CN113082286A - 一种基于3d打印技术的三层仿生皮肤支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于3D打印技术的三层仿生皮肤支架及其制备方法，属于组织工程技术领域。本发明皮肤支架分为三层，第一层为模仿表皮的致密层；第二、三层分别为模仿真皮、皮下组织的疏松层，具有相互连通的微通道及不同的孔径；本发明基于3D打印方法，通过特定设置的生物墨水制备三层仿生皮肤支架，整体支架具有高溶胀比、降解受控、无细胞毒性、抗菌性、低免疫原性、促进深层创面高质量修复等优点，且该皮肤支架及其降解产物都具有良好的生物相容性。

Description

一种基于3D打印技术的三层仿生皮肤支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种基于3D打印技术的三层仿生皮肤支架及其制备方法，属于组织工程技术领域。
背景技术
皮肤作为人体最大的器官，由外向内分为表皮层、真皮层和皮下组织，覆盖全身，是人体与外界环境接触的屏障，承担着防御、感知、呼吸、调节体温、免疫等功能，同时也是人体最易受到损伤的器官之一。许多类型的损伤，如挫伤、割伤、化学和热烧伤都会破坏皮肤的完整性并造成一定量正常组织的丢失。对于一些轻微的皮肤损伤，皮肤可以快速自我修复并再生；但是对于由严重烧伤、糖尿病足溃疡等造成的深层及大面积开放性创面(涉及真皮层及皮下组织的缺失)，仅通过人体的自我修复非常困难，即使创面愈合成功也仍伴有大面积疤痕产生，且缺少汗腺、毛囊等功能性的皮肤附属物，将对患者的社会生活造成终身性的困扰。因此，促进深层创面的愈合和减少疤痕的形成成为了临床亟待解决的难题。
目前用于皮肤深层创面的传统治疗方法包括自体移植和异体移植。前者将患者身上其他部位上的正常皮肤移植到创面处，所以并不适合大面积创面的皮肤移植，并且这种“以创伤修复创伤”的方法还会使患者产生新的痛苦；而后者采用他人皮肤移植因面临着供体不足、易出现免疫排斥反应和道德伦理问题等因素而受到极大的限制。而近年来随着组织工程技术、3D打印技术的发展。为皮肤移植提供了新的思路，为皮肤深层受损的患者带来了新的曙光。
组织工程是指将工程科学和生命科学的原理相结合,研究开发用于组织和器官修复、改善和功能维持的生物替代物。组织工程皮肤是通过在体外培养扩增大量的功能细胞，复合到支架材料，通过细胞与支架相互作用，诱导、生长形成三维的有活性的皮肤替代物。
3D打印技术又被称为增材成型技术、堆积成型技术，是一种基于计算机三维数字成像技术及多层次连续打印的新型数字化成型技术，由3D打印技术制备出的组织工程支架具有精度高、成型速度快、细胞可植入等优点，已经在组织工程学、再生医学中得到广泛应用。数字投影技术(Digital Light Processing，DLP)也称面曝光快速成形技术，主要基于数字投影的面曝光快速成形3D打印系统，是将3D数字模型的切片信息通过数字光处理芯片向光固化料槽中投射，进而引发相应的光聚合反应过程，最终通过层层堆积的方式实现整个3D实体的构筑。基于DLP的光固化生物3D打印分辨率高、打印速度快、可实现复杂结构精细打印，在水凝胶/细胞高精度批量制造上具有显著优势，适合于临床及动物实验中批量可重复需求，已逐渐成为主流生物3D打印方法，在实际的科研、生产中具有广泛的应用价值。
因此，基于已有的技术积累，研究人员一直在研究新一代组织工程皮肤支架，但目前的技术方法距离真正理想的皮肤替代物尚存有一定差距。如专利CN201610793440.6与专利CN201610499353.X分别报道了一种海藻酸钠水凝胶支架构建的组织工程皮肤和一种微纳米复合双层皮肤支架，但这二者仅模拟了正常皮肤的表皮层与真皮层，并未对于皮肤表皮与真皮层之下的皮下组织进行模拟。研究表明，理想的皮肤支架应模仿正常皮肤的三层构架以及存在相互连通的微通道，促进空气(CO2，O2)和水分(H2O)与外部环境的交换以及营养物质的输送，为细胞迁移和增殖提供优越的微环境，从而促进皮肤再生。因此，如何建立一种在结构、力学性能和生物功能等方面类似于正常皮肤的组织工程皮肤支架来促进深层创面的高质量愈合是亟待解决的问题之一。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于3D打印技术的三层仿生皮肤支架及其制备方法，该皮肤支架分为三层，第一层为模仿表皮的致密层；第二、三层分别为模仿真皮、皮下组织的疏松层，具有相互连通的微通道及不同的孔径。整体支架具有高溶胀比、降解受控、无细胞毒性、抗菌性、低免疫原性、促进深层创面高质量修复等优点，且该皮肤支架及其降解产物都具有良好的生物相容性。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种3D打印制备三层仿生皮肤支架的方法，包括以下步骤：
(1)制备打印皮肤支架所需的生物墨水：将GelMA、HAMA、光引发剂和光阻剂分散在PBS溶液中，混匀，制得生物墨水；将盛有墨水的EP管保温在45℃水浴中等待打印，以上操作全程避光；
(2)将步骤(1)所得的生物墨水装载于3D打印机中进行打印，所述打印包括：先致密打印400μm高，作为表皮层；然后打印100-300μm孔径，高1200μm的六通孔结构作为真皮层；最后打印300-600μm孔径、高1000μm的六通孔结构作为皮下组织层。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中的3D打印机的三维打印模型为：设置400μm高作为表皮层；100-300μm孔径，高1200μm的六通孔结构作为真皮层；300-600μm孔径、高1000μm的六通孔结构作为皮下组织层。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中将生物墨水装载在打印机的过程中全程避光。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中分散是PBS溶液的温度为40-50℃，具体可选45℃。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中生物墨水中的GelMA的质量浓度为5wt％-20wt％；接枝率范围为50％-60％。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中生物墨水中的HAMA的质量浓度为1.5wt％-5wt％；接枝率范围为25％-40％。
在本发明的一些实施方案中，所述生物墨水中，GelMA的质量浓度优选为8wt％，HAMA的质量浓度优选为1.5％。
在本发明的一种实施方式中，所述生物墨水中中，光阻剂可选择酚红；光阻剂的用量为0.02-0.1wt％；具体可选0.05wt％。
在本发明的一种实施方式中，所述生物墨水中，光引发剂可选择LAP；光引发剂的用量为0.1wt％-0.5wt％；具体可选0.3wt％。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中的3D打印机的打印方法为DLP光固化3D打印(DLP，Digital Light Processing，基于数字投影技术)，所述DLP光固化3D打印机的关键打印参数的设置：光强为5-15mW/cm2、曝光时间为5-35s。
在本发明的一种实施方式中，所述DLP的操作过程如下：
(A)：将适量混合墨水移入打印机生物墨水料槽，将预先设计好的皮肤支架STL文件导入打印机控制软件，在模型的切片参数设置界面中，设置光强、片层曝光时间等关键打印参数后即可启动打印，打印机内部通过一定波长的光源对料槽底部的沉积平台进行照射，激活生物墨水中的光引发剂实现墨水固化完成打印。首先在沉积平台上打印一定高度仿生皮肤的表皮层，使表皮层的生物墨水实现从溶胶态到凝胶态的转变；随后在表皮层之下打印一定高度仿生皮肤的真皮层，使真皮层的生物墨水实现从溶胶态到凝胶态的转变；最终在真皮层之下打印一定高度仿生皮肤的皮下组织层，使皮下组层织的生物墨水实现从溶胶态到凝胶态的转变，依此层层叠加，得到支架初产品。
(B)：打印完成后小心取下沉积平台，使用75％酒精清洗表面并擦拭干净，小心使用刀片沿底部刮下皮肤支架，将皮肤支架放入75％酒精中超声振动5min，取出后吸取表面液体，使用光固化设备固化一段时间，即得三层仿生皮肤支架。
在本发明的一种实施方式中，所述3D打印制备三层仿生皮肤支架的方法，具体包括：
(1)建立皮肤支架的三维模型：以高400μm，不进行人为设置孔径的致密结构作为表皮层，以100-300μm孔径，高1200μm的六通孔结构作为真皮层，以300-600μm孔径、高1000μm的六通孔结构作为皮下组织层；
(2)制备打印皮肤支架所需的生物墨水：取一定量冻干后的GelMA与HAMA并溶解在45℃的PBS溶液中，然后添加光引发剂LAP和光阻剂(UV吸收剂)，制得混合生物墨水，将盛有墨水的EP管保温在45℃水浴中等待打印，以上操作全程避光；
(3)按照步骤(1)中的模型，使用步骤(2)所得的生物墨水，通过3D打印制备得到三层仿生皮肤支架。
在本发明的一种实施方式中，临床应用皮肤支架前，应先使用扫描仪对患者创面的实际形状进行3D扫描，根据创面需要合理设计皮肤支架的相关几何参数，建立三层仿生皮肤支架的三维模型。在本发明的一种实施方式中，在步骤(2)中选择水凝胶作为皮肤支架的生物墨水材料，一方面由于其具有良好的力学性能及生物相容性，可避免对伤口造成二次伤害，同时由于水凝胶的可降解性，能够在创面修复时同步降解，从而为新生的皮肤组织提供生长空间，顺利实现皮肤支架向新生皮肤组织的过渡。
在本发明的一种实施方式中，以GelMA与HAMA共混物作为生物墨水，既保留了良好的力学性能，又可利用GelMA和HAMA具有与天然细胞外基质(ECM)的结构相似性，为细胞生长和组织再生提供有益的微环境。涉及的GelMA和HAMA的制备过程如下：
GelMA的制备：在50℃油浴条件下将明胶与甲基丙烯酸酐进行反应，得到甲基丙烯酸酰化的明胶(GelMA)，引入了不饱和基团从而使GelMA具有光敏性。
HAMA的制备：在冰浴条件下将透明质酸与甲基丙烯酸酐进行反应，得到甲基丙烯酸酰化的透明质酸(HAMA)，引入了不饱和基团从而使HAMA具有光敏性。
在本发明的一种实施方式中，为了进一步提高深层创面修复质量，在临床应用中三层仿生皮肤支架还可根据需求复配生物活性因子，通过合理复配生物活性因子不仅可以促进细胞增殖和分化，抑制炎症反应，还能刺激内源性组织的修复和再生，从而促进深层创面高质量修复，实施方案可选用活性因子浸泡法。
在本发明的一种实施方式中，所述的生物活性因子，包括但不仅限于表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮细胞生长因子。
在本发明的一种实施方式中，所述活性因子浸泡法包括如下过程：将打印出的皮肤支架冷冻干燥后得到海绵样产物，所有的冻干产物应该保存于洁净的干燥皿中，复配前应将冻干的皮肤支架置于超净台中紫外灭菌20min，然后浸入4℃解冻的生物活性因子上清液中，在37℃的无菌培养箱中浸泡24h即可完成复配。
在本发明的一种实施方式中，为了进一步提高深层创面修复质量，在临床应用中三层仿生皮肤支架还可根据需求复配细胞(如皮肤成纤维细胞、表皮角质形成细胞、血管内皮细胞)，形成细胞-皮肤支架复合物，该皮肤支架为细胞提供一个生存的三维空间，且三维培养较传统的二维培养更能贴近细胞的自然生长状态，而复配的细胞也可在皮肤支架逐步降解吸收过程中，继续增殖并分泌促进创面愈合的物质，如成纤维细胞可分泌皮肤胶原、生长因子和结构性蛋白。实施方案可采用细胞攀附法。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞攀附法包括如下过程：将打印出的皮肤支架浸没在含有相应细胞的与胎牛血清的培养基中，在37℃、5％CO2条件下进行培养，每隔2天进行换液，培养5天后即可完成复配。
在本发明的一种实施方式中，包括但不仅限于皮肤成纤维细胞、表皮角质形成细胞、血管内皮细胞。
在本发明的一种实施方式中，为了进一步提高深层创面修复质量，在临床应用中三层仿生皮肤支架还可根据需求复配干细胞(如脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、皮肤表皮干细胞)，形成干细胞-皮肤支架复合物，干细胞具有自我更新、无限增殖和多向分化的能力，通过特定的诱导条件可分化为特定的细胞类型或功能性衍生物，可在皮肤修复中发挥极大作用。如骨髓间充质干细胞能参与伤口愈合过程中的所有阶段，抑制局部免疫反应、分泌生长因子，促进新生血管和再上皮化，加速伤口闭合。骨髓间充质干细胞还可以促进成纤维细胞和角质形成细胞的迁移，分泌可溶性因子诱导真皮成纤维细胞增殖、迁移和趋化，增加人真皮成纤维细胞的增殖和胶原合成。实施方案可采用上述的细胞攀附法。
在本发明的一种实施方式中，包括但不仅限于脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、皮肤表皮干细胞。
本发明基于上述方法提供了一种三层仿生皮肤支架。
在本发明的一种实施方式中，使用本发明的三层仿生肤支架时，需先用生理盐水或伤口清洁剂清洗伤口部位，轻轻擦干周围皮肤，有感染或不新鲜的溃疡创面时，须先进行清创，清创完成后将储存的皮肤支架贴敷于伤口处即可。
有益效果：
(1)本发明的皮肤支架由明胶、透明质酸等明胶为原料，模拟细胞外基质组成，具有良好的生物相容性，可避免对伤口造成二次伤害，并可为创伤部位提供湿性环境，有利于新生细胞的生长，从而更好地促进深层创面修复愈合。
(2)本发明的皮肤支架具有模拟正常皮肤的三层构架，可解决目前纯敷料或双层支架与正常皮肤的三层构架(表皮、真皮、皮下组织)不匹配问题，从而更好地促进深层创面修复愈合。
(3)本发明的皮肤支架内含微通道，一方面可供细胞攀附、生长，另一方面可促进空气(CO2，O2)和水分(H2O)与外部环境的交换以及营养物质的输送，为细胞迁移和增殖提供优越的微环境，从而促进皮肤再生。
(4)本发明的皮肤支架具有良好的力学性能，其杨氏模量可达10-70KPa，与人体正常皮肤杨氏模量相近，可提高患者的顺应性，减少患者的不适感。
(5)本发明的皮肤支架有相当强的湿组织黏附强度。粘合强度可达10-60KPa，可提高患者的顺应性，有利于促进湿润环境伤口愈合。
(6)本发明的皮肤支架具有较低的免疫原性，对生物体组织刺激小。
(7)本发明的皮肤支架可自行降解，可有效避免因除去过程而造成的二次伤害。
(8)本发明的皮肤支架可根据需要复配生物活性因子、细胞、干细胞等，应用前景广阔。
(9)本发明制备方法简单，原料易得，成本低廉，生产过程无污染，最终产物对环境和人体均无污染，绿色环保，适合大规模生产。
附图说明
图1为本发明皮肤支架材料的流变学测试图；
图2为本发明制备的三层仿生皮肤支架实物图；
图3为本发明制备的三层仿生皮肤支架显微形貌测试图；
图4为本发明皮肤支架在不同角度的关节施用效果图；
图5为本发明粘合强度测试的结构示意图；
图6为本发明皮肤支架材料的粘合强度测试结果；
图7为本发明力学性能测试的结构示意图；
图8为本发明皮肤支架材料的力学性能测试结果图；
图9为本发明皮肤支架材料的的溶胀性能测试实验结果；
图10为本发明皮肤支架材料的的保水性能测试实验结果；
图11为本发明实施例3制备的三层仿生皮肤支架的SEM图。
具体实施方式
本发明涉及的三层仿生皮肤支架模型为：
通过三维建模软件，建立三层仿生支架的三维模型：皮肤支架模型的表皮层为致密结构，高400μm；真皮层为200μm孔径的六通孔结构，高1200μm；皮下组织层为400μm孔径的六通孔结构，高1000μm；整体长10600μm，宽10600μm，高2600μm，并保存为STereoLithography(STL)文件。
本发明涉及的生物墨水中的各组分通过如下方式获取：
(1)GelMA合成：
称取5g A型明胶(300bloom)，在50℃油浴下溶于50ml的PBS中，至Gel完全溶解，在50℃、剧烈搅拌条件下缓慢加入(0.5ml/1min)6ml甲基丙烯酸酐(MA)反应6-7小时，而后停止搅拌，将产物收于3.5kDa透析袋中，于40℃蒸馏水、生化培养箱中透析2-3天，透析过程中每4小时换一次水；反应与透析过程全程避光。最后一次透析结束后将产物收至EP管中，与-20℃下冷冻12h，而后冻干3-5天，得到疏松多孔的GelMA并保存于4℃冰箱。
(2)HAMA合成：
将1g透明质酸(HA)溶于90mL DMF：H2O(1：2，v/v)混合溶剂中，冷却至4℃，用3M氢氧化钠调节溶液pH至8，缓慢滴加甲基丙烯酸酐8mL。通过在反应的前12小时内每小时加入氢氧化钠，将pH维持在8-9。再孵育12h后，将反应液倒入1L乙醇中，在-20℃下保温过夜后通过离心收集MAHA沉淀物(5000rpm，10min)。将得到的MAHA溶解于水中，在截留分子量为14kDa的透析带中透析2-3天，透析过程中每4小时换一次水，反应与透析过程全程避光。最后一次透析结束后将产物收至EP管中，与-20℃下冷冻12h，而后冻干3-5天，得到疏松的HAMA并保存于4℃冰箱。
为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。
实施例1
1、制备混合生物墨水
取冻干后的GelMA(接枝率为52％)溶解在45℃的PBS溶液中，然后添加光引发剂LAP和光阻剂酚红(ΜV吸收剂)，制得由8％GelMA、0.3％LAP和0.05％光阻剂组成的混合生物墨水，将盛有墨水的EP管保温在45℃水浴中等待打印，以上操作全程避光。
2、3D打印三层仿生皮肤支架
(1)3D打印
以上述三层仿生支架的三维模型作为模型(皮肤支架模型的表皮层为致密结构，高400μm；真皮层为200μm孔径的六通孔结构，高1200μm；皮下组织层为400μm孔径的六通孔结构，高1000μm；整体长10600μm，宽10600μm，高2600μm)，将预先设计好的皮肤支架STL文件导入DLP光固化打印机控制软件，用移液枪将步骤中2制备的混合生物墨水(1-3ml)缓慢移入DLP光固化打印机生物墨水料槽内，在模型的切片参数设置界面中，设置层高为50μm、光强为13mW/cm2、曝光时间为15s，模型切片准备完成后在软件中启动打印，打印机内部通过一定波长的光源对料槽底部的沉积平台进行照射，激活生物墨水中的光引发剂实现墨水固化完成打印。首先在沉积平台上打印仿生皮肤400μm厚度的表皮层，使表皮层的生物墨水实现从溶胶态到凝胶态的转变；随后在表皮层之下打印仿生皮肤1200μm厚度的真皮层，使真皮层的生物墨水实现从溶胶态到凝胶态的转变；最终在真皮层之下打印仿生皮肤1000μm厚度的皮下组织层，使皮下组层织的生物墨水实现从溶胶态到凝胶态的转变，依此层层叠加，得到支架初产品。
(2)打印后处理
打印完成后小心取下沉积平台，使用75％酒精清洗表面并擦拭干净，小心使用刀片沿底部刮下皮肤支架，将皮肤支架放入75％酒精中超声振动5min，取出后吸取表面液体，使用EFL光固化设备固化3min，即得三层仿生皮肤支架。
实施例2
1、制备混合生物墨水
取冻干后的GelMA(接枝率为52％)与HAMA(接枝率为33％)溶解在45℃的PBS溶液中，然后添加光引发剂LAP和光阻剂酚红(UV吸收剂)，制得由8wt％GelMA、1wt％HAMA、0.3wt％LAP和0.05wt％光阻剂组成的混合生物墨水，将盛有墨水的EP管保温在45℃水浴中等待打印，以上操作全程避光。
2、3D打印三层仿生皮肤支架
(1)3D打印
以上述三层仿生支架的三维模型作为模型(皮肤支架模型的表皮层为致密结构，高400μm；真皮层为200μm孔径的六通孔结构，高1200μm；皮下组织层为400μm孔径的六通孔结构，高1000μm；整体长10600μm，宽10600μm，高2600μm)，将预先设计好的皮肤支架STL文件导入DLP光固化打印机控制软件，用移液枪将步骤中2制备的混合生物墨水(1-3ml)缓慢移入DLP光固化打印机生物墨水料槽内，在模型的切片参数设置界面中，设置层高为50μm、光强为13mW/cm2、曝光时间为15s，模型切片准备完成后在软件中启动打印，打印机内部通过一定波长的光源对料槽底部的沉积平台进行照射，激活生物墨水中的光引发剂实现墨水固化完成打印。首先在沉积平台上打印仿生皮肤400μm厚度的表皮层，使表皮层的生物墨水实现从溶胶态到凝胶态的转变；随后在表皮层之下打印仿生皮肤1200μm厚度的真皮层，使真皮层的生物墨水实现从溶胶态到凝胶态的转变；最终在真皮层之下打印仿生皮肤1000μm厚度的皮下组织层，使皮下组层织的生物墨水实现从溶胶态到凝胶态的转变，依此层层叠加，得到支架初产品。
(2)打印后处理
打印完成后小心取下沉积平台，使用75％酒精清洗表面并擦拭干净，小心使用刀片沿底部刮下皮肤支架，将皮肤支架放入75％酒精中超声振动5min，取出后吸取表面液体，使用EFL光固化设备固化3min，即得三层仿生皮肤支架。
实施例3
1、制备混合生物墨水
取冻干后的GelMA(接枝率为52％)与HAMA(接枝率为33％)溶解在45℃的PBS溶液中，然后添加光引发剂LAP和光阻剂酚红(UV吸收剂)，制得由8wt％GelMA、1.5wt％HAMA、0.3wt％LAP和0.05wt％光阻剂组成的混合生物墨水，将盛有墨水的EP管保温在45℃水浴中等待打印，以上操作全程避光。
2、3D打印三层仿生皮肤支架
(1)3D打印
以上述三层仿生支架的三维模型作为模型(皮肤支架模型的表皮层为致密结构，高400μm；真皮层为200μm孔径的六通孔结构，高1200μm；皮下组织层为400μm孔径的六通孔结构，高1000μm；整体长10600μm，宽10600μm，高2600μm)，将预先设计好的皮肤支架STL文件导入DLP光固化打印机控制软件，用移液枪将步骤中2制备的混合生物墨水(1-3ml)缓慢移入DLP光固化打印机生物墨水料槽内，在模型的切片参数设置界面中，设置层高为50μm、光强为13mW/cm2、曝光时间为15s，模型切片准备完成后在软件中启动打印，打印机内部通过一定波长的光源对料槽底部的沉积平台进行照射，激活生物墨水中的光引发剂实现墨水固化完成打印。首先在沉积平台上打印仿生皮肤400μm厚度的表皮层，使表皮层的生物墨水实现从溶胶态到凝胶态的转变；随后在表皮层之下打印仿生皮肤1200μm厚度的真皮层，使真皮层的生物墨水实现从溶胶态到凝胶态的转变；最终在真皮层之下打印仿生皮肤1000μm厚度的皮下组织层，使皮下组层织的生物墨水实现从溶胶态到凝胶态的转变，依此层层叠加，得到支架初产品。
(2)打印后处理
打印完成后小心取下沉积平台，使用75％酒精清洗表面并擦拭干净，小心使用刀片沿底部刮下皮肤支架，将皮肤支架放入75％酒精中超声振动5min，取出后吸取表面液体，使用EFL光固化设备固化3min，即得三层仿生皮肤支架。
性能测试：
一、生物墨水流变学测试：
将实施例3中的生物墨水制备成直径6cm，高2mm的圆形薄片凝胶，用旋转流变仪进行应变扫描，选择合适的线性范围，确定扫描应变。再在剪切模式下进行动态频率扫描，扫描范围为1～100rad/s，所有测试均在常温条件下进行。
实验结果：如图1所示，湿态凝胶在1-100rad/s范围内，储存模量(G’)始终比损耗模量(G”)大一个数量级，并且没有频率依赖性，说明凝胶内部结构稳定，以弹性为主，弹性模量高于1KPa。另外在1-100rad/s范围内，凝胶的复态粘度(η)随剪切速率的增大而减小，说明凝胶具有潜在的可打印性。
二、显微形貌测试：
采用4×10放大倍数的光学显微镜对实施例3中皮肤支架分别从俯视和侧视的视角进行观察。
实验结果：如图3所示，从侧视视角可以看出皮肤支架三层结构清晰，模拟的表皮层、真皮层、皮下组织排列有序，无断裂、凸起等异常现象。从俯视视角可以清晰的看出皮肤支架具有网络结构以及上面的孔隙，且各个孔隙排列有序，孔隙之间无任何杂质。
三、粘附性能测试
三层仿生皮肤支架在施用后，如图4所示可以完全粘附并密封伤口部位，以起到屏障效果以及防止伤口渗出液流出，当关节在各个弯曲角度下也都具有良好的粘附效果。使用搭接剪切测试评估水凝胶的粘合强度。
粘合强度测试方法：经处理的猪皮于37℃水浴锅中解冻，切成1×4cm2样品，表面水分用吸水纸充分吸收，37℃保温。将由实施例1、2、3中用用于制作皮肤支架的生物墨水分别涂在猪皮表面(1×3cm2)后，将两块猪皮粘合，再利用光固化设备照射5min，待两块猪皮间的生物墨水固化完成后将样品在万能机械试验机上用50N称重传感器以十字头速率5mm/min进行单轴拉伸应力-应变试验。每次拉伸至断开作为最终的最大粘合力，计算出相应的粘合强度。结果如表1和图6所示。
表1不同实施例中支架材料的粘合强度结果
实施例 实施例1 实施例2 实施例3
墨水配比(GelMA：HAMA) 8％ 8％:1％ 8％:1.5％
粘合强度(KPa) 14.473 23.237 35.110
四、力学性能测试：
在创面修复及皮肤再生领域，制备的皮肤支架在材料学上必须要具有所需的力学性能，要能满足在皮肤愈合过程中，能支持维持一定的立体结构，且在生命活动中不受影响。杨氏模量是描述材料力学性能最常用的参数之一，是通过纵向应力引起的应变来描述材料的纵向变形，其单位是每单位面积上的力，现有研究结果表明，人体皮肤的平均杨氏模量在30KPa左右。
使用万能试验机测试皮肤支架原材料的力学性能。将不同比例的生物墨水放置模具中经固化制成圆柱形水凝胶(d＝9mm，h＝5mm)，将其放置在万能测试机上带有圆形金属板的称重传感器(200kgf)之间，以0.1mm/min的十字头速度将样品压缩至断裂，记录数据并作出应力-应变曲线以分析其杨氏模量。
实验结果：本发明皮肤支架水凝胶原材料的力学性能试验结果如图8所示。使用实施例1中生物墨水制得样品的杨氏模量为20.9KPa，在此基础上随着GelMA浓度的增加2％，其杨氏模量上升至47.0KPa；使用实施例3中生物墨水制得样品的杨氏模量为31.7KPa，与正常皮肤30KPa的杨氏模量近似，在此基础上随着GelMA浓度的增加2％，其杨氏模量上升至60.2KPa。
五、溶胀性能测试：
皮肤支架由水凝胶组成，高分子凝胶是由具有网状结构的聚合物和溶剂组成的，水凝胶在水中可显著溶胀。溶胀性是指凝胶吸收液体后自身体积或重量明显增大的特性，溶胀的程度可用溶胀率来衡量。测定皮肤支架水凝胶原材料的溶胀能力。首先，利用模具将实施例1和实施例3中的生物墨水制成圆柱形测试样品，冷冻干燥后并记录样品初始质量，将冻干后的两组样品分别浸入蒸馏水中，室温下溶胀，分别于1min、5min、10min、15min、30min、60min、120min、720min将样品取出，用滤纸擦拭表面多余水分并称重。按照公式计算皮肤支架的溶胀率：
溶胀率(％)＝(不同时间点样品的重量-样品的初始重量)/样品的初始重量×100；
实验结果：本发明皮肤支架水凝胶原材料的溶胀结果如图9所示。实施例1样品10min溶胀率上升至400％后缓慢增加至600％，实施例3样品由于含有透明质酸，其中含有大量的-COOH、-OH等亲水基团，从而10min溶胀率上升至650％后缓慢增加至850％，实施例3的溶胀率在测试范围内均高于实施例1。
六、保水性能测试：
测定皮肤支架材料的水分保留能力。首先，利用模具将实施例1和实施例3中的生物墨水制成圆柱形测试样品，将样品浸泡在蒸馏水中使其充分溶胀，然后将其保存在含有硫酸铵饱和溶液的干燥器中(37℃，相对湿度79％)，在不同时间点取出皮肤支架称重，连续测试6天。保水率按如下公式计算：
保水率(％)＝不同时间点样品的重量/样品的初始重量×100
实验结果：本发明皮肤支架水凝胶原材料的保水结果如图10所示。6天内总体趋势是皮肤支架的水分逐渐减少，显示保水行为对时间的依赖性。除在初始12h内，两者保水性能接近，12h后实施例3样品的剩余质量(保水性能)均高于实施例1样品，说明了透明质酸的的存在会影响样品的的保水率。
七、微观结构检测：
将实施例3制得的三层仿生皮肤支架冻干，之后将其浸入液氮并掰开，以获得内部横截面。将水凝胶的截面向上用导电胶带黏在样品台在其上进行溅射镀金，以研究内部形貌。用扫描电子显微镜(SEM)观测皮肤支架的内部形态。
实验结果：本发明的皮肤支架的表观形貌检测结果如图11所示，经SEM放大可看到皮肤支架骨架的多孔结构，该皮肤支架具有良好的孔隙结构和较高的孔隙率，不但有利于伤口渗出液的吸收，还可以透湿透气、为细胞攀附、增殖创造空间。
实施例4
参照实施例3，将生物墨水中的GelMA的质量浓度由8％分别替换为10％、5％，其他条件不变，制得相应的三层仿生皮肤支架，按上述力学性能检测方案测试其材料力学性能，结果如表2所示，GelMA浓度变为5％或10％后，材料的杨氏模量与人体真实皮肤杨氏模量存在一定的差异，需优化墨水配比。
表2不同墨水配比下支架材料的杨氏模量结果
GelMA：HAMA 杨氏模量
5％：1.5％ 22.7KPa
8％：1.5％(实施例3) 31.7KPa
10％：1.5％ 60.2KPa
可见，使用实施例3中特定浓度比例的生物墨水制得样品的杨氏模量为31.7KPa，与正常皮肤30KPa的杨氏模量最相近。
实施例5
参照实施例3，将生物墨水中的GelMA的质量浓度由8％替换为5％、HAMA的质量浓度由1.5％替换为1.25％，其他条件不变，制得相应的三层仿生皮肤支，按上述力学性能检测方案测试其材料力学性能，结果发现其杨氏模量为19.7KPa，与人体真实皮肤杨氏模量存在显著差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，其并非用以限定本发明，应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做出若干改进和润饰，因此这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种3D打印制备三层仿生皮肤支架的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备打印皮肤支架所需的生物墨水：将GelMA、HAMA、光引发剂和光阻剂分散在PBS溶液中，混匀，制得生物墨水；
(2)将步骤(1)所得的生物墨水装载于3D打印机中进行打印，所述打印包括：先致密打印400μm高，作为表皮层；然后打印100-300μm孔径，高1200μm的六通孔结构作为真皮层；最后打印300-600μm孔径、高1000μm的六通孔结构作为皮下组织层。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物墨水中，GelMA的接枝率为50％-60％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物墨水中，GelMA的质量浓度为5wt％-20wt％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物墨水中，HAMA的接枝率为25％-40％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物墨水中，HAMA的质量浓度为1.5wt％-5wt％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物墨水中，光阻剂为酚红；光阻剂的用量为0.02-0.1wt％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物墨水中，光引发剂可选择LAP；光引发剂的用量为0.1wt％-0.5wt％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的3D打印机的打印方法为DLP光固化3D打印，所述DLP光固化3D打印机的打印参数的设置：光强为5-15mW/cm2、曝光时间为5-35s。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在打印结束后，将获得的打印产品浸泡在含有生物活性因子或者细胞的溶液体系中，获得复合功能性的三层仿生皮肤支架。
10.权利要求1-9任一项所述方法制备得到的三层仿生皮肤支架。
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