亚全能干细胞加入传代培养基悬浮细胞，以1000-1500个细胞/cm2的密度接种于滚瓶中，培养条件为：将滚瓶放置于滚瓶培养箱中，培养的前三天保持转速为20-25r/min，每天向培养基中添加如下浓度的组分组成的混合物：5％-10％的维生素C磷酸镁酯、2％-4％的肌苷、6％-10％的血小板裂解物和1％-3％的FGF，第四天开始将转速调至10-15r/min，更换传代培养基，待细胞融合至85％-90％，即得传代扩增培养细胞；
5)冻存：将步骤4)获得的传代扩增培养细胞放置于液氮条件下进行冻存，获得冻存细胞；
6)复苏：取出步骤5)获得的冻存细胞，进行复苏操作，得复苏胎盘亚全能干细胞。
进一步改进，所述传代培养基为包括10％-20％的维甲酸、2％-5％的转铁蛋白、20％-30％的人血白蛋白和1％-2％的重组人血管内皮细胞生长因子的F12培养基。
其中，FGF为成纤维细胞生长因子，浓度％的单位为g/L。
本发明通过以上方法对胎盘亚全能干细胞进行分离培养，获得的胎盘亚全能干细胞扩增快、增殖能力强。
进一步改进，步骤2)所述胎盘亚全能干细胞的分离具体包括以下方法：
将步骤1)采集瓶中的胎儿面绒毛膜吸出，取40重量份放入离心管中，在离心管中加入200-300重量份的DMEM培养基和2-5重量份的混合消化酶，充分混合均匀，在37℃，80-120r/min转速条件下震荡消化1-1.5h，用300μm细胞筛过滤，将滤液离心，去上清，在离心管中加入100-150重量份的HBSS缓冲液混匀，调节pH值至6-6.5，再加入10-20重量份的AEBSF和5-10重量份的E-64，离心2-5min，去上清，取沉淀用PBS缓冲液洗涤，收集胎盘亚全能干细胞。
进一步改进，混合消化酶由重量份数比为2-3:5-10的胰蛋白酶、和DNA酶。
其中，AEBSF为丝氨酸蛋白酶抑制剂，E-64为半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
本发明通过以上方法分离得到的胎盘亚全能干细胞纯度高，有效的去除了胎儿面绒毛膜中的间充质干细胞，提高了胎盘亚全能干细胞的纯度，降低间充质干细胞的数量，为接下来的细胞培养打好基础。
进一步改进，步骤3)具体包括以下方法：
3)胎盘亚全能干细胞的培养：将步骤2)分离得到的胎盘亚全能干细胞接种于原代培养基上，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37.5±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，培养时间为一周，隔1.5天对原代培养基进行一次全量换液，待细胞长满瓶底40％-50％时，加入0.2-0.5mg/mL的胰蛋白酶和0.5-1mg/mL的乳酸脱氢酶，待细胞长满瓶底75％-80％时，向培养瓶内加入1mL胰酶替代物，调pH值至8.5-9，待细胞变圆，立即终止消化收集，收获得原代干细胞。
本发明通过以上方法对细胞进行原代培养，可以显著的提高细胞的活性率，提高细胞的质量。
进一步改进，步骤5)所述冻存具体包括以下方法：
用1-5℃的冻存液重悬步骤4)获得的传代扩增培养细胞，使细胞的密度为1-1.5×106/ml，放入冻存盒中于-10℃条件下预冻4-6h，再加入20％-30％冻存液，调整温度为-40℃冻存2-3h，调整温度至-80℃冻存1-2h，调整温度至140℃冻存4-5h，放置于196℃的液氮中保存。
进一步改进，所述冻存液由以下重量份的组分组成：5-10的DMEM-F12、4-8的还原型谷胱甘肽、4-8的勃脉力A液、2-4的HEPES、2-4的丙酮酸钠和3-6的含人脐血血清。
其中，20％-30％为体积浓度，本发明通过以上冻存方法和冻存液对胎盘亚全能干细胞进行分离，可显著的降低胎盘亚全能干细胞的污染率，为复苏后的细胞扩增培养提供良好的基础。
进一步改进，步骤6)所述复苏具体包括以下方法：
从液氮中取出装有胎盘亚全能干细胞的离心管，25-30℃条件下平衡20-30min，再置于30-35℃水浴锅中水浴3-5min，取出，离心5-10min，去掉上清，向离心管中加入与去掉的上清液相同体积的复苏液，放置于超声清洗机中震荡10-20min，离心2-5min，去掉上清，即得复苏成功的胎盘亚全能干细胞；其中，该步骤全程避光。
进一步改进，复苏液包括以下重量份的成分：20-30的肝素和50-60的MS培养基。
本发明通过以上复苏方法和复苏液，显著的提高了复苏后的胎盘亚全能干细胞扩增细胞的质量，在扩增25代后，细胞依然未出现老化现象。
本发明提供了一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，该方法分离得到的胎盘亚全能干细胞纯度高，原代培养的细胞活率高，冻存后的细胞污染率低，同时显著的提高了复苏后的胎盘亚全能干细胞扩增细胞的质量。
实施例1
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)采集样本：取健康胎盘，去除羊膜和淤血，使用生理盐水对胎盘进行消毒处理，剪取胎儿面绒毛膜于玻璃皿中，剪碎至0.5mm3的小块，放置于采集瓶中，向采集瓶中添加200IU/mL的硫酸链霉素，24h内分离；
2)胎盘亚全能干细胞的分离：将步骤1)采集的样本进行细胞分离，获得胎盘亚全能干细胞；
3)胎盘亚全能干细胞的原代培养：将步骤2)获得的胎盘亚全能干细胞进行原代培养，获得原代胎盘亚全能干细胞；
4)胎盘亚全能干细胞的传代扩增培养：将步骤3)获得原代胎盘亚全能干细胞加入传代培养基悬浮细胞，以1000个细胞/cm2的密度接种于滚瓶中，培养条件为：将滚瓶放置于滚瓶培养箱中，培养的前三天保持转速为20r/min，每天向培养基中添加如下浓度的组分组成的混合物：5％的维生素C磷酸镁酯、2％的肌苷、6％的血小板裂解物和1％的FGF，第四天开始将转速调至10r/min，更换传代培养基，待细胞融合至85％-90％，即得传代扩增培养细胞；
5)冻存：将步骤4)获得的传代扩增培养细胞放置于液氮条件下进行冻存，获得冻存细胞；
6)复苏：取出步骤5)获得的冻存细胞，进行复苏操作，得复苏胎盘亚全能干细胞。
其中，所述传代培养基为包括10％的维甲酸、2％的转铁蛋白、20％的人血白蛋白和1％的重组人血管内皮细胞生长因子的F12培养基。
实施例2
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)采集样本：取健康胎盘，去除羊膜和淤血，使用生理盐水对胎盘进行消毒处理，剪取胎儿面绒毛膜于玻璃皿中，剪碎至0.5mm3的小块，放置于采集瓶中，向采集瓶中添加300IU/mL的硫酸链霉素，24h内分离；
2)胎盘亚全能干细胞的分离：将步骤1)采集的样本进行细胞分离，获得胎盘亚全能干细胞；
3)胎盘亚全能干细胞的原代培养：将步骤2)获得的胎盘亚全能干细胞进行原代培养，获得原代胎盘亚全能干细胞；
4)胎盘亚全能干细胞的传代扩增培养：将步骤3)获得原代胎盘亚全能干细胞加入传代培养基悬浮细胞，以1250个细胞/cm2的密度接种于滚瓶中，培养条件为：将滚瓶放置于滚瓶培养箱中，培养的前三天保持转速为23r/min，每天向培养基中添加如下浓度的组分组成的混合物：8％的维生素C磷酸镁酯、3％的肌苷、8％的血小板裂解物和2％的FGF，第四天开始将转速调至12r/min，更换传代培养基，待细胞融合至85％-90％，即得传代扩增培养细胞；
5)冻存：将步骤4)获得的传代扩增培养细胞放置于液氮条件下进行冻存，获得冻存细胞；
6)复苏：取出步骤5)获得的冻存细胞，进行复苏操作，得复苏胎盘亚全能干细胞。
其中，所述传代培养基为包括15％的维甲酸、3％的转铁蛋白、25％的人血白蛋白和1.5％的重组人血管内皮细胞生长因子的F12培养基。
其中，步骤2)所述胎盘亚全能干细胞的分离具体包括以下方法：
将步骤1)采集瓶中的胎儿面绒毛膜吸出，取40重量份放入离心管中，在离心管中加入200重量份的DMEM培养基和2重量份的混合消化酶，充分混合均匀，在37℃，80r/min转速条件下震荡消化1h，用300μm细胞筛过滤，将滤液离心，去上清，在离心管中加入100重量份的HBSS缓冲液混匀，调节pH值至6，再加入10重量份的AEBSF和5重量份的E-64，离心2min，去上清，取沉淀用PBS缓冲液洗涤，收集胎盘亚全能干细胞。
其中，混合消化酶由重量份数比为2.5:5的胰蛋白酶和DNA酶组成。
实施例3
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)采集样本：取健康胎盘，去除羊膜和淤血，使用生理盐水对胎盘进行消毒处理，剪取胎儿面绒毛膜于玻璃皿中，剪碎至0.5mm3的小块，放置于采集瓶中，向采集瓶中添加400IU/mL的硫酸链霉素，24h内分离；
2)胎盘亚全能干细胞的分离：将步骤1)采集的样本进行细胞分离，获得胎盘亚全能干细胞；
3)胎盘亚全能干细胞的原代培养：将步骤2)获得的胎盘亚全能干细胞进行原代培养，获得原代胎盘亚全能干细胞；
4)胎盘亚全能干细胞的传代扩增培养：将步骤3)获得原代胎盘亚全能干细胞加入传代培养基悬浮细胞，以1500个细胞/cm2的密度接种于滚瓶中，培养条件为：将滚瓶放置于滚瓶培养箱中，培养的前三天保持转速为25r/min，每天向培养基中添加如下浓度的组分组成的混合物：10％的维生素C磷酸镁酯、4％的肌苷、10％的血小板裂解物和3％的FGF，第四天开始将转速调至15r/min，更换传代培养基，待细胞融合至85％-90％，即得传代扩增培养细胞；
5)冻存：将步骤4)获得的传代扩增培养细胞放置于液氮条件下进行冻存，获得冻存细胞；
6)复苏：取出步骤5)获得的冻存细胞，进行复苏操作，得复苏胎盘亚全能干细胞。
其中，所述传代培养基为包括20％的维甲酸、5％的转铁蛋白、30％的人血白蛋白和2％的重组人血管内皮细胞生长因子的F12培养基。
其中，步骤2)所述胎盘亚全能干细胞的分离具体包括以下方法：
将步骤1)采集瓶中的胎儿面绒毛膜吸出，取40重量份放入离心管中，在离心管中加入250重量份的DMEM培养基和3重量份的混合消化酶，充分混合均匀，在37℃，100r/min转速条件下震荡消化1.2h用300μm细胞筛过滤，将滤液离心，去上清，在离心管中加入125重量份的HBSS缓冲液混匀，调节pH值至6.3，再加入15重量份的AEBSF和8重量份的E-64，离心3min，去上清，取沉淀用PBS缓冲液洗涤，收集胎盘亚全能干细胞。
其中，混合消化酶由重量份数比为3:10的胰蛋白酶和DNA酶组成。
实施例4
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例2的区别之处在于，步骤2)所述胎盘亚全能干细胞的分离具体包括以下方法：
将步骤1)采集瓶中的胎儿面绒毛膜吸出，取40重量份放入离心管中，在离心管中加入300重量份的DMEM培养基和5重量份的混合消化酶，充分混合均匀，在37℃，120r/min转速条件下震荡消化1.5h，用300μm细胞筛过滤，将滤液离心，去上清，在离心管中加入150重量份的HBSS缓冲液混匀，调节pH值至6.5，再加入20重量份的AEBSF和10重量份的E-64，离心5min，去上清，取沉淀用PBS缓冲液洗涤，收集胎盘亚全能干细胞。
其中，混合消化酶由重量份数比为2:8的胰蛋白酶和DNA酶组成。
其中，步骤3)所述的原代培养具体包括以下方法：
将步骤2)分离得到的胎盘亚全能干细胞接种于原代培养基上，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37.5±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，培养时间为一周，隔1.5天对原代培养基进行一次全量换液，待细胞长满瓶底40％时，加入0.2mg/mL的胰蛋白酶和0.5mg/mL的乳酸脱氢酶，待细胞长满瓶底75％-80％时，向培养瓶内加入1mL胰酶替代物，调pH值至8.5，待细胞变圆，立即终止消化收集，收获得原代干细胞。
实施例5
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例4的区别之处在于，步骤3)所述的原代培养和步骤5)所述的冻存具体包括以下方法：
步骤3)原代培养：将步骤2)分离得到的胎盘亚全能干细胞接种于原代培养基上，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37.5±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，培养时间为一周，隔1.5天对原代培养基进行一次全量换液，待细胞长满瓶底45％时，加入0.3mg/mL的胰蛋白酶和0.8mg/mL的乳酸脱氢酶，待细胞长满瓶底78％时，向培养瓶内加入1mL胰酶替代物，调pH值至8.8，待细胞变圆，立即终止消化收集，收获得原代干细胞。
步骤5)冻存：用1℃的冻存液重悬步骤4)获得的传代扩增培养细胞，使细胞的密度为1-1.5×106/ml，放入冻存盒中于-10℃条件下预冻4h，再加入20％冻存液，调整温度为-40℃冻存2h，调整温度至-80℃冻存1h，调整温度至140℃冻存4h，放置于196℃的液氮中保存。
其中，冻存液由以下重量份的组分组成：5的DMEM-F12、4的还原型谷胱甘肽、4的勃脉力A液、2的HEPES、2的丙酮酸钠和3的含人脐血血清。
实施例6
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例4的区别之处在于，步骤3)所述的原代培养和步骤5)所述的冻存具体包括以下方法：
步骤3)原代培养：将步骤2)分离得到的胎盘亚全能干细胞接种于原代培养基上，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37.5±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，培养时间为一周，隔1.5天对原代培养基进行一次全量换液，待细胞长满瓶底50％时，加入0.5mg/mL的胰蛋白酶和1mg/mL的乳酸脱氢酶，待细胞长满瓶底80％时，向培养瓶内加入1mL胰酶替代物，调pH值至9，待细胞变圆，立即终止消化收集，收获得原代干细胞。
步骤5)冻存：用3℃的冻存液重悬步骤4)获得的传代扩增培养细胞，使细胞的密度为1-1.5×106/ml，放入冻存盒中于-10℃条件下预冻5h，再加入25％冻存液，调整温度为-40℃冻存2.5h，调整温度至-80℃冻存1.5h，调整温度至140℃冻存4.5h，放置于196℃的液氮中保存。
其中，冻存液由以下重量份的组分组成：8的DMEM-F12、6的还原型谷胱甘肽、6的勃脉力A液、3的HEPES、3的丙酮酸钠和5的含人脐血血清。
实施例7
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例6的区别之处在于，步骤5)所述冻存具体包括以下方法：
用5℃的冻存液重悬步骤4)获得的传代扩增培养细胞，使细胞的密度为1-1.5×106/ml，放入冻存盒中于-10℃条件下预冻6h，再加入30％冻存液，调整温度为-40℃冻存3h，调整温度至-80℃冻存2h，调整温度至140℃冻存5h，放置于196℃的液氮中保存。
其中，冻存液由以下重量份的组分组成：10的DMEM-F12、8的还原型谷胱甘肽、8的勃脉力A液、4的HEPES、4的丙酮酸钠和6的含人脐血血清。
实施例8
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例8的区别之处在于，步骤6)所述复苏具体包括以下方法：
从液氮中取出装有胎盘亚全能干细胞的离心管，25℃条件下平衡20min，再置于30℃水浴锅中水浴3min，取出，离心5min，去掉上清，向离心管中加入与去掉的上清液相同体积的复苏液，放置于超声清洗机中震荡10min，离心2min，去掉上清，即得复苏成功的胎盘亚全能干细胞；其中，该步骤全程避光。
其中，复苏液包括以下重量份的成分：20的肝素和50的MS培养基。
实施例9
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例8的区别之处在于，步骤6)所述复苏具体包括以下方法：
从液氮中取出装有胎盘亚全能干细胞的离心管，28℃条件下平衡25min，再置于32℃水浴锅中水浴4min，取出，离心8min，去掉上清，向离心管中加入与去掉的上清液相同体积的复苏液，放置于超声清洗机中震荡15min，离心4min，去掉上清，即得复苏成功的胎盘亚全能干细胞；其中，该步骤全程避光。
其中，复苏液包括以下重量份的成分：25的肝素和55的MS培养基。
实施例10
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例8的区别之处在于，步骤6)所述复苏具体包括以下方法：
从液氮中取出装有胎盘亚全能干细胞的离心管，30℃条件下平衡30min，再置于35℃水浴锅中水浴5min，取出，离心10min，去掉上清，向离心管中加入与去掉的上清液相同体积的复苏液，放置于超声清洗机中震荡20min，离心5min，去掉上清，即得复苏成功的胎盘亚全能干细胞；其中，该步骤全程避光。
其中，复苏液包括以下重量份的成分：30的肝素和60的MS培养基。
对照例1
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例2的区别之处在于，滚瓶速度一直保持23r/min。
对照例2
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例2的区别之处在于，滚瓶速度一直保持12r/min。
对照例3
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例2的区别之处在于，步骤4)的具体方法如下：
将步骤3)获得原代胎盘亚全能干细胞加入传代培养基悬浮细胞，以1250个细胞/cm2的密度接种于滚瓶中，培养条件为：将滚瓶放置于滚瓶培养箱中，培养的前三天保持转速为23r/min，第四天开始将转速调至12r/min，更换传代培养基，待细胞融合至85％-90％，即得传代扩增培养细胞。
对照例4
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例2的区别之处在于，
将步骤3)获得原代胎盘亚全能干细胞加入传代培养基悬浮细胞，以1000-1500个细胞/cm2的密度接种于滚瓶中，培养条件为：将滚瓶放置于滚瓶培养箱中，培养的前三天保持转速为20-25r/min，第四天开始将转速调至10-15r/min，更换传代培养基，后三天每天向培养基中添加由浓度为5％-10％的维生素C磷酸镁酯、2％-4％的肌苷、6％-10％的血小板裂解物和1％-3％的FGF组成的混合物，待细胞融合至85％-90％，即得传代扩增培养细胞。
对照例5
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例2的区别之处在于，混合物中增加3％的腺嘌呤。
对照例6
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例2的区别之处在于，用bFGF代替FGF。
对照例7
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例4的区别之处在于，未添加DMEM培养基。
对照例8
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例4的区别之处在于，删除了震荡消化的步骤。
对照例9
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例4的区别之处在于，步骤2)所述胎盘亚全能干细胞的分离具体包括以下方法：
将步骤1)采集瓶中的胎儿面绒毛膜吸出，取40重量份放入离心管中，在离心管中加入300重量份的DMEM培养基和5重量份的混合消化酶，充分混合均匀，在37℃，120r/min转速条件下震荡消化1.5h，用300μm细胞筛过滤，将滤液离心，去上清，在离心管中加入150重量份的HBSS缓冲液混匀，再加入20重量份的AEBSF和10重量份的E-64，离心5min，去上清，取沉淀用PBS缓冲液洗涤，收集胎盘亚全能干细胞。
对照例10
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例4的区别之处在于，未添加AEBSF和E-64。
对照例11
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例6的区别之处在于，删除添加胰酶替代物的步骤。
对照例12
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例6的区别之处在于，去掉添加胰蛋白酶和乳酸脱氢酶的步骤。
对照例13
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例6的区别之处在于，将待细胞长满瓶底45％时替换为待细胞长满瓶底60％时。
对照例14
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例6的区别之处在于，将胰酶替代物的浓度替换为2mg/mL。
对照例15
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例6的区别之处在于，未加入25％冻存液。
对照例16
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例6的区别之处在于，将细胞密度由1-1.5×106/ml调整为1-1.5×107/ml。
对照例17
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例6的区别之处在于，步骤5)所述冻存具体包括以下方法：
用3℃的冻存液重悬步骤4)获得的传代扩增培养细胞，使细胞的密度为1-1.5×106/ml，放入冻存盒中于-10℃条件下预冻3h，再加入25％冻存液，调整温度至-80℃冻存3h，调整温度至160℃冻存8h，放置于196℃的液氮中保存。
对照例18
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例6的区别之处在于，在冻存液中加入5份的SOD。
对照例19
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例6的区别之处在于，用谷胱甘肽替换还原型谷胱甘肽。
对照例20
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例10的区别之处在于，删除全程避光的步骤。
对照例21
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例10的区别之处在于，删除30℃条件下平衡30min的步骤。
对照例22
一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，与实施例10的区别之处在于，删除置于35℃水浴锅中水浴5min的步骤。
试验例1增殖效率对比试验
分别取实施例1-3、对照例1-6提供的胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法和阳性对照组提供的方法传代扩增培养胎盘亚全能干细胞，其中，阳性对照组采用CN200810240040.8提供的方法，用胰酶消化后以1×104/mL接种于96孔培养板内，自当天起确定一个固定时间点，隔天取出3孔加入20μL5mg/mL的MTT，混匀，孵育6h后弃培养液，加入100μL异丙醇，分别在第1、3、5、7、9、11、13、15天用酶联免疫检测仪在490nm波长处测其OD值，取平均值，结果见表1。
表1胎盘亚全能干细胞的增殖检测
由表1可知，实施例1-3的扩增培养方法培养得到的胎盘亚全能干细胞的1-15天的OD值均高于对照例1-6，说明本发明提供的扩增培养方法得到的胎盘亚全能干细胞的增殖能力强，当增加、删除或替换本发明提供的混合物组分或步骤时，都会导致胎盘亚全能干细胞增殖能力的降低，并且，实施例2的OD值远远高于实施例1和实施例3的OD值，证明实施例2提供的方法能够显著增强胎盘亚全能干细胞的增殖能力。
试验例2细胞表面免疫表型遗传试验
分别取实施例2-4、对照例7-10提供的胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法分离得到的胎盘亚全能干细胞和阳性对照品，阳性对照品采用CN200810240040.8提供的方法分离培养得到的胎盘亚全能干细胞，调整细胞密度至1×106cells/ml，取实施例2-4、对照例7-10和阳性对照品的细胞混悬液各100μl，分别加入单克隆流式抗体SSEA4-FITC、Sox2-FITC、Oct4-FITC、CD34-FITC和CD45-FITC，混匀后于4℃避光孵育30min，然后用PBS缓冲液洗涤2次，再加入培养基重悬，然后分别用流式细胞仪检测实施例2-4、对照例7-10和阳性对照品的表面标志物的表达情况，结果见表2。
表2各组胎盘亚全能干细胞表面标志物检测结果
由表2可知，采用本发明实施例2-4提供的分离方法制得的胎盘亚全能干细胞对阳性标记的表达均高于对照例7-10和阳性对照品、对阴性标记的表达均低于对照例7-10和阳性对照品，证明本发明提供的方法分离得到的胎盘亚全能干细胞纯度高，混杂的间充质干细胞数量少，当改变本发明提供的分离方法中的某个步骤或因素时，培养出的胎盘亚全能干细胞的纯度降低，且实施例4的阳性标记表达率最高、阴性表达率最低，证明实施例4提供的分离方法分离出的胎盘亚全能干细胞的纯度最高。
试验例3胎盘亚全能干细胞活率试验
分别以实施例4-6和对照例11-14的方法进行胎盘亚全能干细胞的原代培养，取传获得的胎盘亚全能干细胞，用台盼蓝法测定细胞活率，结果见表3。
细胞活率＝(细胞总数-死细胞数)/细胞总数×100％。
表3各组胎盘亚全能干细胞细胞活率的检测结果
由表3可知，实施例4-6提供的原代培养方法培养的胎盘亚全能干细胞具有较高的活率，远远的高于对照例11-14，证明本发明提供的方法培养的胎盘亚全能干细胞具有较高的细胞活率，当改变该方法中的某个步骤或成分时，均会降低胎盘亚全能干细胞的细胞活率。
试验例4污染率试验
分别将胎盘亚全能干细胞用实施例5-7和对照例15-19的方法冻存，1年后，将冻存的细胞消化处理后进行培养，培养10天后，用菌落计数法检测细胞污染的数量，并计算污染率，结果如表4所示。
表4各组胎盘亚全能干细胞冻存后的污染率(％)
由表4可知，实施例5-7的方法冻存的胎盘亚全能干细胞经处理后再培养的污染率远远低于对照例15-19，证明本发明提供的冻存方法能够显著的降低胎盘亚全能干细胞的污染率，当改变该冻存方法中的步骤或成分时，均会降低其抗污染的能力，且实施例6的胎盘亚全能干细胞污染率最低，说明使用实施例6的冻存方法降低污染率的效果最好。
试验例5细胞老化代次试验
使用实施例8-10和对照例20-22的方法复苏冻存后的胎盘亚全能干细胞，并进行传代培养，观察细胞开始老化代次，结果见表5。
表5不同的复苏方法对细胞开始老化代次的影响
由表5可知，实施例8-10的方法复苏的细胞传代培养后开始老化的代次远远高于对照例20-22，证明本发明提供的复苏方法能够显著的提高胎盘亚全能干细胞传代培养后开始老化的代次，当改变该复苏方法中的某个步骤时，均会降低胎盘亚全能干细胞传代培养后开始老化的代次，且实施例10的胎盘亚全能干细胞开始老化的代次最高，达25代，说明使用实施例10的冻存方法的复苏效果最好。
Claims (7)
1.一种胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）采集样本：取健康胎盘，去除羊膜和淤血，使用生理盐水对胎盘进行消毒处理，剪取胎儿面绒毛膜于玻璃皿中，剪碎至0.5mm3的小块，放置于采集瓶中，向采集瓶中添加200-400IU/mL的硫酸链霉素，24h内分离；
2）胎盘亚全能干细胞的分离：将步骤1）采集的样本进行细胞分离，获得胎盘亚全能干细胞；
3）胎盘亚全能干细胞的原代培养：将步骤2）获得的胎盘亚全能干细胞进行原代培养，获得原代胎盘亚全能干细胞；
4）胎盘亚全能干细胞的传代扩增培养：将步骤3）获得原代胎盘亚全能干细胞加入传代培养基悬浮细胞，以1000-1500个细胞/cm2的密度接种于滚瓶中，培养条件为：将滚瓶放置于滚瓶培养箱中，培养的前三天保持转速为20-25r/min，每天向培养基中添加如下浓度的组分组成的混合物：5%-10%的维生素C磷酸镁酯、2%-4%的肌苷、6%-10%的血小板裂解物和1%-3%的FGF，第四天开始将转速调至10-15r/min，更换传代培养基，待细胞融合至85%-90%，即得传代扩增培养细胞；
5）冻存：将步骤4）获得的传代扩增培养细胞放置于液氮条件下进行冻存，获得冻存细胞；
6）复苏：取出步骤5）获得的冻存细胞，进行复苏操作，得复苏胎盘亚全能干细胞。
2.如权利要求1所述的胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，其特征在于，所述传代培养基为包括10%-20%的维甲酸、2%-5%的转铁蛋白、20%-30%的人血白蛋白和1%-2%的重组人血管内皮细胞生长因子的F12培养基。
3.如权利要求1所述的胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，其特征在于，步骤2）所述胎盘亚全能干细胞的分离具体包括以下方法：
将步骤1）采集瓶中的胎儿面绒毛膜吸出，取40重量份放入离心管中，在离心管中加入200-300重量份的DMEM培养基和2-5重量份的混合消化酶，充分混合均匀，在37℃，80-120r/min转速条件下震荡消化1-1.5h，用300μm细胞筛过滤，将滤液离心，去上清，在离心管中加入100-150重量份的HBSS缓冲液混匀，调节pH值至6-6.5，再加入10-20重量份的AEBSF和5-10重量份的E-64，离心2-5min，去上清，取沉淀用PBS缓冲液洗涤，收集胎盘亚全能干细胞。
4.如权利要求3所述的胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，其特征在于，所述混合消化酶由重量份数比为2-3:5-10的胰蛋白酶和DNA酶组成。
5.如权利要求1所述的胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，其特征在于，步骤3）所述的原代培养具体包括以下方法：
将步骤2）分离得到的胎盘亚全能干细胞接种于原代培养基上，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37.5±0.5℃、二氧化碳体积分数为 5±0.2%的条件下进行细胞培养，培养时间为一周，隔1.5天对原代培养基进行一次全量换液，待细胞长满瓶底40%-50%时，加入0.2-0.5mg/mL的胰蛋白酶和0.5-1mg/mL的乳酸脱氢酶，待细胞长满瓶底75%-80%时，向培养瓶内加入1mL胰酶替代物，调pH值至8.5-9，待细胞变圆，立即终止消化收集，收获得原代干细胞。
6.如权利要求1所述的胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，其特征在于，步骤6）所述复苏具体包括以下方法：
从液氮中取出装有胎盘亚全能干细胞的离心管，25-30℃条件下平衡20-30min，再置于30-35℃水浴锅中水浴3-5min，取出，离心5-10min，去掉上清，向离心管中加入与去掉的上清液相同体积的复苏液，放置于超声清洗机中震荡10-20min，离心2-5min，去掉上清，即得复苏成功的胎盘亚全能干细胞；其中，该步骤全程避光。
7.如权利要求6所述胎盘亚全能干细胞分离、扩增、冻存、复苏干细胞的方法，其特征在于，所述复苏液包括以下重量份的成分：20-30的肝素和50-60的MS培养基。
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