CN116875531A - 一种角膜内皮细胞的培养方法 - Google Patents
一种角膜内皮细胞的培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116875531A CN116875531A CN202310788932.6A CN202310788932A CN116875531A CN 116875531 A CN116875531 A CN 116875531A CN 202310788932 A CN202310788932 A CN 202310788932A CN 116875531 A CN116875531 A CN 116875531A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- endothelial cells
- culturing
- culture solution
- corneal endothelial
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 210000000399 corneal endothelial cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 241000222355 Trametes versicolor Species 0.000 claims abstract description 16
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 11
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims abstract description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims abstract description 9
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- KQXDHUJYNAXLNZ-XQSDOZFQSA-N Salinomycin Chemical compound O1[C@@H]([C@@H](CC)C(O)=O)CC[C@H](C)[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](CC)[C@@H]1[C@@H](C)C[C@@H](C)[C@@]2(C=C[C@@H](O)[C@@]3(O[C@@](C)(CC3)[C@@H]3O[C@@H](C)[C@@](O)(CC)CC3)O2)O1 KQXDHUJYNAXLNZ-XQSDOZFQSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000004189 Salinomycin Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N lutein Chemical compound C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\[C@H]1C(C)=C[C@H](O)CC1(C)C KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229960001548 salinomycin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 235000019378 salinomycin Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 16
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 6
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 26
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 9
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 69
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 25
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 22
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 15
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 6
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 description 1
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 101710087047 Cytoskeleton-associated protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 1
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102100027881 Tumor protein 63 Human genes 0.000 description 1
- 101710140697 Tumor protein 63 Proteins 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/33—Insulin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提出了一种角膜内皮细胞的培养方法，包括在复苏阶段时，使用复苏培养液培养解冻后的角膜内皮细胞，在传代阶段时，使用含云芝多糖的基础培养液进行培养，得目标角膜内皮细胞；复苏培养液包括在DMEM‑F12培养液中添加200～300mL/L胎牛血清、2～3μg/mL重组胰岛素、15～18ng/mL内皮细胞生长因子、25～30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5～8μg/mL叶黄素酯、2～4μg/mL盐藻黄素、0.5～0.8mM腺嘌呤和5～8ng/mL庆大霉素。本发明对角膜内皮细胞的贴壁生长具有一定影响，使冷冻复苏的角膜内皮细胞在体外培养4h时，细胞贴壁率达到70％以上，其复苏状态良好，体外增殖效率高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种角膜内皮细胞的培养方法。
背景技术
角膜内皮细胞位于角膜最内面，细胞质内的细胞器含量丰富，同时角膜内皮细胞与弹力层的连接较为松散，易从组织中脱离。近年来，对角膜缘干细胞的培养传代方法较多，一般采用组织法和酶消化法进行，能够从角膜缘干细胞分离得到内皮细胞。但在较长时间的保存下，易导致内皮细胞活力的降低，同时，在复苏角膜内皮细胞时，易使成纤维细胞生长速度极快而造成细胞种类混杂，降低了内皮细胞的细胞复苏状态。而角膜内皮细胞因外界因素引起细胞密度下降远超过正常值时，则会使其内皮细胞的功能出现障碍。角膜内皮细胞通常依靠细胞增殖来达到修复损失，关于如何促进角膜内皮细胞的增殖是目前的研究热点之一。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提出一种角膜内皮细胞的培养方法，提高冷冻复苏的角膜内皮细胞的良好状态。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种角膜内皮细胞的培养方法，包括在复苏阶段时，使用复苏培养液培养解冻后的角膜内皮细胞，在传代阶段时，使用含云芝多糖的基础培养液进行培养，得目标角膜内皮细胞；
复苏培养液包括在DMEM-F12培养液中添加200～300mL/L胎牛血清、2～3μg/mL重组胰岛素、15～18ng/mL内皮细胞生长因子、25～30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5～8μg/mL叶黄素酯、2～4μg/mL盐藻黄素、0.5～0.8mM腺嘌呤和5～8ng/mL庆大霉素。
选用胎牛血清、重组胰岛素、内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、叶黄素酯、盐藻黄素、腺嘌呤和庆大霉素制备的DMEM-F12复苏培养液，不仅给予角膜内皮细胞化学信号的影响，也为角膜内皮细胞提供良好的细胞外基质环境，帮助其黏附，并形成分层，促进其增殖以及延长细胞寿命。
进一步说明，基础培养液为DMEM培养液，云芝多糖的添加浓度为1～2μg/mL。
进一步说明，在复苏阶段时，将冻存的角膜内皮细胞水浴化开，加入复苏培养液，离心，取沉淀，加入复苏培养液，培养，弃去吸取上层的培养液后，重新加入复苏培养液，继续培养，得复苏角膜内皮细胞。
进一步说明，取沉淀，加入复苏培养液，所述培养的时间为2～3d；弃去吸取上层的培养液后，重新加入复苏培养液，所述继续培养的时间为1～2d。
进一步说明，在传代阶段时，通过逐步提高培养条件的CO2浓度占比，进行低氧胁迫培养，离心，取沉淀，再通过培养过程中更换1～2次含云芝多糖的基础培养液进行培养，得目标角膜内皮细胞。
进一步说明，所述低氧胁迫培养的方式为：每4～6h提高CO2浓度占比0.4～0.6％，培养20～28h。
更进一步说明，低氧胁迫培养共进行2～3次。
更进一步说明，在进行一次低氧胁迫培养后，还包括加入胰蛋白酶进行消化，胰蛋白酶的加入量为3～3.5g/L，消化时间为20～25min。
更进一步说明，更换1～2次含云芝多糖的基础培养液进行培养时，培养的CO2浓度为7～9％，培养的时间为1～2d。
进一步说明，所述角膜内皮细胞为人角膜内皮细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明由胎牛血清、重组胰岛素、内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、叶黄素酯、盐藻黄素、腺嘌呤和庆大霉素制备的DMEM-F12复苏培养液，对角膜内皮细胞的贴壁生长具有一定影响，使冷冻复苏的角膜内皮细胞在体外培养4h时，细胞贴壁率达到70％以上，其复苏状态良好，体外增殖效率高。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
复苏培养液的组成为DMEM-F12培养液(含200mL/L胎牛血清、2μg/mL重组胰岛素、15ng/mL内皮细胞生长因子、25ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5μg/mL叶黄素酯、2μg/mL盐藻黄素、0.5mM腺嘌呤和5ng/mL庆大霉素)；
基础培养液为DMEM培养液。
实施例2
(1)复苏：将冻存的人角膜内皮细胞取出，置于37℃水浴化开，加入复苏培养液，吹打均匀，2000rpm离心4min，取沉淀，加入复苏培养液，吹打均匀，置于37℃、5％ CO2培养2d，吸取上层培养液，重新加入基础培养液，置于37℃、5％ CO2再培养1d，得复苏人角膜内皮细胞；
(2)传代：将复苏人角膜内皮细胞接种至基础培养液中，设置培养箱的初始培养条件为：37℃，5％ CO2，而后每4h提高CO2浓度0.5％，降低O2浓度0.5％，培养24h后，加入3g/L胰蛋白酶(酶活10U/mg)，消化20min，更换新的基础培养液(含1μg/mL云芝多糖)，继续以每4h提高CO2浓度0.5％，降低O2浓度0.5％的方式再培养24h，2000rpm离心4min，取沉淀，加入PBS缓冲液冲洗2次，加入基础培养液(含1μg/mL云芝多糖)，吹打均匀，置于37℃、8％ CO2培养2d，更换新的基础培养液，置于37℃、8％ CO2培养1d，得目标人角膜内皮细胞。
实施例3
(1)复苏：将冻存的人角膜内皮细胞取出，置于37℃水浴化开，加入复苏培养液，吹打均匀，2000rpm离心4min，取沉淀，加入复苏培养液，吹打均匀，置于37℃、5％ CO2培养2d，吸取上层培养液，重新加入基础培养液，置于37℃、5％ CO2再培养1d，得复苏人角膜内皮细胞；
(2)传代：将复苏人角膜内皮细胞接种至基础培养液中，设置培养箱的培养条件为：37℃，5％ CO2，培养24h后，加入3g/L胰蛋白酶(酶活10U/mg)，消化20min，更换新的基础培养液再培养24h，2000rpm离心4min，取沉淀，加入PBS缓冲液冲洗2次，加入基础培养液，吹打均匀，置于37℃、5％ CO2培养2d，更换新的基础培养液，置于37℃、5％ CO2培养1d，得目标人角膜内皮细胞。
实施例4
(1)复苏：将冻存的人角膜内皮细胞取出，置于37℃水浴化开，加入复苏培养液，吹打均匀，2000rpm离心4min，取沉淀，加入复苏培养液，吹打均匀，置于37℃、5％ CO2培养2d，吸取上层培养液，重新加入基础培养液，置于37℃、5％ CO2再培养1d，得复苏人角膜内皮细胞；
(2)传代：将复苏人角膜内皮细胞接种至基础培养液中，设置培养箱的初始培养条件为：37℃，5％ CO2，而后每8h提高CO2浓度0.5％，降低O2浓度0.5％，培养24h后，加入3g/L胰蛋白酶(酶活10U/mg)，消化20min，更换新的基础培养液(含0.2μg/mL云芝多糖)，继续以每8h提高CO2浓度0.5％，降低O2浓度0.5％的方式再培养24h，2000rpm离心4min，取沉淀，加入PBS缓冲液冲洗2次，加入基础培养液(含0.2μg/mL云芝多糖)，吹打均匀，37℃，5％ CO2培养2d，更换新的基础培养液，置于37℃、5％ CO2培养1d，得目标人角膜内皮细胞。
试验例1
活细胞率计算：将细胞密度调整为1×105cells/mL，取9滴细胞培养液，加入1滴质量浓度0.4％的台盼蓝溶液，轻轻吹打均匀，在3min通过显微镜计算活细胞率，活细胞率＝(活细胞数/细胞总数)×100％。
贴壁率计算：将细胞密度调整为2×104cells/mL，接种至24孔板，每4h取3孔细胞进行细胞计数，贴壁率＝(贴壁活细胞数/接种细胞数)×100％，结果如下表所示。
由上表可知，实施例2的活细胞率达到99％，4h细胞贴壁率达到76％，表明细胞贴壁能力强，角膜内皮细胞复苏状态良好，增殖效率提高，能够降低成纤维细胞的污染，提高角膜内皮细胞的纯化效率。实施例3和实施例4的贴壁能力较差，尤其是实施例3，4h贴壁的细胞未超过70％，且贴壁后的细胞生长较慢，表明通过逐步提高CO2浓度占比的二次低氧胁迫培养，结合含一定浓度云芝多糖的基础培养基，在提高角膜内皮细胞低氧适应时，有助于调节角膜内皮细胞对能量代谢的适应性调节，促进细胞的快速增殖。
实施例5
复苏培养液的组成为DMEM-F12培养液(含300mL/L胎牛血清、3μg/mL重组胰岛素、18ng/mL内皮细胞生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、8μg/mL叶黄素酯、4μg/mL盐藻黄素、0.8mM腺嘌呤和8ng/mL庆大霉素)。
(1)复苏：将冻存的人角膜内皮细胞取出，置于37℃水浴化开，加入复苏培养液，吹打均匀，2000rpm离心4min，取沉淀，加入复苏培养液，吹打均匀，置于37℃、5％ CO2培养2d，吸取上层培养液，重新加入基础培养液，置于37℃、5％ CO2再培养1d，得复苏人角膜内皮细胞；
(2)传代：将复苏人角膜内皮细胞接种至基础培养液中，设置培养箱的初始培养条件为：37℃，5％ CO2，而后每4h提高CO2浓度0.5％，降低O2浓度0.5％，培养24h后，加入3g/L胰蛋白酶(酶活10U/mg)，消化20min，更换新的基础培养液(含1μg/mL云芝多糖)，继续以每4h提高CO2浓度0.5％，降低O2浓度0.5％的方式再培养24h，2000rpm离心4min，取沉淀，加入PBS缓冲液冲洗2次，加入基础培养液(含1μg/mL云芝多糖)，吹打均匀，置于37℃、8％ CO2培养2d，更换新的基础培养液，置于37℃、8％ CO2培养1d，得目标人角膜内皮细胞。
实施例6
复苏培养液的组成为DMEM-F12培养液(含200mL/L胎牛血清、2μg/mL重组胰岛素、15ng/mL内皮细胞生长因子、25ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5μg/mL叶黄素酯、2μg/mL盐藻黄素、0.5mM腺嘌呤和5ng/mL庆大霉素)。
(1)复苏：将冻存的人角膜内皮细胞取出，置于37℃水浴化开，加入复苏培养液，吹打均匀，2000rpm离心4min，取沉淀，加入复苏培养液，吹打均匀，置于37℃、5％ CO2培养2d，吸取上层培养液，重新加入复苏培养液，置于37℃、5％ CO2再培养1d，得复苏人角膜内皮细胞；
(2)传代：将复苏人角膜内皮细胞接种至复苏培养液中，设置培养箱的初始培养条件为：37℃，5％ CO2，而后每4h提高CO2浓度0.5％，降低O2浓度0.5％，培养24h后，加入3g/L胰蛋白酶(酶活10U/mg)，消化20min，更换新的复苏培养液，继续以每4h提高CO2浓度0.5％，降低O2浓度0.5％的方式再培养24h，2000rpm离心4min，取沉淀，加入PBS缓冲液冲洗2次，加入复苏培养液，吹打均匀，置于37℃、8％ CO2培养2d，更换新的复苏培养液，置于37℃、8％CO2培养1d，得目标人角膜内皮细胞。
上述检测结果如下：
由上表可知，由胎牛血清、重组胰岛素、内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、叶黄素酯、盐藻黄素、腺嘌呤和庆大霉素制备的DMEM-F12复苏培养液，对角膜内皮细胞的贴壁生长具有一定影响，使用该DMEM-F12复苏培养液进行低氧胁迫培养，易导致基质成纤维细胞的过快增殖，限制角膜内皮细胞的充分分裂增殖，则反而降低了角膜内皮细胞的增殖能力。
实施例7
取实施例2-6培养的角膜内皮细胞，调整细胞浓度为1×104cells/mL，接种于24孔培养板，培养24h后，采用免疫组化检测试剂盒(上海沪峥生物科技有限公司)进行染色检测，结果显示培养的角膜内皮细胞的ABCG2、p63、PCNA、K3/K12和Cx43均为阳性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种角膜内皮细胞的培养方法，其特征在于，包括在复苏阶段时，使用复苏培养液培养解冻后的角膜内皮细胞，在传代阶段时，使用含云芝多糖的基础培养液进行培养，得目标角膜内皮细胞；
复苏培养液包括在DMEM-F12培养液中添加200～300mL/L胎牛血清、2～3μg/mL重组胰岛素、15～18ng/mL内皮细胞生长因子、25～30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5～8μg/mL叶黄素酯、2～4μg/mL盐藻黄素、0.5～0.8mM腺嘌呤和5～8ng/mL庆大霉素。
2.根据权利要求1所述角膜内皮细胞的培养方法，其特征在于，基础培养液为DMEM培养液，云芝多糖的添加浓度为1～2μg/mL。
3.根据权利要求1所述角膜内皮细胞的培养方法，其特征在于，在复苏阶段时，将冻存的角膜内皮细胞水浴化开，加入复苏培养液，离心，取沉淀，加入复苏培养液，培养，弃去吸取上层的培养液后，重新加入复苏培养液，继续培养，得复苏角膜内皮细胞。
4.根据权利要求3所述角膜内皮细胞的培养方法，其特征在于，取沉淀，加入复苏培养液，所述培养的时间为2～3d；弃去吸取上层的培养液后，重新加入复苏培养液，所述继续培养的时间为1～2d。
5.根据权利要求1所述角膜内皮细胞的培养方法，其特征在于，在传代阶段时，通过逐步提高培养条件的CO2浓度占比，进行低氧胁迫培养，离心，取沉淀，再通过培养过程中更换1～2次含云芝多糖的基础培养液进行培养，得目标角膜内皮细胞。
6.根据权利要求5所述角膜内皮细胞的培养方法，其特征在于，所述低氧胁迫培养的方式为：每4～6h提高CO2浓度占比0.4～0.6％，培养20～28h。
7.根据权利要求6所述角膜内皮细胞的培养方法，其特征在于，低氧胁迫培养共进行2～3次。
8.根据权利要求6所述角膜内皮细胞的培养方法，其特征在于，在进行一次低氧胁迫培养后，还包括加入胰蛋白酶进行消化，胰蛋白酶的加入量为3～3.5g/L，消化时间为20～25min。
9.根据权利要求5所述角膜内皮细胞的培养方法，其特征在于，更换1～2次含云芝多糖的基础培养液进行培养时，培养的CO2浓度为7～9％，培养的时间为1～2d。
10.根据权利要求1～9任意一项所述角膜内皮细胞的培养方法，其特征在于，所述角膜内皮细胞为人角膜内皮细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310788932.6A CN116875531A (zh) | 2023-06-30 | 2023-06-30 | 一种角膜内皮细胞的培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310788932.6A CN116875531A (zh) | 2023-06-30 | 2023-06-30 | 一种角膜内皮细胞的培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116875531A true CN116875531A (zh) | 2023-10-13 |
Family
ID=88254042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310788932.6A Pending CN116875531A (zh) | 2023-06-30 | 2023-06-30 | 一种角膜内皮细胞的培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116875531A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117653789A (zh) * | 2023-11-29 | 2024-03-08 | 广东康盾高新技术产业集团股份公司 | 一种角膜脱细胞的方法 |
-
2023
- 2023-06-30 CN CN202310788932.6A patent/CN116875531A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117653789A (zh) * | 2023-11-29 | 2024-03-08 | 广东康盾高新技术产业集团股份公司 | 一种角膜脱细胞的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114317443B (zh) | 乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法 | |
| US8609408B2 (en) | Method for the reconstruction of a tissue-engineered human corneal endothelium | |
| CN116875531A (zh) | 一种角膜内皮细胞的培养方法 | |
| CN112553148A (zh) | 一种用于培养肉种子细胞体外扩大培养的改良培养基及其应用 | |
| CN114480273A (zh) | 用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基及其制备方法 | |
| CN110564675A (zh) | 一种毛囊干细胞的分离提取方法 | |
| CN111235101B (zh) | 一种人脐带间充质干细胞培养基及人脐带间充质干细胞的培养方法 | |
| CN114107173A (zh) | 一种血管化胰岛微器官及其构建方法 | |
| CN114574433B (zh) | 一种化学成分明确的用于肌源性细胞体外增殖的培养基 | |
| CN111088218A (zh) | 一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法 | |
| CN108753712B (zh) | 一种脂肪干细胞提取方法 | |
| CN113287603B (zh) | 一种生物样本保存液及其制备方法与应用 | |
| CN111849880B (zh) | 一种人脂肪间充质干细胞超低温冻存后的复苏方法 | |
| CN113088482A (zh) | 一种犊牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法 | |
| CN106834214B (zh) | 一种诱导多能干细胞形成角质形成细胞的诱导培养基及诱导方法 | |
| CN108034634B (zh) | 一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法 | |
| CN111593015A (zh) | 一种口腔黏膜上皮细胞分离培养方法 | |
| CN112941015B (zh) | 一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的添加剂及方法 | |
| CN112251397B (zh) | 一种新生猪胰岛细胞培养方法 | |
| CN112375731A (zh) | 一种皮肤成纤维细胞分离培养方法 | |
| CN113046300A (zh) | 一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法 | |
| CN113817674B (zh) | 一种适用于宫血干细胞高效扩增的培养基及应用 | |
| CN114763524A (zh) | 一种细胞的传代培养方法与应用 | |
| CN112075416A (zh) | 一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法 | |
| CN106834213B (zh) | 一种诱导多能干细胞形成毛乳头细胞的诱导培养基及诱导方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |