CN101306207A - 组织工程化角膜上皮移植膜及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织工程化角膜上皮移植膜、其制备方法与应用。其目的是提供一种组织工程化角膜移植膜，所述组织工程化角膜移植膜包括人角膜上皮细胞和无抗原性组织工程角膜支架材料，所述人角膜上皮细胞和无抗原性组织工程角膜支架材料通过组织工程法整合在一起。本发明同时还提供一种制备所述的组织工程化角膜移植膜的方法，以及所述的组织工程化角膜移植膜在制备用于治疗因角膜病变或角膜损伤引起的盲性眼疾的医疗材料中的用途。

Description

组织工程化角膜上皮移植膜及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种组织工程化角膜上皮移植膜、其制备方法和应用，以及一种构建组织工程角膜用支架材料。本发明属于生物工程和临床医学领域。

背景技术

严重的角膜病变和角膜损伤引起的盲性眼疾，居致盲性眼病的首位。角膜移植手术虽然治疗效果好，成功率高，但供体角膜材料来源十分匮乏。长期以来，迫切希望通过在体外再造组织工程化生物角膜，使组织工程化角膜成为人体角膜移植等效物，最终移植人眼角膜成功使角膜盲患者视功能得到一定的恢复并提高他们的生活质量。因此，寻求可用于人体移植的组织工程化角膜，扩大供体来源，满足患者需求成为迫切需要解决的问题。

在体外构建符合人体组织工程学和细胞生物学特点的组织工程化角膜是解决上述问题的一种理想方法。

角膜(cornea)是眼球壁最外层纤维膜的前1/6部分，具有透明、无血管和感觉神经丰富的特点。其前凸，表面光滑，质地坚韧并有弹性。在组织学上角膜由外向内分为：上皮细胞层、基质层和内皮细胞层。角膜基本结构示意图可参见图18。角膜的生理功能有以下几个方面：(1)保护眼球与巩膜一起构成眼球壁最外层，共同保护眼球。同时其神经末梢丰富，有敏锐的感觉功能，与眼的保护有密切关系。(2)具有很强的屈光能力是屈光间质的主要组成部分，提供70％的屈光力。(3)透入光线功能角膜本身透明，无色，没有血管，因此光线通过角膜可投入眼内。

目前，体外培养角膜上皮细胞和角膜基质细胞的培养技术已基本成熟(参见Griffth M，Hakim M，Shimmura S，et al.Artificialhuman corneas：scaffolds for transplantation and hostregeneration.Cornea，2002，21：54-61；陈家祺，张胜，郭林洁等应用三维培养技术体外重建角膜的初步研究。中华眼科杂志，2001，37：244-247；Reichl S，Bednarz J，Muller-Goymann CC.Humancorneal equivalent as cell culture model for in vitro drugpermeation studies.Br J Ophthalmol，2004，88：560-565)，对培养出的角膜上皮细胞和基质细胞生物学特性也进行了较深入的研究。然而，对角膜内皮细胞尤其对灵长类角膜内皮细胞，特别是对人角膜内皮细胞还没有找到比较有效的体外培养方法。

有些学者曾报道在体外成功培养出人角膜内皮细胞并对其特性进行了分析，1999年Griffith等(Grifft，Osborne R，Manger R.Functinal human corneal equivalents constructed from cell lines.Science，1999，286：2169-2172)通过SV40病毒基因转染使人角膜内皮细胞永生化，因而获得体外培养角膜内皮细胞。一方面，对该报道中所培养出的人角膜内皮细胞还有待于进一步证实，同时，通过转基因方法获得的人角膜内皮细胞不排除具有肿瘤细胞特性。因此，在体外培养中要想获得与体内内皮细胞具有相同生理功能的人角膜内皮细胞还需要在今后的研究中加以解决。

为了最终获得含有完全结构的组织工程化角膜，本发明人首先成功制备了由角膜上皮细胞和支架材料构成的组织工程化角膜上皮移植膜。所述组织工程化角膜上皮移植膜既有良好的组织相容性又有一定透明屈光间质功能，能够应用于板层和深板层角膜移植术，避免因角膜上皮缺而引起的基质持续水肿，新生血管侵入，出现免疫排斥反应，最终植片混浊，脱落。

发明内容

本发明的一个方面，涉及一种组织工程化角膜上皮移植膜，其包括人角膜上皮细胞和组织工程角膜支架材料。

在本发明中，所述组织工程化角膜上皮移植膜中的人角膜上皮细胞可由角膜缘组织块培养法获得。

在本发明中，所述组织工程角膜支架材料的选择主要取决于所选材料是否具有与人角膜基质具有相似生物学、物理学和光学特性。为了避免或减少组织工程化角膜移植膜移植后引起的免疫反应，所述组织工程角膜支架材料应当无抗原性或抗原性较低。

在本发明中，所述无抗原性或抗原性较低的组织工程角膜支架材料可以为人源的角膜基质或非人源的异种脱细胞角膜基质。在本发明中，所述异种脱细胞角膜基质是经过酶，例如胰蛋白酶消化处理的异种角膜基质。具体的，经过酶例如胰蛋白酶消化处理的角膜基质由于脱除了基质细胞后无抗原性或抗原性较低，同时保留了角膜基质应具备的结构特点。实际上，用于制备脱细胞角膜基质的方法业已为本领域技术人员知晓，适于制备本发明所述组织工程化角膜上皮移植膜的脱细胞角膜基质也能够根据需要商购获得。

本发明中，用作组织工程角膜支架材料的异种脱细胞角膜基质需要满足如下条件：

1)异种角膜基质易得；

2)异种角膜基质经酶处理脱细胞后无抗原性；

3)异种角膜基质经酶处理脱细胞后基质内胶原纤维排列无改变；

4)异种脱细胞角膜基质经甘油处理脱水后角膜基质恢复透明；

5)异种脱细胞角膜基质在移植异种角膜后组织相容性良好；

6)在异种脱细胞角膜基质上接种人角膜上皮后，细胞可贴壁、增殖、分裂并保持原有的细胞特性。

在本发明中，用作组织工程角膜支架材料的所述异种脱细胞角膜基质包括但不限于：猪脱细胞角膜基质和狗脱细胞角膜基质。符合上述性质的其它适宜的脱细胞角膜基质也能够用作本发明所述组织工程角膜支架材料。

本发明同时提供一种构建组织工程角膜用支架材料，所述无抗原性组织工程角膜支架材料为脱细胞角膜基质。优选的，所述脱细胞角膜基质细胞是经酶消化处理的猪角膜基质细胞。

本发明还提供一种所述的组织工程化角膜上皮移植膜在制备用于治疗因角膜病变或角膜损伤引起的盲性眼疾的医疗材料中的用途。

另一方面，本发明提供一种制备所述组织工程化角膜上皮移植膜的方法，包括：①取人角膜缘组织利用植块培养法在体外原代、传代培养角膜上皮细胞；②对原代、传代培养的人角膜上皮细胞特异性进行鉴定确认；③构建组织工程角膜支架材料；④将体外培养的人角膜上皮接种于脱细胞角膜基质载架上共同在体外培养，最终得到构建组织工程化角膜上皮移植膜。

优选的，所述制备所述的组织工程化角膜移植膜的方法，可进一步具体包括以下操作步骤：①取人角膜缘组织利用植块培养法在体外原代，传代培养角膜上皮细胞；②对原代，传代培养的人角膜上皮细胞特异进行鉴定确认培养出的细胞为所需特定细胞，并对上述细胞的生物学特性进行综合分析，包括贴壁时间，生长曲线，克隆形成力，增值能力，代谢能力和特异性蛋白表达等；③对组织工程角膜支架材料：脱细胞角膜基质进行组织相容性和光学特性检验；④将体外培养的人角膜上皮接种于脱细胞角膜基质载架上共同在体外培养，分时段观察细胞形态特征和生物学活性，同时，观察种植上皮细胞和支架材料之间的相容性，最终构建组织工程化角膜上皮移植膜；⑤在此次研究中将构建的组织工程化角膜上皮移植膜移植动物模型分时段观察组织工程化角膜上皮移植膜与植床之间的组织相容性，透明性和支架载体上细胞形态和活性变化以及眼内，外生理性，病理性变化；⑥最终将构建的组织工程化角膜上皮移植膜移植人眼角膜，分阶段观察组织工程化角膜上皮移植膜与植床之间的组织相容性，透明性和支架载体上细胞形态和活性变化以及眼内，外生理性，病理性变化。

在本发明中，体外培养人角膜上皮细胞采用如下所述的组织块培养法，包括：

1)在角膜缘取角膜缘组织块，并用含有1％青霉素-链霉素的D-PBS缓冲液(PBS缓冲液：(pH7.2～7.4)：NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L)冲洗；

2)于dispase II酶消化液(0.24U/ml)中于4℃下放置过夜，以使得中性蛋白酶对细胞的损伤最小，而对细胞基底膜的消化作用最大，然后以D-PBS缓冲液冲洗；

3)再用0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃处理10分钟，于含10％FBSDMEM培养液中中和胰蛋白酶；

4)待置于培养皿中的经上述处理的角膜缘组织块完全贴壁后，在含10％FBS DMEM培养液中37℃、5％二氧化碳培养箱里培养，培养液隔日一换。

按照上述方法体外培养人角膜上皮细胞，可采用本领域普通技术人员知晓的方法，例如经角膜上皮特异性抗体K3和干细胞非特异性抗体P63的免疫荧光染色，来确证培养细胞是否为角膜上皮细胞，同时具有一定干细胞性。

在本发明中，通过组织工程方法，将所述人角膜上皮细胞接种到所述组织工程角膜支架材料上，在组织工程角膜支架材料上培养所述人角膜上皮细胞，得到本发明所述组织工程化角膜上皮移植膜。在本发明的一个具体实施方案中，通过体外角膜缘组织块培养法培养出的人角膜上皮细胞接种到异种脱细胞角膜基质，例如猪异种脱细胞角膜基质上，在体外共同构建组织工程化角膜上皮移植膜。所得体外构建组织工程化角膜上皮移植膜的有效性，可采用本领域普通技术人员知晓的方法进行评价。例如，可将体外构建角膜上皮移植膜移植活体后，移植膜在脱水状态下保持一定透明度并与周边角膜愈合良好无渗漏和明显的免疫排斥反应，说明在该脱细胞角膜基质上接种的人角膜上皮细胞存活并保持原有特性。

本发明提供的组织工程化角膜上皮移植膜移植术可应用于板层或深板层角膜移植手术，并且，因无抗原性或抗原性较低术后可避免免疫排斥反应等多项并发症的发生。由于现有技术中的以往载体多为羊膜，胶原膜和亲水凝胶膜，这些以往载体因缺乏正常角膜应具备的透明性、弹性、韧性和三维结构均不宜做角膜替代物。与以往技术相比，本发明应用异种脱细胞角膜基质经酶消化处理后不仅消除原抗原性，而且角膜基质组织结构未受破坏，具有弹性，韧性和一定厚度，脱水状态时呈透明，接种角膜上皮细胞易在脱细胞角膜基质上增殖、分裂，同时保持细胞原有生物特性。因此，体外构建的组织工程化角膜上皮移植膜完全可应用于板层，深板层角膜移植术。

附图说明：

下面结合附图对本发明作进一步的说明：

图1A图为角膜缘组织块培养法培养角膜上皮细胞情况。接种培养皿第五天发现角膜上皮细胞从角膜缘组织块爬出，细胞分布较致密，形态呈类圆形；B图为用角膜缘组织块培养法培养10天后的角膜上皮细胞.细胞密度较致密形态圆形或类圆形。

图2A图为在共聚焦显微镜下所有细胞对角蛋白3呈阳性情况；B图为体外培养角膜上皮细胞情况。角膜上皮细胞的特异性抗体为角蛋白3(Keratin 3，后简称“K3”)。用角膜缘组织块培养法培养角膜上皮，传代培养1周时细胞对角蛋白3在共聚焦显微镜下呈阳性。

图3A图为在共聚焦显微镜下抗P63呈阳性细胞情况；B图为体外培养角膜上皮细胞情况。角膜上皮干细胞目前还没有特异性抗体证明为角膜上皮干细胞，但现在可利用间接方法证明其干细胞性，检测P63是其中有效方法之一。用角膜缘组织块培养法培养角膜上皮，传代培养1周时部分细胞对抗P63在共聚焦显微镜下呈阳性。

图4为用角膜缘组织块体外培养法培养角膜上皮细胞情况。传代培养1周时用黏蛋白MUC5AC染色观察培养出的角膜上皮细胞有无杯状细胞的污染。A图为Hochest染色，通过荧光染色可标记体外培养细胞核呈兰色，直观反映培养细胞数；B图为黏蛋白MUC5AC免疫染色无绿色荧光说明体外培养的角膜上皮细胞无杯状细胞的污染。

图5为用角膜缘组织块体外培养法培养角膜上皮细胞情况。传代培养1周时用TUNEL染色观察角膜上皮细胞凋亡情况。A图为Hochest染色，通过荧光染色可标记体外培养细胞核呈兰色，直观反映培养细胞数；B图为TUNEL染色无绿色荧光说明体外培养的角膜上皮细胞无明显细胞凋亡。

图6为用角膜缘组织块体外培养法培养角膜上皮细胞情况。波形蛋白作为非特异性骨架蛋白存在于多种细胞胞质内。传代培养1周时用波形蛋白特异性抗体荧光染色角膜上皮内波形蛋白。A图为Hochest染色，通过荧光染色细胞核直观反映体外培养细胞数；B图为大部分角膜上皮细胞质内波形蛋白染色阳性。

图7为用角膜缘组织块体外培养法培养角膜上皮细胞，传代培养1周时用BrdU染色观察角膜上皮细胞增殖、分裂情况。A图为Hochest染色，通过荧光染色表示体外培养所有细胞核直观反映培养细胞数；B图为BrdU染色阳性呈绿荧光。约占培养细胞的30-40％，表明角膜上皮细胞分裂，增殖较旺盛。

图8为体外培养角膜上皮细胞流式细胞学检测结果：从上至下依次为：阴性对照，K3，P63，MUC5AC。

图9为体外培养角膜上皮细胞接种羊膜上在体外共培养4周时的情况，角膜上皮细胞分层至5-7层，表层呈扁平细胞，中间层呈翼状，基底呈柱状。图A为PAS染色呈阴性说明无杯状细胞污染；图B为HE染色观察细胞形态。

图10为体外培养角膜上皮细胞接种猪脱细胞角膜基质后体外共培养2周情况。如图B，C，D所示，角膜上皮细胞特异性抗体K3在免疫荧光染色中表达阳性。图A为非特异性染色。

图11为体外培养角膜上皮细胞接种猪脱细胞角膜基质后体外共培养2周HE染色观察细胞形态和分层情况。角膜上皮细胞形成单层或双层。细胞形态与正常角膜上皮相似。

图12为体外培养角膜上皮细胞接种猪脱细胞角膜基质后体外共培养4周用透射电镜观察连接复合体的形成情况。培养前2周(图A，B)细胞与基质之间未形成连接复合体培养第3，4周两者之间形成初级连接复合体。

图13为体外培养角膜上皮细胞接种猪脱细胞角膜基质上在体外共培养2周后的扫描电镜图。体外培养角膜上皮细胞不仅很好地贴壁于猪脱细胞角膜基质上而且上皮细胞增殖，分裂旺盛，在5000倍中可见微绒毛。

图14图A、B为猪角膜基质脱细胞后无菌包装；图C为甘油脱水之前的脱细胞角膜基质呈灰白，水肿，不透明；图D为甘油脱水后脱细胞角膜基质变透明；图E为培养对照透明角膜透明度；图F为浸水中1后脱细胞角膜基质，角膜透明度明显下降。

图15为猪角膜基质经酶处理后扫描电镜观察脱细胞角膜基质。可观察到角膜胶原纤维排列整齐，板层结构完整，同时未见细胞.脱细胞角膜基质基本保持角膜原有的结构。

图16为碱烧伤兔角膜模型。

图17为体外培养角膜上皮细胞接种猪脱细胞角膜基质-体外构建组织工程化角膜上皮移植膜移植兔模型眼后仍保持透明。

图18为角膜的基本结构示意图。

图19为体外传代培养角膜上皮细胞12天内的细胞生长曲线。

图20为体外培养角膜上皮细胞传代后单克隆培养状态。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规条件，或者按照厂商所建议的条件。同时，下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，则均为重量百分含量。

实施例一、人角膜上皮细胞的角膜缘组织体外培养

1.角膜缘组织块体外原代，传代培养角膜上皮细胞

原代培养：以10％碘伏消毒人的结膜囊及眼表，2％利多卡因作球后麻醉，用白内障超声乳化切口刀(Alcon，U.S.A.)在人角膜缘取大小约2.0mm×2.0mm厚度约200μm的角膜缘组织块，用含有1％青霉素-链霉素的D-PBS缓冲液冲洗3次，然后放置1.2U/ml dispase II消化液中在4℃冰箱中过夜，取出后D-PBS缓冲液冲洗3次，再用0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃处理10分钟，含10％FBS DMEM培养液中和胰蛋白酶。角膜缘组织块放置60mm培养皿中在超净台内室温下自然干燥，贴壁，时间约需15分钟，待角膜缘组织块完全贴壁后加含10％FBS DMEM培养液适量，在37℃5％二氧化碳培养箱里培养。培养液隔日一换。培养第3天起可发现从角膜缘组织块中有细胞向外分化，培养10天时人角膜缘上皮细胞细胞充满培养皿底部。

传代培养：培养细胞充满培养皿底部时清除DMEM培养液，再用含有1％青霉素-链霉素的D-PBS缓冲液冲洗3次，加0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃处理10分钟，用含10％FBS DMEM培养液中和胰酶。1200rpm，5分钟离心吸出上清液，加10％FBS DMEM培养液制成细胞悬浮液，以5×10³/mm²细胞数接种培养皿，培养液隔日一换。

2.培养角膜上皮特异性和干细胞性鉴定：

体外培养传代角膜上皮用常规免疫荧光染色方法染色角膜上皮特异性抗体K3和干细胞非特异性抗体P63。具体方法如下：

染色角膜上皮特异性抗体K3：

4％多聚甲醛固定，4℃，30分钟，或者-20℃无水乙醇固定，10分钟，PBS浸洗3次，每5分钟，-20℃甲醇处理细胞10分钟，以增加膜通透性，PBS浸洗3次，每次5分钟，37℃用羊血清封闭1小时，加一抗(keratin 3)4℃孵育过夜，或者37℃ 2小时，PBS浸洗3次，每次5分钟，滴加荧光素标记的二抗[抗小鼠的二抗(anti-Mouse/Murine Ig)，1∶200]，37℃避光孵育1-2小时，PBS浸洗3次，每次5分钟，封片观察，若标记细胞核加Hochest染色(Hochest是一种嗜DNA的荧光染料，它与DNA发生特异性结合后，在荧光显微镜发绿荧光，可清楚地显示核的形态、大小及核质的密度；具体方法可参见常规细胞生物学教材中的实验操作)。

Hochest是一种已知的嗜DNA的荧光染料，它可清楚地显示核的形态、大小及核质密度，可以用来反应凋亡时胞核的变化)；二抗后PBS洗1次5分钟，加Hochest室温处理15分钟(1∶1000-1∶500)，PBS浸洗3次，每次5分钟后封片。

染色干细胞非特异性抗体P63：

4％多聚甲醛固定，4℃，30分钟，或者-20℃无水乙醇固定，10分钟，PBS浸洗3次，每5分钟，-20℃甲醇处理细胞10分钟，以增加膜通透性，PBS浸洗3次，每次5分钟，37℃用羊血清封闭1小时，加一抗(P63)4℃孵育过夜，或者37℃2小时，PBS浸洗3次，每次5分钟，滴加荧光素标记的二抗[抗小鼠的二抗(anti-Mouse/MurineI g)，1∶200]，37℃避光孵育1-2小时，PBS浸洗3次，每次5分钟，封片观察，若标记细胞核加Hochest染色。

Hochest是一种已知的嗜DNA的荧光染料，它可清楚地显示核的形态、大小及核质密度，可以用来反应凋亡时胞核的变化)；二抗后PBS洗1次5分钟，加Hochest室温处理15分钟(1∶1000-1∶500)，PBS浸洗3次，每次5分钟后封片。

如图2、3所示，结果为阳性，证实培养细胞为角膜上皮细胞同时具有一定干细胞性。

3.细胞贴壁率，生长曲线：

体外传代培养角膜上皮细胞以5×10³/mm²细胞数接培养皿后，每24小时用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化后进行细胞计数。根据细胞计数可得出角膜上皮细胞24小时贴壁率和12天内细胞生长曲线。经检测，角膜上皮细胞24小时贴壁率为(74.89±15.72)％，生长曲线参见图19。

4.单克隆形成：

体外培养角膜上皮细胞传代后以100和300细胞数接种培养皿，连续培养7天后去除培养液，D-PBS缓冲液冲洗3次，10％多聚甲醛固定16小时在4℃冰箱内，然后用2％Rhodamin blue(MERCK，Germany)和2％Nile blue(MERCK，Germany)以1∶1比例混合后在4℃冰箱内染色30分钟，D-PBS缓冲液再冲洗3次，常温下干燥1小时。计数克隆。经检测，克隆计数值为(15.17±3.25)％。克隆生长状态参见图20。

6.结膜杯状细胞鉴定：

体外培养角膜上皮细胞传代后以5×10³/mm²细胞数接种细胞载玻片后培养7天。如图4、8所示，用结膜杯状细胞特异性黏蛋白MUC5AC进行免疫荧光染色(方法同上)，结果为阴性。

7.用BrdU染色观察细胞增殖，分裂情况：

体外培养角膜上皮细胞传代后以5×10³/mm²细胞数接种细胞载玻片后培养7天。用BrdU(5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo2-deoxyuridine，BrdU)是DNA前体胸腺嘧啶核苷的类似物，能选择性的掺入到处于细胞周期S期(即DNA合成期)细胞的单链DNA核苷酸序列中，在活体引用合成DNA的可示踪的前体物质BrdU，使增殖期细胞可竞争性的替代胸腺嘧啶而掺入)进行免疫荧光染色，具体方法如下：-20℃预冷的甲醇处理标本4℃，10分钟(若没有时间在此步骤之后可以风干将标本置于-20℃保存即可，下次染色前PBS水化3-55分钟即可)，PBS浸洗3次，每次5分钟；2N HCl 1次，60分钟；37℃，0.1molPBS，pH8.5，2次，每次10分钟；PBS 3次，每次5分钟；0.1％BSA(牛血清白蛋白)(或者PBS配)溶6μg/ml抗体(keratin 3，1∶100-1∶200)60分钟-120分钟室温，PBS处理3次，每次5分钟，滴加荧光素标记的二抗[抗小鼠的二抗(anti-Mouse/Murine Ig)，1∶200]，37℃避光孵育1-2小时，PBS浸洗3次，每次5分钟，封片观察，若标记细胞核加Hochest；二抗后PBS洗1次，5分钟；加Hochest室温处理15分钟(1∶1000-1∶500)，PBS浸洗3次，每次5分钟后封片。结果如图7所示。

8.用TUNEL染色观察细胞凋亡情况：

体外培养角膜上皮细胞传代后以5×10³/mm²细胞数接种细胞载玻片后培养7天。用原位末端标记法(TUNEL法)(基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TerminalDeoxynucleotidyl Transferase，TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(荧光-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是原位末端标记(TUNEL)法(具体方法可参见常规细胞生物学教材中的实验操作)进行免疫荧光染色，具体方法如下：组织切片4℃，4％PFA(PFA是四氟乙烯和全氟烃基乙烯醚的共聚物)固定30分。室温处理，PBS洗3次，每次5分钟。-20℃预冷的甲醇处理切片15分钟，4℃，以增加细胞膜的通透性(注意此时多观察，防止甲醇蒸发干，此间需要添加甲醇)。室温处理、PBS洗3次，每次5分钟。除去液体，用100μl平衡液缓冲覆盖组织，室温处理、10分钟。平衡时，在冰上解冻核苷复合物，为所有实验反应片制定充分的室温处理dT反应复合物。继续置于冰上，每玻片加50μl(具体用量视标本大小而定)反应液完全覆盖细胞；(平衡缓冲液：核苷复合物：室温处理dT＝45∶5∶1)[阴性对照片为省略室温处理dT的对照孵育液，平衡缓冲液∶核苷复合物∶dH2O＝45∶5∶1]加50μl室温处理dT反应复合物在玻片上，将塑料盖玻片盖在细胞片上防止液体蒸发及确保试剂分布均衡(也可以不覆盖，覆盖后容易脱片)。37℃孵育60分钟，以使末端充分反应(避光)。用去离子水1∶10稀释20×SSC【20×SSC成分及浓度：配制1L溶液各成分的用量：300mmol/L柠檬酸三钠(二水)；3mol/L氯化钠；水88.2g；175.3g；补足1L。溶解柠檬酸三钠(二水)和氯化钠于约0.9L水中，加几滴10N NaOH溶液调pH为7.0，用水补足体积至1L。】，室温下将玻片浸2×SSC液15分钟，终止反应。室温处理下，PBS洗3次，每次5分钟，去除未结合的荧光-12-dUTP。封存，观察。若同时标记细胞核加Hochest；终止反应后PBS洗1次，5分钟，加Hochest于室温处理15分钟(1∶1000-1∶500)PBS浸洗3次，每次5分钟后封片。结果如图5所示。

实施例二、组织工程化角膜支架材料

1.载体选择：

在构建组织工程化角膜上皮移植膜时其载体目前有多种，其中以羊膜，胶原膜和亲水凝胶膜选用者较多，但这些膜都有一个共同的缺点，即缺少一定的厚度抗张性，抗压性和屈光性。因此，其应用受到限制。异种脱细胞基质尤其是猪脱细胞基质容易得到而且经酶消化猪角膜基质细胞后无抗原性同时有角膜应具备的结构特点。

2.猪脱细胞角膜基质制备：

如图14所示，新鲜猪眼球在0.125％氯霉素液中浸泡1小时，75％乙醇浸泡0.15小时，刀片刮除上皮，沿角膜缘剪取角膜，经0.125％胰蛋白酶37℃消化30分钟，PBS液振洗2遍，浸于1％TritonX2100的离心 管内(或不经酶消化直接进入此步骤)，4℃振荡72小时。PBS反复振洗，用含有1％青霉素-链霉素的D-PBS缓冲液冲无菌密封包装。实施例三、体外构建组织工程化角膜上皮移植膜的制备

1.脱细胞猪角膜基质的准备：

将实施例2中已经制备好的角膜基质浸泡胎牛血清24小时后置DMEM培养液以备用。

2.体外传代培养角膜上皮细胞用0.25％胰蛋白酶消化后制成细胞悬浮液。

3.脱细胞猪角膜基质原上皮面朝上放置培养皿内自然干燥数分钟，待基质略呈脱水状，将制备好的角膜上皮细胞悬浮液以细胞数5×10³/mm²接种在脱细胞猪角膜基质上在超净台内待细胞贴壁，期间不断滴培养液以免细胞过度干燥。待贴壁完成后加少量胎牛血清置于37℃，5％二氧化碳培养箱内培养24小时，24小时后加适量培养液继续体外共培养2周。

4.如图13所示，脱细胞猪角膜基质和角膜上皮细胞体外共培养2周后通过HE染色，免疫荧光染色和扫描电镜可观察到角膜上皮较好地贴附在基质载体上，而且表达K3阳性，细胞形态与正常角膜上皮形态相似。

5.形态观察：

体外培养角膜上皮细胞传代后以5×10³/mm²细胞数接种羊膜上和脱细胞角膜基质上体外共培养4周用HE(苏木精和伊红)染色[苏木素与伊红对比染色法(简称HE对染法)是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过H.E.染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。具体可参见常规细胞生物学教材中的实验操作]，投射，扫描电镜观察细胞形态和连接复合体的形成。HE(苏木精和伊红)染色，投射，扫描电镜按常规方法制作标本观察，结果如图9、10、11所示。

实施例四、对体外构建组织工程化角膜上皮移植膜的有效性的评价：组织工程化角膜上皮移植膜应用到碱烧伤兔角膜模型

有效性评价实验具体操作步骤包括：

-构建三维立体组织工程化角膜上皮移植膜

组织块法原代培养兔角膜缘上皮细胞

取板层角膜缘组织并剪成大小：2.0×2.0mm，厚约200um的组织块，在37℃，5％ CO₂孵箱中用1.2U/ml Dispase II处理30分，每六孔板内置三块儿角膜缘组织块，每组织块上皮面朝上，透明角膜侧朝中央，间隔2mm并平置于3T3成纤维滋养层细胞上。待组织块贴附培养皿底部后加培养液。置37℃，5％CO₂孵箱中培养，每2天换液一次。

角膜缘上皮细胞传代培养

兔角膜缘上皮细胞经原代培养后，制成单细胞悬浮液，以4×10³/cm²细胞数直接接种脱细胞猪角膜基质进行共培养。

猪脱细胞角膜基质的制备

取下新鲜猪眼球后剔出眼球周边组织和筋膜用1％双抗PBS反复冲洗眼球多次后沿角膜缘透明角膜侧取角膜组织5％多聚甲醛固定16小时，1％双抗PBS中浸泡2小时，加0.25％胰蛋白酶在37℃孵箱内消化30分钟，1％双抗PBS冲洗3次共15分钟，将角膜组织置入1％曲拉酮(TritonX-100)内在4℃冰箱中震荡72小时，1％双抗PBS浸洗3次共15分钟后无菌包装后留用。

1.构建组织工程化角膜上皮膜

取以备好的无菌猪脱细胞角膜基质放入D-PBS内浸泡24小时，后用D-PBS浸洗3次共5分钟。然后，将猪脱细胞角膜基质上皮面朝上放置6孔板培养皿中待用.用组织块培养法培养兔角膜上皮细胞细胞充满培养皿底部时清除培养液加D-PBS冲洗2次，加0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA适量在37℃，5％CO₂孵箱中处理3分，1200rpm，20℃离心5分钟，制成单细胞悬浮液以5×10⁴/cm₂密度接种在无菌猪脱细胞角膜基质上皮面，待细胞贴壁后加10％DMEM/F12培养液进行共培养.培养至第4周终止培养进行。

-移植兔角膜模型

兔角膜用0.1N NaOH烧10秒，用生理盐水反复冲洗。每天涂抗生素眼膏一次，观察4周。4周后发现角膜混浊，透明度下降，新生血管侵入。

-观察移植片与植床之间愈合情况，具体可参照以下指标：

-有无渗漏，溶解

荧光素染色角膜上皮后通过裂隙灯显微镜检查。

-中央光学区透明度的变化

通过裂隙灯显微镜观察角膜厚度变化和后方虹膜纹理清晰程度进行分析。具体如下：

I级：清晰见虹膜纹理

II级：后方虹膜纹理可见，但模糊。

III级：后方虹膜纹理不清，但瞳孔可辨。

IV级：后方虹膜纹理及瞳孔均不不见。

-形态变化通过光镜和电镜观察

将移植的角膜上皮移植膜和受体眼角膜制成切片后行苏木精-伊红染色和扫描电镜观察。具体如下：

苏木精-伊红染色：

将组织工程化角膜上皮膜置于10％多聚甲醛中固定，酒精梯度脱水从50％，60％，70％，80％，90％，95％至100％。用25％、50％、70％、90％二甲苯一无水酒精透化使酒精完全脱除。将组织工程化角膜上皮膜放入60℃温箱中，取熔点52-56℃的纯净石蜡液中进行浸蜡，换蜡2-3次。将熔蜡及脱细胞角膜组织趁热倒入预制小纸盒中，让蜡渐渐冷凝，移浮于水面，至完全凝固。剥离纸盒，切取角膜组织蜡块，于旋转切片机上切成连续蜡带8-15μm厚。玻片上涂一薄层粘贴剂，加1滴水，切取蜡带材料烘干。脱细胞角膜切片在二甲苯中脱蜡5～10分钟，入100％、95％、85％、70％酒精，各级为2～5分钟。最后经蒸馏水转入染液苏木精染液染色5分钟，水洗玻片上多余染液。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟，流水冲洗15分钟，0.5％伊红染液染色1分钟，依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3分钟，在95％以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。二甲苯透明(二次)，共约10分钟。封片擦去切片周围多余二甲苯，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。

扫描电镜：

将组织工程化角膜上皮移植膜置入2.5％戊二醛磷酸缓冲液中固定，然后用蔗糖冲洗液冲洗2小时，共3次，过夜后使用1％四氧化锇缓冲液后固定1～2小时。乙醇梯度脱水后，用无水乙醇和环氧树脂的混合剂浸透1小时，用纯环氧树脂浸透，室温下过夜。次日升温至60℃聚合固化，48小时后取出组织工程化角膜上皮膜制作厚约20nm的超薄切片，应用醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行双染色后置于铜网在不同倍数的扫描电镜(JEM-1200EX，Japan)下观察组织工程化角膜上皮膜结构。

-组织工程化角膜上皮移植膜的细胞生物学特性变化：

细胞分裂，增殖活性-BrdU染色：

传代兔角膜缘上皮细胞接种脱细胞猪角膜面共培养4周时加1.0mMBrdU稀释液24小时后用-20℃预冷的甲醇在4℃处理标本10分钟，PBS浸洗3次每次5分钟，2N  HCl 37℃处理60分钟，PBS浸洗各2次每次10分钟，3次每次5分钟，0.1％抗BrdU抗体6μg/ml，(1∶100-1∶200)常温下反应120分钟后PBS浸洗3次每次5分钟，滴加荧光素标记的二抗(1∶200)，37℃避光孵育1-2小时PBS浸洗3次后封片观察。标记细胞核加Hochest。

细胞凋亡-TUNEL检测：

传代兔角膜缘上皮细胞接种脱细胞猪角膜面共培养4周，4％PFA固定30分钟，在常温下PBS浸洗3次每次5分钟。用在-20℃预冷的甲醇在4℃中处理细胞15分钟，以增加细胞膜的通透性，常温下PBS浸洗3次每次5分。除去液体，在常温下用100μl平衡液缓冲覆盖组织10分钟。平衡时，在冰上解冻核苷复合物，为所有实验反应片制定充分的rTdT反应复合物。继续置于冰上，每玻片加50μl(具体用量视标本大小而定)反应液完全覆盖细胞；(平衡缓冲液∶核苷复合物∶rTdT＝45∶5∶1)加50μl rTdT反应复合物在玻片上，将塑料盖玻片盖在细胞片上防止液体蒸发及确保试剂分布均衡。37℃孵育60分钟，以使末端充分反应(避光)。用去离子水1∶10稀释20×SSC，室温下将玻片浸入2×SSC液15分钟，终止反应。常温下PBS浸洗3次共15分钟，去除未结合的荧光-12-dUTP。封存，观察。若同时标记细胞核加Hochest。

-眼内炎性反应

通过裂隙灯检查前房内房闪，角膜后沉积物及前房积脓或玻璃体混浊情况。

-视网膜及视盘功能变化

通过眼底照相和光学断层显像技术评价视网膜神经层的厚度和杯盘比的变化。

根据实施例四，使用猪脱角膜基质与受体角膜植床之间的愈合及生物相容性实验的具体实验结果如图16、17所示，将脱细胞猪角膜基质经无菌处理后用8.0mm环转转取同时在实验动物兔角膜上转取7.5mm的角膜板层组织后将脱细胞猪角膜基质移植到受体兔角膜上10-0缝线间断缝合(将供体脱细胞角膜基质和受体角膜紧密连接，起密闭作用)观察4周。术眼以抗生素眼药点眼。每周观察术眼。第1天眼球睫状充血，角膜水肿，半透明，1周后充血渐退；2周植片变薄，4周植片与植床相融合切口对合良好，前房形成，无渗漏。同时，未发现供体脱细胞猪角膜基质溶解。

上述结果显示：将体外构建的组织工程化角膜上皮移植膜移植到碱烧伤兔角膜模型活体后，该组织工程化角膜上皮移植膜在脱水状态下保持一定透明度并与周边角膜愈合良好无渗漏和明显的免疫排斥反应。脱细胞角膜基质上接种的角膜上皮细胞存活并保持原有特性。

Claims (10)

1、一种组织工程化角膜上皮移植膜，其包括人角膜上皮细胞和组织工程角膜支架材料。

2、根据权利要求1所述的组织工程化角膜上皮移植膜，其中所述组织工程角膜支架材料为无抗原性或抗原性较低的人源或非人源脱细胞角膜基质。

3、根据权利要求2所述的组织工程化角膜上皮移植膜，其中所述脱细胞角膜基质是猪脱细胞角膜基质或狗脱细胞角膜基质。

4、根据权利要求1所述的组织工程化角膜上皮移植膜，其中所述人角膜上皮细胞是由角膜缘组织块培养法获得的。

5、根据权利要求1所述的组织工程化角膜上皮移植膜，其是通过组织工程方法，将所述人角膜上皮细胞接种到所述组织工程角膜支架材料上，在组织工程角膜支架材料上培养所述人角膜上皮细胞得到的。

6、制备权利要求1所述的组织工程化角膜上皮移植膜的方法，包括：

1)取人角膜缘组织利用植块培养法在体外原代培养、传代培养人角膜上皮细胞；

2)选择具有角膜上皮细胞特异性的原代培养、传代培养人角膜上皮细胞；

3)构建组织工程角膜支架材料；和

4)将步骤1)和2)所得体外培养的人角膜上皮细胞种接种于步骤3)所得组织工程角膜支架上，共同在体外培养，最终得到组织工程化角膜上皮移植膜。

7、根据权利要求6所述的方法，其中在体外培养人角膜上皮细胞的方法包括：

1)在角膜缘取角膜缘组织块，并用含有1％青霉素-链霉素的D-PBS缓冲液冲洗；

2)于中性蛋白酶，优选dispase II消化液中4℃下放置过夜，然后D-PBS缓冲液冲洗；

3)再用0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃处理10分钟，于含10％FBS DMEM培养液中中和胰酶；

4)待置于培养皿中的经上述处理的角膜缘组织块完全贴壁后，在含10％FBS DMEM培养液中37℃5％二氧化碳培养箱里培养。

8、根据权利要求6所述的方法，其中步骤3)所述组织工程角膜支架材料为无抗原性或抗原性较低的人源或非人源脱细胞角膜基质。

9、根据权利要求8所述的方法，其中所述脱细胞角膜基质是猪脱细胞角膜基质或狗脱细胞角膜基质。

10、权利要求1所述的组织工程化角膜上皮移植膜在制备用于治疗因角膜病变或角膜损伤引起的盲性眼疾的医疗材料中的应用。

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