CN102085390A - 软骨脱细胞基质及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了软骨脱细胞基质及其制备方法和用途。所述软骨脱细胞基质的厚度为1-30μm，且通过下述方法制备得到：(1)将动物软骨切为厚度为1-30μm的薄片；(2)将步骤(1)得到的薄片进行脱细胞处理。本发明还公开了组织工程化软骨移植物的制备方法，步骤为(a)将种子细胞接种于软骨脱细胞基质的一个表面上；(b)在接种有种子细胞的基质表面上覆盖另一片的软骨脱细胞基质；和(c)重复步骤(a)-(b)直至本发明提供的软骨脱细胞基质有10-30层，得到组织工程化软骨移植物；所述的种子细胞选自软骨细胞、骨髓基质干细胞hBMSCs、或其混合。

Description

软骨脱细胞基质及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及组织工程领域，尤其涉及一种软骨脱细胞基质及其制备方法和用途。

背景技术

创伤、炎症及先天疾病引起的软骨组织缺损或畸形在临床上非常常见，而软骨的自我修复能力较低，组织工程技术的发展为修复软骨缺损提供了很好的思路。可降解材料是组织工程化组织构件的基本要素，目前常用构建软骨的材料有聚乳酸(polyglycolicacid，PGA)、I型胶原、软骨脱细胞基质等。许多天然以及高分子合成材料已在软骨组织构建中得到应用，但存在材料生物力学强度低，降解产物引起免疫反应等问题。组织脱细胞基质是天然的可降解支架材料，具有细胞相容性好，无免疫原性等优点，成为组织工程材料的研究重点。软骨组织脱细胞基质研究也已存在不少报道，但由于软骨是较致密的结缔组织，因此存在脱细胞不全和新生细胞难以长入两大障碍。为了解决上述难题，人们采用化学方法提取软骨中的主要基质成分II型胶原制成凝胶，用于软骨组织构建，但凝胶的生物力学强度低，很难制成特定的形状并在软骨组织构建中维持形状。还有研究者将软骨组织打成粉末，再与软骨细胞混合构建组织，同样存在构建组织形状难以控制的缺点。

因此本领域迫切需要提供细胞脱尽的软骨脱细胞基质，并将其用于制备组织工程化软骨。

发明内容

本发明旨在提供一种软骨脱细胞基质及其制备方法和用途。

本发明的另一个目的是提供一种组织工程化软骨移植物及其制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种软骨脱细胞基质，所述基质的厚度为1-30μm，且通过下述方法制备得到：

(1)将动物软骨切为厚度为1-30μm的薄片；和

(2)将步骤(1)得到的薄片进行脱细胞处理；得到软骨脱细胞基质。

在另一优选例中，所述基质的形状为人耳廓、鼻背、鼻翼、下颏、颧弓、眉弓、管状、菱形、片状、圆柱等多种形状但不仅限于此。

在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的软骨脱细胞基质的制备方法，所述的方法包括步骤：

(1)将动物软骨切为厚度为1-30μm的薄片；和

(2)将步骤(1)得到的薄片进行脱细胞处理，得到如上所述的本发明提供的软骨脱细胞基质。

在另一优选例中，所述的脱细胞处理是将步骤(1)得到的薄片置于0.5-3％的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中5-48小时。

在本发明的第三方面，提供了一种组织工程化软骨移植物，所述的移植物包括种子细胞和如上所述的本发明提供的软骨脱细胞基质；所述的种子细胞选自软骨细胞、骨髓基质干细胞hBMSCs、脂肪间充质干细胞等成体来源间充质干细胞、脐带血干细胞、胚胎干来源间充质细胞、IPS细胞诱导全能型干细胞、或其混合。

在另一优选例中，以移植物的总重量计，其中的软骨脱细胞基质占20-40％。

在另一优选例中，所述移植物外形为人耳廓、鼻背、鼻翼、下颏、颧弓、眉弓、管状、菱形、片状、圆柱等多种形状但不仅限于此。

在本发明的第四方面，提供了一种如上所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，所述的方法包括步骤：

(a)将种子细胞接种于如上所述的本发明提供的软骨脱细胞基质的一个表面上；

(b)在接种有种子细胞的基质表面上覆盖另一片如上所述的本发明提供的软骨脱细胞基质；和

(c)重复步骤(a)-(b)直至如上所述的本发明提供的软骨脱细胞基质有10-30层，得到如上所述的组织工程化软骨移植物；

所述的种子细胞选自软骨细胞、骨髓基质干细胞hBMSCs、脂肪间充质干细胞等成体来源间充质干细胞、脐带血干细胞、胚胎干来源间充质细胞、IPS细胞诱导全能型干细胞、或其混合。

在另一优选例中，以每层软骨脱细胞基质的表面积为30-40平方毫米计，每层软骨脱细胞基质表面上接种的种子细胞为0.5-10×10⁵个。

在另一优选例中，在步骤(c)后还包括步骤(d)：将得到的组织工程化软骨移植物体外培养2-6周。

在本发明的第五方面，提供了一种如上所述的本发明提供的软骨脱细胞基质的用途，用于体外构建组织工程化软骨移植物。

据此，本发明提供了细胞脱尽的软骨脱细胞基质，并将其用于制备组织工程化软骨。

附图说明

图1显示了本发明实施例1提供的软骨脱细胞基质；其中

A，B是圆柱形软骨组织；C是软骨脱细胞基质薄片；D是不同厚度基质的染色情况；其中D1是DAPI染色情况，D2是HE染色情况。

图2显示了本发明实施例2提供的组织工程化软骨移植物的制作方法。

图3显示了不同细胞浓度体外构建组织工程化软骨移植物的大体形态与湿重(4周)；其中A：5x10⁴细胞/层；B：1x10⁵细胞/层；C：2.5x10⁵细胞/层；D：5x10⁵细胞/层；E：构建组织的湿重。

图4显示了不同细胞浓度体外构建组织工程化软骨移植物的组织学和特殊染色的情况。

具体实施方式

发明人经过深入研究，发现将软骨切成薄片可以充分脱细胞，然后利用“三明治”模式，将软骨脱细胞基质和种子细胞层层叠加构建的组织工程化软骨移植物，可以得到新生细胞能够充分长入，并且可以塑造成各种形状的软骨移植物。在此基础上，完成了本发明。

术语

如本发明所用，“种子细胞”是指组织工程学中用于体外构建移植物所使用的具有分化、增殖能力的细胞。本发明中所使用的种子细胞是构建组织工程化软骨移植物的种子细胞，包括自体软骨细胞、同种异体软骨细胞、骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)、BMSCs与软骨细胞的共培养、软骨膜细胞、骨膜细胞、肌肉源性基质干细胞(muscle derived stromal cells)、脂肪源性基质干细胞(adipose tissue derived stromal cells，ADSC)、胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)、和基因修饰的种子细胞。本发明使用的种子细胞是来自自体或同种异体。可以通过本领域熟知的或常规的方法分离得到种子细胞。

术语“种子细胞的分离”指将存在于动物体组织或器官中的种子细胞由多种细胞群体中选取出来的过程。

术语“种子细胞的扩增”指为了获取大量种子细胞而在体外环境中大量增殖的过程。

术语“诱导”指提供特殊的生化环境，将具有多向分化能力的干细胞等细胞群体转变为另一种功能特性不同的细胞群体的过程。

术语“接种”指将细胞均匀分布于三维支架材料上的过程。

术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽，例如纯化的细胞因子，或分离的软骨细胞。

术语“自体移植”指将所需生物活体材料(如种子细胞、脱细胞基质、和/或它们构成的移植物)从某个体中取出并再施用于同一个体的过程。

术语“异种移植”指将所需生物活体材料(如种子细胞、脱细胞基质、和/或它们构成的移植物)从某一物种中取出并再施用于另一物种对象的方法。

术语“异体移植”指将所需生物活体材料(如种子细胞、脱细胞基质、和/或它们构成的移植物)从某个体中取出并再施用于同物种另一不同个体的方法。

软骨脱细胞基质

本发明提供的软骨脱细胞基质是厚度为1-30μm(较佳地为3-20μm，更佳地为5-10μm)的薄片，其形状可以为人耳廓、鼻背、鼻翼、下颏、颧弓、眉弓、管状、菱形、片状、圆柱等多种形状但不仅限于此。

本发明提供的软骨脱细胞基质可以通过以下步骤制备得到：

(1)将动物软骨切为厚度为1-30μm的薄片(较佳地为3-20μm，更佳地为5-10μm)；和

(2)将步骤(1)得到的薄片进行脱细胞处理，得到本发明提供的软骨脱细胞基质。

本发明使用的动物软骨的获取部位没有特别限制，可以是关节软骨、肋软骨或其他软骨。所述的动物是包括人在内的哺乳动物，例如但不限于，猪、狗、猫、兔、猴等。

可以使用本领域常规的方法将动物软骨切成薄片，一种优选的方法是使用冰冻切片机。

可以使用本领域常规的方法进行脱细胞处理，例如但不限于，利用SDS进行脱细胞处理，利用Triton-X-100，PEG(聚乙二醇)进行脱细胞处理等，优选使用将步骤(1)得到的薄片置于0.5-3％的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中5-48小时(较佳地为8-36小时，更佳地为12-24小时)。

脱细胞处理的结果是以得到的脱细胞组织的细胞核染色计，其中所含有的细胞为0-10％，较佳地为1-5％，更佳地为0％。

组织工程化软骨移植物

本发明提供的组织工程化软骨移植物包括种子细胞和本发明提供的软骨脱细胞基质。以移植物的总重量计，其中的软骨脱细胞基质占20-40％，种子细胞的接种量为10⁶-10⁷个。

本发明提供的移植物外形为人耳廓、鼻背、鼻翼、下颏、颧弓、眉弓、管状、菱形、片状、圆柱等多种形状但不仅限于此。

本研究将软骨先切成10μm左右的薄片后脱除软骨细胞，经检测能较好地脱除细胞，具有脱细胞周期短及细胞脱除彻底的优点。利用“三明治法”将切片和软骨细胞层层叠加也解决了由于软骨脱细胞基质孔隙率过小而使软骨细胞无法长入的问题。软骨切片脱细胞基质通过和软骨细胞复合能较好保持软骨原有的力学性质。

本发明的组织工程化软骨的制备方法包括步骤：

第一步，将种子细胞接种于本发明的软骨脱细胞基质的一个表面上；

第二步，在接种有种子细胞的基质表面上覆盖另一片本发明的软骨脱细胞基质；

第三步，将种子细胞接种于第二步中覆盖上的另一片基质没有接触到接种细胞的一个表面上；

第四步，重复第二步至第三步，直至叠加的软骨脱细胞基质有10-30层(较佳地为15-25层)，得到本发明的组织工程化软骨移植物。

简言之，本发明的组织工程化软骨的制备方法是按照“软骨脱细胞基质(薄片)-种子细胞-软骨脱细胞基质(薄片)-种子细胞……”的模式制备得到的，也可以说是将接种有种子细胞的软骨脱细胞基质(薄片)层层叠加获得的。

每层软骨脱细胞基质表面上接种的种子细胞为0.5-10×10⁵个，较佳地为1.0-8×10⁵个，更佳地为2.5-5×10⁵个；该接种量以基质表面积为30-40平方毫米计。

在完成上述叠加步骤后还包括步骤：将得到的组织工程化软骨移植物体外培养2-6周(较佳地3-5周)。可以是本领域常规的方式进行体外培养，例如但不限于，利用生物反应器进行培养。

本发明中制备软骨脱细胞基质的软骨同制备组织工程化软骨移植物中的种子细胞可以来源于同体，也可以是同种异体或是异种，优选同体或同种异体，更佳地为同体。

应用方法

本发明的种子细胞与软骨脱细胞基质在体外复合，可以在生物反应器内形成适合各种软骨缺损大小和形状的组织工程化软骨后，再植入体内软骨缺损处。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明的软骨脱细胞基质中的细胞含量几乎为零，即脱细胞完全。

2、本发明的软骨脱细胞基质可以使种子细胞有效长入。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

制备软骨脱细胞基质

取新鲜成年猪耳廓软骨，用角膜环钻切成直径7mm的圆柱状，冰冻切片机切成厚度10-30μm的圆形薄片，置入1％SDS(上海生工)溶液，于摇床震荡过夜。切片用蒸馏水漂洗数次，常规苏木素-伊红(HE)染色和二脒基苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen，美国)荧光染色，检测脱细胞程度。切片用冷冻干燥机(Virtis，美国)冻干备用。

结果

猪耳廓软骨用角膜环钻切成直径7mm的圆柱状(图1A，B)，冰冻切片机切成厚度10-30μm的圆形薄片(图1C)，经SDS处理24小时后DAPI染色发现10μm厚的切片中无DAPI阳性染色，表明无DNA残留，而20μm和30μm厚的切片内可见较多的DAPI阳性区域，表明有DNA残留(图1D1)；HE染色观察发现10μm厚的切片中无胞核染色，而20μm和30μm厚的切片内有胞核染色(图1D2)。

HE和DAPI染色证实10μm厚的切片脱细胞完全，膜片可作为支架材料用于进一步的软骨组织构建。经SDS脱完细胞的软骨切片脱细胞基质韧性较强，冻干后呈白色片状(见图1)。

实施例2

制备组织工程化软骨移植物

耳廓软骨细胞培养

取新生猪耳廓软骨组织，切成1×1×1mm大小，加入0.1％胶原酶消化过夜，用75μm孔径的滤网滤过后，加入高糖DMEM(Hyclone，美国)含10％胎牛血清(FBS；Hyclone)的培养液，置于含5％CO₂的37℃培养箱培养，培养至90％融合后传代。

三明治法体外构建软骨

用0.25％胰蛋白酶消化收集培养的软骨细胞，用含10％FBS的DMEM培养液重新悬浮至不同浓度组(10、20、50、100×10⁶/ml)，将软骨脱细胞基质膜片和软骨细胞按“膜片-细胞悬液-膜片-细胞悬液”的方式在培养皿中层层叠加(图2)，细胞悬液每层5μl，共叠加20层膜片。静置1小时后加入高糖DMEM，10％FBS的培养液覆盖复合物，置于含5％CO₂的37℃培养箱培养。隔天换液，培养4周后取材。

构建软骨移植物的组织学检测

HE染色：将切片脱蜡水化后苏木素染色8分钟，冲洗后盐酸酒精分化数秒，自来水洗返蓝30分钟，伊红染色2分钟后乙醇脱水；二甲苯透明后中性树脂封片。

II型胶原免疫组织化学染色：切片脱蜡水化后，加入3％过氧化氢乙醇溶液室温下放置10分钟，(磷酸缓冲液)PBS漂洗3次，0.4％胃蛋白酶37℃消化30分钟；PBS漂洗3次，山羊血清封闭30分钟，吸去血清后加入1∶200稀释的一抗(abcam，美国)，4℃过夜后加入二抗，37℃温箱1小时，后用3，3’-二氨基联苯胺显色。

藏红花染色：苏木素染至大体颜色呈深蓝色，蒸馏水冲洗2分钟；0.5％盐酸酒精分化数秒，流水冲洗30分钟；Fast green染色4分钟；1％醋酸冲洗2次；Safranin’O液染3分钟；乙醇脱水；二甲苯透明后中性树脂封片。

甲苯胺蓝染色：甲苯胺蓝乙醇液10分钟，蒸馏水冲洗后乙醇脱水，二甲苯透明后封片观察。

结果

软骨组织体外构建

以10μm厚的软骨脱细胞膜片为支架材料，采用“三明治”复合的方法将软骨细胞和膜片复合(图2)，其中细胞量以5×10⁴-5×10⁵个细胞/层不等，体外培养4周后可见有软骨样组织形成(图3A-D)，组织湿重测量显示构建组织重量与接种细胞数量呈正相关，以5×10⁵个细胞每层接种后形成的组织最重(图3E)。

构建软骨的组织学检测

体外培养4周后组织取材，HE切片显示以5×10⁵个细胞每层接种后形成的组织结构致密，有较多成熟软骨细胞陷窝，并可见未完全降解的脱细胞基质，但无空泡样结构。而接种细胞量低时形成的组织结构松散，常见空泡样结构(图4)。Safranin’O染色显示未降解支架呈深红色，新合成细胞外基质呈浅红色，以5×10⁵个细胞每层接种后形成的组织中染色呈大片状阳性，而低细胞量接种形成的组织新合成基质量少。甲苯胺蓝染色显示未降解支架呈浅蓝色，新合成细胞外基质呈深蓝色，也以5×10⁵个细胞每层接种后形成的组织中新合成基质最多(图4)。II型胶原免疫组织化学染色显示构建的组织中有大量的II型胶原被染成特异性的棕黄色，说明构建组织具有软骨特征(图4)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (10)

1.一种软骨脱细胞基质，其特征在于，所述基质的厚度为1-30μm，且通过下述方法制备得到：

(1)将动物软骨切为厚度为1-30μm的薄片；

(2)将步骤(1)得到的薄片进行脱细胞处理；得到软骨脱细胞基质。

2.如权利要求1所述的软骨脱细胞基质，其特征在于，所述基质的形状为人耳廓、鼻背、鼻翼、下颏、颧弓、眉弓、管状、菱形、片状、圆柱等多种形状但不仅限于此。

3.一种如权利要求1或2任一所述的软骨脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)将动物软骨切为厚度为1-30μm的薄片；和

(2)将步骤(1)得到的薄片进行脱细胞处理，得到如权利要求1或2任一所述的软骨脱细胞基质。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的脱细胞处理是将步骤(1)得到的薄片置于0.5-3％的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中5-48小时。

5.一种组织工程化软骨移植物，其特征在于，它包括种子细胞和如权利要求1或2任一所述的软骨脱细胞基质；

所述的种子细胞选自软骨细胞、骨髓基质干细胞hBMSCs、脂肪间充质干细胞等成体来源间充质干细胞、脐带血干细胞、胚胎干来源间充质细胞、IPS  细胞诱导全能型干细胞、或其混合。

6.如权利要求5所述的移植物，其特征在于，以移植物的总重量计，其中的软骨脱细胞基质占20-40％。

7.一种如权利要求5或6任一所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)将种子细胞接种于如权利要求1或2任一所述的软骨脱细胞基质的一个表面上；

(b)在接种有种子细胞的基质表面上覆盖另一片如权利要求1或2任一所述的软骨脱细胞基质；和

(c)重复步骤(a)-(b)直至如权利要求1或2任一所述的软骨脱细胞基质有10-30层，得到如权利要求5或6任一所述的组织工程化软骨移植物；

所述的种子细胞选自软骨细胞、骨髓基质干细胞hBMSCs、脂肪间充质干细胞等成体来源间充质干细胞、脐带血干细胞、胚胎干来源间充质细胞、IPS细胞诱导全能型干细胞、或其混合。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，以每层软骨脱细胞基质的表面积为30-40平方毫米计，每层软骨脱细胞基质表面上接种的种子细胞为0.5-10×10⁵个。

9.如权利要求7或8任一所述的制备方法，其特征在于，在步骤(c)后还包括步骤(d)：将得到的组织工程化软骨移植物体外培养2-6周。

10.一种如权利要求1或2任一所述的软骨脱细胞基质的用途，其特征在于，用于体外构建组织工程化软骨移植物。

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