CN109550080A

CN109550080A - 一种人工双层皮肤及其制备方法

Info

Publication number: CN109550080A
Application number: CN201910067699.6A
Authority: CN
Inventors: 唐辉; 杨涛; 伍津津; 雷霞; 杨桂红
Original assignee: Chinese Peoples Liberation Army Army Specialized Medical Center
Current assignee: Chinese Peoples Liberation Army Army Specialized Medical Center
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2019-04-02

Abstract

本发明属于器官组织工程技术领域，具体涉及一种人工双层皮肤及制备方法，其中本发明的人工双层皮肤有类似于正常人体皮肤的表皮层和真皮层，所述真皮层包括支架材料和真皮层细胞，且真皮层内还包含有血管样结构；所述表皮层为覆盖在真皮层的表皮细胞。通过切片H.E染色显示，本发明制备的人工皮肤有着和天然皮肤相似的组织结构特征，表皮层细胞分化良好，真皮层细胞分布均匀，形态饱满，组织间可见血管样结构，赋予了人工皮肤重要的生理功能。含血管结构的人工双层皮肤在移植后的早期，能为细胞提供足够的氧气和其他营养成分，可直接应用于因各种因素导致的皮肤缺损的修复。

Description

一种人工双层皮肤及其制备方法

技术领域

本发明属于人工器官组织工程技术领域，具体涉及一种人工双层皮肤及其制备方法。

背景技术

皮肤作为机体最大的器官，具有屏障保护、排泄体液、调节体温和感受外界刺激等作用。慢性溃疡、重度烧伤、严重外伤等是造成大面积皮肤缺损的常见重要原因。自体皮肤移植是治疗皮肤缺损的一个常用方法，但存在供皮区新伤、供皮来源受限、移植部位的皮肤与邻近皮肤存在色泽、质地与功能上的差异等缺陷。而人工皮肤的出现为皮肤创面的修复和愈合提供了一条新的治疗途径。

国内外研究显示，目前各种人工皮肤移植存活率明显低于自体断层皮片移植，其中一个主要原因是人工皮肤移植后血管化速度较自体断层皮片慢。自体断层皮片的血管化是一个复合过程，包括血管吻合和血管新生。由于自体断层皮片内具有血管丛结构，移植后皮片内血管很快与植皮受区创面血管发生吻合，这是移植物早期血管化的主要机制。血管新生则发生在较后时期，即移植创面血管长入移植物的过程。动物实验表明这一过程至少发生在移植后一周。人工皮肤缺乏血管丛结构，其血管化过程单纯依靠血管新生，所以其血管化速度不及自体断层皮片。移植后的早期，营养成分单纯依靠扩散作用提供给移植物，距离血管0.2mm以上的细胞往往因得不到足够的氧分及其他营养成分而凋亡，所以早期血管化对缩短移植物再灌注所需的时间、降低缺血过程及提高移植物存活率等都具有十分重要的作用。

现有技术制备的人工皮肤虽然大多具有表皮层和真皮层，但真皮层细胞的营养来源却只能单纯依靠扩散作用提供，不利于细胞的生长及增殖，从而影响人工皮肤的质量及移植后的治疗效果。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种人工双层皮肤及其制备方法，使其具有制备周期短、制备方法简单、生产成本低，易于操作的优势，以解决上述技术缺陷。

为了实现上述目的，本发明通过如下的技术方案来实现：

1.一种人工双层皮肤，包括表皮层和真皮层，所述真皮层包括支架材料和真皮层细胞，还包含有血管样结构；所述表皮层为覆盖在真皮层的表皮细胞层。

进一步，所述真皮层的支架材料为胶原蛋白与壳多糖。

进一步，所述真皮层的支架材料还包括丝素蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、海藻酸盐和/或聚乙烯醇。

进一步，所述胶原蛋白是从动物的皮肤、尾腱、跟腱等组织提取的胶原蛋白。

进一步，所述表皮细胞为人角质形成细胞。

进一步，所述真皮层细胞为人成纤维细胞和血管内皮细胞。

2.人工双层皮肤的制备方法，所述制备方法具体步骤为：

a.先混匀真皮层支架材料，再加入真皮层细胞混匀，等待凝固成形；

b.接种表皮层细胞于真皮层支架上；

c.将接种后的复合物用皮肤血管化培养基浸没，37℃，5％CO₂下培养4～7天，每隔2～3天更换培养基。待表皮细胞生长融合后，将人工皮肤的表皮层部分暴露于空气中，形成气-液界面使其进一步熟化培养1～2周，此期间每周更换培养基2～3次，从而获得具有血管样结构的人工双层皮肤。

更进一步，所述真皮层细胞终浓度为0.2×10⁵-2×10⁵个/ml，所述表皮层细胞接种量为10⁴-10⁶个/cm²。

优选的所述表皮层细胞接种量为2×10⁵个/cm²。

更进一步，所述真皮层支架材料为胶原蛋白和壳多糖混合物，所述胶原蛋白浓度为1-1.5mg/ml，所述壳多糖浓度为0.004-0.006mg/ml。

更进一步，所述真皮层细胞或/和表皮层细胞为原代细胞传代后第3～8代细胞。

本发明的人工双层皮肤的制备方法，包括人工皮肤培养液的制备、工作细胞的制备、人工双层皮肤的构建，为便于理解本发明技术方案的内容，以下进行具体的描述。

细胞来源：本发明制备人工双层皮肤所使用的表皮细胞和成纤维细胞，可以来自青少年包皮环切术后的皮肤组织或废弃无病变皮肤，经消化处理获得。也可以来自能分化成表皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞的干细胞，包括成体干细胞和胚胎干细胞，如：皮肤干细胞、骨髓间充质干细胞、肌肉干细胞、肝脏干细胞、神经干细胞、造血干细胞中的一种或几种；

进一步地，细胞培养液的制备方法包括如下步骤：

1.角质形成细胞培养液：Epilife培养基500mL，在临近使用前加入角质形成细胞生长补充剂(HKGS)5ml，置于4℃中避光保存；

2.成纤维细胞培养液配置为：DMEM培养基粉末10g，4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.4g，碳酸氢钠3.7g，胎牛血清100mL，青霉素100，000u，链霉素100，000u，加超纯水至1000mL，调节pH值至7.2～7.4，使用0.22μm滤膜过滤，分装，于4℃保存备用；

3.脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养液为：内皮细胞培养基(ECM)500mL，在临近使用前加入胎牛血清25mL，内皮细胞补充剂(ECGS)5mL；

4.组织工程皮肤血管化培养液为：内皮细胞培养基500mL，胎牛血清20mL，氢化可的松0.4ug/mL，L-谷氨酰胺2mmol/L，血管内皮生长因子5ng/mL，成纤维细胞生长因子5ng/mL。

进一步地，工作细胞的制备方法包括如下步骤：

1.脐静脉内皮细胞HUVEC培养的步骤为：将原代脐静脉内皮细胞放置于温度为37℃，二氧化碳体积分数为5％的孵箱中培养2小时，更换新鲜的脐静脉内皮细胞培养液，观察细胞增殖至细胞培养瓶底面积的90％后，用浓度为0.25％的胰酶消化传代，每天换液，培养条件均为37℃，二氧化碳体积分数为5％的环境中，本发明采用的是3～8代细胞构建人工皮肤。

2.成纤维细胞的分离和培养的方法为：将无病变的包皮组织置于磷酸盐缓冲液(PBS)中，并迅速转移至无菌间进行细胞分离培养。具体包括了，使用体积分数为75％酒精溶液消毒，清除皮下组织，使用磷酸盐缓冲液冲洗5～8遍，将包皮组织剪成0.2～0.4cm×0.2～0.4cm皮条，加入浓度为0.25％的分离酶浸没皮条后，置于4℃消化16～18小时；使用眼科镊子分离表皮层与真皮层，将表皮层用于角质形成细胞的培养；将真皮组织剪碎后加入浓度为0.2％的胶原酶于温度在37℃、体积分数为5％二氧化碳孵箱中消化3h，消化完成后加入PBS稀释消化液；在1500rpm离心5min，吸弃上清液，再次加入PBS后再次进行离心，如此反复操作3～6次；加入适量成纤维细胞培养液重悬计数，先按1～2×10⁶个/ml的浓度接种到T75细胞培养瓶内，放置于37℃、体积分数为5％二氧化碳孵箱中培养，每隔三天换液一次，观察细胞增殖至细胞培养瓶底面积的85～95％后用浓度为0.25％的胰酶消化传代，本发明采用3～8代细胞构建人工双层皮肤。

进一步地，人工双层皮肤的构建包括以下步骤：

1、溶液的配置：

在无菌条件下，将胶原蛋白和壳多糖使用醋酸分别配置成浓度为3mg/mL的胶原醋酸溶液和浓度为0.1mg/mL的壳多糖醋酸溶液；

称取1.4614g L-谷氨酰胺粉末，加入50mL双蒸水将其配置成200mM的工作液，在无菌的条件下，用0.22um滤膜过滤备用。

2、合成真皮支架：

在冰浴的条件下，在已消毒灭菌的离心管中分别加入3mg/mL胶原醋酸溶液9mL；0.1mg/mL的壳多糖醋酸溶液1mL，200mM的L-谷氨酰胺水溶液1.5mL，浓缩了10倍含体积分数为50％小牛血清的DMEM培养液5mL，含体积分数为20％胎牛血清的内皮细胞培养液(ECM)5mL，充分混匀后，使用1MNaOH溶液调pH至7.2～7.4。

3、接种细胞：

加入人成纤维细胞悬液使其最终浓度为2.5×10⁴个/mL，之后再加入人脐静脉内皮细胞悬液使其终浓度为10⁵个/mL，将其快速与凝胶均匀混合后自然形成真皮层凝胶，以10^4～10⁶个/cm²的密度将人角质形成细胞接种到真皮层凝胶上，优选接种浓度为2×10⁵个/cm²。

4、人工双层皮肤的培养熟化：

将接种后的复合物用组织工程皮肤血管化培养液培养，置于37℃，体积分数为5％二氧化碳孵箱中浸没培养4～7天，每隔2～3天更换培养液。待表皮细胞生长融合后，用消毒棉垫及细胞筛网(美国Corning公司的Transwell板)将人工皮的角质形成细胞层部分暴露于空气中，形成气-液界面使其进一步熟化培养1～2周，此期间每周更换培养液2-3次，从而获得具有双层结构的血管化人工皮肤移植物。

本发明益处

1、本发明的含血管结构人工双层皮肤，制备方法简单，培养时间短，生产成本低，易于操作。

2、本发明的含血管结构人工双层皮肤，含有类似于人体皮肤的表皮层和真皮层，病理切片显示，表皮层和真皮层之间有完整的基底膜，并有连续长度不等的上皮突。其次真皮层内含有血管样结构，使人工皮肤接近天然人体皮肤，赋予了人工皮肤微循环系统，为组织提供更有效的代谢条件。含血管结构的人工双层皮肤在移植后早期，能为细胞提供足够的氧气和其他营养成分，可直接应用于因各种因素导致的皮肤缺损的修复。

3、本发明的含血管结构人工双层皮肤，其性状为类似于天然人体皮肤的柔软膜片，移植后既能有效保持创面水分，又能透气透湿，能在愈合前期为创面提供必要的湿性愈合条件。

4、本发明的含血管结构人工双层皮肤具有一定的弹性、韧性，形状大小及厚度可随创面要求进行覆盖、填塞、缝合，适应范围广。

5、本发明使用的同种异体细胞，本身抗原不高，且经过体外扩增培养过程，使得部分抗原丢失。另外，接种的细胞中无朗格汉斯细胞及树突状细胞，无抗原递呈作用，因此构建的含血管结构人工双层皮肤具有低免疫原性的特点，有较好的临床应用前景。

附图说明

图1为本发明制备的含血管结构的人工双层皮肤在培养过程中的低倍显微镜照片，图片显示真皮层中的内皮细胞在三维培养状态下形成的血管结构；

图2为本发明制备的含血管结构的人工双层皮肤的组织学结构，图片显示皮肤全层结构，包括表皮层、真皮层。真皮层内成纤维细胞形态正常，分布均匀，并含有较多血管样结构(横断面)，直径约为5～36微米；

图3为本发明制备的含血管结构的人工双层皮肤的免疫荧光染色照片(血管内皮细胞标记物CD31)，图片中绿色荧光显示了内皮细胞组织的存在及形态位置。

具体实施方式

以下实施例仅是对本发明的进一步阐述与说明，而不是对本发明范围的限制。结合附图，下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内

实施例1

具体的，一种含血管结构的人工双层皮肤的制备方法包括如下步骤：

(1)人工皮肤培养液制备：

①角质形成细胞培养液：Epilife基础培养液购买于Gibco公司，货号MEPI500CA，临用前加入人角质形成细胞生长补充剂(HKGS，Gibco，S-001-5)，于4℃保存。

成纤维细胞培养液：DMEM培养液粉末10g(Gibco，31600034)，HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)2.4g，NaHCO₃(碳酸氢钠)3.7g，小牛血清100m1，青霉素100，000u，链霉素100，000u，加超纯水至1000ml，用1M的NaOH(氢氧化钠)溶液或1M的HCl(盐酸)溶液调pH值至7.2～7.4，0.22μm滤膜过滤，分装，于4℃保存备用。

②脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养液：内皮细胞培养液(ECM，ScienCell，1001)500ml，临用前加入胎牛血清(FBS，ScienCell，0025)25ml，内皮细胞生长补充剂(ECGS，ScienCell，1052)5ml。

③组织工程皮肤血管化培养液：内皮细胞培养液(ECM)500ml，20ml胎牛血清(FBS)，氢化可的松0.4ug/ml，L-谷氨酰胺2mM，血管内皮生长因子5ng/ml，成纤维细胞生长因子5ng/ml。

(2)工作细胞制备：

①脐静脉内皮细胞HUVEC：购买于ATCC公司，货号CRL-1730^TM，来源于人脐静脉血管内皮。将购买的原代脐静脉内皮细胞放置于37℃、5％CO₂孵箱培养2小时后换新鲜的脐静脉内皮细胞培养液，观察细胞增殖至细胞培养瓶底面积的90％后用胰酶(0.25％)消化传代。传代后每隔1天换液1次，采用3～8代细胞构建人工皮肤。

②人成纤维细胞的分离和培养：手术环切术切取的无皮肤病变的包皮组织(年龄6～18岁)，征得其法定监护人知情同意后，将其放入PBS(磷酸缓冲盐溶液，phosphatebuffer saline)溶液中，并迅速转移至无菌间进行细胞分离培养，具体步骤如下：75％酒精消毒，清除皮下组织，PBS液反复冲洗5～8遍，剪成0.2～0.4cm×0.2～0.4cm皮条，加入0.25％的分离酶浸没皮条后置于4℃消化16～18h，用眼科镊分离表、真皮层，表皮层用于人角质形成细胞的培养，所得的真皮组织剪碎后加入0.2％的胶原酶于37℃、5％CO₂孵箱中消化3h。消化完后加PBS液稀释消化液，1500rpm×5min离心，吸弃上清，反复操作4次。加入适量成纤维细胞培养液重悬计数，按1～2×10⁶个/ml的浓度接种到T75细胞培养瓶内，放置于37℃、5％CO₂孵箱中。以后每隔3天换液1次，观察细胞增殖至细胞培养瓶底面积的90％后用0.25％的胰酶消化传代。采用第3～7代细胞进行人工皮肤构建。

表皮层材料为正常人角质形成细胞，真皮层细胞为正常人成纤维细胞和血管内皮细胞。表皮层和真皮层细胞来源可以是青少年包皮环切术后的皮肤组织或废弃无病变皮肤，经消化处理获得，也可以来自能分化成表皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞的干细胞，包括成体干细胞和胚胎干细胞，如：皮肤干细胞、骨髓间充质干细胞、肌肉干细胞、肝脏干细胞、神经干细胞、造血干细胞中的一种或几种。

(3)含血管结构人工双层皮肤的构建：

①溶液的配制：

A.在无菌条件下，将胶原蛋白用醋酸配制成质量-体积浓度为3mg/ml的胶原醋酸溶液；

胶原提取和配制方法：

a.鼠尾胶原前处理：剪取无特殊病原体级别(SPF级别)大鼠鼠尾，自来水浸泡清洗5次，每次3分钟，再用75％乙醇消毒，放入配制好的PBS缓冲液中，抽腱、去杂、清洗、沥干、冷冻切片(厚度40微米)、冷冻干燥等提取工序后得到胶原干粉，最后按3g/管称量，分装于15ml无菌离心管中，每管分别用自封口袋包装，送Co60辐照消毒后，再传入物料暂存间暂存；

b.千分之一冰醋酸液配制：在前处理室操作台，按冰醋酸：注射用水为1:1000体积比配制后高温湿热灭菌备用；

c.无菌冻干胶原3g加1000ml(1‰)冰醋酸溶液配制成胶原溶液，回旋震荡溶解1小时，4度冰箱保存，溶解待用。

B.在无菌条件下，取壳多糖配制成质量-体积浓度为0.1mg/ml的壳多糖醋酸溶液；

C.称取1.4614g L-谷氨酰胺粉末，加入50ml双蒸水配成200mM的工作液，在无菌条件下，用0.22um滤膜过滤备用；

②合成真皮层支架

在冰浴条件下，在已消毒灭菌的离心管中分别加入3mg/mL胶原醋酸溶液9mL；0.1mg/mL的壳多糖醋酸溶液1mL，200mM的L-谷氨酰胺水溶液1.5mL，浓缩了10倍含体积分数为50％小牛血清的DMEM培养液5mL，含体积分数为20％胎牛血清的内皮细胞培养液(ECM)5mL，充分混匀后，使用1M NaOH溶液调pH至7.2～7.4。

真皮层支架中还可以添加丝素蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、海藻酸盐和/或聚乙烯醇等物质帮助细胞更好的生长繁殖。

壳多糖是一种组织相容性良好的天然细胞外基质，也是良好的交联剂，无毒、无免疫原性、无致突变效应，可自然降解，同时具有广谱的抑制细菌、真菌生长的作用，还能促进上皮细胞生长和伤口愈合。

③接种细胞

按2.5×10⁴个/ml的终浓度加入人成纤维细胞悬液，再按10⁵个/ml的终浓度加入人脐静脉内皮细胞悬液，快速与真皮层支架液体混匀后待其自然形成真皮层凝胶。本实施例在6孔板中每孔加入了5ml真皮层支架液体，然后以10^4～10⁶个/cm²的密度将人角质形成细胞接种到真皮层凝胶上，优选的浓度为2×10⁵个/cm²。

真皮层由成纤维细胞和脐静脉内皮细胞种植到胶原-壳多糖凝胶中重塑而成。在重塑过程中，活细胞能释放多种细胞因子，这些因子不仅能诱导创面周围的表皮细胞向创面生长，还能诱导人工皮肤的再生表皮向周围创面生长从而实现再上皮化；成纤维细胞能合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维等有生物学活性的细胞外基质，这些基质不仅参与组织损伤后的修复，还可作为无炎症反应的活组织植入物供组织重塑。移植后，真皮层不仅为创面修复提供细胞、细胞因子和细胞外基质互相作用的动态环境，还为成纤维细胞、内皮细胞重新定植提供支架，并具有一定的屏障保护作用。

(4)含血管结构人工双层皮肤的培养熟化：

将接种后的复合物用组织工程皮肤血管化培养液培养，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下浸没培养4～7天，每隔2～3天更换培养液。待表皮细胞生长融合后，用消毒棉垫及细胞筛网(美国Corning公司的Transwell板)将人工皮的角质形成细胞层部分暴露于空气中，形成气-液界面使其进一步熟化培养1～2周，此期间每周更换培养液2～3次，从而获得具有双层结构的血管化人工皮肤移植物。

图1为本发明制备的含血管结构的人工双层皮肤第5天显微镜下明场照片(x200)，图片显示真皮层中的内皮细胞在三维培养状态下形成的血管结构；

图2为本发明制备的含血管结构的人工双层皮肤第10天H.E染色照片(x200)，图片显示皮肤全层结构，包括表皮层、真皮层。真皮层内成纤维细胞形态正常，分布均匀，并含有较多血管样结构(横断面)，直径约为5～36微米；

图3为本发明制备的含血管结构的人工双层皮肤第10天免疫荧光染色照片(血管内皮细胞标记物CD31染色)，图片中绿色荧光显示内皮细胞组织的存在及形态位置，蓝色荧光显示细胞核位置。

免疫荧光染色方法：将培养第10天的标本制成5um石蜡切片标本，脱蜡、水化，抗原修复后封闭，孵育兔抗人CD31抗体，漂洗后孵育抗兔的绿色荧光二抗，DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染核后漂洗，封片后于荧光显微镜200倍下观察。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种人工双层皮肤，包括表皮层和真皮层，其特征在于，所述真皮层包括支架材料和真皮层细胞，还包含有血管样结构；所述表皮层为覆盖在真皮层的表皮细胞层。

2.根据权利要求1所述的人工双层皮肤，其特征在于，所述真皮层的支架材料为胶原蛋白与壳多糖。

3.根据权利要求2所述的人工双层皮肤，其特征在于，所述真皮层的支架材料还包括丝素蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、海藻酸盐和/或聚乙烯醇。

4.根据权利要求2所述的人工双层皮肤，其特征在于，所述胶原蛋白是从动物的皮肤、尾腱、跟腱等组织提取的胶原蛋白。

5.根据权利要求1～4任一项所述的人工双层皮肤，其特征在于，所述表皮细胞为人角质形成细胞。

6.根据权利要求1～4任一项所述的人工双层皮肤，其特征在于，所述真皮层细胞为人成纤维细胞和血管内皮细胞。

7.权利要求1～6任一项所述人工双层皮肤的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体步骤为：

b.接种表皮层细胞于真皮层支架上；

c.将接种后的复合物用皮肤血管化培养基浸没，37℃，5％CO₂下培养4～7天，每隔2～3天更换培养基；待表皮细胞生长融合后，将人工皮肤的表皮层部分暴露于空气中，形成气-液界面使其进一步熟化培养1～2周，此期间每周更换培养基2～3次，从而获得具有血管样结构的人工双层皮肤。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述真皮层细胞终浓度为0.2×10⁵-2×10⁵个/ml，所述表皮层细胞接种量为10⁴-10⁶个/cm²。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述真皮层支架材料为胶原蛋白和壳多糖混合物，所述胶原蛋白浓度为1-1.5mg/ml，所述壳多糖浓度为0.004-0.006mg/ml。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述真皮层细胞或/和表皮层细胞为原代细胞传代后第3～8代细胞。