CN111304168B - 三维生物打印的体内肿瘤模型及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种三维生物打印的体内肿瘤模型及其构建方法，属于生物技术领域或生物三维打印领域。所述肿瘤模型包括：肿瘤细胞，水凝胶支架，其为通过三维生物打印方式获得的立体支架；其中，所述水凝胶支架被移植于动物体内，形成所述体内肿瘤模型。所述体内肿瘤模型的构建方法包括：混合的步骤、打印的步骤、水凝胶支架培养的步骤、移植的步骤。本发明的目的在于提供一种可快速、稳定、大规模制备、高致瘤率的体内肿瘤模型及其构建方法。本发明利用3D生物打印技术可快速、稳定、大规模制备载肿瘤细胞水凝胶支架，经体外短时间培养后移植入裸鼠体内而获得高致瘤率，并可根据研究的需要构建不同部位和不同类型的肿瘤模型，个性化构建肿瘤模型。

Description

三维生物打印的体内肿瘤模型及其构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域或生物三维打印领域，具体涉及一种三维生物打印的体内肿瘤模型及其构建方法。
背景技术
无胸腺裸鼠动物模型已广泛应用于肿瘤学、免疫学、毒理学等各个领域的研究工作，其可以帮助我们研究疾病的发生发展机制、抗癌药物的筛选，对于提高疾病的诊断和治疗方法具有重要的意义。目前，应用最多的裸鼠动物模型是移植瘤模型，由于裸鼠无胸腺，缺乏成熟的T淋巴细胞，肿瘤移植后生长良好，是肿瘤研究中较为理想和常用的动物实验工具。依据移植方式的不同可以分为肿瘤组织块移植和肿瘤细胞悬液注射移植。
肿瘤组织块移植法是将新鲜肿瘤组织标本切成细小的组织块或制成匀浆后再移植入裸鼠体内，此方法保留了原有肿瘤组织结构和肿瘤细胞的三维微环境，但由于存在对取材的新鲜肿瘤组织部位要求高、取材时间严格、致瘤率低等缺点限制了它的应用。
细胞悬液注射法是取体外培养处于对数生长期的肿瘤细胞，用无血清培养液或生理盐水调整到合适的细胞浓度后再注射入裸鼠体内，此方法操作简便、致瘤率高，但由于移植所用的肿瘤细胞需经过酶消化处理，肿瘤的原有细胞结构可能被破坏，且体外二维培养的肿瘤细胞呈单层生长，缺乏细胞-细胞及细胞-细胞外基质之间的相互作用，无法模拟体内肿瘤组织微环境所具有的三维结构，从而在蛋白表达、细胞信号传导、细胞活性以及对药物的反应方面显示出与体内肿瘤细胞的不同。这些因素可导致移植肿瘤生物学行为的改变，最终影响肿瘤的诊断与治疗。
三维(3D)生物打印是基于计算机辅助添加制造技术，精确控制生物材料、细胞和生长因子等在3D结构中的分布和组合，所构建的模型能模拟体内细胞所需要的三维微环境并促进细胞和细胞及细胞与细胞外基质的相互作用，从而更好的保持细胞的生物学行为。
引用文献1公开了一种三维组织结构体的制备方法及其应用，并具体公开了该方法的三维组织结构体为将细胞微球和基质材料进行生物打印，得到的三维组织结构体。其中，所述细胞微球按照如下方法1)或2)或3)制备：
1)将细胞A悬浮于载体材料中，得到的细胞微球；2)将涂覆材料均匀涂覆在1)制备的细胞微球表面，得到的细胞微球；3)将细胞B均匀粘附在2)制备的细胞微球外周，得到的细胞微球；所述细胞A和细胞B为相同的细胞或不同细胞。三维组织结构体不仅可应用于药物开发、药物筛选、药物检测、药物测试、构建药理模型、病理模型、组织/器官模型和肿瘤模型，还可用于治疗疾病或病症、组织修复或再生以及矫形或整形的植入物。
引用文献2公开了一种冰胶三维结构体、其制备方法及应用，并具体公开了所述制备冰胶三维结构体的方法包括：(a)将冰胶原料与交联溶液混合得到冰胶前体溶液，其中所述冰胶原料包含选自以下的一种或多种物质：明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、壳聚糖、层连接蛋白、纤连接蛋白和纤维蛋白；所述交联溶液包括选自以下的一种或多种物质：氯化钙溶液、京尼平溶液、戊二醛溶液、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶；(b)将所述冰胶前体溶液三维打印成预凝胶三维结构体；(c)冷冻所述预凝胶三维结构体，从而得到冷冻的预凝胶三维结构体；以及(d)干燥所述冷冻的预凝胶三维结构体，从而得到冰胶三维结构体。所述体外研究包括细胞培养、细胞生物学研究、药物开发、药物筛选、药物检测、药物测试、构建药理模型、病理模型、组织/器官模型和肿瘤模型。
也就是说，现有技术中公开了体外肿瘤模型和制备体外肿瘤模型的方法。但是，鉴于现有技术中存在的体外肿瘤模型的缺陷，因此，需要构建一种既能保持肿瘤细胞所需的三维微环境，又避免移植前对肿瘤细胞进行消化传代处理，同时保证移植的成功率的肿瘤模型。
引用文献：
引用文献1：CN 106139251 A
引用文献2：CN 106178110 A
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种可快速、稳定、大规模制备的、高致瘤率的体内肿瘤模型、构建方法，以及前述体内肿瘤模型的用途。
用于解决问题的方案
本公开涉及的技术方案如下。
(1)一种体内肿瘤模型或其构建方法，其中，所述体内肿瘤模型包括：
水凝胶支架；
其中，所述水凝胶支架中载有肿瘤细胞；
将所述水凝胶支架移植入动物体内，进而得到所述体内肿瘤模型。
(2)根据(1)所述的体内肿瘤模型或其构建方法，其中，所述水凝胶支架为立体支架；可选的，所述水凝胶支架的边长或直径为10mm～20mm；可选的，所述水凝胶支架的厚度为0.5mm～2.0mm；可选的，所述水凝胶支架为具有网格结构的立体支架；优选的，所述水凝胶支架通过三维生物打印方式获得。
(3)根据(1)或(2)所述的体内肿瘤模型或其构建方法，其中，所述水凝胶支架通过水凝胶体系制备得到，其中，所述水凝胶体系为含有选自包括明胶、海藻酸钠、胶原、壳聚糖、透明质酸中的一种或两种以上的组合的体系；优选的，所述水凝胶体系为含有海藻酸钠和明胶的体系；更优选的，所述水凝胶体系为含有0.5％(w/v)～1.5％(w/v)的海藻酸钠和5％(w/v)～15％(w/v)的明胶的体系。
(4)根据(1)-(3)任一项所述的体内肿瘤模型或其构建方法，其中，所述水凝胶体系中还含有交联剂；优选的，所述交联剂为CaCl2溶液；更优选的，所述CaCl2溶液的浓度为2％(w/v)～3％(w/v)。
(5)根据(1)-(4)任一项所述的体内肿瘤模型或其构建方法，其中，所述水凝胶支架由水凝胶纤维丝构成，可选的，所述水凝胶纤维丝在所述体内肿瘤模型中的体积填充率为40～60％；可选的，所述水凝胶纤维丝的直径为0.20mm～0.40mm；优选的，所述水凝胶纤维丝的直径为0.25mm～0.35mm。
(6)根据(1)-(5)任一项所述的体内肿瘤模型或其构建方法，其中，所述肿瘤细胞选自包括胶质瘤细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、直肠癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、表皮癌细胞、淋巴癌细胞中的一种或两种以上的组合；优选的，所述肿瘤细胞的来源为人。
(7)根据(1)-(6)任一项所述的体内肿瘤模型或其构建方法，其中，所述动物为小鼠或大鼠；优选的，所述小鼠或所述大鼠为裸鼠。
(8)根据(1)-(7)任一项所述的体内肿瘤模型的构建方法，其中，所述构建方法包括如下步骤：
混合步骤：将所述肿瘤细胞与所述水凝胶体系混合，形成混合物；
打印步骤：以所述混合物为打印材料，使用三维生物打印机打印，获得水凝胶支架；
水凝胶支架培养步骤：在体外培养所述水凝胶支架；
移植步骤：将培养后的水凝胶支架移植到动物体内，得到所述体内肿瘤模型；
可选的，所述构建方法还包括如下步骤：
细胞获取步骤：在所述混合步骤之前，常规培养所述肿瘤细胞至对数生长期后，获取细胞；和/或
交联步骤：在所述打印的步骤后，使用交联剂，促使所述水凝胶体系的内部形成交联结构；优选的，所述交联剂为CaCl2溶液；更优选的，所述CaCl2溶液的浓度为2％(w/v)～3％(w/v)。
(9)根据(8)所述的构建方法，其中，在所述打印步骤中，所述打印的速度为10μm/s～40μm/s；优选的，所述打印的速度为20μm/s～30μm/s；可选的，在所述水凝胶支架培养步骤中，所述体外培养的时间为7～15天。
(10)根据(1)-(7)任一项所述的体内肿瘤模型或根据(8)-(9)任一项所述的构建方法在体外研究中的应用，其中，所述体外研究选自脑肿瘤发生机制研究、胶质瘤干细胞生物学研究、胶质瘤血管化研究、脑肿瘤化疗药物的开发和/或临床前研究。
(11)一种体内肿瘤模型的构建方法，其中，所述体内肿瘤模型包括：
水凝胶支架；
其中，所述水凝胶支架中载有肿瘤细胞；
将所述水凝胶支架移植入动物体内，进而得到所述体内肿瘤模型。
(12)根据(11)所述的体内肿瘤模型的构建方法，其中，所述水凝胶支架为立体支架；可选的，所述水凝胶支架的边长或直径为10mm～20mm；可选的，所述水凝胶支架的厚度为0.5mm～2.0mm；可选的，所述水凝胶支架为具有网格结构的立体支架；优选的，所述水凝胶支架通过三维生物打印方式获得。
(13)根据(11)或(12)所述的体内肿瘤模型的构建方法，其中，所述水凝胶支架通过水凝胶体系制备得到，其中，所述水凝胶体系为含有选自包括明胶、海藻酸钠、胶原、壳聚糖、透明质酸中的一种或两种以上的组合的体系；优选的，所述水凝胶体系为含有海藻酸钠和明胶的体系；更优选的，所述水凝胶体系为含有0.5％(w/v)～1.5％(w/v)的海藻酸钠和5％(w/v)～15％(w/v)的明胶的体系。
(14)根据(11)-(13)任一项所述的体内肿瘤模型的构建方法，其中，所述水凝胶体系中还含有交联剂；优选的，所述交联剂为CaCl2溶液；更优选的，所述CaCl2溶液的浓度为2％(w/v)～3％(w/v)。
(15)根据(11)-(14)任一项所述的体内肿瘤模型的构建方法，其中，所述水凝胶支架由水凝胶纤维丝构成，可选的，所述水凝胶纤维丝在所述体内肿瘤模型中的体积填充率为40～60％；可选的，所述水凝胶纤维丝的直径为0.20mm～0.40mm；优选的，所述水凝胶纤维丝的直径为0.25mm～0.35mm。
(16)根据(11)-(15)任一项所述的体内肿瘤模型的构建方法，其中，所述肿瘤细胞选自包括胶质瘤细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、直肠癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、表皮癌细胞、淋巴癌细胞中的一种或两种以上的组合；优选的，所述肿瘤细胞的来源为人。
(17)根据(11)-(16)任一项所述的体内肿瘤模型的构建方法，其中，所述动物为小鼠或大鼠；优选的，所述小鼠或所述大鼠为裸鼠。
发明的效果
在本发明的一个实施方式中，本发明可快速、稳定、大规模制备载肿瘤细胞水凝胶支架，移植后的致瘤率较高。
在本发明的另一个实施方式中，采用本发明构建方法构建的肿瘤动物模型，可为肿瘤的研究提供理想的动物体内肿瘤模型。
在本发明的另一个实施方式中，本发明利用三维生物打印方式构建的载有肿瘤细胞水凝胶支架在移植前无需用胰酶进行消化传代处理，并且可以根据研究的需要构建不同部位和不同类型的肿瘤模型，个性化构建体内肿瘤模型。
在本发明的另一个实施方式中，本发明采用三维打印方式形成的水凝胶支架中，随着培养时间的增加，水凝胶支架中的肿瘤细胞逐渐聚集形成肿瘤细胞球，更加有利于促进细胞与细胞之间的相互作用。
在本发明的另一个实施方式中，通过本发明构建的体内肿瘤模型，将有助于进一步阐明肿瘤的发生发展机制，提供脑肿瘤发生机制研究、胶质瘤干细胞生物学研究、胶质瘤血管化研究，更好的为抗肿瘤药物的筛选和开发有效的临床治疗方法提供帮助。
附图说明
图1示出了本发明三维生物打印和交联原理和步骤示意图；
图2示出了本发明三维生物打印的具有网格结构的载有肿瘤细胞的水凝胶支架扫描电镜照片；
图3示出了本发明三维生物打印的水凝胶支架培养15天后的照片；
图4示出了在传统二维培养条件下形成的肿瘤细胞生长照片；
图5示出了本发明三维水凝胶支架中形成的肿瘤细胞球照片；
图6示出了本发明三维水凝胶支架移植步骤中裸小鼠手术切口照片；
图7示出了本发明移植了载有U118肿瘤细胞的水凝胶支架4周后的肿瘤组织形成情况的照片；
图8示出了本发明三维生物打印胶质瘤细胞水凝胶支架所形成的异种移植瘤照片；
图9示出了本发明三维生物打印胶质瘤细胞水凝胶支架所形成的异种移植瘤HE染色照片；
图10示出了本发明采用二维培养的人胶质瘤细胞U118注射入Balb/c裸鼠皮下所形成的异种移植瘤的照片；
图11示出了本发明直接将人胶质瘤细胞U118与海藻酸钠/明胶溶液混合后移植入Balb/c裸鼠皮下所形成的异种移植瘤的照片；
图12示出了本发明采用直接混合胶质瘤细胞与水凝胶后皮下移植所形成的异种移植瘤组织切片的HE染色照片；
图13示出了采用本发明方法构建的体内异种移植瘤免疫组化照片，显示具有血管结构的体内肿瘤模型，其中，黑色箭头示出了有血管结构形成；
图14示出了采用本发明三维打印载肿瘤细胞水凝胶支架，通过体外培养方式构建肿瘤模型后，进行HE染色的结果，结果显示，前述模型不具有血管结构；
图15示出了在培养1天和7天后，本发明不同培养方式的肿瘤细胞的活细胞/死细胞染色结果，其中，上排的培养方式为直接混合细胞水凝胶方式，下排的培养方式为三维打印的方式；
图16示出了培养7天后，本发明三维打印肿瘤模型组和直接混合细胞水凝胶组的细胞存活率的比较。
具体实施方式
本申请的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
需要说明的是：
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，术语“w/v”表示溶液中溶质质量与溶液体积的比值。其中，溶质质量的单位为g，溶液体积的单位为mL。
本说明书中，“可选的”或“可选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。本说明书中，术语“三维”与“3D”具有相同的含义，三维是指在平面二维系中又加入了一个方向向量构成的空间系。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
本公开中采用的分子生物学方法，均可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
<第一方面>
本发明在的<第一方面>提供了一种体内肿瘤模型，所述体内肿瘤模型包括：水凝胶支架；
其中，所述水凝胶支架中载有肿瘤细胞；
将所述水凝胶支架移植入动物体内，进而得到所述体内肿瘤模型。
肿瘤细胞
在本发明中，所述肿瘤细胞是指具有三个显著的基本特征的细胞系，这三个基本特征分别为不死性，迁移性和失去接触抑制。
在本发明中，对所述肿瘤细胞与被移植的动物是同种还是异种不作特定限定。举例而言，当被移植的动物为裸小鼠时，所述肿瘤细胞的来源可以是人源、小鼠源、大鼠源或仓鼠源。
在本发明中，对于肿瘤细胞的种类不作特定限定。举例而言，所述肿瘤细胞可以是神经胶质瘤细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、直肠癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、表皮癌细胞、淋巴癌细胞。可选的，所述胶质瘤细胞可以是人胶质瘤细胞系U118、人胶质瘤细胞系U87、人胶质瘤细胞系U251、人胶质瘤细胞系U373、人胶质瘤细胞系T98G、人胶质瘤细胞系HS683、人胶质瘤细胞系sw1783、人胶质瘤细胞系snb19。
水凝胶体系
在本发明中，水凝胶体系是指能够为肿瘤细胞生长提供环境条件的一类极为亲水的，内部结构交联的，或者在交联剂的作用下能够形成交联结构的基质。所述水凝胶体系具有和天然组织非常相似的生物物理学特性，可以作为肿瘤细胞培养的基质。
在本发明中，所述水凝胶体系包括但不限于明胶、海藻酸钠、动物细胞外基质提取物水凝胶、蛋白质水凝胶、肽水凝胶、聚合物水凝胶、纤维素水凝胶胶原、层纤连蛋白、纤维蛋白、琼脂糖、透明质酸、壳聚糖等中的一种或两种以上的组合。可选的，所述水凝胶体系为海藻酸钠和明胶。示例性的，所述水凝胶体系为0.5％(w/v)～1.5％(w/v)的海藻酸钠和5％(w/v)～15％(w/v)的明胶。
水凝胶支架
在本发明中，所述水凝胶支架为通过三维生物打印方式获得的立体支架。其中，所述水凝胶支架被移植于动物体内，形成所述体内肿瘤模型。
本发明发明人意外的发现了，将水凝胶支架移植到动物体内，能够形成肿瘤组织。经过体外培养的水凝胶支架，移植入动物体内的致瘤率是100％。因为在移植前肿瘤细胞已经具有三维微环境，而且当三维打印肿瘤模型具有网格结构时，还有利于肿瘤细胞的增殖和干细胞性能的提高。并且，本发明利用三维生物打印方式构建的载有肿瘤细胞水凝胶支架在移植前无需用胰酶进行消化传代处理，移植时细胞仍保持在三维水凝胶微环境中，且可以根据研究的需要，构建不同部位和不同类型的肿瘤模型，可个性化构建肿瘤模型。
发明人还意外发现了通过三维生物打印方式形成的含有肿瘤细胞的水凝胶支架，通过移植到动物体内后，在动物体内再次成形，能够形成具有血管化的肿瘤模型。由于肿瘤的血管化在肿瘤的发生发展中起着重要作用，因此，血管化的肿瘤模型对于后续研究肿瘤的发生发展机制有很大的帮助。相反的，在体外构建的由肿瘤细胞和水凝胶体系构成的体外肿瘤模型，包括采用三维打印方式形成的体外肿瘤模型，均缺乏肿瘤血管化。
在本发明中，所述水凝胶支架由水凝胶纤维丝构成，所述水凝胶纤维丝直径为0.20mm～0.40mm。作为优选，所述水凝胶纤维丝直径为0.25mm～0.35mm。
在本发明中，所述水凝胶支架的立体结构包括但不限于为圆柱体、三棱柱、长方体、五棱柱、多边体等。在本发明的一些具体的实施方式中，所述水凝胶支架的边长或直径为10mm～20mm。举例而言，所述水凝胶支架的边长或直径可以为12mm、14mm、16mm、18mm等。可选的，所述水凝胶支架的厚度为0.5mm～2.0mm。举例而言，所述水凝胶支架的厚度可以为0.6mm、0.8mm、1.0mm、1.2mm、1.5mm、1.8mm等。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述水凝胶支架为具有网格结构的立体支架。采用三维生物打印方式构建的具有网格结构的载有肿瘤细胞的水凝胶支架。本发明发明人意外的发现，在体外培养时，所述网格结构有利于营养物质传入和代谢产物的排出，有利于肿瘤细胞的增殖和干细胞性能的提高。这些因素对于提高体内的致瘤率很有帮助。而直接将肿瘤细胞混合到水凝胶材料内，得到无网格结构的载有肿瘤细胞的水凝胶材料，在体外培养时，不利于营养物质传入和代谢产物的排出，导致水凝胶中心区域的肿瘤细胞因缺氧出现死亡，进一步影响细胞的增殖，肿瘤细胞数量的下降，不利于移植后的致瘤率提高。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述水凝胶支架的堆积体积为50～800mm3。发明人发现，考虑到动物皮下移植操作的可行性，水凝胶支架的堆积体积不易过大，否则容易造成皮下移植后，裸鼠皮肤张力过大，难以缝合，术后出现皮肤感染或者皮肤愈合不良。而水凝胶支架的堆积体积过小，则单位体积内含有的肿瘤细胞数量减少，会降低移植后的致瘤率。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述水凝胶纤维丝在所述体内肿瘤模型中的体积填充率为40～60％。所述体积填充率是指在水凝胶支架中载有肿瘤细胞的水凝胶体系占水凝胶支架堆积体积的百分比。示例性的，所述填充率可以是50％。发明人发现，如果水凝胶纤维丝在所述体内肿瘤模型中的体积填充率低于40％，则打印后得到的水凝胶支架机械强度较低，因而前述支架在体外培养的过程中容易解离、破碎。与此同时，过低的体积填充率会导致相应的水凝胶支架中含有的肿瘤细胞数量变少，不利于后续的体内移植致瘤。相反的，如果前述体积填充率高于60％，虽然得到的水凝胶支架的机械强度较高，但填充率过高会导致水凝胶支架中的孔隙率降低，不利于体外培养时，营养物质传入和代谢产物的排出，从而影响水凝胶支架中细胞的活性。
实验动物
在本发明中，所述水凝胶支架被移植于动物体内，形成所述体内肿瘤模型。在本发明中，对所述动物的种类不作特定限定，可以是小鼠、大鼠或地鼠。当构建乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌体内肿瘤模型时必须选用雌性动物。当同种移植时，所述水凝胶支架被移植于同种背景的动物体内；当异种移植时，所述水凝胶支架被移植于免疫缺陷的动物体内。所述免疫缺陷的动物包括先天性免疫缺陷动物和获得性免疫缺陷动物。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述动物包括小鼠或大鼠；作为优选，所述小鼠或所述大鼠为裸鼠。所述裸鼠是指先天无胸腺的鼠，可选的裸鼠品系包括NIH小鼠、Balb/c小鼠、C3H小鼠、J:NU小鼠、C57BL/6小鼠、NC小鼠、Swiss小鼠或导入了run基因的大鼠等。举例而言，可以选择雌性Balb/c裸鼠，鼠龄4～6周，体质量15～20g作为实验动物。
在本发明中，可在无特定病原体条件下饲养实验动物，室温26～28℃，湿度40％～60％，用高压灭菌的饮用水和饲料定期喂养。
<第二方面>
本发明在的<第二方面>提供了一种根据<第一方面>所述的体内肿瘤模型的构建方法，所述构建方法包括：
混合步骤：将肿瘤细胞与水凝胶体系混合，形成混合物；
打印步骤：以所述混合物为材料，使用三维生物打印机打印，获得水凝胶支架；
水凝胶支架培养步骤：在体外培养所述水凝胶支架；
移植步骤：将培养后的水凝胶支架移植到动物体内。
可选的，所述构建方法还可以包括如下步骤：
细胞获取步骤：在所述混合步骤之前，常规培养所述肿瘤细胞至对数生长期后，获取细胞；和/或
交联步骤：在所述打印的步骤后，使用交联剂，促使所述水凝胶体系的内部形成交联结构；优选的，所述交联剂为CaCl2溶液；更优选的，所述CaCl2溶液的浓度为2％(w/v)～3％(w/v)。
示例性的，本发明中所采用的步骤的具体操作方式如下。
混合步骤
在本发明中，所述混合的步骤包括将肿瘤细胞与水凝胶体系混合，形成混合物，所述混合的步骤中形成的混合物作为三维生物打印的材料。在本发明的一些具体的实施方式中，可以先将肿瘤细胞重悬于液体培养基中后，以含有肿瘤细胞的液体培养基与水凝胶体系混合，形成所述混合物。所述混合物中肿瘤细胞的浓度为1×105-3×106/mL；作为优选，所述混合物中肿瘤细胞的浓度为2×105-2.5×106/mL。
打印步骤
在本发明中，所述打印的步骤：以所述混合物为材料，使用三维生物打印机打印，获得水凝胶支架。所述三维生物打印方式可采用三维单喷嘴生物打印机、三维双喷嘴生物打印机、三维多喷嘴生物打印机进行打印。所述生物打印机喷嘴的直径为0.2mm～0.4mm，举例而言，所述生物打印机喷嘴的直径可以为0.21mm、0.26mm、0.34mm。作为优选，所述生物打印机喷嘴的直径为0.25mm～0.35mm，举例而言，所述生物打印机喷嘴的直径优选为0.26mm。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述生物打印机喷嘴的温度控制在20～30℃；作为优选，所述生物打印机喷嘴的温度控制在24℃～26℃；举例而言，所述生物打印机喷嘴的温度优选控制在25℃。在本发明的一些具体的实施方式中，所述生物打印机打印舱室的温度控制在4～10℃；作为优选，所述三维生物打印机打印舱室的温度控制在7℃～9℃；所述三维生物打印机打印舱室的温度优选控制在8℃。
在本发明的一些具体的实施方式中，在所述打印的步骤中，可以使用计算机软件预先设置水凝胶支架的形状、大小，以及所述打印机的打印速度。
在本发明的一些具体的实施方式中，在所述打印的步骤中，打印的速度为10μm/s～40μm/s；作为优选，打印速度为20μm/s～30μm/s。
在本发明的一些具体的实施方式中，在所述打印的步骤中，可以采用逐层打印的方式进行打印。
水凝胶支架培养步骤
在本发明中，所述水凝胶支架培养的步骤包括在体外培养所述水凝胶支架。所述水凝胶支架培养的步骤中，可以采用本领域常规的肿瘤细胞培养的方法进行培养。举例而言，可以将所述水凝胶支架加入到新鲜培养基中，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
在本发明的一些具体的实施方式中，在水凝胶支架培养的步骤中，所述培养的时间为7～15天，所述培养的时间优选为7天。即使培养到第15天，三维生物打印方式形成的水凝胶支架仍然保持着良好的形态结构。
在本发明中，本发明人意外地发现在采用三维打印方式形成的水凝胶支架中，随着培养时间的增加，水凝胶支架中的肿瘤细胞逐渐聚集形成肿瘤细胞球，这样更加有利于促进细胞与细胞之间的相互作用。而在传统二维条件下培养的肿瘤细胞，呈单层扁平状生长，不利于促进细胞与细胞之间的相互作用。
移植步骤
在本发明中，移植的步骤包括将培养后的水凝胶支架移植到动物体内。所述移植的步骤，可以采用本领域常规的肿瘤组织块移植构建动物体内肿瘤模型的方法进行移植操作。举例而言，进行裸小鼠移植瘤实验时，将2.5％戊巴比妥溶液以30mg/kg剂量注入裸鼠腹腔，麻醉成功后，在超净工作台中用碘酊和乙醇消毒裸鼠接种部位的皮肤，无菌条件下用眼科剪在接种裸鼠背部剪开约2cm皮肤切口，取载有肿瘤细胞水凝胶支架，沿剪开的皮肤处轻柔放入皮下，术毕，缝线缝合皮肤，皮肤切口局部消毒，观察裸鼠直至麻醉苏醒。
细胞获取的步骤
在本发明中，所述细胞获取的步骤包括在所述混合的步骤之前，常规培养所述肿瘤细胞至对数生长期，并消化、离心。所述细胞获取的步骤，可以采用本领域常规的肿瘤细胞培养的方法进行培养。
举例而言，将肿瘤细胞培养在含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，每2-3天更换一次培养基。待细胞处于对数生长期时，用0.25％胰酶消化、离心收集备用。
需要说明的是，由于收集的细胞来自于传统2D培养皿培养的细胞，所以需要用胰酶消化生长于2D培养皿中的细胞。
交联的步骤
在本发明中，所述交联的步骤包括在所述打印的步骤后，使用交联剂，促使所述水凝胶体系的内部形成交联的结构。有一些水凝胶体系需要使用交联剂来促使水凝胶体系内部形成交联的网络结构，这类水凝胶体系形成的水凝胶支架，需要在打印的步骤后，使用交联剂，促使所述水凝胶体系的内部形成交联的结构。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述水凝胶体系包括海藻酸钠，所述交联剂选自为CaCl2溶液。在交联的步骤结束后，可以用磷酸盐缓冲溶液冲洗水凝胶支架，以在培养前除去过量的交联剂。
在本发明的一个具体的实施方式中，当交联剂选自为CaCl2溶液时，所述交联剂的浓度为2％(w/v)～3％(w/v)。
示例性的，本发明可以采用如下方法制备体内肿瘤模型：
体外利用培养皿二维常规培养肿瘤细胞，(例如人胶质瘤细胞的原代胶质瘤细胞或者胶质瘤细胞系，优选U118，U87，U251等)，待细胞处于对数生长期时收集用于打印。配制质量体积分数分别为2％-5％的海藻酸钠和10-20％的明胶溶液，高温高压灭菌备用。将收集的肿瘤细胞以培养基重悬后，溶解于海藻酸钠和明胶溶液，得到用于3D生物打印机进行打印的原料。使用3D生物打印机打印边长或直径为10mm～20mm，厚度为0.5mm～2.0mm的圆柱体、三棱柱、长方体、正方体、五棱柱或多边体等。打印结束后，将载有肿瘤细胞的水凝胶支架浸入到2％-3％W/V的氯化钙溶液1-3分钟，以交联海藻酸钠，用磷酸盐缓冲溶液轻轻洗涤支架三次，加入新鲜培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待体外培养7～10天后将载肿瘤细胞水凝胶支架移植入裸鼠皮下，定期观察记录肿瘤的生长。
<第三方面>
本发明在<第三方面>提供了一种<第一方面>所述的体内肿瘤模型或根据<第二方面>所述的构建方法在体外研究中的应用，所述体外研究可以选自脑肿瘤发生机制研究、胶质瘤干细胞生物学研究、胶质瘤血管化研究、脑肿瘤化疗药物的开发和/或临床前研究。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本发明中，具体使用的材料和仪器的厂家及型号或来源如下：
人胶质瘤细胞系U118，购自于中国科学院细胞库(中国上海)；
人胶质瘤细胞系U87，购自于中国科学院细胞库(中国上海)；
DMEM培养基，厂家：Gibco；货号：C11885500BT；
DMEM高糖培养基，厂家：Gibco，货号：C11995500BT；
胎牛血清，厂家：Gibco，货号：12664025；
胰酶，厂家：Gibco，货号：25200056；
海藻酸钠，厂家：Sigma-Aldrich，型号：A0682；
明胶，厂家：Sigma-Aldrich，型号：TypeA，V900863；
3D多喷嘴生物打印机，厂家：清华大学，型号：Tissform III；
Balb/c裸鼠：由广东省医学动物中心提供(实验动物许可证号：SCXK粤2018-0003)。
实施例1：通过人胶质瘤细胞U251制备体内肿瘤模型
1.将人胶质瘤细胞U251培养在含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养基每2-3天更换一次，待细胞处于对数生长期时，常规用0.25％胰酶消化、离心收集备用。
2.配制质量体积分数分别为3％海藻酸钠和10％明胶溶液，高温高压灭菌。首先将3×106/mL的胶质瘤细胞重悬于1mL DMEM高糖培养基中，再与4％海藻酸钠和20％明胶溶液按体积比为1:1:2混合，得到最终浓度为5％明胶、0.75％海藻酸钠和7.5×105/mL胶质瘤细胞的混合打印材料。
3.通过本发明图1所示的三维生物打印和交联原理和步骤示意图进行三维打印。具体来说，打印时将配好的打印材料装入1mL注射器内，置于打印机推进卡槽中并连接打印喷头。计算机软件预先设置打印的水凝胶支架直径为15mm，厚度为1mm，填充率为50％。使用3D多喷嘴生物打印机(Tissform III)逐层打印圆柱形网格支架。喷嘴和打印舱室的温度分别控制在22℃和7℃。喷嘴的直径选择为0.3mm，打印速度控制在30μm/s，打印支架的网格孔为正方形，网格孔的边长为311.39±34.71μm；纤维细丝直径为354.27±18.34μm。打印结束后，将载有肿瘤细胞的水凝胶支架浸入到2％(W/V)氯化钙溶液3分钟，以交联海藻酸钠。然后用磷酸盐缓冲溶液轻轻洗涤支架三次，以在培养前除去过量的交联剂。加入新鲜培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
4.准备雌性Balb/c裸鼠5只，鼠龄4周左右，体质量15g左右，在无特定病原体条件下饲养，室温26℃，湿度优选40％，用高压灭菌的饮用水和饲料定期喂养。裸鼠移植瘤实验时，将2.5％戊巴比妥溶液以30mg/kg剂量注入裸鼠腹腔，麻醉成功后，在超净工作台中用碘酊和乙醇消毒裸鼠接种部位的皮肤,无菌条件下用眼科剪在接种裸鼠背部剪开约2cm皮肤切口，取培养7天的载肿瘤细胞水凝胶支架，沿剪开的皮肤处轻柔放入皮下，手术完成后，缝线缝合皮肤，皮肤切口局部消毒，观察裸鼠直至麻醉苏醒。
5.定期予以裸鼠背部皮肤切口消毒，观察并记录肿瘤体积变化。
实验结果：
如说明书图2所示，打印成型的载细胞水凝胶支架具有内部互通的网格结构以便于营养物质和代谢废物的交换。
如说明书图3所示，即使培养到第15天，3D生物打印的水凝胶支架仍然保持着良好的形态结构。
如说明书图4所示，胶质瘤细胞在传统的2D培养条件下呈单层扁平状生长，而如说明书图5所示，在3D打印水凝胶支架中逐渐聚集形成肿瘤细胞球，这样更加有利于促进细胞与细胞之间的相互作用。
进一步的，说明书图6示出了本发明三维水凝胶支架移植步骤中裸小鼠手术切口照片。
实施例2：通过人胶质瘤细胞U118制备体内肿瘤模型
具体实验步骤：
将人胶质瘤细胞系U118细胞培养在含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养基每2-3天更换一次，待细胞处于对数生长期时，常规离心收集备用。
配制质量体积分数分别为4％的海藻酸钠和20％的明胶溶液，高温高压灭菌。首先将4×106/mL U118细胞重悬于1mL细胞培养基中，再与4％海藻酸钠和20％明胶溶液按体积比为1:1:2混合，得到最终浓度为10％明胶、1％海藻酸钠和1×106/mL U118细胞的混合物。
使用3D多喷嘴生物打印机打印边长为15mm，厚度为1mm的正方体网格支架，填充率为60％。喷嘴和打印舱室的温度分别控制在25℃和8℃。喷嘴的直径选择为0.26mm，以上述混合物为材料进行打印，打印速度控制在25μm/s。打印支架的网格孔为正方形，网格孔的边长为338.41±23.18μm；纤维细丝直径为324.27±30.98μm。
打印结束后，将载有肿瘤细胞的水凝胶支架浸入到3％(w/v)氯化钙溶液2分钟，以交联海藻酸钠。然后用磷酸盐缓冲溶液轻轻洗涤水凝胶支架三次，以在培养前除去过量的交联剂。加入新鲜细胞培养基3mL，置于6孔板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
准备雌性Balb/c裸鼠5只，鼠龄5周左右，体质量20g左右。在无特定病原体条件下饲养，室温28℃，湿度50％。用高压灭菌的饮用水和饲料定期喂养。裸鼠移植瘤实验时，将2.5％戊巴比妥溶液以30mg/kg剂量注入裸鼠腹腔，麻醉成功后，在超净工作台中用碘酊和乙醇消毒裸鼠接种部位的皮肤，无菌条件下用眼科剪在接种裸鼠背部剪开约2cm皮肤切口，取培养8天的载有肿瘤细胞的水凝胶支架，沿剪开的皮肤处轻柔放入皮下，术毕，缝线缝合皮肤，皮肤切口局部消毒，观察裸鼠直至麻醉苏醒。
术后第二天，查看裸鼠成活情况，以及饲养观察期间裸鼠背部皮肤切口有无感染发生。皮下移植实验4周后，观察裸鼠背部肿瘤组织的形态，并进行拍照。处死裸鼠，取出肿瘤组织，并进行拍照，对肿瘤组织形态进行分析。并对肿瘤组织进行切片，进行HE染色，观察肿瘤组织中肿瘤细胞的形态。
实验结果：
术后第二天，移植实验的5只裸鼠均成活，饲养观察期间裸鼠背部皮肤切口干燥无感染迹象。
如说明书图7所示，皮下移植实验4周后观察到5只裸鼠背部均有肿瘤组织的形成。
如说明书图8所示，处死裸鼠，取出移植瘤，肉眼下肿瘤组织呈鱼肉样，质软，边界不清，与实际临床中人胶质瘤外观相似。
如说明书图9所示，HE染色可见肿瘤组织中充满大量深染、异常的肿瘤细胞核，提示有人源性胶质瘤的形成。
如说明书图13所示，三维生物打印方式形成的含有肿瘤细胞的水凝胶支架，通过移植到动物体内后，在动物体内再次成形，能够形成具有血管化的肿瘤模型，其中，黑色箭头示出了有血管结构形成。
如说明书图14所示，在体外构建的由肿瘤细胞和水凝胶体系构成的肿瘤模型，缺乏肿瘤血管化。
实施例3：通过人胶质瘤细胞U87制备体内肿瘤模型
具体实验步骤：
将人胶质瘤细胞系U87细胞培养在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养基每2-3天更换一次，待细胞处于对数生长期时，常规离心收集备用。
配制质量体积分数分别为2％的海藻酸钠和15％的明胶溶液，高温高压灭菌。首先将8×106/mL U87细胞重悬于1mL细胞培养基中，再与2％海藻酸钠和15％明胶溶液按体积比为1:1:2混合，得到最终浓度为7.5％明胶、0.5％海藻酸钠和2×106/mL U87细胞的混合物。
使用3D多喷嘴生物打印机打印边长为20mm，厚度为1.5mm的正方体网格支架，填充率为50％。喷嘴和打印舱室的温度分别控制在26℃和10℃。喷嘴的直径选择为0.28mm，以上述混合物为材料进行打印，打印速度控制在35μm/s。打印支架的网格孔为正方形，网格孔的边长为319.81±26.07μm；纤维细丝直径为332.42±25.14μm。
打印结束后，将载有肿瘤细胞的水凝胶支架浸入到3％(w/v)氯化钙溶液1分钟，以交联海藻酸钠。然后用磷酸盐缓冲溶液轻轻洗涤支架三次，以在培养前除去过量的交联剂。加入新鲜培养基3mL，置于6孔板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
准备雄性Balb/c裸鼠5只，鼠龄4周左右，体质量20g左右。在无特定病原体条件下饲养，温度27℃，湿度45％。用高压灭菌的饮用水和饲料定期喂养。裸鼠移植瘤实验时，将2.5％戊巴比妥溶液以30mg/kg剂量注入裸鼠腹腔，麻醉成功后，在超净工作台中用碘酊和乙醇消毒裸鼠接种部位的皮肤，无菌条件下用眼科剪在接种裸鼠背部剪开约2cm皮肤切口，取培养7天的载有肿瘤细胞的水凝胶支架，沿剪开的皮肤处轻柔放入皮下，术毕，缝线缝合皮肤，皮肤切口局部消毒，观察裸鼠直至麻醉苏醒。
术后第二天，查看裸鼠成活情况，以及饲养观察期间裸鼠背部皮肤切口有无感染发生。皮下移植实验4周后观察裸鼠背部肿瘤组织的形态，进行拍照。处死裸鼠，取出肿瘤组织，并进行拍照，对肿瘤组织形态进行分析。并对肿瘤组织进行切片，进行HE染色，观察肿瘤组织中肿瘤细胞的形态。
实验结果：
实施例3得到的实验结果，和实施例2的实验结果相似。
具体来说，从实施例3得到的结果来看，皮下移植实验4周后观察到5只裸鼠背部均有肿瘤组织的形成。处死裸鼠，取出移植瘤，肉眼下肿瘤组织呈鱼肉样，质软，边界不清，与实际临床中人胶质瘤外观相似。HE染色可见肿瘤组织中充满大量深染、异常的肿瘤细胞核，提示有人源性胶质瘤的形成。三维生物打印方式形成的含有肿瘤细胞的水凝胶支架，通过移植到动物体内后，在动物体内再次成形，能够形成具有血管化的肿瘤模型。
对比例1：2D培养的肿瘤细胞异种移植瘤的构建
实验方法：
在体外采用二维培养皿培养胶质瘤细胞U118，待细胞处于对数生长期时，常规消化、离心收集细胞，以200μL无血清DMEM高糖培养基重悬肿瘤细胞，用1mL注射器将肿瘤细胞悬液注入裸鼠皮下。
实验结果：
如说明书图10所示，直接将体外2D培养的人胶质瘤细胞U118注射入裸鼠皮下所形成的异种移植瘤与周围组织边界清晰，质硬，这与人体内的实体胶质瘤组织质软，边界不清不符。
对比例2：混合细胞水凝胶材料异种移植瘤的构建
方法：体外采用二维培养皿培养胶质瘤细胞U118，待细胞处于对数生长期时，常规消化、离心收集细胞，按上述配制打印材料的方法将胶质瘤细胞与海藻酸钠/明胶溶液相混合及交联，体外培养7天后，按上述动物实验方法将混合细胞水凝胶材料植入裸鼠皮下。
实验结果：
如说明书图11所示，不使用3D生物打印技术，直接将人胶质瘤细胞U118与海藻酸钠/明胶溶液混合后移植入裸鼠皮下致瘤，发现其形成的异种移植瘤表面有机化物形成，质硬，且与周围组织边界清晰。
如说明书图12所示，HE染色可见肿瘤组织中含有大量生物材料。
实施例4：不同培养方式对肿瘤细胞存活率的影响
实验方法：3D打印肿瘤模型的构建方法和步骤参照实施例1；
直接混合细胞与水凝胶模型的具体实验步骤如下：
将人胶质瘤细胞系U118细胞培养在含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养基每2-3天更换一次，待细胞处于对数生长期时，常规消化、离心收集备用。
配制质量体积分数分别为4％的海藻酸钠和20％的明胶溶液，高温高压灭菌。首先将4×106/mL U118细胞重悬于1mL细胞培养基中，再与4％海藻酸钠和20％明胶溶液按体积比为1:1:2混合，得到最终浓度为10％明胶、1％海藻酸钠和1×106/mL U118细胞的混合物。
活/死细胞染色及计算的具体实验步骤如下：
参照活/死细胞染色试剂盒(南京凯基生物公司，货号：KGAF001)的操作说明书来分析细胞在水凝胶支架中的细胞活性。首先配制8μM碘化丙啶(PI)和2μM钙黄绿素AM，取5μL16mM PI原液加入到10mL PBS溶液中，震荡混匀得到8μM的PI工作液。将5μL 4mM的钙黄绿素AM原液加入到上一步10mL的PI工作液中,充分混匀得到8μM碘化丙啶和2μM钙黄绿素AM。将载有细胞的水凝胶支架浸入配制好的混合工作液中，避光孵育10分钟，PBS洗涤三次，每次5分钟。加入少量PBS后在荧光显微镜下观察，活细胞呈绿色，死细胞呈红色。每个支架在200倍视野下随机选取5个视野来计算细胞的活/死比例。根据以下公式计算细胞存活率：存活率(％)＝(绿色染色细胞数/总细胞数)×100。
实验结果：
如说明书图15和16所示，在体外培养的第7天，本发明实施例1和对比例的肿瘤细胞水凝胶，3D打印肿瘤模型中的细胞存活率明显高于直接混合细胞水凝胶组。
本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种体内肿瘤模型的构建方法，其中，所述构建方法包括如下步骤：
混合步骤：将肿瘤细胞与水凝胶体系混合，形成混合物；
打印步骤：以所述混合物为打印材料，使用三维生物打印机打印，获得水凝胶支架；
水凝胶支架培养步骤：在体外培养所述水凝胶支架；
移植步骤：将培养后的水凝胶支架移植到动物体内，得到所述体内肿瘤模型；其中，所述水凝胶支架为具有网格结构的立体支架，并且，所述水凝胶支架中载有肿瘤细胞；
所述水凝胶体系含有最终浓度为0.5％(w/v)～1.5％(w/v)的海藻酸钠和最终浓度为5％(w/v)～15％(w/v)的明胶；
所述水凝胶体系中还含有交联剂，所述交联剂为CaCl2溶液，所述CaCl2溶液的浓度为2％(w/v)～3％(w/v)；
所述水凝胶支架由水凝胶纤维丝构成，所述水凝胶纤维丝在所述体内肿瘤模型中的体积填充率为40～60％，所述水凝胶纤维丝的直径为0.20mm～0.40mm。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述水凝胶支架的边长或直径为10mm～20mm。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其中，所述水凝胶支架的厚度为0.5mm～2.0mm。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述水凝胶纤维丝的直径为0.25mm～0.35mm。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述肿瘤细胞选自包括胶质瘤细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、直肠癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、表皮癌细胞、淋巴癌细胞中的一种或两种以上的组合。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其中，所述肿瘤细胞的来源为人。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述动物为小鼠或大鼠。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其中，所述小鼠或所述大鼠为裸鼠。
9.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述构建方法还包括如下步骤：
细胞获取步骤：在所述混合步骤之前，常规培养所述肿瘤细胞至对数生长期后，获取细胞；和/或
交联步骤：在所述打印的步骤后，使用交联剂，促使所述水凝胶体系的内部形成交联结构。
10.根据权利要求1所述的构建方法，其中，在所述打印步骤中，所述打印的速度为10μm/s～40μm/s。
11.根据权利要求10所述的构建方法，其中，所述打印的速度为20μm/s～30μm/s。
12.根据权利要求1所述的构建方法，其中，在所述水凝胶支架培养步骤中，所述体外培养的时间为7～15天。
13.一种根据权利要求1-12任一项所述的构建方法得到的体内肿瘤模型在体外研究中的应用，其中，所述体外研究选自脑肿瘤发生机制研究、胶质瘤干细胞生物学研究、胶质瘤血管化研究、脑肿瘤化疗药物的开发和/或临床前研究。
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