CN116875531A - 一种角膜内皮细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种角膜内皮细胞的培养方法,包括在复苏阶段时,使用复苏培养液培养解冻后的角膜内皮细胞,在传代阶段时,使用含云芝多糖的基础培养液进行培养,得目标角膜内皮细胞;复苏培养液包括在DMEM‑F12培养液中添加200~300mL/L胎牛血清、2~3μg/mL重组胰岛素、15~18ng/mL内皮细胞生长因子、25~30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5~8μg/mL叶黄素酯、2~4μg/mL盐藻黄素、0.5~0.8mM腺嘌呤和5~8ng/mL庆大霉素。本发明对角膜内皮细胞的贴壁生长具有一定影响,使冷冻复苏的角膜内皮细胞在体外培养4h时,细胞贴壁率达到70%以上,其复苏状态良好,体外增殖效率高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域,特别涉及一种角膜内皮细胞的培养方法。
背景技术
角膜内皮细胞位于角膜最内面,细胞质内的细胞器含量丰富,同时角膜内皮细胞与弹力层的连接较为松散,易从组织中脱离。近年来,对角膜缘干细胞的培养传代方法较多,一般采用组织法和酶消化法进行,能够从角膜缘干细胞分离得到内皮细胞。但在较长时间的保存下,易导致内皮细胞活力的降低,同时,在复苏角膜内皮细胞时,易使成纤维细胞生长速度极快而造成细胞种类混杂,降低了内皮细胞的细胞复苏状态。而角膜内皮细胞因外界因素引起细胞密度下降远超过正常值时,则会使其内皮细胞的功能出现障碍。角膜内皮细胞通常依靠细胞增殖来达到修复损失,关于如何促进角膜内皮细胞的增殖是目前的研究热点之一。
发明内容
鉴于此,本发明的目的在于提出一种角膜内皮细胞的培养方法,提高冷冻复苏的角膜内皮细胞的良好状态。
本发明的技术方案是这样实现的:
一种角膜内皮细胞的培养方法,包括在复苏阶段时,使用复苏培养液培养解冻后的角膜内皮细胞,在传代阶段时,使用含云芝多糖的基础培养液进行培养,得目标角膜内皮细胞;
复苏培养液包括在DMEM-F12培养液中添加200~300mL/L胎牛血清、2~3μg/mL重组胰岛素、15~18ng/mL内皮细胞生长因子、25~30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5~8μg/mL叶黄素酯、2~4μg/mL盐藻黄素、0.5~0.8mM腺嘌呤和5~8ng/mL庆大霉素。
选用胎牛血清、重组胰岛素、内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、叶黄素酯、盐藻黄素、腺嘌呤和庆大霉素制备的DMEM-F12复苏培养液,不仅给予角膜内皮细胞化学信号的影响,也为角膜内皮细胞提供良好的细胞外基质环境,帮助其黏附,并形成分层,促进其增殖以及延长细胞寿命。
进一步说明,基础培养液为DMEM培养液,云芝多糖的添加浓度为1~2μg/mL。
进一步说明,在复苏阶段时,将冻存的角膜内皮细胞水浴化开,加入复苏培养液,离心,取沉淀,加入复苏培养液,培养,弃去吸取上层的培养液后,重新加入复苏培养液,继续培养,得复苏角膜内皮细胞。
进一步说明,取沉淀,加入复苏培养液,所述培养的时间为2~3d;弃去吸取上层的培养液后,重新加入复苏培养液,所述继续培养的时间为1~2d。
进一步说明,在传代阶段时,通过逐步提高培养条件的CO2浓度占比,进行低氧胁迫培养,离心,取沉淀,再通过培养过程中更换1~2次含云芝多糖的基础培养液进行培养,得目标角膜内皮细胞。
进一步说明,所述低氧胁迫培养的方式为:每4~6h提高CO2浓度占比0.4~0.6%,培养20~28h。
更进一步说明,低氧胁迫培养共进行2~3次。
更进一步说明,在进行一次低氧胁迫培养后,还包括加入胰蛋白酶进行消化,胰蛋白酶的加入量为3~3.5g/L,消化时间为20~25min。
更进一步说明,更换1~2次含云芝多糖的基础培养液进行培养时,培养的CO2浓度为7~9%,培养的时间为1~2d。
进一步说明,所述角膜内皮细胞为人角膜内皮细胞。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明由胎牛血清、重组胰岛素、内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、叶黄素酯、盐藻黄素、腺嘌呤和庆大霉素制备的DMEM-F12复苏培养液,对角膜内皮细胞的贴壁生长具有一定影响,使冷冻复苏的角膜内皮细胞在体外培养4h时,细胞贴壁率达到70%以上,其复苏状态良好,体外增殖效率高。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容,下面提供具体实施例,对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
复苏培养液的组成为DMEM-F12培养液(含200mL/L胎牛血清、2μg/mL重组胰岛素、15ng/mL内皮细胞生长因子、25ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5μg/mL叶黄素酯、2μg/mL盐藻黄素、0.5mM腺嘌呤和5ng/mL庆大霉素);
基础培养液为DMEM培养液。
实施例2
(1)复苏:将冻存的人角膜内皮细胞取出,置于37℃水浴化开,加入复苏培养液,吹打均匀,2000rpm离心4min,取沉淀,加入复苏培养液,吹打均匀,置于37℃、5% CO2培养2d,吸取上层培养液,重新加入基础培养液,置于37℃、5% CO2再培养1d,得复苏人角膜内皮细胞;
(2)传代:将复苏人角膜内皮细胞接种至基础培养液中,设置培养箱的初始培养条件为:37℃,5% CO2,而后每4h提高CO2浓度0.5%,降低O2浓度0.5%,培养24h后,加入3g/L胰蛋白酶(酶活10U/mg),消化20min,更换新的基础培养液(含1μg/mL云芝多糖),继续以每4h提高CO2浓度0.5%,降低O2浓度0.5%的方式再培养24h,2000rpm离心4min,取沉淀,加入PBS缓冲液冲洗2次,加入基础培养液(含1μg/mL云芝多糖),吹打均匀,置于37℃、8% CO2培养2d,更换新的基础培养液,置于37℃、8% CO2培养1d,得目标人角膜内皮细胞。
实施例3
(1)复苏:将冻存的人角膜内皮细胞取出,置于37℃水浴化开,加入复苏培养液,吹打均匀,2000rpm离心4min,取沉淀,加入复苏培养液,吹打均匀,置于37℃、5% CO2培养2d,吸取上层培养液,重新加入基础培养液,置于37℃、5% CO2再培养1d,得复苏人角膜内皮细胞;
(2)传代:将复苏人角膜内皮细胞接种至基础培养液中,设置培养箱的培养条件为:37℃,5% CO2,培养24h后,加入3g/L胰蛋白酶(酶活10U/mg),消化20min,更换新的基础培养液再培养24h,2000rpm离心4min,取沉淀,加入PBS缓冲液冲洗2次,加入基础培养液,吹打均匀,置于37℃、5% CO2培养2d,更换新的基础培养液,置于37℃、5% CO2培养1d,得目标人角膜内皮细胞。
实施例4
(1)复苏:将冻存的人角膜内皮细胞取出,置于37℃水浴化开,加入复苏培养液,吹打均匀,2000rpm离心4min,取沉淀,加入复苏培养液,吹打均匀,置于37℃、5% CO2培养2d,吸取上层培养液,重新加入基础培养液,置于37℃、5% CO2再培养1d,得复苏人角膜内皮细胞;
(2)传代:将复苏人角膜内皮细胞接种至基础培养液中,设置培养箱的初始培养条件为:37℃,5% CO2,而后每8h提高CO2浓度0.5%,降低O2浓度0.5%,培养24h后,加入3g/L胰蛋白酶(酶活10U/mg),消化20min,更换新的基础培养液(含0.2μg/mL云芝多糖),继续以每8h提高CO2浓度0.5%,降低O2浓度0.5%的方式再培养24h,2000rpm离心4min,取沉淀,加入PBS缓冲液冲洗2次,加入基础培养液(含0.2μg/mL云芝多糖),吹打均匀,37℃,5% CO2培养2d,更换新的基础培养液,置于37℃、5% CO2培养1d,得目标人角膜内皮细胞。
试验例1
活细胞率计算:将细胞密度调整为1×105cells/mL,取9滴细胞培养液,加入1滴质量浓度0.4%的台盼蓝溶液,轻轻吹打均匀,在3min通过显微镜计算活细胞率,活细胞率=(活细胞数/细胞总数)×100%。
贴壁率计算:将细胞密度调整为2×104cells/mL,接种至24孔板,每4h取3孔细胞进行细胞计数,贴壁率=(贴壁活细胞数/接种细胞数)×100%,结果如下表所示。
由上表可知,实施例2的活细胞率达到99%,4h细胞贴壁率达到76%,表明细胞贴壁能力强,角膜内皮细胞复苏状态良好,增殖效率提高,能够降低成纤维细胞的污染,提高角膜内皮细胞的纯化效率。实施例3和实施例4的贴壁能力较差,尤其是实施例3,4h贴壁的细胞未超过70%,且贴壁后的细胞生长较慢,表明通过逐步提高CO2浓度占比的二次低氧胁迫培养,结合含一定浓度云芝多糖的基础培养基,在提高角膜内皮细胞低氧适应时,有助于调节角膜内皮细胞对能量代谢的适应性调节,促进细胞的快速增殖。
实施例5
复苏培养液的组成为DMEM-F12培养液(含300mL/L胎牛血清、3μg/mL重组胰岛素、18ng/mL内皮细胞生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、8μg/mL叶黄素酯、4μg/mL盐藻黄素、0.8mM腺嘌呤和8ng/mL庆大霉素)。
(1)复苏:将冻存的人角膜内皮细胞取出,置于37℃水浴化开,加入复苏培养液,吹打均匀,2000rpm离心4min,取沉淀,加入复苏培养液,吹打均匀,置于37℃、5% CO2培养2d,吸取上层培养液,重新加入基础培养液,置于37℃、5% CO2再培养1d,得复苏人角膜内皮细胞;
(2)传代:将复苏人角膜内皮细胞接种至基础培养液中,设置培养箱的初始培养条件为:37℃,5% CO2,而后每4h提高CO2浓度0.5%,降低O2浓度0.5%,培养24h后,加入3g/L胰蛋白酶(酶活10U/mg),消化20min,更换新的基础培养液(含1μg/mL云芝多糖),继续以每4h提高CO2浓度0.5%,降低O2浓度0.5%的方式再培养24h,2000rpm离心4min,取沉淀,加入PBS缓冲液冲洗2次,加入基础培养液(含1μg/mL云芝多糖),吹打均匀,置于37℃、8% CO2培养2d,更换新的基础培养液,置于37℃、8% CO2培养1d,得目标人角膜内皮细胞。
实施例6
复苏培养液的组成为DMEM-F12培养液(含200mL/L胎牛血清、2μg/mL重组胰岛素、15ng/mL内皮细胞生长因子、25ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5μg/mL叶黄素酯、2μg/mL盐藻黄素、0.5mM腺嘌呤和5ng/mL庆大霉素)。
(1)复苏:将冻存的人角膜内皮细胞取出,置于37℃水浴化开,加入复苏培养液,吹打均匀,2000rpm离心4min,取沉淀,加入复苏培养液,吹打均匀,置于37℃、5% CO2培养2d,吸取上层培养液,重新加入复苏培养液,置于37℃、5% CO2再培养1d,得复苏人角膜内皮细胞;
(2)传代:将复苏人角膜内皮细胞接种至复苏培养液中,设置培养箱的初始培养条件为:37℃,5% CO2,而后每4h提高CO2浓度0.5%,降低O2浓度0.5%,培养24h后,加入3g/L胰蛋白酶(酶活10U/mg),消化20min,更换新的复苏培养液,继续以每4h提高CO2浓度0.5%,降低O2浓度0.5%的方式再培养24h,2000rpm离心4min,取沉淀,加入PBS缓冲液冲洗2次,加入复苏培养液,吹打均匀,置于37℃、8% CO2培养2d,更换新的复苏培养液,置于37℃、8%CO2培养1d,得目标人角膜内皮细胞。
上述检测结果如下:
由上表可知,由胎牛血清、重组胰岛素、内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、叶黄素酯、盐藻黄素、腺嘌呤和庆大霉素制备的DMEM-F12复苏培养液,对角膜内皮细胞的贴壁生长具有一定影响,使用该DMEM-F12复苏培养液进行低氧胁迫培养,易导致基质成纤维细胞的过快增殖,限制角膜内皮细胞的充分分裂增殖,则反而降低了角膜内皮细胞的增殖能力。
实施例7
取实施例2-6培养的角膜内皮细胞,调整细胞浓度为1×104cells/mL,接种于24孔培养板,培养24h后,采用免疫组化检测试剂盒(上海沪峥生物科技有限公司)进行染色检测,结果显示培养的角膜内皮细胞的ABCG2、p63、PCNA、K3/K12和Cx43均为阳性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种角膜内皮细胞的培养方法,其特征在于,包括在复苏阶段时,使用复苏培养液培养解冻后的角膜内皮细胞,在传代阶段时,使用含云芝多糖的基础培养液进行培养,得目标角膜内皮细胞;
复苏培养液包括在DMEM-F12培养液中添加200~300mL/L胎牛血清、2~3μg/mL重组胰岛素、15~18ng/mL内皮细胞生长因子、25~30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5~8μg/mL叶黄素酯、2~4μg/mL盐藻黄素、0.5~0.8mM腺嘌呤和5~8ng/mL庆大霉素。
2.根据权利要求1所述角膜内皮细胞的培养方法,其特征在于,基础培养液为DMEM培养液,云芝多糖的添加浓度为1~2μg/mL。
3.根据权利要求1所述角膜内皮细胞的培养方法,其特征在于,在复苏阶段时,将冻存的角膜内皮细胞水浴化开,加入复苏培养液,离心,取沉淀,加入复苏培养液,培养,弃去吸取上层的培养液后,重新加入复苏培养液,继续培养,得复苏角膜内皮细胞。
4.根据权利要求3所述角膜内皮细胞的培养方法,其特征在于,取沉淀,加入复苏培养液,所述培养的时间为2~3d;弃去吸取上层的培养液后,重新加入复苏培养液,所述继续培养的时间为1~2d。
5.根据权利要求1所述角膜内皮细胞的培养方法,其特征在于,在传代阶段时,通过逐步提高培养条件的CO2浓度占比,进行低氧胁迫培养,离心,取沉淀,再通过培养过程中更换1~2次含云芝多糖的基础培养液进行培养,得目标角膜内皮细胞。
6.根据权利要求5所述角膜内皮细胞的培养方法,其特征在于,所述低氧胁迫培养的方式为:每4~6h提高CO2浓度占比0.4~0.6%,培养20~28h。
7.根据权利要求6所述角膜内皮细胞的培养方法,其特征在于,低氧胁迫培养共进行2~3次。
8.根据权利要求6所述角膜内皮细胞的培养方法,其特征在于,在进行一次低氧胁迫培养后,还包括加入胰蛋白酶进行消化,胰蛋白酶的加入量为3~3.5g/L,消化时间为20~25min。
9.根据权利要求5所述角膜内皮细胞的培养方法,其特征在于,更换1~2次含云芝多糖的基础培养液进行培养时,培养的CO2浓度为7~9%,培养的时间为1~2d。
10.根据权利要求1~9任意一项所述角膜内皮细胞的培养方法,其特征在于,所述角膜内皮细胞为人角膜内皮细胞。
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CN202310788932.6A CN116875531A (zh) | 2023-06-30 | 2023-06-30 | 一种角膜内皮细胞的培养方法 |
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- 2023-06-30 CN CN202310788932.6A patent/CN116875531A/zh active Pending
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