CN113444680A - 一种生物3d打印制备体外皮肤模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种生物3D打印制备体外皮肤模型的方法,使用挤出式生物3D打印机对生物墨水进行打印,对打印的结构体进行光固化交联并进行培养,形成真皮层组织结构体;将人永生化角质形成细胞加载于真皮层组织结构体的表面并进行培养,然后对得到的双层皮肤模型进行气‑液分离培养,得到体外皮肤模型,本发明的生物3D打印制备体外皮肤模型的方法能够以较短的周期制备具有三维结构的体外皮肤模型,且各批次的质量稳定,制得的体外皮肤模型在功能上更接近人体组织,可用于皮肤健康相关的化妆品安全性及化学品毒理学评价。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域,具体涉及一种生物3D打印制备体外皮肤模型的方法。
背景技术
传统的化妆品、外用药品以及与皮肤接触的化学品的安全性评价是通过动物实验开展的,但是大量研究表明,实验动物比如大鼠的皮肤结构与人类存在差异,且动物模型存在实验周期较长、成本较高、个体差异性较大等缺点。另外,各国动物福利法律逐渐完善,欧盟自2009年起全面禁止采用动物实验进行化妆品原料和成品的安全性评价,并且不允许其成员国进口经动物实验进行安全性评价的化妆品。因此体外替代评价方法逐渐成为化妆品安全性、药品及有害化学品毒性检测和相关毒理学评判的重要手段。
目前,体外皮肤模型一般采用2D细胞培养方法,此方法需要大量人永生化角质形成细胞和成纤维细胞通过手工接种的方式平铺于胶原基底,并需花费较长培养周期才能形成多层细胞结构体。
生物3D细胞打印技术可重复构建批次内误差较小的组织支架及模型,细胞接种密度和分布都相对均匀,且模型结构可以是多样化、复杂化的。另外该技术支持多种细胞同时打印,还可做到不同种类细胞在成型过程中的分层、分区域叠加,可在很大程度上缩短体外模型的制备耗时。另一优势是,细胞在3D结构中因与体内三维环境相似,各细胞信号通路可正常运作表达,细胞在三维结构体中的状态和功能要优于传统2D培养。
发明内容
发明要解决的问题
普通2D体外皮肤模型构建存在耗时较长,且各批次质量上存在差异等弊端,从而影响检测评估结果的可靠性。因此提供一种具有较好的皮肤生理功能、批次质量稳定,可作为传统动物模型的良好替代品的体外皮肤模型的制备方法是本领域亟待解决的问题。
用于解决问题的方案
针对现有技术中存在的问题,本发明提供一种生物3D打印制备体外皮肤模型的方法,具体地,本发明通过以下方案解决本发明的技术问题。
[1]一种生物3D打印制备体外皮肤模型的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:将甲基丙烯酸酐化明胶(GelMa)溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中,然后加入光引发剂和人皮肤成纤维细胞,得到生物墨水;
步骤2:使用挤出式生物3D打印机对所述生物墨水进行打印,得到打印的结构体;
步骤3:在步骤2的打印过程中或打印后对所述打印的结构体进行光照射,得到含有成纤维细胞的水凝胶;
步骤4:将所述含有成纤维细胞的水凝胶浸没于细胞培养液中进行培养,形成真皮层组织结构体;
步骤5:将人永生化角质形成细胞加载于所述真皮层组织结构体的表面,并将加载后的结构体浸没于角质细胞培养液中进行培养,得到双层皮肤模型;
步骤6:对得到的双层皮肤模型进行气-液分离培养,得到体外皮肤模型。
[2]根据[1]所述的方法,其特征在于,所述步骤2中,将所述生物墨水打印于细胞培养皿中,优选打印于Transwell小室中。
[3]根据[1]或[2]所述的方法,其特征在于,所述步骤1包括以下:
步骤1-1:将GelMa溶解于PBS中,得到GelMa溶液;
步骤1-2:将光引发剂溶液添加至所述GelMa溶液中,得到GelMa水凝胶前驱液;
步骤1-3:将人皮肤成纤维细胞与所述GelMa水凝胶前驱液混合,得到所述生物墨水。
[4]根据[2]所述的方法,其特征在于,在所述步骤1中,还将人源重组胶原蛋白以及任选的动物组织提取的天然胶原蛋白和任选的从植物中提取的大分子材料加入所述PBS中。
[5]根据[1]或[2]所述的方法,其特征在于,所述步骤1中,所述GelMa在PBS中的浓度为0.03~0.15g/mL,优选0.05~0.125g/mL,所述GelMa的甲基丙烯酰基取代率为30%~75%。
[6]根据[1]或[2]所述的方法,其特征在于,所述光引发剂是苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂或Irgacure2959,所述光引发剂的用量为所述生物墨水的0.0001~0.002g/mL,优选是0.0005~0.0015g/mL。
[7]根据[1]或[2]所述的方法,其特征在于,所述生物墨水中所述人皮肤成纤维细胞密度为1×105~5×106个/mL,优选为1×105~5×105个/mL。
[8]根据[1]或[2]所述的方法,其特征在于,所述步骤2中打印的结构体的尺寸的长×宽×高为5mm×5mm×0.2mm~15mm×15mm×2mm。
[9]根据[1]或[2]所述的方法,其特征在于,所述步骤3中使用波长为365~405nm的光进行所述光照射,照射时间为5~40秒,优选为5~20秒。
[10]根据[1]或[2]所述的方法,其特征在于,所述步骤5中的加载通过生物3D打印或人工接种的方式进行,优选细胞加载密度为1×105~5×106个/mL,更优选为1×105~1×106个/mL。
[11]根据[1]或[2]所述的方法,其特征在于,所述步骤4中的培养时间为2~7天,优选为3~5天;所述步骤5中的培养时间为3~10天,优选为3~5天;所述步骤6中的气-液分离培养时间为7~21天,优选为14~21天。
[12]由根据[1]~[10]中任一项所述的方法制备的体外皮肤模型。
[13]根据[12]所述的体外皮肤模型用于皮肤毒理检测中的用途。
[14]根据[13]所述的用途,其中所述皮肤毒理检测为化妆品安全性监测评估、化学制剂对皮肤的损伤检测或皮肤应对有害化学品的毒理学检测。
发明的效果
本发明的生物3D打印制备体外皮肤模型的方法能够以较短的周期制备具有三维结构的体外皮肤模型,且各批次的质量稳定,制得的体外皮肤模型在功能上更接近人体组织,可用于皮肤健康相关的化妆品安全性及化学品毒理学评价。
附图说明
图1为实施例1中使用挤出式生物3D打印机对所述生物墨水进行打印的图。
图2为实施例2得到的体外皮肤模型中的角质形成细胞与成纤维细胞在气-液培养时的双荧光标记图。
图3为实施例3中培养14天后的体外皮肤模型在光学显微镜下的苏木精/伊红染色组织切片。
具体实施方式
<术语及定义>
本说明书中,使用“数值A~数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中,使用“以上”或“以下”表示的数值范围是指包含本数的数值范围。
本说明书中,使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中,使用“任选地”或“任选的”表示某些物质、组分、执行步骤、施加条件等因素使用或者不使用。
本说明书中,所使用的单位名称均为国际标准单位名称,并且如果没有特别声明,所使用的“%”均表示重量或质量百分含量。
本说明书中,所提及的“优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如,特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中,并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外,应理解,所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
<制备方法>
本发明的一个目的是提供一种生物3D打印制备体外皮肤模型的方法,包括以下步骤:
步骤1:将甲基丙烯酸酐化明胶(以下简称为GelMa)溶解于磷酸盐缓冲液(以下简称为PBS)中,然后加入光引发剂和人皮肤成纤维细胞,得到生物墨水;
步骤2:使用挤出式生物3D打印机对所述生物墨水进行打印,得到打印的结构体;
步骤3:在步骤2的打印过程中或打印后对所述打印的结构体进行光照射,得到含有成纤维细胞的水凝胶;
步骤4:将所述含有成纤维细胞的水凝胶浸没于细胞培养液中进行培养,得到真皮层组织结构体;
步骤5:将人永生化角质形成细胞加载于所述真皮层组织结构体的表面,并将加载后的结构体浸没于角质细胞培养液中进行培养,得到双层皮肤模型;
步骤6:对得到的双层皮肤模型进行气-液分离培养,得到体外皮肤模型。
本发明的方法优选在无菌的环境中进行,更优选在超净台中进行,并且所有使用的原料均优选是无菌的。
以下详细描述本发明方法的各个步骤。
步骤1
本步骤为配制生物墨水的步骤。本步骤中使用的GelMa为明胶的甲基丙烯酸酐化产物,其可以为粉末状,优选取代率在30%~75%之间,此取代率区间下的GelMa水溶性好,配制GelMa溶液耗时短。GelMa在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.03~0.15g/mL,优选0.05~0.125g/mL。
在优选的实施方案中,在步骤1中,还将人源重组胶原蛋白以及任选的动物组织提取的天然胶原蛋白和任选的从植物中提取的大分子材料加入所述磷酸盐缓冲液中。其中人源重组胶原蛋白可以为产自微生物,例如大肠杆菌、链球菌、汉森酵母、酿酒酵母、毕赤酵母等表达系统的人源重组胶原蛋白。从植物中提取的大分子材料例如可以为海藻酸钠。其中人源重组胶原蛋白优选人源Ⅲ型重组型胶原蛋白,动物组织提取的天然胶原蛋白优选为鼠尾Ⅰ型胶原。在生物墨水中进一步使用这些组分,能够提高生物墨水的打印性和生物相容性。
本发明中使用的光引发剂是苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂或Irgacure2959,所述光引发剂的用量为所述生物墨水的0.0001~0.002g/mL,优选是0.0005~0.0015g/mL。本发明所具体选择的光引发剂在规定浓度下对细胞毒性小,且交联效率高。
生物墨水中的人皮肤成纤维细胞密度为1×105~5×106个/mL,优选为1×105~5×105个/mL。
在具体的实施方案中,步骤1包括以下:
步骤1-1:将GelMa粉末溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中,得到GelMa溶液;
步骤1-2:将光引发剂溶液添加至所述GelMa溶液中,得到GelMa水凝胶前驱液;
步骤1-3:将人皮肤成纤维细胞与所述GelMa水凝胶前驱液混合,得到所述生物墨水。
步骤2
本步骤为进行生物3D打印的步骤。在本步骤中,可以利用本领域任何已知的挤出式生物3D打印机对步骤1配制的生物墨水进行3D打印。可以将生物墨水打印于任何合适的细胞培养器皿内,优选将生物墨水打印于Transwell小室中。Transwell小室可为皮肤模型培养过程中的‘气-液分离培养’提供有效支持。
步骤2中得到的打印的结构体可以根据需要为任何形状和尺寸的,例如可以为5mm×5mm×0.2mm~15mm×15mm×2mm(长×宽×高)的结构体。
生物3D打印的具体参数可根据实际需要以及所使用的3D打印机进行选择。在一个实施方案中,挤出速度为4-8mm/s,层高为0.2-0.3mm,打印丝间接为0.2-0.3mm,打印环境温度为20-25℃,成型平台温度为2-6℃,所使用的针头规格可以为25G。
步骤3
在本步骤中,对打印的结构体进行光照,使其发生光交联固化,得到含有成纤维细胞的水凝胶。本步骤可以在步骤2的打印过程中进行,也可以在步骤2的打印结束后进行。例如,可以在步骤2中对生物墨水进行打印的同时,对打印的结构体进行光照射,使其发生光交联固化,也可以在步骤2的打印结束后,对打印的结构体进行光照射,使其发生光交联固化。
本步骤中,优选使用对细胞伤害较小的蓝光对打印的结构体进行光照射,例如可以使用波长为365~405nm的光。对于具体的光源,本发明没有特别限制,其可以为本领域已知的任何合适的光源,例如LED光源等。光照射的时间可以为5~40秒,优选为5~20秒。
本步骤中得到的水凝胶具有多孔结构。水凝胶内部的多孔结构,可为其中的成纤维细胞提供养分的输送和细胞代谢物的排出。
步骤4
在本步骤中,对步骤3得到含有成纤维细胞的水凝胶进行培养,使成纤维细胞增殖,从而形成真皮层组织。
在具体的实施方案中,将含有成纤维细胞的水凝胶浸入人成纤维细胞培养液中,于37℃、5%CO2的条件下进行培养,培养时间为2~7天,优选为3~5天。培养可以在细胞培养箱中进行,并每隔一定的时间,例如2天,更换一次新鲜的培养液。
在具体的实施方案中,本步骤中使用的人成纤维细胞培养液包含FBS、青链霉素混合液(双抗)、谷氨酰胺和DMEM,其中青链霉素混合液(双抗)的含量可以为例如0.1-2%(V/V),谷氨酰胺的浓度可以为例如0.1-25g/L。
步骤5
本步骤中,在真皮层组织表面形成角质层,从而得到双层皮肤模型。
本步骤中,人永生化角质形成细胞可以通过生物3D打印或人工接种的方式进行。在采用生物3D打印的实施方案中,将人永生化角质形成细胞通过挤出式生物3D打印机打印于步骤4中得到的真皮层组织结构体的表面。
在一个实施方案中,人永生化角质形成细胞的加载密度为1×105~5×106个/mL,更优选为1×105~1×106个/mL。本发明中所使用的人永生化角质形成细胞比原代细胞更稳定。
将加载有人永生化角质形成细胞的真皮层组织结构体浸没于角质细胞培养液中进行培养,使角质形成细胞增殖。培养的时间可以为3~10天,优选为3~5天。可以在细胞培养箱中进行培养,培养的条件可以为37℃、5%CO2。
在具体的实施方案中,本步骤中使用的角质细胞培养液包含FBS、青链霉素混合液(双抗)和EMEM,其中青链霉素混合液(双抗)的含量可以为例如0.1-2%(V/V)。
步骤6
本步骤中,对双层皮肤模型进行气-液分离培养,从而得到成熟的体外皮肤模型。优选在Transwell小室中进行。
在具体的实施方案中,将双层皮肤模型的角质形成细胞层表面的培养液移除并使双层皮肤模型仅下部,即真皮层组织接触角质细胞培养液,以此对角质形成细胞层进行气-液分离培养,得到成熟角质层的体外皮肤模型。气-液分离培养是时长为7~21天,优选为14~21天。
在具体的实施方案中,本步骤中使用的角质细胞气-液分离培养液包含FBS、CaCl2、人角质细胞生长因子、青链霉素混合液(双抗)、谷氨酰胺、EMEM和F12。
<体外皮肤模型及其用途>
本发明的另一个目的是提供由本发明的方法制备的体外皮肤模型。
本发明的另一个目的是提供由本发明的方法制备的体外皮肤模型用于皮肤毒理检测中的用途。其中皮肤毒理检测包括但不限于化妆品安全性监测评估、化学制剂对皮肤的损伤检测和皮肤应对有害化学品的毒理学检测。
实施例
下面结合实例对本发明的做进一步说明,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。需要理解的是,本发明并不局限于下述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改。
除非另外明确说明,以下实施例中所使用的化学品和仪器的说明和来源如下:
GelMa:甲基丙烯酸酐化明胶,SunP Gel G1,甲基丙烯酰基取代率为55~65%,上普博源(北京)生物科技有限公司;
PBS:磷酸盐缓冲液;
LAP:苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂,SunP Gel LAP CAT NO.SP-BI-C02-2;
PBS:磷酸盐缓冲液WISENT CAT NO.311-010-CL;
DMEM:WISENT CAT NO.319-005-CL;
EMEM:WISENT CAT NO.320-006-CL;
F12:WISENT CAT NO.319-085;
人皮肤成纤维细胞:HFF-1ZQ0450,上海中乔新舟生物科技有限公司;
生物3D打印机:BioMaker,上普博源(北京)生物科技有限公司;
人皮肤角质形成细胞(human immortalized keratinocytes):协和细胞资源中心;
人源Ⅲ型重组胶原蛋白粉末:江苏江山聚源生物科技有限公司。
除非另外明确说明,以下实施例中所使用的培养液的组成如下:
人成纤维细胞培养液:10%(V/V)FBS、1%(V/V)青链霉素混合液(双抗)和1%(V/V)谷氨酰胺(glutamine),余量为DMEM;
角质细胞培养液:培养液含10%(V/V)FBS、1%(V/V)青链霉素混合液(双抗),余量为EMEM;
角质细胞气-液分离培养液:培养液含10%(V/V)FBS、1.8mmol/L CaCl2,10ug/L人角质细胞生长因子,1%(V/V)青链霉素混合液(双抗)和1%(V/V)谷氨酰胺,余量为EMEM/F12(3:1,V:V)。
实施例1
将750mg GelMa加入PBS溶液中,在37℃下搅拌10分钟使其完全溶解,配制成0.075g/mL的GelMa溶液。取1mL GelMa溶液,移入15mL离心管中,加入100μL 1%(g/mL)的LAP溶液均匀混合,配制成可光固化的水凝胶前驱液。将1mL细胞密度为5×105/mL的人皮肤成纤维细胞悬液离心后去除培养液,用1mL上述浓度为0.075g/mL的GelMa溶液重旋,与可光固化的水凝胶前驱液混合并搅拌均匀,制得生物墨水。
将制得的生物墨水装配至3mL注射器中,并于4℃低温放置5分钟。然后将注射器安装于生物3D打印机上并调节参数,按照挤出速度6mm/s、针头规格25G、层高0.25mm、打印尺寸为10mm×10mm、打印丝间距为0.25mm,打印环境温度23℃、成型平台温度4℃进行3D打印,结构体被打印于培养皿中。
打印完成后使用蓝光对打印的结构体进行光照固化15秒,得到含有成纤维细胞的水凝胶。
将含有成纤维细胞的水凝胶浸没于人成纤维细胞培养液中,于细胞培养箱中在37℃、5%CO2培养5天,每2天换一次新鲜的培养液,得到真皮层组织结构体。
将100μL细胞密度为1×106个/mL的人皮肤角质形成细胞接种于得到的真皮层组织结构体的表面,静置2小时,加入角质细胞培养液没过表层细胞并放入培养箱中于37℃、5%CO2培养4天,得到双层皮肤模型。
将双层皮肤模型取出,转入Transwell小室中进行气-液分离培养14天,每2天更换一次角质细胞气-液分离培养液,得到功能完整的体外皮肤模型。
实施例2
将1000mg GelMa加入PBS中,于37℃下搅拌10分钟使其完全溶解,配制成0.1g/mL的GelMa溶液。取1mL GelMa溶液,移入15mL离心管中,加入150μL 1%(g/mL)的LAP溶液均匀混合,配制成可光固化的水凝胶前驱液。将1mL细胞密度为5×105个/mL的人皮肤成纤维细胞悬液离心后去除培养液,用1mL上述浓度为0.1g/mL的GelMa溶液重旋,与可光固化的水凝胶前驱液混合并搅拌均匀,制得生物墨水;
将制得的生物墨水装配至3mL注射器中,并于4℃低温放置5分钟。然后将注射器安装于生物3D打印机上并调节参数,按照挤出速度6mm/s、针头规格25G、层高(打印体厚度)0.25mm、打印尺寸为10mm×10mm、打印丝间距为0.25mm,打印环境温度23℃、成型平台温度4℃进行3D打印,直接打印于Transwell小室内。
打印完成后使用波长405nm光源对打印的结构体进行光照固化20秒,得到含有成纤维细胞的水凝胶。
将含有成纤维细胞的水凝胶浸没于人成纤维细胞培养液中,放入细胞培养箱中于37℃、5%CO2培养5天,每2天换一次新鲜的培养基,得到真皮层组织结构体。
将100μL细胞密度为1×106个/mL的人皮肤角质形成细胞接种于得到的真皮层组织结构体的表面,静置2小时,加入角质细胞培养液没过表层细胞并放入培养箱中于37℃、5%CO2培养4天,每2天换液,得到双层皮肤模型。
将盛装有双层皮肤模型的Transwell小室取出,去除Transwell小室中体外皮肤模型上部的角化细胞培养基,进行气-液分离培养14天,每2天更换一次角质细胞气-液分离培养液,得到功能完整的体外皮肤模型。
实施例3
将750mg GelMa和300mg人源Ⅲ型重组胶原蛋白粉末加入PBS中,37℃下搅拌10分钟使其完全溶解,配制成GelMa浓度为0.075g/mL的GelMa/重组胶原蛋白混合溶液。取1mL此溶液,移入15mL离心管中,加入100μL 1%(g/mL)的LAP溶液均匀混合,得到可光交联的水凝胶前驱液。将1mL细胞密度为5×105个/mL的人皮肤成纤维细胞悬液离心后去除培养液,用1mL上述浓度为0.075g/mL的GelMa/重组胶原蛋白混合溶液重旋,与可光固化的水凝胶前驱液混合并搅拌均匀,制得生物墨水。
将制得的生物墨水装配至3mL注射器中,并于4℃低温放置5分钟。然后将注射器安装于生物3D打印机上并调节参数,按照挤出速度6mm/s、针头规格25G、层高(打印体厚度)0.25mm、打印尺寸为10mm×10mm、打印丝间距为0.25mm,打印环境温度23℃、成型平台温度4℃进行3D打印,直接打印于Transwell小室内。
打印完成后使用波长405nm光源对打印的结构体进行光照固化15秒,得到含有成纤维细胞的水凝胶。
将含有成纤维细胞的水凝胶浸没于人成纤维细胞培养液中,放入细胞培养箱中于37℃、5%CO2培养5天,每2天换一次新鲜的培养基,得到真皮层组织结构体。
将100μL细胞密度为1×106个/mL的人皮肤角质形成细胞接种于结构体表面,静置2小时,加入角质细胞培养液覆盖表层细胞并放入培养箱中于37℃、5%CO2培养4天,每2天换液,得到双层皮肤模型。
将含有双层皮肤模型的Transwell小室取出,去除Transwell小室中结构体上部的角化细胞培养液,进行气-液分离培养14天,每2天更换一次角质细胞气-液分离培养液,得到功能完整的体外皮肤模型。
产业上的可利用性
本发明的方法制得的体外皮肤模型可以广泛用于在体外检测、评估化妆品安全性、药品及化学试剂对皮肤的刺激及毒理学影响。
Claims (14)
1.一种生物3D打印制备体外皮肤模型的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:将甲基丙烯酸酐化明胶(GelMa)溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中,然后加入光引发剂和人皮肤成纤维细胞,得到生物墨水;
步骤2:使用挤出式生物3D打印机对所述生物墨水进行打印,得到打印的结构体;
步骤3:在步骤2的打印过程中或打印后对所述打印的结构体进行光照射,得到含有成纤维细胞的水凝胶;
步骤4:将所述含有成纤维细胞的水凝胶浸没于细胞培养液中进行培养,形成真皮层组织结构体;
步骤5:将人永生化角质形成细胞加载于所述真皮层组织结构体的表面,并将加载后的结构体浸没于角质细胞培养液中进行培养,得到双层皮肤模型;
步骤6:对得到的双层皮肤模型进行气-液分离培养,得到体外皮肤模型。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤2中,将所述生物墨水打印于细胞培养皿中,优选打印于Transwell小室中。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤1包括以下:
步骤1-1:将GelMa溶解于PBS中,得到GelMa溶液;
步骤1-2:将光引发剂溶液添加至所述GelMa溶液中,得到GelMa水凝胶前驱液;
步骤1-3:将人皮肤成纤维细胞与所述GelMa水凝胶前驱液混合,得到所述生物墨水。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在所述步骤1中,还将人源重组胶原蛋白以及任选的动物组织提取的天然胶原蛋白和任选的从植物中提取的大分子材料加入所述PBS中。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤1中,所述GelMa在PBS中的浓度为0.03~0.15g/mL,优选0.05~0.125g/mL,所述GelMa的甲基丙烯酰基取代率为30%~75%。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述光引发剂是苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂或Irgacure2959,所述光引发剂的用量为所述生物墨水的0.0001~0.002g/mL,优选是0.0005~0.0015g/mL。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述生物墨水中所述人皮肤成纤维细胞密度为1×105~5×106个/mL,优选为1×105~5×105个/mL。
8.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤2中打印的结构体的尺寸的长×宽×高为5mm×5mm×0.2mm~15mm×15mm×2mm。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤3中使用波长为365~405nm的光进行所述光照射,照射时间为5~40秒,优选为5~20秒。
10.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤5中的加载通过生物3D打印或人工接种的方式进行,优选细胞加载密度为1×105~5×106个/mL,更优选为1×105~1×106个/mL。
11.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤4中的培养时间为2~7天,优选为3~5天;所述步骤5中的培养时间为3~10天,优选为3~5天;所述步骤6中的气-液分离培养时间为7~21天,优选为14~21天。
12.由根据权利要求1~10中任一项所述的方法制备的体外皮肤模型。
13.根据权利要求12所述的体外皮肤模型用于皮肤毒理检测中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途,其中所述皮肤毒理检测为化妆品安全性监测评估、化学制剂对皮肤的损伤检测或皮肤应对有害化学品的毒理学检测。
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