CN101917932B - 处理猪角膜以脱细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于处理猪角膜的方法，所述方法使用NaCl水溶液和胰蛋白酶/EDTA水溶液对摘出的猪角膜脱细胞化。通过所述方法处理的猪角膜既不会引起炎症也不会引起免疫排斥。通过所述方法脱细胞化的猪角膜基质可以在移植后与宿主角膜细胞一起再细胞化。

Description

处理猪角膜以脱细胞的方法
技术领域
本发明涉及处理猪角膜的方法，更具体而言，涉及处理猪角膜以脱细胞的方法。
背景技术
角膜是折射光线的器官，其占眼球最外层膜的六分之一。角膜总共由五个层构成，即，角膜上皮层、鲍曼氏膜(Bowman′s membrane)、角膜基质层(也称作固有质层)、戴氏膜(Descemet′s membrane)和角膜内皮层。角膜上皮由5至6层细胞构成。角膜上皮的基底细胞来自边缘的干细胞，向角膜的中心迁移并在7日内脱落。鲍曼氏膜由非细胞的胶原纤维构成，并且是无色透明的。然而，鲍曼氏膜不能再生，在外科手术或外伤伤害时通常会出现疤痕。角膜基质占角膜厚度的约90％，并具有均匀排列的尺寸一致的细胞。戴氏膜由3至4层细胞构成，并被认为是角膜内皮细胞的基膜。角膜内皮是单层细胞，由特化的内皮细胞构成，在再生方面被严格限制，并且其细胞数量随年龄减少。当细胞数量减少时，细胞尺寸增加以填补空隙。
同时，因角膜透明性丧失而导致的角膜盲是仅次于白内障的引起视力丧失的主要原因。眼外伤和角膜溃疡每年使150万～200万的人们失明。对于这种失明唯一有效的治疗是移植人类供体角膜(也称作“角膜移植术”)。供体角膜的短缺使得需要异体移植的替代方式。
关于角膜置换已经进行了大量研究。合成置换材料包括人工角膜和天然角膜等材料，这些材料使用培养的细胞和细胞外基质(ECM)进行组织工程化。
然而，目前，这些材料因与生物相容性和光学及机械性质有关的问题而没有得到广泛应用，而利用其它动物角膜代替人类角膜的异种移植是发展最快的方法。
猪角膜是最具前景的人类角膜置换物，因为它们具有与人类角膜相当的折射率和尺寸，将猪用于移植被认为是伦理学可接受的，并且基因修饰的猪(例如，α-1，3-半乳糖基转移酶敲除猪和hDAF转基因猪)已被开发并最终进入了临床实践。
然而，传统研究报道了角膜全厚度异种移植会引发严重的免疫排斥。另外，本发明人报道的研究显示，即使在不存在角膜内皮的情况下，板层角膜异种移植也会遭遇免疫排斥[Oh，J.Y.，Kim，M.K.，Wee，W.R.Lamellar corneal pig-to-rabbit xenotransplantation.Xenotransplantation 15，198，2008；Oh，J.Y.，Kim，M.K.，Ko，J.H.，Lee，H.J.，Park，C.G，Kim，S.J.，Wee，W.R.，Lee，J.H.Histological differences in full-thickness versus lamellarcorneal pig-to-rabbit xenotransplantation.Vet Ophthalmol 12，78，2009]。这意味着角膜细胞(角膜基质细胞)也可以引起免疫排斥。
因此，本发明的发明人考虑到，对于具有正常内皮细胞但患有基质浑浊的患者，无细胞的猪角膜基质(已经脱去细胞)可用作板层角膜异种移植的供体组织。此外，角膜移植的新近范式已经由置换整个区域的全厚度角膜移植改变为仅置换病变区域的部分厚度的角膜移植。所述方法被认为在临床实践中更为有用。
有大量无细胞生物材料被用于修复各种器官中的缺陷，并且研究了各种脱细胞方法。
然而，关于对角膜基质脱细胞的方法还没有进行深入研究，特别是关于有效处理角膜同时减小移植后的免疫反应及致病性并保持角膜透明的方法还没有进行研究。
发明内容
因此，鉴于上述问题进行了本发明，本发明的一个目的是提供有效处理角膜同时减小角膜移植术后的免疫反应及致病性并保持角膜透明的方法。
根据本发明，上述和其它目的可以通过提供处理猪角膜的方法而实现，所述方法包括：将摘出的猪角膜浸入NaCl水溶液中；将该猪角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中；和洗涤该猪角膜。
NaCl水溶液和胰蛋白酶/EDTA水溶液的使用能够较少免疫反应和炎症，有助于脱细胞。
NaCl水溶液可以含有1.0M～2.0M NaCl。
将猪角膜浸入NaCl水溶液中的步骤可以在35℃～39℃的温度进行12小时～36小时。
胰蛋白酶/EDTA水溶液可以含有0.01％～0.10％(w/v)的胰蛋白酶和0.01％～0.05％(w/v)的EDTA。
将猪角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中的步骤可以在35℃～39℃的温度进行36小时～60小时。
洗涤可以使用磷酸盐缓冲液(PBS)作为洗涤液来进行。
附图说明
通过以下详细描述并结合附图，本发明的上述和其它目的、特征及其它优点将会得到更加清楚的理解，附图中：
图1是下述各组的猪角膜的图像：未处理的对照组(A)、3次冻融组(B)、高渗盐水(hypertonic saline)组(C)、高渗透甘油(hyperosmolar glycerol)组(D)、胰蛋白酶/分散酶(Dispase)/SDS组(E)和DNase/RNase组(F)。3次冻融组、高渗盐水组和高渗透甘油组的角膜保持光学透明性，而胰蛋白酶/分散酶/SDS组和DNase/RNase组的角膜失去了光学透明性；
图2显示了来自下述各组的苏木精-曙红染色的猪角膜：对照组(A)、3次冻融组(B)、高渗盐水组(C)、高渗透甘油组(D)、胰蛋白酶/分散酶/SDS组(E)和DNase/RNase组(F)。3次冻融组、高渗盐水组、高渗透甘油组和胰蛋白酶/分散酶/SDS组几乎不具有细胞，而DNase/RNase组具有严重变形的胶原，且不具任何细胞结构；
图3显示了下述各组的猪角膜的TUNEL测试结果：对照组(A)、冷冻组(B)、3次冻融组(C)、高渗盐水组(D)、高渗透甘油组(E)、胰蛋白酶/分散酶/SDS组(F)和DNase/RNase组(G)。对照组和冷冻组不具有凋亡细胞。另一方面，高渗透甘油组和胰蛋白酶/分散酶/SDS组具有许多凋亡细胞；
图4是下述各组的猪角膜的透射电子显微镜(TEM)图像：对照组(A，B)、3次冻融组(C，D)、高渗盐水组(E，F)、高渗透甘油组(G，H)、胰蛋白酶/分散酶/SDS组(I，J)和DNase/RNase组(K，L)。对照组具有在结构良好的胶原束之间的正常角膜细胞。另一方面，其它组的角膜具有严重受损的细胞。胰蛋白酶/分散酶/SDS组和DNase/RNase组具有过于破碎的胶原纤维且没有细胞结构；
图5显示了由正常角膜培养的猪角膜细胞(A，B，C)的形态和由冻融三次的角膜培养的猪角膜细胞(D，E，F)的形态。与正常角膜相比，3次冻融的猪角膜在术后1周(A，D)、2周(B，E)和3周(C，F)生长了较少的细胞；
图6是兔角膜的图像，在所述兔角膜中板层移植了猪角膜。新鲜的猪角膜(对照组)至术后2周(A)仍保持透明性，但是在术后4周(B)显示排斥反应。冷冻的猪角膜(冷冻组)在术后1个月(C)也显示了排斥反应，并且高渗透甘油处理的角膜(高渗透甘油组)较早开始发炎且变得不透明(D)。移植后，胰蛋白酶/分散酶/SDS组和DNase/RNase组(分别为E，F)发生了融合。(G)和(H)分别显示移植后1个月(G)和移植后2个月(H)的3次冻融组的猪角膜。此外，高渗盐水组的角膜即使在2个月(L)和6个月(I)后还保持透明性；
图7显示了由猪至兔的板层移植1个月后的苏木精-曙红的染色结果。对照组具有炎性细胞向供体移植连接处的严重的浸润(A)。在冷冻组(B)、3次冻融组(C)和高渗透甘油组(D)中也观察到许多炎性细胞。另一方面，高渗盐水组的移植物没有炎性细胞，并且在移植后1个月(E)和移植后6个月(F)中被再细胞化(recellularized)；
图8显示了CD3+和Hoechst 33342免疫组织化学染色。在术后一个月显示排斥反应的对照组的移植物中观察到许多CD3+细胞(A)，而高渗盐水组的猪角膜移植物不具有CD3+细胞(B)。术后1个月在整个高渗盐水处理的移植物中观察到Hoechst 33342染色的角膜细胞(D)。在此情况中，所述角膜细胞的数量与正常的兔角膜基质相当；
图9是术后1个月(A)、3个月(B)和6个月(C)的兔角膜的体内片段的图像，所述兔角膜中移植了高渗盐水处理的猪角膜。观察移植物-宿主连接处(箭头)，其意味着猪移植物适当地结合到了受体的角膜中。在移植后6个月时，移植的角膜完全结合到基体角膜中，并且连接处已不容易看到；并且
图10是比较总角膜厚度与所移植角膜的移植物厚度的图(A)，和比较所移植角膜与对侧的未移植的眼球的角膜之间的总角膜厚度的图(B)。
具体实施方式
下面将详细阐释本发明。
用于板层移植或覆盖移植的最适宜的角膜置换物必须表现出与人类角膜相似的机械和光学性质、不会引起免疫反应、对于邻近的眼组织无毒并且具有功能活性的细胞外基质。
角膜细胞外基质重要的两个原因如下。
首先，细胞外基质起到生物支架的作用，所述生物支架提供了角膜恢复和再生所需的最适宜的微环境。
其次，由胶原形成的占角膜干重的70％以上的细胞外基质具有薄胶原纤维的板层形态，因而对于角膜的透明性是不可或缺的。
因此，尽管为开发角膜置换物付出了艰巨的努力，但是尚未获得可临床应用的置换物。
此外，本发明人认为，猪角膜具有用于人类角膜的细胞外基质的潜力，因为它们具有与人类角膜相似的物理和折射性质。根据本发明人以前的研究，尽管是前板层移植，猪角膜还是显示了术后4周的排斥反应[Oh，J.Y.，Kim，M.K.，Wee，W.R.Lamellar corneal pig-to-rabbitxenotransplantation.Xenotransplantation 15，198，2008；Oh，J.Y.，Kim，M.K.，Ko，J.H.，Lee，H.J.，Park，C.G.，Kim，S.J.，Wee，W.R.，Lee，J.H.Histologicaldifferences in full-thickness versus lamellar corneal pig-to-rabbitxenotransplantation.Vet Ophthalmol 12，78，2009.]。
因此，本发明人决定通过利用物理处理(冷冻、重复冻融过程)、化学处理(高渗(hypertonic)、高渗透(hyperosmolar))或酶处理破坏细胞来减少猪角膜的免疫反应。其原因在于，胶原具有低抗原性，而细胞具有高抗原性[Dufrane，D.，Cornu，O.，Delloye，C.，Schneider，Y.J.Physical and chemicalprocessing for a human dura mater substitute.Biomaterials 23，2979，2002；Minami，A.，Usui，M.，Ishii，S.，Kobayashi，H.The in vivo effects of variousimmunoreactive treatments on allogeneic tendon grafts.J Hand Surg[Am]8，888，19，1983.]。
作为本发明的测试结果，“1.5mol NaCl，0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA”的实验组减少了免疫反应，最有效地保存了胶原结构，适宜结合在宿主角膜中，并且保持了角膜透明性，在部分移植至兔中之后6个月中没有引起发炎或排斥反应。
此外，一个比较实验组(即“冷冻组”)没有从猪角膜中充分地除去细胞，并且与对照组(即新鲜猪角膜组)同时经历了排斥反应。
此外，另一比较实验组(即“3次冻融组”)因处理后留下的细胞残留物而在移植后2个月引发了排斥反应。
此外，又一比较实验组(即“高渗透甘油组”或“胰蛋白酶/分散酶/SDS组”)引发了严重的细胞凋亡从而得到了死亡细胞碎片，触发了兔眼球的免疫反应，并经历了较早的排斥反应。
此外，其它比较实验组(即“胰蛋白酶/分散酶/SDS组”和“Dnase/Rnase组”)严重地破坏了胶原结构，导致猪角膜的所有胶原纤维被除去和断裂。另外，所处理的猪角膜失去了透明性并且被融合。
此外，本发明的值得注意的问题在于，比较实验组(即高渗盐水组)的脱细胞化的猪角膜基质在移植后与宿主角膜干细胞(stemal cell)一起被再细胞化。高渗盐水组的总角膜厚度和移植物厚度增加，与对侧的未移植的眼睛相似。这表明，猪角膜基质中所再次增殖的角膜细胞在功能上是活性的，并且产生细胞外基质。脱细胞化的移植物的再细胞化非常重要，因为角膜细胞在角膜基质的维持和代谢中扮演了必不可少的角色[McLaughlin，C.R.，Fagerholm，P.，Muzakare，L.，Lagali，N.，Forrester，J.V.，Kuffova，L，Rafat，M.A.，Liu，Y.，Shinozaki，N.，Vascotto，S.G.，Munger，R.，Griffith，M.Regeneration of corneal cells and nerves in an implanted collagencorneal substitute.Cornea 27，580，2008；Salvalaio，G.，Fasolo，A.，Bruni，A.，Frigo，A.C.，Favaro，E.，Ponzin，D.Improved preparation and preservation ofhuman keratoplasty lenticules.Ophthalmic Res 35，313，2003；Muller，L.J.，Pels，E.，Vrensen，G.F.J.M.The effects of organ-culture on the density ofkeratocytes and collagen fibers in human corneas.Cornea 20，80，2004]。
下面将提供实例以便进一步理解本发明。以下实例仅处于说明性目的，因而不用于限制本发明的范围。
实施例和比较例：本发明的实施例(实验组)和比较例(比较实验组)的样品制备
猪角膜获自刚死的兄妹交配的小型成年猪(12月龄)。使用乙醇处理上皮并随后将其剥下。然后，在搅拌下每隔30分钟使用磷酸盐缓冲液(PBS)和抗生素处理角膜3次。使用直径为8.0mm的环钻(Trephine)(Kaiindustries Cp.Ltd，Seki city，东京)由猪角膜获得250μm厚的前板层。
如下表1中所示，将角膜分为7组，并按照以下程序进行处理。每组包括5只眼睛(n＝5)
(1)未处理的新鲜角膜(对照组)，(2)在-20℃冷冻1周4然后在室温解冻的角膜(冷冻组)，(3)通过在含有液氮的50ml的试管中冷冻15分钟，迅速在37℃解冻，并重复该冻融过程3次而获得的角膜(3次冻融组)，(4)通过浸入1.5M NaCl溶液，在37℃保持24小时，浸入37℃的0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA水溶液48小时，并使用PBS洗涤3次而获得的角膜(高渗盐水组)，(5)通过在4℃的98％甘油溶液中储存21天，使用PBS洗涤，在37℃的0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA溶液中保持48小时，并使用PBS洗涤3次而获得的角膜(高渗透甘油组)，(6)通过浸入4℃的0.25％胰蛋白酶溶液24小时，浸入室温的0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液6小时，使用4℃的560单位/l的分散酶溶液处理12小时，使用室温的0.1％SDS溶液处理6小时，并使用PBS洗涤三次而获得的角膜(胰蛋白酶/分散酶/SDS组)，(7)通过浸入25℃的0.1M NaOH溶液2小时，在搅拌下使用40U/mL的Dnase和RNase处理并使用PBS彻底洗涤而获得的角膜(Dnase/RNase组)。
在用于各组之前，将角膜在4℃储存。
表1
Figure GPA00001131010200081
实验例1：根据上表1中所示的方法脱细胞化的角膜基质的体外评价
1.宏观分析
宏观分析揭示，对照组、冷冻组、3次冻融组、高渗盐水处理组和高渗透甘油处理组的角膜保持透明，而胰蛋白酶/分散酶/SDS处理组和DNase/RNase处理组的角膜变得不透明(图1)。
2.微观分析
首先，将各组的猪角膜切片并以苏木精和曙红(H&E)染色法染色。然后，在光学显微镜(Olympus Optical Co.Ltd.，日本东京)下观察H&E-染色的切片。
H&E染色的3次冻融组、高渗盐水组、高渗透甘油组和胰蛋白酶/分散酶/SDS组几乎没有细胞。另一方面，对照组和冷冻组具有许多遍布于角膜基质中的细胞核(图2)。Dnase/Rnase组不具有细胞并且胶原结构发生了严重的变形，这是在宏观分析中所观察到的角膜不透明的内在原因。
此外，使用
Figure GPA00001131010200091
Plus Fluorescein原位细胞凋亡检测试剂盒(Chemicon international，Billerica，MA，USA)通过TUNEL测试来分析猪角膜的脱细胞化机理。使用荧光显微镜(BX 61，Olympus，Shinjuku，日本东京)观察凋亡细胞。
作为TUNEL测试的结果，高渗透甘油组和胰蛋白酶/分散酶/SDS组具有相当多的阳性染色细胞核，3次冻融组局部具有阳性染色细胞核，高渗盐水组几乎不具有细胞核(图3)。
作为TUNEL测试的结果，对照组和冷冻组的细胞核没有被阳性染色。这就是这些组没有经历细胞凋亡的原因。
此外，Dnase/Rnase组经过H&E和TUNEL染色而未染色的原因在于，Dnase和Rnase是在不存在细胞碎片或细胞核碎片下处理的。
此外，为评价对于角膜细胞和胶原的细微伤害，将角膜在2.5％的戊二醛PBS(pH 7.2)中固定，保持4℃过夜，并在四氧化锇中固定1小时。再次洗涤样品，并使用连续稀释的乙醇对样品脱水。将样品安装在基棒(stub)上，溅射涂覆金，然后通过TEM(JEM-1400JEOL，日本东京)观察。
从TEM观察结果可以看出，对照组(即新鲜的角膜)具有位于结构良好的胶原薄片之间的正常角膜细胞。然而，3次冻融组和高渗透甘油组因凋亡的角膜细胞残留物而承受了显著的细胞损伤(图4)。特别是，高渗盐水组的角膜不具有可见的细胞或其残留物，但是具有正常保存和排列的胶原束。另一方面，胰蛋白酶/分散酶/SDS组和Dnase/RNase组的角膜因受到严重破坏的细胞质而只有空洞，不具有细胞结构。另外，对于这两个组，胶原纤维消失或严重片段化，表明了胶原薄片形态的破坏。
3.角膜细胞活力的评价
为评价角膜细胞活力，将角膜破碎并在用于角膜细胞培养的培养基(DMEM/F-12，10％FBS和1％青霉素-链霉素(Lonza，Basel，瑞士))中温育。
与对照组中的角膜细胞相比，3次冻融组的角膜细胞生长非常缓慢(图5)。然而，尽管培养了21天，但高渗盐水组、高渗透甘油组、胰蛋白酶/分散酶/SDS组和Dnase/Rnase组的角膜细胞没有生长。
实验例2：关于异种移植模型的脱细胞化角膜基质的体内效率的鉴定
1.对于角膜异种移植的临床过程的评价
使用2kg～3kg的成年新西兰白兔(Orient Bio Inc.，Seoungnam，韩国)作为本实验例2中的角膜移植术的受体动物。通过肌肉内施用10mg/kg的唑拉西泮(
Figure GPA00001131010200101
Yuhan Corp.，韩国首尔)和6.8mg/kg的盐酸赛拉嗪(
Figure GPA00001131010200102
Bayer，德国法兰克福)麻醉所述兔。
为移植猪角膜，使用直径为8.0mm的环钻标记猪角膜的250μm厚的前板层移植物，并使用弯月形刀(crescent knife)(Alcon Surgical，FortWorth，TX，USA)将其手工分离。使用10-0尼龙缝合线(Ethicon，Somerville，NJ，USA)通过间断缝合，用8针将猪角膜的前板层移植物(各组N＝7)缝入兔的受体角膜中。一周时拆除所有缝合线。进行全部厚度的眼睑缝合并保持1周。对于手术的兔每日施用两次左氧氟沙星抗生素眼药水(
Figure GPA00001131010200103
Santen Pharmaceutical Co.，Ltd.，Osaka，日本)，并通过肌肉内注射对其施用全身抗生素(
Figure GPA00001131010200104
40mg/kg体重；AbbottLaboratories，North Chicago，IL，USA)。
每月使用裂隙灯显微镜观察移植的角膜三次。此处，排斥反应被定义为移植物完全失去透明性的状况(即，角膜周边及虹膜结构被移植物完全遮蔽的状况)。
作为观察结果，对照组、冷冻组、3次冻融组、高渗盐水组和高渗透甘油组的角膜被适当地并入移植的兔角膜中，并且在一周后被宿主上皮完全再上皮化。对照组和冷冻组的猪角膜基质在移植到兔中2周内都是透明的。
然而，之后角膜变得不透明并且在移植后4周中所有移植的角膜完全不透明。3次冻融组的移植物透明了1个月，但是在术后2个月显示了排斥反应。高渗盐水组的猪角膜在移植后6个月都保持光学透明，且无排斥反应或炎症。
此外，在术后3周，高渗透甘油组的猪角膜移植的兔眼发生了炎症和新生血管形成，于是变得完全不透明。
此外，胰蛋白酶/分散酶/SDS组和Dnase/Rnase组的猪角膜板层在移植到兔中后马上融合，移植物失去透明性。
各组的移植物的存活时段和角膜图像分别如下表2和图6所示。
表2
  组别   数量 存活时段(天)
  对照组   7 20，20，28，28，30，30，34
  冷冻组   7 20，20，20，24，24，28，28
  3次冻融组   7 43，43，47，47，60，60，60
  高渗盐水(NaCl)组   7 ＞30，＞60，＞180，＞180，＞180，＞180，＞180
  高渗透甘油组   7 16，18，18，18，20，20，20
  胰蛋白酶/分散酶/SDS组   7 0，0，0，0，0，0，0
  Dnase/RNase组   7 0，0，0，0，0，0，0
2.角膜异种移植的组织学观察
在术后1、2和6个月，杀死各组的兔并从其上取出角膜。
使用H&E染色或免疫荧光染色来染色角膜片段。在CD3+细胞存在下对角膜进行免疫荧光染色。将获得的角膜在10％的中性缓冲甲醛中固定并在4℃温育过夜。将角膜切为5μm厚，于60℃干燥2小时，并在二甲苯中脱蜡。然后，将获得的角膜部分顺序使用蛋白酶K(20μg/ml，Sigma，St.Louis，Missouri，USA)、5％H2O2和0.3％triton X-100处理，并补充1％的血清。使用抗兔CD3+的单克隆抗体作为一抗，并使用PBS作为阴性对照。使用FITC-偶联的山羊抗兔IgG(1∶1000，Southernbiotech，Birmingham，AL，USA)作为二抗，并且使用Hoechst 33342(Sigma)进行对比染色。然后，使用荧光显微镜观察染色的CD3+细胞。
观察结果确认，与临床检验相似，H&E染色显示出排斥反应和炎性细胞的严重浸润。除了高渗盐水组之外的组显示了在供体-移植物连接处中并向移植物中生长的内源的角膜新生血管形成(图7)。然而，高渗盐水组的猪角膜在术后6个月间没有发炎和新生血管形成。
此外，经免疫组织化学染色，高渗盐水组的猪角膜移植物不具有CD3+阳性细胞，而对照组的猪角膜移植物具有许多CD3+阳性淋巴细胞(图8)。此外，在使用Hoechst 33342染色并移植到兔中一个月后，高渗盐水组的脱细胞化的猪角膜移植物再次增殖。这表示移植物针对宿主角膜细胞的再次增殖(图8)。
3.角膜异种移植的体内片段图像研究、角膜厚度测量和组织学结果
利用前部光学相干断层成像(optical coherence tomography)(OCT；VisanteTM OCT Model 1000，Carl Zeiss Meditec Inc.，Dublin，CA，USA)每月获得全厚度角膜的横截面的前部和后部图像。
作为断层成像的结果，猪角膜被移植到兔角膜中的组织片段完全结合在高渗盐水组的移植物中，并成功地重构在兔角膜中(图9)。
此外，对于角膜厚度的测量，在体内使用前部OCT测量总角膜厚度和移植的角膜基质厚度。通过测量角膜上皮与角膜内皮之间的距离和角膜内皮与移植位点之间的距离来计算角膜厚度。使用超声波测厚仪(Pachymeter，Quantel Medical，Clermont-Ferrand，法国)测量总角膜厚度。
作为角膜厚度的顺序测量的结果，显示移植的猪角膜板层的厚度随着总角膜厚度的增加而增加(图10A)。另外，移植的兔角膜就像对侧的未移植的眼睛那样正常生长。
从上述描述中可以明显看出，本发明提供了既不引发炎症又不引发免疫反应的处理猪角膜的方法。通过所述方法脱细胞化的猪角膜基质可以在移植后与角膜细胞一起再细胞化。因此，脱细胞化的猪角膜基质可用于通过体外培养和组织工程化人类角膜细胞而制备的角膜置换物。
虽然出于说明性目的公开了本发明的优选实施方式，但是本领域技术人员知道，可以进行各种修改、添加和替代，而不偏离所附权利要求中公开的本发明的范围和精神。

Claims (2)

1.一种处理猪角膜的方法，所述方法包括：
将摘出的猪角膜浸入NaCl水溶液中，所述NaCl水溶液含有1.0M～2.0M的NaCl，并且所述NaCl水溶液的NaCl浓度不为1.0M；
将所述猪角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中；和
洗涤所述猪角膜，
其中，将所述猪角膜浸入NaCl水溶液中的步骤在35℃～39℃的温度进行12小时～36小时，将所述猪角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中的步骤在35℃～39℃的温度进行36小时～60小时，并且所述胰蛋白酶/EDTA水溶液含有0.01%～0.10%(w/v)胰蛋白酶和0.01%～0.05%(w/v)EDTA。
2.如权利要求1所述的方法，其中，洗涤步骤使用磷酸盐缓冲液(PBS)作为洗涤液来进行。
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