CN117653789A - 一种角膜脱细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种角膜脱细胞的方法，包括以下步骤：S1浸泡处理、S2预脱、S3激光脱层、S4气磁交联、S5梯度脱水及S6辐照灭菌等步骤，利用保护液对角膜进行浸泡，通过原料选择对角膜后弹力层细胞保护，调整渗透压使角膜上皮层细胞溶胀有利于脱细胞液对其脱除，使前弹力层暴露，通过激光对其切割对前弹力层和基质层分离，再通过气磁交联能对角膜基质胶原无损伤脱除，本发明步骤协同发挥作用，脱细胞角膜高，胶原纤维排列整齐，未见细胞附着，未见染色细胞及胶原断裂现象，最大程度保护角膜基质的生物学特性并有效地去除基质细胞，保留天然角膜结构特征和功能以用于组织工程人工角膜构建，是一种较为理想的组织工程角膜的支架材料。
Description
技术领域
本发明涉及角膜细胞工程技术领域，特别涉及一种角膜脱细胞的方法。
背景技术
角膜是维持人体正常视力最重要的组织之一，天然角膜从外至内是由上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层组成，其中基质层是由有序的胶原束与蛋白聚糖排列组成的透明组织，胶原束直径为22～32nm，间距约30nm，该空间距离是由胶原与蛋白聚糖分子中的氢键所维持，这种结构能阻止散光发生，并为角膜提供特殊生物力学性能以抵御眼内压力。
角膜会由于发生圆锥角膜、大泡性角膜、真菌感染、外伤瘫痕等疾病造成视力下降或失明，中国公民因单眼和双眼角膜病致盲的盲人约300～500万，仅次于白内障，现今角膜盲已成为全球第二大致盲性疾病。导致角膜盲的主要疾病包括各种感染性角膜病、角膜变性、严重机械外伤、眼表化学伤、重症干眼症等，几乎涵盖了所有角膜病种。角膜炎的临床病理过程可以分为四个阶段，即炎症期、溃疡期、消退期、愈合期。第一个阶段为角膜浸润期，由于致病因子形成局限性或丛簇样灰白色混浊病灶，引起眼睛明显的刺激症状和视力下降。第二个阶段是角膜溃疡形成期，炎症继续加重，病变组织发生变性、坏死、脱落，形成角膜溃疡，溃疡区角膜变薄，在眼压的作用下可以造成角膜后弹力层膨出甚至穿孔。第三个阶段是角膜炎症消退期，炎症因子被抑制了活性，溃疡边缘炎症减轻，基质坏死脱落停止，病灶逐步消退，患者自觉症状明显改善。第四个阶段是角膜炎愈合期，炎症因子被控制以后，角膜炎症病灶逐步吸收，溃疡凹面被增殖的结缔组织充填，形成疤痕。
脱细胞技术是当前组织工程中应用广泛的生物材料，这类材料的使用创新了许多眼科疾病的治疗方式，但当前脱细胞组织材料制备采用的技术方法多而复杂，在受体组织中易降解，以及物理、化学及生物方法进行脱细胞处理时难免对组织固有结构造成影响。另外，脱细胞材料尚无统一的评价标准，研究中的部分材料脱细胞不完全等问题都可能影响最终的治疗效果，需进一步的研究来解决。脱细胞组织材料可以应用于大部分眼部结构的重建手术，具有良好的治疗效果，但同时也存在植片溶解、新生血管植入、适应时间较长、植片收缩及细胞化不完全等不足，需研究出现这些并发症的病理生理机制以寻找有效的解决方案。为尽量降低发生免疫反应的风险，用于角膜移植的角膜基质需提前对角膜基质上的基质细胞进行脱细胞处理。脱细胞处理方式由起初的传统冻融法发展至当今普遍应用的表面活性剂(即去污剂)洗脱法、液氮冻融法以及高静水压力法等，但均存在一些难以规避的问题：例如反复冻融和高静水压力处理均可能导致胶原断裂，损伤角膜基质的张力；而表面活性剂均具有较大的毒性，处理后难以应用于临床，如何在脱细胞处理的同时保持组织固有结构仍是一大难题，基质结构受影响可能导致角膜植片的稳定下降，导致移植失败，需进一步研究来完善。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种角膜脱细胞的方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种角膜脱细胞的方法：包括以下步骤：
步骤S1、浸泡处理：将摘取的完整的动物源性角膜置于保护液中，保护液是角膜重量的3-5倍，调整pH为7-9，温度30-50℃下浸泡3-8h；
步骤S2、预脱：将浸泡后角膜取出，置于脱细胞液中，角膜和脱细胞液的质量体积为1.2:(3-5)g/mL，在温度-5～-2℃下使用超声振荡处理25-35min，使上皮层脱落，使角膜前弹力层暴露；
步骤S3、激光脱层：将上述预脱后的角膜放入激光发生器中进行激光爆破、气化切割，去除角膜前弹力层；
步骤S4、气磁交联：将上述前弹力层的角膜与电磁液混合，放入离心管中，角膜与电磁液占离心管体积的1/5-1/4，往离心管内充满氮气，并用封管膜封管，在转速为4000-6000rpm下恒温振荡处理12-24h，并间断性施加脉冲磁场，即得到脱基质细胞的角膜基质；
步骤S5、梯度脱水：将步骤S4得到的角膜基质用质量摩尔数0.01-0.3M的NaCl溶液洗涤3-5次/30min，再用质量百分比40％、60％、80％、90％、95％和100％乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后用体积比为5-10:1的甘油和水洗5-10min，得到脱细胞角膜；
步骤S6、辐照灭菌：将脱细胞角膜用钴-60辐照灭菌，辐照剂量为5-10kGy。
进一步的，所述步骤S1的保护液为浓度为3-7％w/v的海藻糖溶液、0.5-5％w/v盐酸萘甲唑林水溶液，二者比值为3-5:0.3-0.9v/v。
进一步的，所述保护液渗透压为150-200mOsm。
进一步的，所述步骤S2的脱细胞液的pH值为7.0-7.4，所述脱细胞液按质量百分比计包括以下的组分：5-10％浓度2-5％w/v的水合乙二胺四乙酸三钠盐、12-18％中性蛋白酶、3-9％聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲溶液。
进一步的，所述步骤S2的超声振荡频率150-200kHz，超声功率为40-60W。
进一步的，所述步骤S3的激光波长为1020-1040nm，重复频率为37-42MHz，平均功率为100-120W，脉冲宽度为300-500fs。
进一步的，所述步骤S4的电磁液为浓度为0.09-0.15mg/mL石墨烯胶体溶液。
进一步的，所述步骤S4的脉冲磁场强度为1.0-1.8T，磁场梯度为15-20T/m，脉冲次数100-300次，磁场频率为10-18kHz，脉冲磁化时间为5-10min，每次间隔20-50s。
进一步的，所述步骤S4的恒温温度为35-45℃。
进一步的，所述动物源性角膜为小鼠、豚鼠、白兔、猫、狗、猪和牛的角膜中的任一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明使用浸泡处理、预脱、激光脱层、气磁交联、梯度脱水以及辐照灭菌对角膜进行脱细胞，得到的脱细胞角膜透光度为79.2-80.6％，完全透明，胶原纤维排列整齐，未见细胞附着，未见染色细胞及胶原断裂现象；其中浸泡处理中采用保护液对角膜后弹力层细胞保护，促进上皮层细胞渗透，并使其溶胀，再置于脱细胞液中，在低温状态下超声去除上皮层细胞，打开角膜原有胶原结构，采用激光脱层，能将前弹力层和基质层的脱细胞角膜基质层分离，通过气磁交联能对角膜基质胶原无损伤脱除；具有脱细胞完全、对角膜基质胶原无损伤、全部流程中应用的药剂均无毒性等优点，可最大程度保护角膜基质的生物学特性并有效地去除基质细胞，保留其天然角膜结构特征和功能以用于组织工程人工角膜构建，是一种较为理想的组织工程角膜的支架材料。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种角膜脱细胞的方法：包括以下步骤：
步骤S1、浸泡处理：将摘取的完整的猪角膜置于保护液中，保护液是角膜重量的3倍，渗透压为150mOsm，调整pH为7，温度30℃下浸泡3h；保护液为体积比3:0.3的浓度3％w/v的海藻糖溶液和0.5％w/v盐酸萘甲唑林水溶液；
步骤S2、预脱：将浸泡后角膜取出，置于脱细胞液中，脱细胞液的pH值为7.0，角膜和脱细胞液的质量体积为1.2:3g/mL，所述脱细胞液按质量百分比计包括以下的组分：5％浓度2％w/v的水合乙二胺四乙酸三钠盐、12％中性蛋白酶、3％聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲溶液，在温度-5℃下使用超声振荡处理25min，超声振荡频率150kHz，超声功率为40W，使上皮层脱落，使角膜前弹力层暴露；
步骤S3、激光脱层：将上述预脱后的角膜放入激光发生器中进行激光爆破、气化切割，激光波长为1020nm，重复频率为37MHz，平均功率为100W，脉冲宽度为300fs，去除角膜前弹力层；
步骤S4、气磁交联：将上述前弹力层的角膜与电磁液混合，电磁液为浓度为0.09mg/mL石墨烯胶体溶液，放入离心管中，角膜与电磁液占离心管体积的1/5，往离心管内充满氮气，并用封管膜封管，在转速为4000rpm恒温35℃下振荡处理12h，并间断性施加脉冲磁场，脉冲磁场强度为1.0T，磁场梯度为15T/m，脉冲次数100次，磁场频率为10kHz，脉冲磁化时间为5min，每次间隔20s，即得到脱基质细胞的角膜基质；
步骤S5、梯度脱水：将步骤S4得到的角膜基质用质量摩尔数0.01M的NaCl溶液洗涤3次/30min，再用质量百分比40％、60％、80％、90％、95％和100％乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后用体积比为5:1的甘油和水洗5min，得到脱细胞角膜；
步骤S6、辐照灭菌：将脱细胞角膜用钴-60辐照灭菌，辐照剂量为5kGy。
实施例2
一种角膜脱细胞的方法：包括以下步骤：
步骤S1、浸泡处理：将摘取的完整的猪角膜置于保护液中，保护液是角膜重量的5倍，渗透压为200mOsm，调整pH为9，温度50℃下浸泡8h；保护液为体积比5:0.9的浓度7％w/v的海藻糖溶液和5％w/v盐酸萘甲唑林水溶液；
步骤S2、预脱：将浸泡后角膜取出，置于脱细胞液中，脱细胞液的pH值为7.4，角膜和脱细胞液的质量体积为1.2:5g/mL，所述脱细胞液按质量百分比计包括以下的组分：10％浓度5％w/v的水合乙二胺四乙酸三钠盐、18％中性蛋白酶、9％聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲溶液，在温度-2℃下使用超声振荡处理35min，超声振荡频率200kHz，超声功率为60W，使上皮层脱落，使角膜前弹力层暴露；
步骤S3、激光脱层：将上述预脱后的角膜放入激光发生器中进行激光爆破、气化切割，激光波长为1040nm，重复频率为42MHz，平均功率为120W，脉冲宽度为500fs，去除角膜前弹力层；
步骤S4、气磁交联：将上述前弹力层的角膜与电磁液混合，电磁液为浓度为0.15mg/mL石墨烯胶体溶液，放入离心管中，角膜与电磁液占离心管体积的1/4，往离心管内充满氮气，并用封管膜封管，在转速为6000rpm恒温35-45℃下振荡处理24h，并间断性施加脉冲磁场，脉冲磁场强度为1.8T，磁场梯度为20T/m，脉冲次数300次，磁场频率为18kHz，脉冲磁化时间为10min，每次间隔50s，即得到脱基质细胞的角膜基质；
步骤S5、梯度脱水：将步骤S4得到的角膜基质用质量摩尔数0.01-0.3M的NaCl溶液洗涤5次/30min，再用质量百分比40％、60％、80％、90％、95％和100％乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后用体积比为10:1的甘油和水洗10min，得到脱细胞角膜；
步骤S6、辐照灭菌：将脱细胞角膜用钴-60辐照灭菌，辐照剂量为5-10kGy。
实施例3
一种角膜脱细胞的方法：包括以下步骤：
步骤S1、浸泡处理：将摘取的完整的猪角膜置于保护液中，保护液是角膜重量的4倍，渗透压为180mOsm，调整pH为8，温度30-50℃下浸泡3-8h；保护液为体积比4:0.7的浓度5％w/v的海藻糖溶液和3％w/v盐酸萘甲唑林水溶液；
步骤S2、预脱：将浸泡后角膜取出，置于脱细胞液中，脱细胞液的pH值为7.2，角膜和脱细胞液的质量体积为1.2:4g/mL，所述脱细胞液按质量百分比计包括以下的组分：8％浓度3％w/v的水合乙二胺四乙酸三钠盐、15％中性蛋白酶、7％聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲溶液，在温度-4℃下使用超声振荡处理30min，超声振荡频率180kHz，超声功率为50W，使上皮层脱落，使角膜前弹力层暴露；
步骤S3、激光脱层：将上述预脱后的角膜放入激光发生器中进行激光爆破、气化切割，激光波长为1030nm，重复频率为40MHz，平均功率为110W，脉冲宽度为400fs，去除角膜前弹力层；
步骤S4、气磁交联：将上述前弹力层的角膜与电磁液混合，电磁液为浓度为0.12mg/mL石墨烯胶体溶液，放入离心管中，角膜与电磁液占离心管体积的1/5，往离心管内充满氮气，并用封管膜封管，在转速为5000rpm恒温40℃下振荡处理18h，并间断性施加脉冲磁场，脉冲磁场强度为1.4T，磁场梯度为18T/m，脉冲次数200次，磁场频率为14kHz，脉冲磁化时间为8min，每次间隔35s，即得到脱基质细胞的角膜基质；
步骤S5、梯度脱水：将步骤S4得到的角膜基质用质量摩尔数0.2M的NaCl溶液洗涤4次/30min，再用质量百分比40％、60％、80％、90％、95％和100％乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后用体积比为8:1的甘油和水洗8min，得到脱细胞角膜；
步骤S6、辐照灭菌：将脱细胞角膜用钴-60辐照灭菌，辐照剂量为8kGy。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于，所述角膜脱细胞的方法不进行步骤S3的激光脱层；具体包括以下步骤：
步骤S1、浸泡处理：将摘取的完整的猪角膜置于保护液中，保护液是角膜重量的4倍，渗透压为180mOsm，调整pH为8，温度30-50℃下浸泡3-8h；保护液为体积比4:0.7的浓度5％w/v的海藻糖溶液和3％w/v盐酸萘甲唑林水溶液；
步骤S2、预脱：将浸泡后角膜取出，置于脱细胞液中，脱细胞液的pH值为7.2，角膜和脱细胞液的质量体积为1.2:4g/mL，所述脱细胞液按质量百分比计包括以下的组分：8％浓度3％w/v的水合乙二胺四乙酸三钠盐、15％中性蛋白酶、7％聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲溶液，在温度-4℃下使用超声振荡处理30min，超声振荡频率180kHz，超声功率为50W，使上皮层脱落，使角膜前弹力层暴露；
步骤S3、气磁交联：将上述角膜与电磁液混合，电磁液为浓度为0.12mg/mL石墨烯胶体溶液，放入离心管中，角膜与电磁液占离心管体积的1/5，往离心管内充满氮气，并用封管膜封管，在转速为5000rpm恒温40℃下振荡处理18h，并间断性施加脉冲磁场，脉冲磁场强度为1.4T，磁场梯度为18T/m，脉冲次数200次，磁场频率为14kHz，脉冲磁化时间为8min，每次间隔35s，即得到脱基质细胞的角膜基质；
步骤S4、梯度脱水：将步骤S4得到的角膜基质用质量摩尔数0.2M的NaCl溶液洗涤4次/30min，再用质量百分比40％、60％、80％、90％、95％和100％乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后用体积比为8:1的甘油和水洗8min，得到脱细胞角膜；
步骤S5、辐照灭菌：将脱细胞角膜用钴-60辐照灭菌，辐照剂量为8kGy。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于，所述角膜脱细胞的方法不进行步骤S4的气磁交联；具体包括以下步骤：
步骤S1、浸泡处理：将摘取的完整的猪角膜置于保护液中，保护液是角膜重量的4倍，渗透压为180mOsm，调整pH为8，温度30-50℃下浸泡3-8h；保护液为体积比4:0.7的浓度5％w/v的海藻糖溶液和3％w/v盐酸萘甲唑林水溶液；
步骤S2、预脱：将浸泡后角膜取出，置于脱细胞液中，脱细胞液的pH值为7.2，角膜和脱细胞液的质量体积为1.2:4g/mL，所述脱细胞液按质量百分比计包括以下的组分：8％浓度3％w/v的水合乙二胺四乙酸三钠盐、15％中性蛋白酶、7％聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲溶液，在温度-4℃下使用超声振荡处理30min，超声振荡频率180kHz，超声功率为50W，使上皮层脱落，使角膜前弹力层暴露；
步骤S3、激光脱层：将上述预脱后的角膜放入激光发生器中进行激光爆破、气化切割，激光波长为1030nm，重复频率为40MHz，平均功率为110W，脉冲宽度为400fs，去除角膜前弹力层；
步骤S4、梯度脱水：将步骤S4得到的角膜基质用质量摩尔数0.2M的NaCl溶液洗涤4次/30min，再用质量百分比40％、60％、80％、90％、95％和100％乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后用体积比为8:1的甘油和水洗8min，得到脱细胞角膜；
步骤S5、辐照灭菌：将脱细胞角膜用钴-60辐照灭菌，辐照剂量为8kGy。
一、结果检测
将上述实施例1-3和对比例1-2的方法得到的脱细胞角膜基质进行HE染色观察、超微结构透射电镜观察，与天然角膜对比，观察结果如下：
实验结果表明，本发明的角膜脱细胞方法，透光度为79.2-80.6％，完全透明，胶原纤维排列整齐，未见细胞附着，未见染色细胞及胶原断裂现象；实施例组与对比例1比较，采用激光脱层，能将前弹力层和基质层的脱细胞角膜基质分离，有利于基质层的脱离；与对比例2比较，通过气磁交联能对角膜基质胶原无损伤脱除，无明显细胞成分残留，基质组织结构接近正常角膜，未见明显纤维碎裂、溶解，最大程度保护角膜基质并有效地去除基质细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种角膜脱细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S1、浸泡处理：将摘取的完整的动物源性角膜置于保护液中，保护液是角膜重量的3-5倍，调整保护液pH为7-9，在温度30-50℃下浸泡3-8h；
步骤S2、预脱：将浸泡后角膜取出，置于脱细胞液中，角膜和脱细胞液的质量体积比为1.2g:3-5mL，在温度-5～-2℃下使用超声振荡处理25-35min，使上皮层脱落，使角膜前弹力层暴露；
步骤S3、激光脱层：将S2预脱后的角膜放入激光发生器中进行激光爆破、气化切割，去除角膜前弹力层；
步骤S4、气磁交联：将S3脱去前弹力层的角膜与电磁液混合，放入离心管中，角膜与电磁液占离心管体积的1/5-1/4，往离心管内充满氮气，并用封管膜封管，在转速为4000-6000rpm下恒温振荡处理12-24h，并施加脉冲磁场，即得到脱基质细胞的角膜基质；
步骤S5、梯度脱水：将步骤S4得到的角膜基质用浓度为0.01-0.3mol/L的NaCl溶液洗涤3-5次/30min，再用质量百分比为40％、60％、80％、90％、95％和100％的乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后用体积比为5-10:1的甘油和水洗5-10min，得到脱细胞角膜；
步骤S6、辐照灭菌：将脱细胞角膜用钴-60辐照灭菌，辐照剂量为5-10kGy。
2.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S1的保护液为浓度为3-7％w/v的海藻糖溶液、0.5-5％w/v盐酸萘甲唑林水溶液，海藻糖溶液和盐酸萘甲唑林水溶液体积比为3-5:0.3-0.9。
3.如权利要求2所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述保护液渗透压为150-200mOsm。
4.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S2的脱细胞液的pH值为7.0-7.4，所述脱细胞液按质量百分比计包括以下的组分：5-10％浓度2-5％w/v的水合乙二胺四乙酸三钠盐、12-18％中性蛋白酶、3-9％聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲溶液。
5.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S2的超声振荡频率150-200kHz，超声功率为40-60W。
6.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S3的激光波长为1020-1040nm，重复频率为37-42MHz，平均功率为100-120W，脉冲宽度为300-500fs。
7.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S4的电磁液为浓度为0.09-0.15mg/mL石墨烯胶体溶液。
8.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S4的脉冲磁场强度为1.0-1.8T，磁场梯度为15-20T/m，脉冲次数100-300次，磁场频率为10-18kHz，脉冲磁化时间为5-10min，每次间隔20-50s。
9.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S4的恒温温度为35-45℃。
10.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述动物源性角膜为小鼠、豚鼠、白兔、猫、狗、猪和牛的角膜中的任一种。
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