CN103865872B - 人表皮干细胞的分离与培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于病理学技术领域，具体涉及人表皮干细胞的分离与培养方法。本发明要解决的技术问题是为人表皮干细胞的分离与培养提供一种新选择。本发明的技术方案是人表皮干细胞的分离与培养方法，包括如下步骤：a、消毒；b、分离表皮与真皮；c、收集；d、培养；e、传代。本发明方法可将人表皮干细胞至少能传到8代，极大提高了细胞扩增倍数。

Description

人表皮干细胞的分离与培养方法

技术领域

本发明属于病理学技术领域，具体涉及人表皮干细胞的分离与培养方法。

背景技术

皮肤是人体最大的组织器官，覆盖于人体的外表，具有抵御微生物入侵、防止紫外线辐射及水分丢失、调节体温，维持外貌等重要功能，是烧伤、创伤外科研究的主要内容。正常皮肤的自我更新及受损皮肤的修复是由多种类型的于细胞共同作用的结果，是维持正常的组织结构和细胞内环境稳定的基本要求。在烧、创伤方面，表皮干细胞拥有无可质疑的潜能，它是皮肤组织特异性干细胞，在维持表皮自我更新、保持皮肤正常的表皮结构与功能及创面修复和皮肤重建方面起着重要作用。然而，体外培养表皮干细胞却迟迟不能应用到临床。传统人表皮干细胞培养方法因需与3T3滋养细胞共培养以及需添加血清，方法复杂、条件较难一致、稳定性差、细胞分化快，一般只能传到3-5代细胞扩增数量有限；因有滋养细胞影响，也无法应用到临床上。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为人表皮干细胞的分离与培养提供一种新选择。

本发明的技术方案是人表皮干细胞的分离与培养方法，包括如下步骤：

a、消毒：将包皮环切术取下的人包皮组织用0.5%碘伏浸泡1～2min，PBS（磷酸缓冲液）漂洗至肉眼观察不再有碘伏着色；

b、分离表皮与真皮：修剪掉皮下脂肪组织，组织修剪为约为0.5cm×1cm大小的皮片；加入0.25%的中性蛋白酶Ⅱ溶液充分覆盖组织块，4℃消化l2～16h；弃中性蛋白酶Ⅱ溶液，PBS（磷酸缓冲液）清洗后用眼科镊子分离表皮与真皮，得到表皮组织；

c、收集：剪碎表皮组织，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化5～10min，终止消化，过滤，离心，PBS洗涤，收集细胞；

d、培养：用K-SFM培养液将收集的细胞制成2.5×10⁵个/mL的单细胞悬液，接种单细胞悬液于包被了IV型胶原的培养器皿中，37℃静置10min；弃未贴壁细胞，用PBS漂洗，加入K-SFM培养液；37℃、5%CO₂培养；次日更换细胞培养液，继续培养，每2天换液1次；

e、传代：待细胞生长密度为70～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，终止消化，离心，收集细胞，按细胞接种面积扩大4～6倍传代；

上述所有操作均在无菌条件下进行。

其中，步骤b中所述的0.25%的中性蛋白酶Ⅱ的配置方法为，0.5g中性蛋白酶Ⅱ溶入100mL0.1MPBS中，搅拌溶解，过滤，-20℃保存。

其中，步骤d中所述的K-SFM培养液包含下述成分：重组人表皮生长因子rEGF0.1～0.2ng/mL，牛垂体提取物BPE20～30μg/mL；CaCl₂0.05mM；青霉素、链酶素均为100U/mL。

其中，步骤d中所述的包被了IV型胶原的培养器皿采用如下方法制备：按照10μg/cm²计算，将适量0.lmg/mL的IV型胶原溶液加入细胞培养器皿中，是液体充分覆盖培养器皿的培养面，4℃放置约12～24小时，使用前采用PBS清洗。

其中，步骤e中进行消化前去掉原培养液，并用PBS清洗细胞。

其中，步骤e中消化是指在37℃、5%CO₂下培养6～10分钟。

其中，所述的终止消化采用含10%小牛血清的RPMI1640培养基。

其中，所述的离心为1000rpm/min条件下离心5min。

本发明的有益效果：本发明方法具有快速、高效、方法简便、细胞活性高、细胞干性强等特点。采用本发明方法培养人表皮干细胞至少能传到8代，极大提高了细胞扩增倍数；且分化控制好、细胞成分单一，因而具备了应用到临床上的基本条件。

附图说明

图1为分离培养人表皮干细胞细胞生长形态示意图；a为接种细胞后第一天贴壁细胞形态200倍；b为培养7天后小细胞克隆散在分布图片200倍；c为12～14天细胞克隆融合后图片200倍；d为高倍镜下细胞形态400倍。

图2为第8代分离培养人表皮干细胞细胞生长形态示意图。

图3为蛋白质印迹法检测表皮干细胞标志物CK19及β1整合素的表达示意图。

图4为激光共聚焦显微镜观察分离培养细胞中β1整合素和ck19的表达示意图；C图为A图和B图的融合；F图为D图和E图的融合。

图5为流式细胞仪检测分离培养细胞表皮干细胞标准物α6-integrin及CD71的表达示意图。

图6为克隆形成实验检测表皮干细胞克隆形成能力示意图。

具体实施方式

本发明的技术方案是人表皮干细胞的分离与培养方法，包括如下步骤：

a、消毒：将包皮环切术取下的人包皮组织用0.5%碘伏浸泡1～2min，PBS漂洗至肉眼观察不再有碘伏着色；

b、分离表皮与真皮：修剪掉皮下脂肪组织，组织修剪为约为0.5cm×1cm大小的皮片；加入0.25%的中性蛋白酶Ⅱ溶液充分覆盖组织块，4℃消化l2～16h；弃中性蛋白酶Ⅱ溶液，PBS（磷酸缓冲液）清洗后用眼科镊子分离表皮与真皮，得到表皮组织；

c、收集：剪碎表皮组织，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化5-10min，终止消化，过滤，离心，PBS洗涤，收集细胞；

d、培养：用K-SFM培养液将收集的细胞制成2.5×10⁵个/mL的单细胞悬液，接种单细胞悬液于包被了IV型胶原的培养器皿中，37℃静置10min；弃未贴壁细胞，用PBS漂洗，加入K-SFM培养液；37℃、5%CO₂培养；次日更换细胞培养液，继续培养，每2天换液1次；

e、传代：待细胞生长密度为70～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，终止消化，离心，收集细胞，按细胞接种面积扩大4-6倍传代；

上述所有操作均在无菌条件下进行。

其中，步骤b中所述的0.25%的中性蛋白酶Ⅱ的配置方法为，0.5g中性蛋白酶Ⅱ溶入100mL0.1MPBS中，搅拌溶解，过滤，-20℃保存。

其中，步骤d中所述的K-SFM培养液包含下述成分：重组人表皮生长因子rEGF0.1～0.2ng/mL，牛垂体提取物BPE20～30μg/mL；CaCl₂0.05mM；青霉素、链酶素均为100U/mL。

其中，步骤d中所述的包被了IV型胶原的培养器皿采用如下方法制备：按照10μg/cm²计算，将适量0.lmg/mL的IV型胶原溶液加入细胞培养器皿中，是液体充分覆盖培养器皿的培养面，4℃放置约12～24小时，使用前采用PBS清洗。

其中，步骤e中进行消化前去掉原培养液，并用PBS清洗细胞。

其中，步骤e中消化是指在37℃、5%CO₂下培养6～10分钟。

其中，所述的终止消化采用含10%小牛血清的RPMI1640培养基。

其中，所述的离心为1000rpm/min条件下离心5min。

本发明中，包皮组织通过0.25%的中性蛋白酶Ⅱ和0.25%胰酶两步消化，采用Ⅳ型胶原快速黏附法收集表皮干细胞，用K-SFM无血清角质细胞专用培养基（K-SFM培养液）培养。

本发明中，所采用的人包皮组织取于12～20岁健康青年包皮环切术后无传染、感染性疾病包皮。

本发明中IV型胶原包被了的培养器皿使用前应用PBS清洗。

本发明中应尽量修剪掉皮下脂肪组织，只留表皮和真皮层；组织块大小0.5cm×1cm较合适。加入0.25%的中性蛋白酶Ⅱ溶液应充分覆盖组织块，否则下一步用镊子分离表皮、真皮很困难。用镊子分离表皮与真皮层时需特别注意保护表皮完整性，尽量避免真皮成分脱落（否则可致成纤维细胞污染）。细胞传代时细胞生长密度不应过大，否则易出现接触性分化；采用0.25%胰酶消化6～10分钟，消化效果及细胞消化后活性均良好。传代次数可根据需要选择。

实施例1采用本发明方法培养人表皮干细胞

(1)将取下的人包皮组织用0.5%碘伏浸泡一分钟，PBS彻底漂洗两次至肉眼观察不再有碘伏着色。包皮组织来自第三军医大学西南医院泌尿外科12～20岁行包皮环切术无泌尿系感染等疾病患者(患者知情同意)；

(2)无菌条件下尽量修剪掉皮下脂肪组织，组织修剪为约0.5cm×1cm大小的皮片。

(3)加入0.25%的中性蛋白酶Ⅱ溶液充分覆盖组织块，4℃消化l2～16h；0.25%的中性蛋白酶Ⅱ的配置及使用方法为，0.5gDispaseII(Roche)溶入100mL0.1MPBS，4℃、过夜，再搅拌促溶解0.22um过滤，分装10ml/瓶，-20℃，保存；

(4)吸弃中性蛋白酶Ⅱ溶液，PBS清洗后用眼科镊轻轻牵扯组织，分离表皮与真皮；分离表皮与真皮层时需特别注意保护表皮完整性，尽量避免真皮成分脱落（否则可致成纤维细胞污染）；

(5)收集并剪碎表皮组织，加入0.25%胰蛋白酶溶液于37℃消化10min；

(6)加入含10%小牛血清RPMI164010mL终止消化后，吹打成混悬液，200目筛网研磨过滤;

(7)1000rpm/min条件下离心5min以收集细胞；

(8)弃去上清液后，PBS洗涤一次；

(9)加入K-SFM并轻柔吹打制成2.5×105/mL单细胞悬液，接种4mL单细胞悬液于预先包被了IV型胶原的25cm2培养瓶中，37℃静置10min；无血清角质细胞专用培养基K-SFM配置方法为，K-SFM(Invitrogen10725)：加入rEGF：(0.1～0.2)ng/mL，BPE:(20～30)μg/mL；加入CaCl20.05mM；双抗（青酶素+链酶素）100U/mL；IV型胶原包被培养瓶或培养板的方法为，按照10μg/cm²计算，将适量0.lmg/mL的IV型胶原溶液加入细胞培养瓶或培养板中，保证液面能够充分覆盖培养瓶或培养板底部即可；放置4℃冰箱，过夜（约12小时）或更长时间。使用前应用PBS液清洗IV型胶原包被了的培养瓶或培养板；

(10)吸去上层细胞悬液，用PBS轻轻漂洗两次，加入适量4mLK-SFM；

(11)37℃、5%CO₂孵箱培养(常规培养)；

(12)次日更换细胞培养液，继续常规培养，每2天换液1次。

(13)待细胞生长密度为70～80%时，进行细胞传代，包括如下步骤：

a、吸弃原细胞培养基，PBS洗2次；

b、加入0.25%胰酶1～1.5mL，37℃、5%CO₂孵箱孵育6～10分钟（镜下观察大部分细胞脱落时终止消化）；

c、加入含10%小牛血清RPMI164010mL终止消化后，吹打成单细胞混悬液；

d、移入离心管中，1000rpm/min条件下离心5min以收集细胞；

e、按1︰5传，加入K-SFM培养液；常规培养，共传代8次。

细胞形态请见图1和图2。

实施例2原代培养人表皮干细胞鉴定

（一）WB检测分离培养细胞中表皮干细胞标志物β1整合素和ck19蛋白的表达。

①蛋白的提取及定量：以浓度10⁵个/mL接种6孔板，每孔接种1mL，细胞密度达到80%后提取细胞总蛋白质,具体操作步骤如下：

1)倒掉培养基后，将细胞用0.1MPBS清洗两次，用加样枪吸净PBS后每孔加入200μL0.25%胰酶，消化约5分钟，每孔加入1mLPBS，吹打，用吸管将细胞悬液转移至离心管，800转，10分钟后弃上清，每管加入RIPA250μL，PMSF5μL，置于冰上消化10分钟。

2)将所有细胞悬液转移至1.5mLEP管中，进行超声裂解细胞。

3)4℃低温高速离心，12000g，30分钟。

4)吸取上清，并做好标记。

5)蛋白定量：(BAC法蛋白定量)准确称取10mg的标准蛋白(常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白)加蒸馏水溶解，定容到100mL。取6支试管分别编号为0～5，分别加入标准蛋白溶液0，20，40，60，80，100μL，并用蒸馏水补足体积到100μL。各试管加入工作液2mL，混匀，37℃水浴保温30min。在分光光度计上，以0管为参比，测定各管样品在562nm的吸光度值。以蛋白浓度为横座标,吸光度为纵座标，绘制标准曲线。取样品溶液100μL，将测得的吸光度值代入上述标准曲线，并计算蛋白浓度。如果样品的浓度过高，可用水做适当的稀释。

②western印记

1)制备分离胶及浓缩胶，按顺序每个加样孔加入10μg蛋白样品，3μLMarker，并做好标记。

2)电泳时先80V30分钟，再100V1小时30分钟。

3)用转移缓冲液洗涤胶和膜，将膜铺在胶上，用5mL的移液管在胶上来回的滚动驱除所有的气泡，在胶/膜外再包一张3mm的滤纸(预先用转移缓冲液侵泡)，将胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。将此滤纸/胶/膜滤纸放入电泳槽中，胶面向阴极。将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没胶，低温电泳(4℃)，100V，1小时30分钟。

4)含3%BSA的PBS封闭3小时。

5)将PVDF膜放入湿盒内，孵一抗，4℃过夜。

一抗浓度为：1︰500

6)1%TBST洗膜，5分钟，6次

7)二抗浓度均为1︰2000，室温放置1小时

8)1%TBST洗膜，5分钟，6次，

9)辣根过氧化酶显色，结果见图3。

（二）细胞免疫荧光染色法检测分离培养细胞中表皮干细胞标准物β1整合素和ck19的表达：

1)用IV型胶原溶液无菌条件下包被准备好的盖玻片，方法同前；

2)0.25%胰蛋白酶消化收集第2代或第8代ESC（人表皮干细胞），并制成单细胞悬液，浓度调整为约5×10⁵个/mL；

3)将盖玻片置于24孔细胞培养板中，滴加0.5mL的单细胞悬液；

4)待细胞贴壁后，加入适量K-SFM，于37℃5％CO₂培养；

5)取密度及状态均较良好的细胞爬片，0.01MPBS漂洗三次；

6)1%BSA(去离子水配)封闭30minRT；

7)1%BSA稀释的鼠抗人整合素β1单克隆抗体，1:100，4℃过夜；

8)复温30minRT；

9)PBS洗5min×3次；

10)1%稀释的TRITC标记的驴抗鼠IgG，1:500，37℃1小时闭光；

11)PBS洗5min×3次；

12)加兔抗人角蛋白(CK)19多克隆抗体，1:1004℃过夜；

13)复温30minRT；

14)PBS洗5min×3次；

15)加相应FITC标记的山羊抗兔IgG，37℃1小时闭光；

16)0.01MPBS洗涤三次，3min/次；

17)75％甘油封片；

18)荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察染色情况并拍照，结果见图4。

（三）流式细胞仪检测分离培养细胞表皮干细胞标准物α6-integrin及CD71的表达

1)取细胞培养瓶，弃培养液，PBS冲洗3次;

2)0.25%胰酶3mL，37℃，消化细胞2min;

3)倒置显微镜下观察细胞回缩，形态变圆，个别细胞脱壁漂浮即用10%FBS+RPMI1640终止消化；

4)轻柔吹打细胞使大部分细胞脱壁，收集细胞悬液离心；1000rpm，5min;

5)PBS重悬，EP管收集离心1000rpm，5min

6)细胞计数，调整细胞密度：106个细胞/300μLEP管

7)PE标记的鼠抗人α6-integrin单抗和(或)FITC标记的鼠抗人CD71单抗，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，4℃60min；

8)流式细胞仪检测，结果见图5。

（四）克隆形成实验检测表皮干细胞克隆形成能力

1)将培养细胞接种于预先用Ⅳ型胶原包被的六孔板中（1000个/六孔板每孔）；

2）加入含10%FBS的完全培养基，置于37℃、5%CO2孵箱内培养，每2天换液1次，培养两周（10-14天）；

3）PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗2遍；

4）0.1%结晶紫溶液室温染色15min，PBS洗5遍；

5）分别使用数码照相机和倒置显微镜观察拍照；

6）计数克隆数及克隆形成率，每个克隆应至少包括32个细胞。克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100。实验结果见图6。

（五）实验结果

如图1所示，采取IV型胶原快速黏附法对ESC进行分离培养，倒置相差显微镜下观察分离培养细胞形态：快速黏附细胞(贴壁10min，RapidAdherentCells,RAC)均匀分布、牢固贴附于培养瓶底部，细胞呈圆形，体积较小；如图1a所示培养24h后细胞明显伸展为扁平或多角形，核浆比例大；如图b所示培养第7天，细胞形成小克隆，胞体紧密相靠，胞膜相互衔接，呈典型“铺路石”样生长；培养第10天，细胞增殖明显加快，部分小克隆相互连接，克隆变大，第12-14天，可见圆形、椭圆形或不规则形状的大克隆形成，细胞连接成片，如图c所示；如图d所示，高倍镜下示细胞形态较一致，体积较小，胞核大，核质比高，细胞间连接紧密。这些现象均符合ESC的形态生长特点。

如图2所示，细胞培养至第8代时仍能成典型“铺路石”克隆样生长，细胞状态良好。

如图3所示，第2代及第8代表皮干细胞中CK19、β1整合素均有清晰蛋白条带。

如图4所示，免疫荧光染色并利用激光扫描共聚焦显微镜观察CK19和整合素β1的表达，FITC绿色荧光标记的CK19胞浆均呈强阳性表达（200倍）；TRITC红色荧光标记的β1整合素多数细胞呈强阳性表达，少数细胞表达较弱，主要表达于细胞膜（200倍）；FITC绿色荧光标记的K19与TRITC红色荧光标记的整合素β1双标合并成像中CK19和整合素β1在绝大多数细胞均表达，表达强弱有所差别，CK19荧光强度明显高于整合素β1（200倍）。结果表明，本实验分离培养的第2代和第8代表皮干细胞均同时表达CK19及β1整合素。

如图5所示，体外培养人表皮干细胞流式细胞术测定结果：第2代α6-integrinbriCD71dim率为85.6%，第8代α6-integrinbriCD71dim率（bri意思是强阳性，dim意思是阴性；也可以说α6-integrin强阳性CD71阴性）为50.4%。

如图6所示，克隆形成能力检测第2代及第8代体外培养人表皮干细胞均有较强的克隆形成能力，克隆形成率分别为33.1±4.8%，28.6±2.9%。

经多种人表皮干细胞标志物多种实验方法相关鉴定实验表明，所培养细胞为表皮干细胞；细胞传至第8代后表皮干细胞特性仍良好。结果表明，使用本发明一种人表皮干细胞改良的快速分离、培养方法解决了体外培养人表皮干细胞分化的问题。另外，细胞扩增数量计算，每瓶25mm²培养瓶细胞生长密度70～80%时细胞数约为8×10⁵个，按1︰5传代至第8代时细胞数约为8×10⁵×58=3.125×10¹¹个细胞；细胞扩增面积保守计算如下，一个成人包皮可获得表皮细胞约10⁷个细胞，约有10%为表皮干细胞。按本实验使用每25mm²培养瓶接种10⁶个表皮细胞计算，可接种面积为250mm²，按1︰5传代，传至第8代时细胞生长面积为250mm²×58=97656250mm²=97.656250m²≈100m²；扩增时间计算，原代需两周，以后每周传一次代，共需10周，及约为70天。按成人体表面积计算m²=(身高-0.6)×1.5，身高为1.7m成人体表面积约为1.65m²，取该成人包皮按本发明计算，250mm²×54=156250培养细胞约需传代数为第4代至第5代，培养时间约为6-7周。因此本发明在临床应用中具有广泛的前景。

Claims (7)

1.人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

a、消毒：将包皮环切术取下的人包皮组织用0.5％碘伏浸泡1～2min，PBS漂洗至肉眼观察不再有碘伏着色；

b、分离表皮与真皮：修剪掉皮下脂肪组织，组织修剪为约为0.5cm×1cm大小的皮片；加入0.25％的中性蛋白酶Ⅱ溶液充分覆盖组织块，4℃消化l2～16h；弃中性蛋白酶Ⅱ溶液，PBS清洗后用眼科镊子分离表皮与真皮，得到表皮组织；

c、收集：剪碎表皮组织，加入0.25％胰蛋白酶溶液消化5～10min，终止消化，过滤，离心，PBS洗涤，收集细胞；

d、培养：用K-SFM培养液将收集的细胞制成2.5×10⁵个/mL的单细胞悬液，接种单细胞悬液于包被了IV型胶原的培养器皿中，37℃静置10min；弃未贴壁细胞，用PBS漂洗，加入K-SFM培养液；37℃、5％CO₂培养；次日更换细胞培养液，继续培养，每2天换液1次；

e、传代：待细胞生长密度为70～80％时，用0.25％胰蛋白酶消化，终止消化，离心，收集细胞，按细胞接种面积扩大4～6倍传代；

上述所有操作均在无菌条件下进行；所述的离心为1000rpm/min条件下离心5min。

2.如权利要求1所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：步骤b中所述的0.25％的中性蛋白酶Ⅱ的配置方法为，0.5g中性蛋白酶Ⅱ溶入100mL0.1MPBS中，搅拌溶解，过滤，-20℃保存。

3.如权利要求1或2所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：步骤d中所述的K-SFM培养液包含下述成分：重组人表皮生长因子rEGF0.1～0.2ng/mL，牛垂体提取物BPE20～30μg/mL；CaCl₂0.05mM；青霉素、链酶素均为100U/mL。

4.如权利要求1或2所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：步骤d中所述的包被了IV型胶原的培养器皿采用如下方法制备：按照10μg/cm²计算，将适量0.lmg/mL的IV型胶原溶液加入细胞培养器皿中，是液体充分覆盖培养器皿的培养面，4℃放置12～24小时，使用前采用PBS清洗。

5.如权利要求1或2所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：步骤e中进行消化前去掉原培养液，并用PBS清洗细胞。

6.如权利要求1或2所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：步骤e中消化是指在37℃、5％CO₂下培养6～10分钟。

7.如权利要求1或2所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：步骤c和e中所述的终止消化采用含10％小牛血清的RPMI1640培养基。