JP2023501925A - 筋線維断片を利用した回旋腱板療法 - Google Patents

Abstract

解離した筋線維断片を利用して肩の機能的筋組織を再生することによる、肩の損傷の修復のための方法及び組成物が開示されている。いくつかの実施形態では、断片は、機能的サテライト細胞を保持するが、細胞壁破壊を呈し、平均サイズが１５０μｍ未満である。本方法には、ドナー部位から筋組織を抽出し、抽出された組織から筋線維を解離させ、解離した筋線維を、機能的サテライト細胞を保持しながら細胞壁破壊を呈し、平均サイズが好ましくは１５０ミクロン未満、より好ましくは約１００ミクロン未満である線維断片に断片化させることによる組成物の調製及び移植が含まれる。例えば、棘上筋又は他の回旋筋腱板の筋肉に注入されると、筋線維断片組成物は、断片から細長い筋線維を再構成又は再構築することができ、生来の肩の筋線維と整列して配向することができる。

Description

関連出願

本出願は、２０１９年１０月２４日に出願された仮出願第６２／９２５，４３２号及び２０１９年１０月２８日に出願された仮出願第６２／９２６，８４１号の優先権を主張し、これらは参照によりその全体が本書に組み込まれるものとする。

本発明の技術分野は、筋組織を再生するための方法及び組成物に関する。また、本発明は、肩の補強手術をするための治療法及び／又はそのような手術に代わる代替療法に関するものである。

回旋筋腱板は、上腕骨頭（肩関節の上腕骨の部分）に腱を介して付着する４つの筋肉から構成されている。これらの腱が切れると、筋力低下及び痛みを引き起こす。

回旋筋腱板断裂は、１９９０年にＨａｍａｄａが提唱したＸ線解析により分類されるのが一般的である。Ｈａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｇｒａｐｈｉｃ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ ｍａｓｓｉｖｅ ｒｏｔａｔｏｒ ｃｕｆｆ ｔｅａｒｓ： Ａ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎ． Ｏｒｔｈｏｐ． Ｒｅｌａｔｅｄ Ｒｅｓ． １９９０； ２５４：９２－９６を参照。Ｈａｍａｄａらの５グレード分類は、回旋筋腱板広範囲断裂のＸ線所見を分析することによって開発され、そのグレードは回旋筋腱板断裂の時間的発展を反映するものである。簡単に説明すると、肩峰骨頭間距離（ＡＨＩ）がグレード１では維持され、グレード２では狭くなる。グレード２の狭窄に加え、臼蓋化（肩峰下面の凹面変形）を起こすと、グレード３に分類される。グレード４では、肩甲上腕関節の狭窄がグレード３の特徴に加わり、グレード５では、上腕骨頭の崩壊の症例を含む。続いて、Ｈａｍａｄａらの基準のグレード４は２つのサブタイプに細分化され、グレード４Ａは肩峰下関節炎（臼蓋化）を伴わない肩甲上腕関節炎であり、グレード４Ｂは肩峰下関節炎を伴う肩甲上腕関節炎である。

回旋筋腱板の断裂を修復する手術では、腱を上腕骨頭部に再接着することを伴うことが多い。部分断裂では、デブリードマンと呼ばれるトリミング又はスムージング処置のみが必要とされる場合がある。完全断裂は、腱を上腕骨の元の部位に縫合することで修復され得る。より広範囲の断裂の場合は、患者の背中から広背筋の一部を切除して、回旋筋腱板の再建に使用し得る。

しかし、回旋筋腱板断裂は慢性的な病変であることが多く、筋萎縮及び脂肪変性を呈する。回旋筋腱板を修復しても、この変性過程を元に戻すには限界がある。そのため、回旋筋腱板修復が成功しても、患者の筋力の回復には限界がある。回旋筋腱板断裂の患者の追跡調査では、回旋筋腱板修復が成功した後でも、初期の筋萎縮及び脂肪変性は改善しないことが、研究者らにより近年判明した。Ｄｅｎｚ ｅｔ ａｌ， Ｆａｔｔｙ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｔｒｏｐｈｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｔａｔｏｒ ｃｕｆｆ ｍｕｓｃｌｅｓ ａｆｔｅｒ ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｉｃ ｒｅｐａｉｒ： Ｄｏｅｓ ｉｔ ｉｍｐｒｏｖｅ， ｈａｌｔ ｏｒ ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｅ？ Ａｒｃｈ． Ｏｒｔｈｏｐ． Ｔｒａｕｍａ Ｓｕｒｇ． ２０１４ Ｊｕｌｙ； １３４（７）：９６５－９０を参照。

棘上筋及び棘下筋の脂肪変性の程度は、解剖学的転帰（すなわち、修復した腱の再断裂）に影響すると考えられ、特に棘下筋の筋変性の程度が高いほど再発の頻度が高くなると考えられる。

Ｇｏｕｔａｌｌｉｅｒ分類は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）解析に基づく半定量的分類システムであり、回旋筋腱板の筋肉の脂肪変性の量を定量化するために使用することができる。この分類は、１つ又は複数の肩の筋肉、通常は棘上筋の萎縮及び脂肪変性の観察される割合に基づいて行われる。（棘上筋は、肩甲骨（肩甲骨）の上部から上腕骨にかけてある背中上部の筋肉である。背中のその下にある棘下筋と一緒に、それらは４つの回旋筋腱板の筋肉のうちの２つを形成し、肩関節を安定させながら上腕骨の回転を可能にする。）

Ｇｏｕｔａｌｌｉｅｒ分類システムによると、回旋筋腱板断裂の外科的修復後、グレードが上がるにつれて重症度が上がり、グレードが上がるほど機能転帰が悪くなるとされている。簡単に説明すると、正常な筋肉はグレード０に分類される。グレード１ではいくつかの脂肪線条が観察される。グレード２は５０％未満の脂肪性筋萎縮、グレード３は５０％の脂肪性筋萎縮、グレード４は５０％を超える筋萎縮を示す。グレード３及び４は、外科的修復後の正常な機能への復帰が不完全であることと相関すると理解されている。

肩の損傷を修復するためのより良い方法、特に、肩の手術の代わりとして又はそのような外科的処置の補助として、回旋筋腱板損傷に関連する筋萎縮及び脂肪変性に対処するための肩領域の筋肉を再生するためのより良い方法が必要とされている。

筋再生により肩の損傷を修復するための方法及び組成物が開示されている。解離した筋線維断片は、肩の機能的筋組織の再生に有効なものとなり得ることが発見された。いくつかの実施形態では、断片は、機能的サテライト細胞を保持するが、細胞壁破壊を呈し、平均サイズが１５０μｍ未満である。本方法には、ドナー部位から筋組織を抽出し、抽出された組織から筋線維を解離させ、解離した筋線維を、機能的サテライト細胞を保持しながら細胞壁破壊を呈し、平均サイズが好ましくは１５０ミクロン未満、より好ましくは約１００ミクロン未満である線維断片に断片化させることによる組成物の調製及び移植が含まれる。例えば、棘上筋又は他の回旋筋腱板の筋肉に注入され、標的とする筋部位に移植されると、筋線維断片組成物は、断片から細長い筋線維を再構築又は再建することができ、生来の肩の筋線維と整列して配向することができる。

本発明の一態様では、細胞断片の平均サイズは、３００μｍ未満、好ましくは１５０μｍ未満又は１００μｍ未満であり、いくつかの例では、より好ましくは約８０μｍ～１２０μｍ又は約９０μｍ～１１０μｍである。断片は任意の形状をとることができるが、好ましくは円形状又は楕円形状であって、例えば、長短寸法のアスペクト比が約２：１～１：１である。筋線維（筋原線維）は長円筒形状の多核細胞であるため、断片は少なくとも１つの核を保持すると同時に、少なくとも１つの機能的サテライト細胞が付着していることも好ましいと言える。

一実施形態では、筋組織を抽出する工程は、自家筋組織を抽出することによって行われ得る。例えば、回旋筋腱板の筋肉の補強の場合、自家筋組織は、患者の胸筋から組織を切除することによって取得され得る。本方法は、コラゲナーゼＩ型などの酵素を用いて、又は酵素を用いずに、例えばノルモソル（登録商標）などの緩衝若しくは等張生理食塩水を用いて、筋線維を解離する工程をさらに含み得る。個々の線維を断片に断片化させるさらなる工程は、機械的撹拌によって、例えば、流体移動（ピペッティング）を介して、又は超音波処理を介して、又は切断若しくは細分化によって行われ得る。いくつかの例では、断片化は、筋線維断片の少なくとも約７５％が細胞壁破壊を呈するまで行われ得る。

本発明の治療的使用は、組成物を１つ又は複数の標的とする肩の筋欠損部位に送達することによって実施され得る。一つのアプローチとして、組成物は生理的に適合性の流体に懸濁され、組成物は標的とする筋欠損部位に注入され得る。肩の損傷の治療のために、又は肩の手術の補助として、筋肉生成組成物は、棘上筋又は筋萎縮若しくは脂肪変性を呈する肩の筋組織の任意の他の領域に注入され得る。あるいは、組成物は足場に播種され、播種された足場は標的とする筋欠損部位に移植され得る。

本方法は、幹細胞、筋前駆細胞、成長因子又はそのような薬剤の組み合わせなどのアジュバントと組成物を同時投与する工程をさらに含み得る。例えば、アジュバントは、骨形成タンパク質、筋形成タンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子－α、形質転換成長因子－β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ）及びアグリンの群から選択される少なくとも１つの成長因子を含み得る。

足場が使用される場合、足場で支持される断片をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養してから、足場を標的とする筋欠損部位に送達することが好ましいと言える。足場は、生理食塩水、コラーゲンゲル、セルロース、フィブリンゲル、アルギン酸ゲル又は紫外線誘発架橋性ゲル系から選択される注入可能な足場であり得る。あるいは、足場は、有機又はポリマーマトリックスを含む移植可能な足場であり得る。有機マトリックスは、例えば、粘膜下組織などの脱細胞化組織であり得る。ポリマーマトリックス材料の例は、例えば、コラーゲン若しくはエラスチン等の１つ若しくは複数の天然ポリマー又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－コ－カプトラクトン）（ＰＬＣＬ）若しくはこれらの組み合わせなどの１つ若しくは複数の合成ポリマーであり得る。

筋線維断片が注入前にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される場合、播種された足場培養物は、筋形成タンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子－α、形質転換成長因子－β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ）、アグリン又はそれらの組み合わせをさらに含み得る。

本教示は、効率的な機能的肩筋再生のための均一に構造化された筋線維の小断片を含む肩筋再生組成物並びにこれらの筋線維断片の作製方法及び使用方法をも開示する。組成物を宿主筋組織（例えば、棘下筋及び／又は棘上筋などの回旋筋腱板の筋肉）に送達（例えば、Ｎｅｖｉａｓｅｒポータルを介して注入）すると、組成物の筋線維断片は、筋線維の効率的な再構築を、生来の筋肉の線維方向に沿って誘発し、並びに患者の生来の血管及び神経回路網への統合を誘発することができる。

本発明の別の態様では、自家肩筋再生組成物を調製するためのキットが開示される。キットは、組織ミキサーと、組織ホモジナイザーと、概ね均一なサイズの筋線維断片を提供するためのろ過システムとの３つの構成要素を含み得る。キットは、筋組織生検を切除するための外科用メス若しくは代替的に切除された筋組織を解離（例えば、細分化）して筋線維にするための外科用メスをさらに含み得、又はキットは、両方の機能を果たすために複数の外科用メス若しくはブレード若しくは切断台の組合せを含み得る。キットは、細分化又は切断シャフトを備えた少なくとも１つのブレードを有する混合キャビティであって、１つ若しくは一連の切断ブレード又はディスクにより水平、垂直若しくは角度のある方向に回転若しくは移動するものも含み得る。キットは、リベラーゼ（登録商標）などの酵素溶液又はノルモソル（登録商標）などの適切な緩衝生理食塩水のいずれか１つ若しくは複数の均質化溶液と、均質化溶液及び解離した筋線維を混合するための容器とをさらに含み得る。さらに、キットは、均質化した筋線維溶液をフィルタに通して線維を断片化し、線維断片のサイズを確実に均一にするための断片化デバイスを含み得る。

本発明に係る、筋組織再生のために筋線維細胞から筋線維断片を形成する方法を示す概略図である。 本発明に係る、筋線維断片の顕微鏡写真である。 本発明に係る、筋組織再生の工程を示すブロック図である。 図４Ａは、筋線維断片（ＭＦ）技術の筋萎縮モデルへの適用であって、ラットにおいて化学的に誘発したＴＡ筋損傷へのＭＦの注入によるものを示す概略図である。図４Ｂは、ＭＦをＴＡ筋損傷に直接注入すると、７、２１及び２８日目の筋機能が有意に向上したことを示すグラフである（スチューデントｔ－検定、Ｐ＜０．０５、ｎ＝７、２つの独立した実験）。 注入の３週間後の筋萎縮試験の細胞の形態学的解析であり、注入したＭＦ及びＭＦ由来の筋前駆細胞（Ｐａｘ７^＋細胞）（図５Ｂ）が、宿主の筋肉（図５Ａ）に統合されていることを、５０μｍ縮尺で示す図である。 注入の３週間後の筋萎縮試験の細胞の形態学的解析であり、注入したＭＦ及びＭＦ由来の筋前駆細胞（Ｐａｘ７^＋細胞）（図５Ｂ）を、５０μｍ縮尺で示す図である。 注入の３週間後の筋萎縮試験の細胞の形態学的解析であり、注入したＭＦ及びＭＦ由来の筋前駆細胞（Ｐａｘ７^＋細胞）（図５Ｂ）が、宿主の血管網（図５Ｃ）に統合されていることを、５０μｍ縮尺で示す図である。 注入の３週間後の筋萎縮試験の細胞の形態学的解析であり、注入したＭＦ及びＭＦ由来の筋前駆細胞（Ｐａｘ７^＋細胞）（図５Ｂ）が、宿主の神経網（図５Ｄ）に統合されていることを、５０μｍ縮尺で示す図である。 図６Ａは、移植可能なＭＦ含有構築物の、外傷性筋欠損モデルへの適用を示す図である。図６Ａは、外科的に誘導したＴＡ筋欠損ラットへのＭＦＦ／コラーゲン構築物の移植の概略図である。図６Ｂは、移植可能なＭＦ含有構築物の、外傷性筋欠損モデルへの適用を示す図である。欠損したＴＡ筋へＭＦＦ／コラーゲンを移植すると、機能的［図６Ｂ］に筋回復の促進が効率的に誘導された。＊Ｂ及びＣにおけるＡＮＯＶＡ及びテューキー検定、Ｐ＜０．０５、ｎ＝７、２つの独立した実験。図６Ｃは、移植可能なＭＦ含有構築物の、外傷性筋欠損モデルへの適用を示す図である。欠損したＴＡ筋へＭＦＦ／コラーゲンを移植すると、構造的（図６Ｃ、移植の４週間後）に筋回復の促進が効率的に誘導された。＊Ｂ及びＣにおけるＡＮＯＶＡ及びテューキー検定、Ｐ＜０．０５、ｎ＝７、２つの独立した実験。 尿道括約筋失禁（ＵＳＩ）モデルへのＭＦ技術の適用を示す図である。図７Ａは、尿道括約筋損傷へのＭＦ注入の概略図である。 尿道括約筋失禁（ＵＳＩ）モデルへのＭＦ技術の適用を示す図である。図７Ｂは、ＭＦ注入後の括約筋機能の改善により、尿流動態機能が向上したことを示すグラフである。電気刺激ありの場合（Ｐ２）と電気刺激なしの場合（Ｐ１）の尿漏出時圧。Ｐ２－Ｐ１＝外括約筋が維持する最大膀胱圧、＊スチューデントｔ－検定、Ｐ＜０．０１、ｎ＝３。 臨床応用のための、ヒト筋線維断片処理の代替技術を示す図である（処理時間約３０分）。 均質で均一なサイズのヒトＭＦＦの形態及び重量収率（３０～４０％）を示す顕微鏡写真である。

本発明の理解がより容易になるよう、いくつかの用語を最初に定義しておく。

「約」又は「おおよそ」という用語は、特定の値について、当業者によって決定される許容可能な誤差範囲内にあることを意味し、これは、部分的には、その値がどのように測定又は決定されるか（例えば、測定システムの限界又は特定の目的に必要な精度の度合いなど）に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣行に従って、１以内又は１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらに好ましくは最大１％の範囲を意味し得る。特定の値が本出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、別段の記載がない限り、「約」という用語は、特定の値について許容可能な誤差範囲内にあることを意味すると想定すべきである。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、文脈が明らかに別段のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子」への言及は、１つ又は複数のそのような分子を含み、「樹脂」は、１つ又は複数のそのような様々な樹脂を含み、「方法」への言及は、本明細書に記載の方法と変更し、又は代替可能である当業者に知られている同等の工程及び方法への言及を含む。

「異方性」は、材料（例えば、筋管、足場など）の物理的性質（例えば、弾性、引張強さ、破断伸びなど）が作用（例えば、伸縮など）の方向によって異なることを意味し、これは、材料の性質が全方向で同一である「等方性」とは対照的なものである。例えば、異方性の細胞基質は、一の軸（例えば、縦軸）に沿った引張強さが、その軸に対して垂直な軸に沿った引張強さよりも大きい場合がある（例えば、０ＭＰａ、１ＭＰａ又は２～４ＭＰａ、５ＭＰａ、６ＭＰａ以上）。一つの軸（例えば、縦軸）に沿った破断伸びは、その軸に対して垂直な軸に沿った破断伸びよりも小さい場合がある（例えば、１０％、２０％、３０％又は４０～５０％、６０％、７０％又は８０％以上）。一つの軸（例えば、縦軸）に沿った応力曲線のピーク（ＭＰａ）は、その軸に対して垂直な軸と比較して、より小さいひずみ（％）で到達し得る。好ましくは、材料は室温で湿潤状態（例えば、リン酸緩衝生理食塩水に浸漬した状態）で試験される。

本明細書において使用する用語「付着」又は「付着する」は、基材に直接又は間接的に接着する細胞だけでなく、他の細胞に接着する細胞も意味する。

本明細書で使用する「生体適合性基材」という語は、被験体への移植に適した材料であって、細胞集団を堆積させることができるものを意味する。生体適合性基材は、いったん被験体に移植されると、毒性又は有害作用を引き起こすことはない。一実施形態では、生体適合性基材は、修復又は交換を必要とする所望の構造に成形可能な表面を有するポリマーである。ポリマーはまた、修復又は交換を必要とする構造の一部に成形することができる。生体適合性基材は、細胞がそれに付着し、その上で増殖できるような支持骨格を提供する。培養された細胞集団は、細胞間の相互作用に必要な適切な間隙距離を提供する生体適合性基材上で増殖することができる。

「生分解性足場」、「生分解性メッシュ」又は「生分解性マトリックス」は、被験体の体内で分解可能及び／又は吸収可能な材料を有する足場である。望ましくは、足場又はマトリックスは多孔性で、マトリックスの孔の上と中の両方に細胞が堆積可能であり、特定の実施形態では、成形されたものである。そのような製剤は、少なくとも１つの細胞集団を生分解性足場に供給して、その細胞集団を足場上及び／又は足場中に播種することによって調製することができる。いくつかの実施形態では、播種された足場は、その後、レシピエントである被験体の体内に移植され、そこで組織化された細胞集団が機能的組織構造の形成を促進する。

本明細書で使用する「共重合体（コポリマー）」という用語は、コポリマー、ターポリマー及びポリマー成分のブロック、グラフ又は無作為な組み合わせによって形成される高次多重ポリマー組成物を包含することが意図されている。

本明細書で使用する「脱細胞化した」又は「脱細胞化」という用語は、細胞及び組織の内容物が除去され、無傷の無細胞基盤が残された生体構造物（例えば、臓器又は臓器の一部）を意味する。腎臓などの臓器は、様々な特殊な組織から構成されている。臓器の特殊な組織構造、すなわち実質は、臓器と関連する特定の機能を提供する。臓器を支える線維網が間質である。ほとんどの臓器は、特殊化されていない結合組織からなる間質組織を有し、これが特殊化された組織を支えている。脱細胞化の過程では、特殊化された組織が除去され、結合組織の複雑な３次元網目構造が残される。結合組織の基盤は、主にコラーゲンから構成されている。脱細胞化された構造体は、様々な細胞集団を注入することができる生体適合性基材となる。脱細胞化された生体構造体は、硬質又は半硬質であり、その形状を変化させる能力を有し得る。本発明において有用な脱細胞化臓器の例としては、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管及び尿道が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本明細書において、筋線維断片について使用される「直径」という用語は、断片の平均直径を意味する。好ましくは、全ての断片の少なくとも８０％が、記載の直径範囲内である。より好ましくは、全ての断片の少なくとも９０％が記載の直径範囲内であり、最も好ましくは、全ての断片の少なくとも９５％が記載の直径範囲内である。

本明細書で使用する「電界紡糸（エレクトロスピニング）」又は「電界紡糸した」という用語は、電界の存在下で、材料が流され、スプレーされ、スパッタされ、滴下され、又はその他の方法で移送される任意の方法を意味する。電界紡糸した材料は、帯電した容器の方向から接地したターゲットに向かって堆積させることができ、又は接地した容器から帯電したターゲットの方向に向かって堆積させることができる。特に、「電界紡糸」という用語は、少なくとも１つの天然生物材料、少なくとも１つの合成ポリマー材料又はそれらの組み合わせを含む帯電溶液から線維を形成するプロセスを意味し、帯電溶液を、開口部すなわちオリフィスを通して、接地されたターゲットに向かって流すことによって行われる。

「細長い」という用語は、例えば、筋線維の長さが、その幅を超えていることを意味する。好ましくは、細長い筋線維の長さは、その幅の少なくとも５倍、より好ましくはその幅の少なくとも１０倍、その幅の少なくとも５０倍又はその幅の少なくとも１００倍となる。

タンパク質その他の生物学的マーカーの「発現する」又は「発現」は、その前駆体の同じものをコードする遺伝子が転写されること、及び好ましくは翻訳されることを意味する。典型的には、本発明によれば、遺伝子のコード領域の発現は、コードされたポリペプチドの産生をもたらすことになるため、その細胞は当該タンパク質その他の生物学的マーカーに対して「陽性」となる。

「線維芽細胞」とは、細胞外マトリックス及びコラーゲンを合成する細胞であり、全身の結合組織に存在する。

「移植片」とは、被験体の生来の組織（少なくともその一部）を修復、補強又は交換するように構成された生成物をいう（例えば、獣医学的又は医療（ヒト）用途において）。「移植可能」という用語は、デバイスが、患者に、挿入、埋め込み、移植その他の方法で長期的に付着し、又は設置され得ることを意味する。移植片には、足場又は生体足場が含まれる（足場又は生体足場に播種された細胞がさらに含まれる場合も含まれない場合もある）が、これらに限定されるものではない。

本明細書で用いられる「単離された」とは、細胞が自然環境以外の条件下に置かれることを意味する。組織又は細胞は、被験体（例えば、一次外植片）から最初に単離されるときに、「採取」される。

本明細書で使用される「筋欠損」という用語は、身体的損傷、火傷、外科的組織切除、筋萎縮、筋ジストロフィー、梗塞、虚血性事象及び神経筋疾患を含むが、これらに限定されない筋機能を損ない得る障害、疾患、欠損及び損傷を広く包含することを意図する。肩の筋肉及び／又は回旋筋腱板補強修復について、「筋欠損」には、具体的に、例えば、上述のＧｏｕｔａｌｌｉｅｒ分類システムによって測定されるような、筋萎縮及び／又は脂肪変性も含まれる。

筋細胞は、筋線維又は筋細胞を含むが、これらに限定されず、任意の適切な種のものであり得、いくつかの実施形態では、組織が移植される被験体と同種のものである。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞（マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル及びヒトの細胞を含む）が特に好ましい。筋細胞は、骨格筋細胞、平滑筋細胞及び心筋細胞を含む。

筋線維断片は、同系（すなわち、遺伝的に同一又は近縁であり、組織移植の拒絶反応を最小限に抑えるもの）、同種異系（すなわち、同種の遺伝的に非同一の個体からのもの）又は異種（すなわち、異種の個体からのもの）であり得る。同種筋線維断片には、自家（すなわち、治療される患者から）及び同種（すなわち、遺伝的に同一であるが異なる被験体、例えば、一卵性双生児から）のものが含まれる。筋線維断片は、例えば、ドナー（生体又は死体のいずれか）から得る場合も、確立された細胞株又は細胞系の細胞から得る場合もある。例えば、筋線維断片は、当該技術分野で知られている標準的な生検技法を使用して、ドナー（例えば、生体足場移植片の潜在的レシピエント）から採取され得る。好ましい一実施形態では、筋線維断片は自家由来である。

筋線維（又は「筋原線維」）は、多核単一筋細胞である。物理的には、それらは非常に細長く、そのサイズは、直径１００ミクロン未満で長さ数ミリメートルのものから、直径数百ミクロンで長さ数センチメートルのものまで様々である。細胞内には収縮性タンパク質、エネルギー貯蔵所及びシグナル伝達機構が密集している。

筋線維細胞は、発生期の筋芽細胞（筋細胞を生み出す胚性前駆細胞の一種）が融合して形成される。筋線維は、アクチンとミオシンの筋原線維がサルコメアとして繰り返された長円筒形状の多核細胞であり、サルコメアは筋線維の基本的機能単位であって、骨格筋の縞模様の外観をもたらし、筋収縮に必要な基本的機構を形成している。

筋線維は最小の完全な収縮システムである。そのため、代謝、興奮及び収縮のためのサブシステムが必要である。効率的に力を生み出すには、線維の全長にわたって同時に収縮が励起される必要がある。収縮信号はＴ管系によって線維に沿って急速に広がり、筋小胞体（ＳＲ）からカルシウムイオンを急速に放出する信号を出す。収縮信号が終わると同時に、ＡＴＰ駆動カルシウムポンプがこのＳＲ内の細胞内カルシウムのほぼ全てを隔離し始める。

各筋線維の内部には、筋原線維の回路網が存在する。この筋原線維には、実際に力を生み出すタンパク質が含まれている。骨格筋がその特徴的な縞模様を示すのは、この筋原線維によるものである。各筋原線維は、タンパク質の大規模な回路網によって、隣接する筋原線維及び細胞膜に結合している。

「筋芽細胞」は筋幹細胞の一種で、脊椎動物では通常、そのライフサイクルの過程で筋線維と密接に関連している。筋線維が損傷を受けた場合、その筋芽細胞は分裂して再増殖する能力がある。一般に、筋損傷後、筋線維は壊死し、マクロファージによって除去される（Ｈｕｒｍｅ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｈｅａｌｉｎｇ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｊｕｒｙ： ａｎ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ， Ｍｅｄ． Ｓｃｉ Ｓｐｏｒｔｓ Ｅｘｅｒｃ． ２３， ８０１－８１０）。これにより、筋芽細胞の増殖及び融合が誘導され、多核の細長い筋管が形成され、これが自己組織化して、より組織化された構造、すなわち筋線維が形成される（Ｃａｍｐｉｏｎ （１９８４） Ｔｈｅ ｍｕｓｃｌｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌ： ａ ｒｅｖｉｅｗ， Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． ８７， ２２５－２５１）。

「筋細胞」とは、筋肉細胞、筋線維又は骨格筋細胞のことである。筋細胞は、筋芽細胞同士が融合することで形成される。

前述の通り、筋原線維とは、多数の筋フィラメントからなる筋線維の細長い糸のことである。筋原線維は細胞の端から端まで伸びており、それぞれの端で細胞表面の膜に付着している。

「筋管」は、細長い多核細胞であり、通常、筋芽細胞の融合により形成される。筋管は、周囲に配置された核を持ち、細胞質内に筋原線維を持つ成熟した筋線維に成長することができる（例えば、哺乳動物の場合）。低血清条件下では、筋芽細胞は細胞周期から外れ、融合して多核筋管を形成し、収縮力を持つようになる。

「ナノ粒子」、「ナノ構造」及び「量子ドット」という用語は、本明細書では交換可能に用いられ、寸法が１又は数ナノメートル～数マイクロメートル、より好ましくは約１～約１０００ナノメートルのオーダーである材料を表す。

本明細書で使用する「天然生体構造」という用語は、被験体内に見られる生体配置を指し、例えば、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管及び尿道が含まれるが、これらに限定されない臓器である。「天然生体構造」という用語は、生体構造の一部、例えば、臓器の一部、例えば、腎臓の腎動脈を含むことも意図している。天然生体材料は、哺乳動物、植物又は他の生物の体内に自然に見出される任意の材料を含む、天然由来の有機材料であり得る。合成ポリマー材料は、人工的な合成、処理又は製造方法を通じて調製された任意の材料であり得る。好ましくは、合成材料は、生物学的に適合性のある材料である。また、天然材料又は合成材料は、電界下で帯電可能なものである。

「配向性」細胞及び／又は細胞基質は、典型的には１つ（又は複数）の配向軸（例えば、縦軸）を有し、これは関心領域内の任意の所望の方向であり得る。組織化が十分に強化され、本明細書に記載の方法の特定の実施に対して意図される効果又は利益がもたらされる限り、本明細書で使用される「配向」には部分的又は完全な配向が含まれ得ることが理解されよう。例えば、線維及び／又は細胞の７０、８０、９０又は９５％以上が、基準軸から５０、４０、３０、２０又は１０度以下の角度の任意の方向にあるように、線維及び／又は細胞は縦軸に沿って配向し得る。

本明細書で使用される場合、「患者」及び「被験体」という用語は、外傷性損傷、腫瘍切除又は機能的損傷等によって失われた筋組織の修復又は再建を必要としている宿主動物を意味する。好ましい患者は、哺乳動物である。患者の例としては、ヒト、ウマ、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヤギ及びヒツジが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、「患者」は、通過、ヒトの患者である。

「初代培養」とは、解離した細胞又は一次外植片を培養容器に播種した後、最初に確立される培養物のことである。本明細書で使用される「増殖する」又は「増殖」は、生細胞数の増加を意味する。増殖は、例えば、細胞の少なくとも一部が分裂してさらなる細胞を産生する１つ又は複数の細胞サイクルを通じて細胞を「成長」させることによって達成され得る。本明細書で使用される「成長する」には、細胞が生存し続けるような細胞の培養が含まれ、細胞の増殖及び／又は分化が含まれる場合も含まれない場合もある。

本明細書で使用される場合、「サテライト細胞」とは、成熟した筋肉に存在する細胞質がほとんどない小さな単核前駆細胞である。それらは、個々の筋線維の基底膜と筋鞘（細胞膜）の間に存在する。サテライト細胞は、分化及び融合して既存の筋線維を増補し、新たな筋線維を形成することができる。損傷を受けていない筋肉では、サテライト細胞の大部分は静止しており、それらは分化も細胞分裂も行わない。機械的負荷に応答して、サテライト細胞は活性化される。活性化されたサテライト細胞は、最初、骨格筋芽細胞として増殖し、筋分化を経る前に筋管に分化することができる。本発明の一実施形態では、ドナー筋線維は、サテライト細胞を含む。いくつかの実施形態では、筋線維断片は、平均して２～３個のサテライト細胞を含むことになる。他の実施形態では、筋線維断片は、より多くのサテライト細胞を含むことになる。

「足場」とは、細胞又は線維が付着することができる天然又は合成マトリックス分子の配列を意味する。線維は、エラスチン、弾性ストランド又はペプチド、フィブリン、コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸オリゴマー、合成線維若しくは原線維又は生物活性ヒドロゲル、微粒子、ビーズ、リポソーム又は小胞などの細胞外マトリックス分子又は成分を含み得る。足場は、エラスチン、エラスチン様又はエラスチン模倣ペプチド、フィブリン、プロテオグリカン、マトリゲル（商標）マトリックス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州サンノゼ）などの市販のマトリックス又はマトリックス代替物、任意のタイプのコラーゲン、合成線維若しくは原線維又は生物活性ヒドロゲルなどの細胞外マトリックス成分をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２０１０／０３３１９８０号明細書に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる足場が使用される。いくつかの実施形態では、足場は、極度に配向した細胞外マトリックスが下層にあることを反映している有意に一軸性の機械的特性を示す、電界紡糸した足場である。いくつかの実施形態では、足場は、電界紡糸したナノ線維メッシュを含み得る。いくつかの実施形態では、メッシュは一軸性の線維角度を有する。

本明細書において、筋線維断片に関して使用される「サイズ」という用語は、その平均直径に沿った断片の長さを意味する。

本明細書で使用する「破壊」及び「崩壊」という用語並びにそれらの派生語は、細胞の細胞質の少なくとも一部が細胞外環境に露出することになる細胞膜の破損又は欠陥を特徴とするものである。

本明細書で使用する「実質的に」という用語は、５０％超、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％であることを意味する。「実質的な細胞壁破壊」という表現は、サンプル中の細胞の５０％超で細胞壁が破壊又は崩壊していることを意味する。より好ましいのは、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の細胞壁が破壊していることである。

本明細書で使用される場合、「標的筋部位」という語句は、筋組織の修復又は再建を必要としている箇所である。標的筋部位は、平滑筋、心筋、骨格筋又はそれらの組み合わせであり得る。標的筋部位は、外傷性損傷、腫瘍切除又は機能的損傷等の部位であり得る。あるいは、標的筋部位は、老化した筋肉又はジストロフィー筋の部位であり得る。例えば、肩の損傷の治療の場合、標的筋部位は、棘上筋、棘下筋又は回旋筋腱板の一部を形成する任意の他の筋肉又は腱であり得る。

本明細書で使用される「３次元足場」という語句は、細胞の播種及び増殖に適した合成又は大部分が無細胞性の有機マトリックスを意味する。ある好ましい実施形態では、「３次元足場」は、天然生体構造、例えば臓器又は組織が脱細胞化されると形成される残留内部構造を指す。この複雑な３次元足場は、細胞が付着し、その上で増殖することを可能にする高度な支持骨格を提供することができる。そうして、培養した細胞集団を、細胞間相互作用に必要な的確な間隙距離を提供する３次元足場上で増殖させることができる。これにより、生来の生体内臓器又は組織に類似した再建臓器が得られる。

そのような３次元足場を、培養細胞、例えば筋細胞の集団で満たすことができる。いくつかの実施形態では、足場には、内皮細胞などの他の細胞タイプであって、増殖及び発達して、少なくとも１つの追加の培養細胞集団、例えば、筋細胞の増殖及び発達を支持することができる内皮組織層を提供する細胞タイプを播種することもできる。

「治療」とは、被験体、例えば、疾患（例えば、筋骨格系疾患）に罹患している又は発症の危険性がある患者に利益を与えるあらゆる種類の治療を指す。治療することは、患者の状態の改善（例えば、１つ又は複数の症状の緩和）、疾患の発症又は進行の遅延等を目的として行われる行為及び行われない行為を含む。いくつかの実施形態では、治療することは、異方性足場（筋細胞の有無にかかわらず）を、それを必要とする被験体に移植することによって骨格筋組織を（例えば、そのような組織が、例えば損傷又は疾患によって失われた場合に）再建することを含む。足場は、当業者に理解されるように、例えば、損傷部位に若しくは損傷部位に隣接して、及び／又は被験体の身体の別の部位であって、被験体に利益を与えると思われる部位に移植され得る。

特定の理論に限定されることなく、筋細胞断片の移植は、新しい筋組織の産生を迅速に導く事象のカスケードを誘発すると考えられている。これらの事象は、断片の自律的修復及び／若しくは新しい筋細胞への成長又は静止サテライト細胞の活性化を含み得、断片の修復及び／又は新しい筋細胞の成長を誘導する。さらに、断片自体がアクチン及びミオシン筋原線維の即時供給源となり、それが捕捉及び利用されて他の断片が再構成及び修復され、並びに／又は新しい筋細胞の増殖が促進され得ると考えられる。

（方法及び組成物）
図１は、筋組織再生のために長い筋線維細胞から筋線維断片を形成する方法を示す概略図である。図の上部では、細胞壁１２、複数の核１４及び付着しているサテライト細胞１６を有する無傷の細長い筋線維細胞１０が概略的に示されている。図の下部には、本発明による処理の後の断片のセット２０が示されている。断片は、細胞壁２２が破壊されていることを特徴とする。好ましくは、ほとんどの断片は、少なくとも１つの天然の核及び少なくとも１つの付着しているサテライト細胞１６を保持している。

図２は、本発明によって形成された筋線維断片の顕微鏡写真である。ほとんどの断片のサイズは１００μｍのオーダーであり、例えば、平均サイズは１００μｍ未満である。この倍率では必ずしも見えないが、これらの断片は、細胞壁破壊を呈する。その破壊があっても、サテライト細胞は断片に付着したままである。

図３は、本発明に係る筋組織再生の工程のブロック図である。最初の工程では、ドナー筋組織は、例えば、切除又は抽出によって得られる。次の工程では、組織は、例えば、結合組織の細分化及び／又は酵素消化により線維を互いに遊離させることによって、個々の線維に解離される。次の工程では、個々の線維は、例えば、機械的撹拌及び／又はろ過によって断片化される。任意選択で、線維断片を足場に播種することができる。（この技法のさらなる詳細については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅらによる米国特許出願公開第２０１０／０３３１９８０号明細書を参照）。最後に、断片又は播種されたマトリックスを、筋組織の再生が望まれる標的部位に注入又は移植することができる。以下のセクションにおいて、方法及び組成物に関するより詳細な情報を提供する。

（Ｉ．線維の調製）
驚くべきことに、約１５０μｍ未満の均一なサイズの筋線維断片を筋欠損部位に移植することにより、その断片から、生存可能な筋組織の産生用のビルディングブロックをることができ、そのような組織の宿主の血管及び神経回路網への統合を促進できることが見出された。したがって、本明細書で提供される方法は、被験体自身の組織に由来し、効率的かつ迅速に調製される自己細胞集団の使用を可能にする。

筋線維の小断片を使用すると、注入された断片（又は足場上の断片）は、生来の筋線維の方向に沿って宿主筋組織へ効率的に再建されるよう誘導される。これらの線維断片はその後、宿主の血管及び神経回路網に統合することができる。

均一な筋線維断片を調製するために、最初にドナー部位から筋組織を採取する。肩の損傷の修復には、患者から自家組織を採取するのが有利である。使い勝手が良いドナー部位の一例は、患者の大胸筋である。例えば、患者の大胸筋から２ｃｍ×０．５ｃｍ×０．５ｃｍの縦長の筋組織を摘出することができる。この筋組織には、生存している筋細胞及びサテライト細胞が含まれている必要がある。次に、酵素消化、機械的断片化及びろ過によって筋線維断片を得る。このようにして得た筋線維断片を、例えば、標的部位に直接注入し、粒子／粉末に成形してから標的部位に注入し、又は足場に塗布して培養してから標的部位に移植することができる。

筋組織は、任意の既知技法によってドナー部位から抽出され得る。ドナー筋組織は、同系（自家又は同種）、同種異系又は異種であり得る。一実施形態では、ドナー筋組織は、自家筋組織である。自家組織は免疫系によって拒絶されないため、これは特に有利である。大胸筋に加えて、又は代替として、筋組織は、例えば、大腿四頭筋などの体肢筋から、又は別の適切な筋肉から、当該技術分野で知られている標準的な生検技法を使用して抽出することが可能である。

筋組織を細分化することで、解離を行うための小さなサイズの断片が得られる。好ましくは、筋線維は、小さなサイズに細分化される。いくつかの実施形態では、筋組織を、滅菌鉗子及び／又はハサミで、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ又は０．５ｍｍ未満のサイズに細分化することができる（サイズ分布も不均一となり得る）。

細分化後、筋線維を解離剤で解離することが好ましい。解離剤は、筋細胞からサテライト細胞を切り離すことなく筋線維を消化することが好ましい。一実施形態では、解離剤は酵素であり、筋線維を消化する。好ましい酵素の一例はコラゲナーゼタイプＩである。使用され得る他の解離剤には、その他のコラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼＨＩ及びペプシン又はそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、酵素の助けを借りずに、例えばノルモソル（登録商標）などの生理食塩水を用いて、筋線維を解離することができる。

次いで、解離した筋線維を断片化する。一実施形態では、解離した筋線維を機械的に断片化する。筋線維を機械的に断片化させる好ましい方法の一例は、ピペッティングを繰り返すなどの混合によることである。ピペットチップへの吸い上げと放出を繰り返すことで、筋線維が混合され、断片化される。一実施形態では、消化された筋線維断片を、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０又はそれ以上の回数、ピペットチップに吸い上げて放出させる。筋線維を機械的に断片化させる別の方法は、激しく撹拌することである。筋線維を機械的に断片化させるさらに別の方法は、サテライト細胞の実質的な溶解を防ぐ周波数及び出力での超音波処理を介するものである。

次いで、断片化した筋線維を含む溶液をろ過し、直径１５０μｍ未満とする。本発明者らは、好ましいフィルタサイズは１５０μｍ未満であることを見出した。一実施形態では、線維断片は、直径が１４０μｍ未満、１３０μｍ未満、１２０μｍ未満、１１０μｍ未満又は１００μｍ未満である。他の実施形態では、線維断片は、４０～１５０μｍ、５０～１４０μｍ、６０～１３０μｍ、７０～１２０μｍ、８０～１１０μｍ又は９０～１００μｍである。他の実施形態では、線維断片は、６０～１５０μｍ、６０～１４０μｍ、７０～１３０μｍ、８０～１２０μｍ、８０～１１０μｍ又は８０～１００μｍである。一実施形態では、直径８０～１００μｍの線維断片は、筋組織の移植及び生成用の均一な線維断片として特に有用であることが示されている。一実施形態では、フィルタは１００μｍのフィルタである。任意選択で、より小さなサイズの断片を、小さなフィルタ（すなわち、８０、７０、６０、５０、４０又は３０μｍのフィルタ）に通してスクリーニングし、ろ液を廃棄することで、筋線維から除去することができる。本明細書では、フィルタとろ過器という用語を同じ意味で使用する。

本明細書に記載の方法によって得られる均一な筋線維断片は、少なくとも２つの成分を含む。それらは、機能的サテライト細胞及び筋線維細胞断片を含む。一実施形態では、サテライト細胞の少なくとも５０％が機能している。別の実施形態では、サテライト細胞の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％が機能している。均一な筋線維断片の筋線維の細胞壁は、実質的に破壊されている。筋原線維の５０％以上、７５％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上で、細胞壁が破壊されている。均一な筋原線維断片におけるサテライト細胞の機能性は、当該技術分野で知られている任意の方法によって測定することができる。例えば、サテライト細胞を、Ｖｙｂｒａｎｔ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）又はＰａｘ７免疫染色などの色素で蛍光標識する場合がある。

均一な筋線維断片中の筋サテライト細胞の量は、有効量であり、すなわち、筋線維断片は、サテライト細胞を、当該細胞が筋形成の役割を果たすのに十分な量で含む。線維断片中のサテライト細胞の正確な量は、ドナー材料の種類、修復される筋損傷の種類、投与様式及び線維断片に提供される追加成分などの要因によって変化する。

一実施形態では、筋線維断片は、無細胞筋線維断片であり得る。別の実施形態では、筋線維断片は、無細胞筋線維由来の粒子／粉末であり得る。免疫原性成分を含まない無細胞断片の使用は、機能的筋再生のための同種異系移植の有望なアプローチとなり得る。細胞及び残存ＤＮＡなどの免疫原性成分を除去することにより、無細胞断片は、ドナー細胞含有筋線維と比較して、免疫反応を低減することができる。さらに、無細胞断片は、ｉ）内因性サテライト細胞の接着、生存及び増殖に適した構造の構築物及び細胞外マトリックスを提供可能な筋特異的鋳型並びにｉｉ）栄養因子を分泌することによる筋細胞の刺激などの重要な役割を担っている。

（ＩＩ．３次元再構築）
いくつかの実施形態では、均一な線維断片を、足場、すなわち人工筋組織の３次元（３Ｄ）再構築物を使用して筋肉損傷に移植する。３Ｄ再構築物の使用は、筋損傷が大きな欠損部位を含む場合に特に有用である。３Ｄ筋組織は、筋線維断片を、注射用足場（コラーゲンゲル、フィブリンゲル、アルギン酸ゲル又はＵＶ誘発架橋ゲルシステム）又は天然及び合成ポリマー由来の移植用足場などの足場システムと組み合わせることによって調製することができる。

一実施形態では、電界紡糸を使用して足場を形成し、マトリックスを作製する。特に有用である電界紡糸マトリックスは、例えば、米国特許第７，５３１，５０３号明細書“Ｃｅｌｌ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ”、米国特許出願公開第２０１０／０１２９４５０号明細書“Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｒｉｃｅｓ”及び
米国特許出願公開第２０１０／０３３１９８０号明細書“Ａｌｉｇｎｅｄ Ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が組み込まれる。

均一な線維断片が移植され得るマトリックスは、生体適合性であり、好ましくは生分解性である。生分解性材料を形成するための代表的な材料には、天然又は合成ポリマー、例えば、コラーゲン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）などのポリ（αエステル）、ポリオルトエステル及びポリ無水物並びにそれらのコポリマーなど、加水分解によって解離される速度が制御され、再吸収されるものが含まれる。これらの材料は、分解性、扱いやすさ、サイズ及び形状の制御を最大限にする。好ましい生分解性ポリマー材料には、吸収性合成縫合材料として開発されたポリグリコール酸及びポリグラクチンが含まれる。

本発明の一態様では、マトリックスは、電界紡糸したマトリックスであり、少なくとも１つの天然生体材料成分と少なくとも１つの合成ポリマー材料とを含む。一実施形態では、天然生体材料成分は、コラーゲン（生体組織源に由来し得、又は合成され得るもの）を含み、合成ポリマー成分は、高分子量ポリマー、例えば、分子量が少なくとも１０００、好ましくは２０００～２００００であるものとすることができる。天然成分は、マトリックスの生体適合性を高め、及び／又は免疫原性を低下させる一方、その分子量のポリマー成分は、マトリックスにさらなる機械的強度を付与し、及び／又は電界紡糸中の溶液の粘度及び紡糸特性を高めることによって製造容易性を改善することが可能である。電界紡糸マトリックスに使用される材料は、帯電可能なものであるか、又は帯電した溶液中で輸送可能なものである。

電界紡糸したマトリックスは、弾性を付与するために選択された第２の天然成分をさらに含むことができる。例えば、天然生体材料成分は、エラスチン（これもまた、生体組織源に由来し得、又は合成され得るもの）を含み得る。電界紡糸の後、安定性及び強度を高めるために、様々な既知の架橋方法を用いて、マトリックスを架橋することもできる。

電界紡糸したマトリックスに含まれ得る天然由来の材料の例としては、アミノ酸、ペプチド、変性コラーゲン由来のゼラチンなどの変性ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、材料化合物は、コラーゲン、フィブリン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン４－硫酸、コンドロイチン６－硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン及びケラタン硫酸並びにプロテオグリカンなどの細胞外マトリックス材料であるが、これらに限定されない。これらの材料は、ヒトその他の動物又は細胞から単離され得る。好ましい天然化合物は、コラーゲンである。コラーゲンの例としては、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＶＩＩ、コラーゲンＶＩＩＩ、コラーゲンＩＸ及びコラーゲンＸが挙げられるが、これらに限定されるものではない。別の好ましい天然化合物は、エラスチンである。エラスチン線維は、いくつかの組織の弾性特性を担っている。エラスチンは、例えば、皮膚、血管及び肺組織に存在し、そこで強度、弾力性及び柔軟性を付与している。

電界紡糸したマトリックスに含まれ得る合成ポリマーの例としては、ポリ（乳酸）ポリマー、ポリ（グリコール酸）ポリマー、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ウレタン）、ポリ（シロキサン）又はシリコーン、ポリ（エチレン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレン－コ－酢酸ビニル）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ナイロン、ポリアミド、ポリ無水物、ポリ（エチレン－コ－ビニルアルコール）（ＥＶＯＨ）、ポリカプロラクトン、ポリ（酢酸ビニル）、ポリビニルヒドロキシド、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）及びポリオルトエステルのうちの１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、合成ポリマー成分は、ポリ（乳酸）ポリマー若しくはポリ（グリコール酸）ポリマー又はそれらのコポリマー、例えばポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）であり、分子量が約１０００～約２０，０００である。

一実施形態では、足場は、様々な溶媒及びポロゲンのうちの１つ又は複数を使用する合成ポリマーを用いて形成される。一実施形態では、足場は、分子自己組織化を使用して形成される。好ましい一実施形態では、ヒドロゲル足場が形成される。

本発明の方法及び組成物は、均一な線維断片の局所的送達に使用することができる。追加の治療剤及び／又は生物学的薬剤もマトリックスに添加することができ、そのような薬剤が被験体の標的部位で制御放出されることが想定される。機能性添加剤は、画像増感剤又は造影剤（例えば、ガドリニウム若しくはバリウム）又は治療剤その他の生物学的薬剤を含み得る。一実施形態では、治療剤又は生物学的薬剤を、ナノ粒子、例えば、量子ドット構造であって、エネルギー印加、例えば、当該ナノ粒子によって容易に吸収される波長又は波長範囲の放射線の照射によって活性化されるものに結合させることができる。

３次元再構築物を、移植前に（ポリマー基材に均一な筋線維断片を移植する前又は後に）添加剤又は薬剤で処理し、例えば、移植後の新たな組織の形成を促進することが可能である。したがって、例えば、成長因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分その他の生物活性材料を基材に添加して、移植片の治癒及び新組織の形成を促進することができる。そのような添加剤は、一般に、移植された臓器又は組織に適した新組織が確実に形成されるように、再建又は補強される組織又は臓器に応じて選択される（骨治癒の促進に用いるそのような添加剤の例としては、例えば、Ｋｉｒｋｅｒ－Ｈｅａｄ， Ｃ． Ａ． Ｖｅｔ． Ｓｕｒｇ． ２４ （５）： ４０８－１９ （１９９５）を参照）。例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６５４，２７３号明細書を参照）を用いて、新たな血管組織の形成を促進することができる。成長因子その他の添加剤（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮様成長因子（ＨＢＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、サイトカイン、遺伝子、タンパク質など）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ）及びアグリンを、基材上に播種した細胞により生成され得るそのような成長因子（もしあれば）の量を超える量で添加することが可能である。そのような添加剤は、好ましくは、修復又は補強される組織又は臓器に適したタイプの新たな組織の形成を（例えば、移植片への宿主細胞の浸潤を引き起こし、又は加速させることによって）促進するのに十分な量で提供される。その他の有用な添加剤としては、抗生物質などの抗菌剤が挙げられる。

マトリックスを保存し、移植の直前に均一な筋線維断片の播種によって使用することができる。多くの電界紡糸マトリックスは、一度紡糸すると乾燥し、乾燥又は凍結状態で保存することが可能である。保存状態は、使用される電界紡糸化合物によって、及び治療剤がマトリックス上又はマトリックス中に組み込まれているかどうかによって決まる。治療薬が組み込まれた実施形態では、マトリックスを、０℃未満の温度で、真空下で、又は凍結乾燥状態で保存することができる。その他の保存状態、例えば、室温、暗中、真空若しくは減圧下、不活性雰囲気下、冷蔵温度、水溶液その他の液体溶液中又は粉末形態を、マトリックス中若しくはマトリックス上の材料に応じて使用することが可能である。

マトリックスは、放射線及び熱などの当業者に知られている従来の手段で滅菌され得る。マトリックスは、チメロサールなどの静菌剤と組み合わせて、細菌の増殖を阻害することもできる。いくつかの実施形態では、組成物を、保存及び輸送における安定性を付与する化学物質、溶液又はプロセスで処理することができる。

（ＩＩＩ．移植）
本発明では、均一な筋線維断片を、患者に注入するように作製する。線維断片は、移植後に宿主内に容易に統合され得る細胞の生存能力を維持する。したがって、線維断片は、長い線維に再構築し、生来の筋肉に沿って配向することが可能である。線維断片は、宿主の筋線維に再建され、血管系及び神経系と統合して、筋肉を機能的に再建し、又は修復する。

本明細書に記載の筋線維断片の形成により、神経筋接合部が保存されるため、宿主内で筋線維を形成する際に神経が筋線維断片と接続されることが判明している。筋肉が収縮するためには、神経の接続が必要である。したがって、神経筋接合部の保存は、本発明の一実施形態の重要な態様である。

一実施形態では、均一な筋線維断片を、患者の標的筋部位に直接注入する。線維断片のサイズが小さく均一であるため、線維断片を生来の筋肉に沿って配向する長い線維に再構築することが可能である。

別の実施形態では、均一な筋線維断片をマトリックスに移植又は播種し、そこで３次元再構築物が形成され、患者に移植される。

本発明は、患者のドナー部位から筋線維を採取し、均一な筋線維断片を調製し、その均一な筋線維断片を患者の標的部位（単数又は複数）に注入するプロセスを１日のうちに行うことを含む。このように、採取及び注入を短時間で行うことができるため、患者は、病院又は同様の場所に何度も訪問する必要がない。一実施形態では、患者の自家ドナー部位から筋線維を採取し、患者がまだ手術室にいる間に均一な筋線維断片を調製し、その均一な筋線維断片をその手術室において標的部位に注入する。いくつかの実施形態では、採取と注入との間の時間枠は８時間未満である。他の実施形態では、その時間枠は６時間未満である。他の実施形態では、その時間枠は４時間未満である。他の実施形態では、その時間枠は３時間未満である。他の実施形態では、その時間枠は２時間未満である。他の実施形態では、その時間枠は、１時間未満である。

（ＩＶ．キット）
本発明の別の態様では、筋線維断片（ＭＦＦ）のポイント・オブ・ケア調製用のキットが開示される。例えば、ＭＦＦの注射用懸濁液は、本明細書に開示されるキットを用いて手術室（又はその近く）で調製することができる。キットには、組織ミキサー、組織ホモジナイザー及びろ過システムを含めることができる。

特定の実施形態では、キットには、ペトリ皿その他の組織（生検）容器、細分化装置（外科用メス又は専用の細分化装置など）、処理中にサンプルを取り扱うための１つ又は複数のチューブ（例えば、コニカルチューブ）、細胞ろ過器、血清用ピペット、シリンジ（単数又は複数）、均質化液及び／又は滅菌生理食塩水のうちの１つ又は複数を含めることができる。

サンプル処理（コニカル）チューブは、細分化されたサンプルを受け取り、それを（例えば、ピペッティング、超音波処理又は機械的撹拌によって）均質化するように構成され得る。チューブは、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（マサチューセッツ州サマービル）が同社のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（登録商標）細胞分離器で使用するために販売しているようなＣチューブで構成され得る。そのようなチューブは、筋組織を撹拌して個々の線維に解離するために、当該分離器に装填されるように設計されている。このチューブには、ローター付きカップを装着し、分離器に差し込むことができる。

本キットは、リベラーゼ（登録商標）などの酵素溶液又はノルモソル（登録商標）などの適切な緩衝生理食塩水のいずれか１つ若しくは複数の均質化溶液をさらに含むことができ、細分化したサンプルは均質化工程の前に均質化液に懸濁することができる。

サンプル入りチューブに、フィルタ、例えば１５０μｍ、１００μｍ又は８０μｍメッシュのふるいフィルタを含むろ過器カップを装着し、細胞断片化を行うこともできる。キャップは、解離した筋線維細胞をふるいフィルタを通して吸引するための吸引リングを含み得る。そのような負圧駆動のふるい分け装置の一例として、ＰｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ社（カリフォルニア州エルカホン）から入手可能なＰｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ^（商標）システムがある。もちろん、ろ液をろ過システムに数回通し、所望の程度の細胞断片化を達成することができる。

上述の使い捨て要素に加えて、ポイント・オブ・ケアシステムは、再利用可能な分離器（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、マサチューセッツ州サマービル）から入手可能な上述のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（登録商標）細胞分離器、遠心分離機、ピペットコントローラー及びチューブラックなどを含むことが可能である。

以下の例では、動物に関する術前の背景研究の結果並びに負傷した患者の治療プロトコルを提供する。

（実施例１－筋線維断片の調製）
均一な構造の筋線維断片を、Ｃ５７ＢＬ６マウス（雄、１０～１２週齢）の前脛骨筋（ＴＡ）及び腓腹筋（ＧＮ）から単離した。単離したＴＡ筋又はＧＮ筋を２本の使い捨て外科用メスで細分化した。筋組織を極小サイズにまで細分化した。細分化後、各断片を無血清ＤＭＥＭ中の０．２％コラゲナーゼタイプＩで３７℃で１時間振盪しながら消化させた。酵素消化後、筋線維をピペッティングして、個々の断片に解離させた。その後、筋線維溶液を細胞ろ過器（１００μｍサイズ、ＢＤ ｆａｌｃｏｎ）で直ちにろ過し、均一なサイズの筋線維断片を得た。

小さな筋線維断片を、動物への移植後の線維追跡のために、Ｖｙｂｒａｎｔ蛍光色素（ＤｉＤ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。共焦点顕微鏡で観察したところ、表面に細胞を含む分離した線維断片がＶｙｂｒａｎｔで蛍光標識されており、繊維断片のサイズはおおよそ直径１００μｍであることが確認された。

（実施例２－筋線維断片の移植）
加工した筋線維断片が注入療法として開発できるかどうかを調べるために、Ｃ５７ＢＬ６マウス（１０～１２週齢）の臀部に単離した筋線維断片を注入した。ＰＢＳの線維断片溶液１０μｌ（線維断片数５００／注入）をハミルトンシリンジ（２６Ｇ、１０μｌ）で臀部領域の切開部位（０．５～１ｃｍ）に向けて２回注入した。移植後、切開部を縫合により閉じた。移植後１、２、３及び４週目に、切開部位の筋組織を採取し、さらにＯＣＴ化合物中で凍結した。

注入した筋線維断片が宿主筋線維に再建し、宿主動物の血管系及び神経系と統合するかどうかを調べるために、採取した組織を用いて組織学的及び免疫組織学的試験を行った。凍結組織を薄片にし、１０％ホルマリン溶液で固定し、Ｈ＆Ｅ染色を行った。免疫組織化学的試験のために、切片を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、メタノール処理で透過処理した後、マウス抗ミオシン重鎖（ＭＨＣ、ＭＦ２０、ハイブリドーマバンク）、ラット抗マウス ＣＤ３１（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、マウス抗Ｐａｘ７（ハイブリドーマバンク）抗体又はα－ブンガロトキシン（ＢＴＸ）染色との抗ニューロフィラメント（ＮＦ）抗体などの一次抗体でインキュベートし、続いてアレクサ４８８ヤギ抗マウス及びＦＩＴＣウサギ抗ラット抗体などの二次抗体でインキュベートした。核染色では、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む封入剤で免疫染色切片を封入した。

組織学的及び免疫組織学的試験により、移植筋線維断片が宿主筋組織の配向の線維に再建することが明確に示され、また、Ｖｙｂｒａｎｔ染色とＭＨＣ又はＰａｘ７免疫染色の二重染色により、移植線維表面の筋幹細胞（サテライト細胞）が生存し、増殖していることが示された。さらに、Ｖｙｂｒａｎｔ染色とＣＤ３１免疫染色の二重染色により、移植線維が宿主動物の血管網に統合されていることが確認された。また、移植線維の宿主動物による神経支配は、Ｖｙｂｒａｎｔ染色を含むＮＦ染色とα－ＢＴＸ染色の三重染色によって確認された。

（実施例３－筋線維断片、長線維及び無細胞組織成分の移植効率の比較）
脱細胞化断片とサテライト細胞含有断片のｉｎ ｖｉｖｏ効果を比較する試験を行った。マウスのｉｎ ｖｉｖｏ試験で有望な結果が得られたことに促され、長線維と比較した小線維断片の効率的な生着について検討するために、ラットを用いた拡張動物試験を、様々な注入量及び線維断片数を用いて実施した。さらに、細胞成分を含まない無細胞断片を移植し、それらの同種異系移植用の「既製」成分としての利用可能性を検討した。ラット（ルイスラット、１０～１２週齢）の筋線維断片を、上記マウスと同じプロトコルで単離した。様々な容量（１００、２００及び３００μＬ）の線維断片（７×１０^４線維／ｍｌ）を、２６Ｇ針のシリンジを用いて、筋欠損のない腓腹筋（ＧＮ）に注入した。長線維の移植には、ろ過プロセスを経ずに単離した３００μＬの線維（３×１０^３線維／ｍｌ）（Ｈａｌｌ ＪＫ ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１１）を注入した。注入した長線維の数は、１本の長線維が１～３ｍｍの長さを示すという観察に基づいて算出した。無細胞断片は、化学的及び酵素的処理を行わず、ＰＢＳ中での単純なインキュベーションにより調製した。簡単に説明すると、単離された線維断片を３７℃で一晩インキュベートし、４℃で保存した。細胞及びＤＮＡ成分の除去は、線維断片のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞核染色によって確認した。無細胞断片の移植は、３００μＬの断片溶液により、上記と同じ注入プロトコルを用いて行った。移植後１、２、３及び４週目にＧＮ筋組織を採取し、重量を測定し、さらに組織学的及び免疫組織学的解析のための処理を行った。移植した線維断片の面積は、共焦点画像におけるＮＩＲ陽性領域を測定することによって半定量化した。

ＧＮ組織の筋肉量を比較すると、線維断片及び無細胞断片の注入は、擬似薬、ＰＢＳ及び長線維と比較して、ＧＮ量／体重を５％増加させたが、統計的な差異は見られなかった。線維断片の局在化は、共焦点画像におけるＮＩＲ陽性スポットによって確認された。３００μＬの線維断片と無細胞断片を注入したグループでは、共焦点画像によって、線維断片は宿主筋組織に沿って顕著に生着したのに対して、長線維は生着しないことが認められ、このことは、筋線維の断片化がｉｎ ｖｉｖｏでの筋線維の効率的な送達を促すことを強く示唆している。マウス試験の結果と同様に、ラットに移植された線維断片は、宿主動物の血管及び神経回路網と統合した。興味深いことに、無細胞断片を注入すると、宿主細胞の生着部位への動員が促進され、宿主動物との効率的な統合において線維断片と同様のパターンが示され、これは、機能的筋再生のための同種異系移植のもう一つの有望なアプローチである。

（実施例４－筋萎縮の治療のための筋線維断片の直接注入）
本試験の目的は、筋線維断片（ＭＦ）を直接注入することで、筋萎縮の筋機能回復が促進されるかどうかを明らかにすることであった。注入されたＭＦは、宿主の筋組織だけでなく、血管及び神経回路網と効率的に統合し、筋損傷の筋機能回復をさらに向上させるとの仮説を立てた。試験計画の概要を図４Ａに示す。

ラットの筋萎縮モデルを作製するために、３００μｌの３％ＢａＣｌ_２を１つのＴＡ筋に注入した。ＢａＣｌ_２注入後３日目に、３００μｌのＰＢＳ溶液に懸濁させた０．１５～０．２×１０^６ＭＦを、２６Ｇ針シリンジを用いて損傷ＴＡ筋に直接注入した。対照として、同量のＰＢＳ溶液を投与した。動物実験中、機能的及び形態的分析により、機能的筋再生を評価した。筋機能回復を判定するため、ＭＦ注入後、所定の時間に筋力検査を行った。電気刺激１００Ｈｚにおける等尺性強縮筋力を測定し、ＭＦ注入後の各時点のトルクを損傷前のトルクで正規化して相対的強縮力（％）を算出した。図４Ｂに示すように、ＭＦ注入後のＴＡ筋組織は、対照（ＰＢＳ注入）よりも高い相対的強縮力を示し、ＭＦ注入後７、２１及び２８日目に統計的有意差を示した。

ＭＦを注入したＴＡ筋組織の免疫染色を用いた形態学的解析［図５Ｂ］も筋機能の改善を裏付けており、注入したＭＦが宿主の筋組織［図５Ａ、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）］並びに血管［図５Ｃ、ＣＤ３１］及び神経回路網［図５Ｄ、神経フィラメント（ＮＦ）及びα－ブンガロトキシン（α－βＴＸ）］と効率的に統合したことを実証している。

（実施例５－外傷性筋欠損の治療のためのＭＦ含有容積型構築物の移植）
この補助試験の目的は、広範囲筋欠損の治療にＭＦ含有３次元構築物を移植することの実現可能性を検討することである。移植可能なＭＦ含有構築物は、構造的完全性を維持し、外科的に誘導された筋欠損の機能的な筋回復を促進するであろうとの仮説を立てた。試験計画の概要を、図６Ａに示す。

外傷性筋損傷動物モデルを作製するために、ラットのＴＡ筋組織の３０～４０％を外科的に切除した。ＭＦ／コラーゲン構築物（０．２ｍｌ）［ＭＦ（０．１ｇ≒０．１ｍｌ）を０．８％コラーゲンゲル０．１ｍｌ中に懸濁したもの］を筋損傷部位に移植し、筋膜と皮膚を縫合して移植部を閉じた。移植なし（欠損のみ）及びコラーゲンのみの移植を対照とした。移植後７、１４、２１及び２８日目にＴＡの強縮力を測定し、相対的強縮力（％）により、ＭＦ／コラーゲン構築物移植の筋機能改善効果を判定した。

移植後の各時点において、ＭＦ／コラーゲン移植グループは、欠損のみ及びコラーゲンのみのグループと比較して高い相対的強縮力を示した。特に、２１日目と２８日目では、統計的有意差が見られた（ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ解析、Ｐ＜０．０５）（図６Ｂ）。また、図６Ｃに示すように、移植後２８日目には、欠損のみの場合と比較して、構築物の移植により筋肉量が有意に改善された。本発明者らの結果は、外科的に誘導された筋欠損にＭＦ／コラーゲン構築物を移植することは実行可能であり、成功し、筋肉量と筋機能の回復を促進することを示している。

（実施例６－尿道括約筋失禁に対するＭＦ技法の応用）
尿失禁（ＵＩ）は、人生のある時点で膀胱の制御が多少ともできなくなった人の３人に１人がかかるとされる深刻な健康問題である。ＵＩ治療の市場規模は２００億ドルを超え、２０２０年には３００億ドルに達すると予想されている。現在の治療法としては、生体材料由来のメッシュ及びスリングの挿入があるが、メッシュの破損、尿道閉塞、隣接臓器の損傷、大量出血、内臓の損傷、瘢痕化などの合併症を引き起こすことが多くある。筋前駆細胞を用いた細胞療法はＵＩ治療法として有望な技法であるが、細胞操作が必要であり、治療に使用できるまでに時間がかかる点でも限界がある。

本試験の目的は、ＵＩ治療用の筋線維断片の使用を実証することであった。注入されたＭＦは、損傷した括約筋の宿主筋組織だけでなく、宿主の血管及び神経回路網と統合し、括約筋骨格筋機能を強化することによって尿流動態機能をさらに改善するとの仮説を立てた。試験計画の概要を、図７Ａに記載する。尿道括約筋失禁動物モデルを作製するために、ラットの尿道括約筋の片側を電気凝固法で損傷させた。尿道括約筋損傷後１ヶ月目に、ＰＢＳ溶液に懸濁させたＭＦを０．０５ｇ（≒０．０５ｍｌ）、括約筋損傷部位に注入した。ＭＦ注入後１及び４週目に、電気刺激なしの場合（Ｐ１）及び電気刺激ありの場合（Ｐ２）の尿漏出時圧を測定することで、尿道括約筋収縮力を測定した。その結果を図７Ｂに集計した。Ｐ２とＰ１の差は、外尿道括約筋が維持する最大膀胱圧である。括約筋損傷後、括約筋を電気刺激しても、どの時点でも膀胱の尿漏出時圧は上昇しなかった。しかしながら、ＭＦ注入グループでは、ＭＦ注入１ヶ月後の尿漏出時圧差分は正常値（擬似薬グループ）の６７％となり、統計的な差異が認められた（スチューデントｔ－検定、Ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。

（実施例７－さらなるＭＦ採取方法）
本試験の目的は、ヒト筋線維断片化プロセスを改良し、収率、作業時間及び試薬の利用率を向上させることであった。図８Ａは、筋組織をドナー部位から採取し、細分化した後、ＧＭＰグレードのコラゲナーゼ溶液（リベラーゼＭＮＰ－Ｓ、Ｒｏｃｈｅ）で酵素的に均質化する代替処理技法を示している。その後、生成物をろ過し、ノルモソル（ＧＭＰグレードの生理食塩水）で洗浄した。均質なサイズのＭＦ断片（例えば、直径５０～１５０μｍ）が得られるまで、均質化及びろ過の工程を繰り返した。図８Ｂは、結果として得られたＭＦを示す顕微鏡写真であり、約３０分の処理時間で得られ、筋肉重量で３０～４０％の収率であった。

（実施例８－その他のＭＦ採取方法）
ドナー部位から筋組織を採取し、細分化した後、ＧＭＰグレードの生理食塩水（ノルモソル（登録商標））で酵素的にホモジナイズする代替処理技術である。その後、生成物をろ過し、ノルモソル（登録商標）で再度洗浄した。均質なサイズのＭＦＦ（例えば、直径５０～１５０マイクロメートル）が得られるまで、均質化とろ過の工程を繰り返した。

（実施例９－回旋筋腱板修復に対するＭＦ技法の応用）
回旋筋腱板修復を受ける４０～８０歳以上の患者で、Ｇｏｕｔａｌｌｉｅｒスコア２～３の筋萎縮とＨａｍａｄａ１及び２の解剖学的分類の患者は、ＭＦＦ－回旋筋腱板補強修復の好ましい候補となる。対象となる筋肉を評価する術前測定が行われ得る。回旋筋腱板修復の前又は最中に、筋肉の生検が行われ得る（例えば、大胸筋から２ｃｍ×０．５ｃｍ×０．５ｃｍの縦長の筋断片）。その後、生検された組織を、手術室内で無菌条件下で処理し、例えば上記の手順によって、ＭＦＦを得ることができる。懸濁液中の自家ＭＦＦからなる最終生成物は、回旋筋腱板修復が完了した後、Ｎａｖｉａｓｅｒポータルを介して直視下で棘上筋の筋腹に標的注射で送達することができる。例えば、ＭＦＦ組成物は、棘上筋中のおおよそ１ｃｍ、棘上窩底の１ｃｍ上の位置に１８ゲージ針でＮｅｖｉａｓｅｒポータルを通して注入することができる。

一実施形態では、１８ゲージ脊髄くも膜下針を経皮的に導入して、修正Ｎａｖｉａｓｅｒポータルから修正前外側ポータルに変化させながら、棘上筋腹（肩甲棘の前方に配向）の正中線位置に直交アクセスすることができる。筋腱接合部を基準として、関節鏡カメラで直接観察しながら、脊髄くも膜下針を内側から外側へ１ｃｍ刻みで導入することができる。針を棘上筋腹筋外膜に刺入し、簡単な加圧検査を行い、注入懸濁液が肩峰下腔に漏出していないことを確認することができる。しっかりした圧力があれば、注入は明らかな体積増加を伴って筋腹に導入することができる。その後、針を１ｃｍ刻みで横方向に導入し、合計４回の注入を行い、最後の注入は筋腱膜接合部のすぐ内側に行うことができる。距離の標準化を図るため、較正済みのプローブを用いて、１ｃｍ刻みで、経皮的に又は標準的な前外側からプローブを導入するように設定することも可能である。

本発明の他の実施形態及び使用は、本明細書に開示された発明の明細書及び実施の検討から当業者に明らかになるであろう。明細書及び実施例は、以下の特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲及び主旨とともに例示としてのみ考慮されるべきである。本明細書で何らかの理由で言及した全ての記事、論文、特許、特許出願その他の刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (34)

1. 患者に対する回旋筋腱板補強修復手術の方法であって、
   筋再生組成物を調製すること
   （当該患者の筋組織のドナー部位から自家筋組織を抽出する工程、
   当該抽出された組織から筋線維を解離させる工程、
   解離した筋線維を、細胞壁破壊を呈し、平均サイズが１５０ミクロン未満の線維断片に断片化させる工程並びに
   当該筋線維断片を生理的に適合性の流体に懸濁させ、当該筋再生組成物を形成する工程によるもの）と、
   当該患者に回旋筋腱板修復手術を行うことと、
   当該回旋筋腱板の近位にある標的筋部位に当該筋再生組成物を注入すること（当該組成物は、当該断片から細長い筋線維を再構築することができ、当該標的筋部位において生来の肩の筋線維と整列して配向することができるものである）
   とを含む、方法。
2. 前記自家筋組織を抽出する工程が、前記患者の大胸筋から筋組織生検を摘出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記筋再生組成物を標的部位に注入する工程が、回旋筋腱板の筋肉に前記組成物を注入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記回旋筋腱板の筋肉が棘上筋である、請求項３に記載の方法。
5. 前記回旋筋腱板の筋肉が棘下筋である、請求項１に記載の方法。
6. 前記断片化させる工程が、前記組成物が前記断片の少なくともいくつかに付着しているサテライト細胞を含むように、生存しているサテライト細胞を保持することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記筋線維断片の平均サイズが、約８０μｍ～１２０μｍ又は約９０μｍ～１１０μｍ又は１００μｍ未満である、請求項１に記載の方法。
8. 前記筋線維断片のアスペクト比が２：１～１：１である、請求項１に記載の方法。
9. 前記断片化の工程が、機械的撹拌、流体移動、ピペッティング又は超音波処理をさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記断片化工程が、前記断片化した線維断片をろ過して平均サイズを１５０μｍ未満にすることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
11. 前記筋線維断片の少なくとも７５％が細胞壁破壊を呈する、請求項１に記載の方法。
12. 前記組成物を注入する工程が、前記回旋筋腱板手術を行う工程の１０時間以内、好ましくは５時間以内、より好ましくは１時間以内に行われる、請求項１に記載の方法。
13. 前記組成物をアジュバントと同時投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記アジュバントが、幹細胞、筋前駆細胞及び成長因子の群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記アジュバントが筋前駆細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記アジュバントが、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ－２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子－α、形質転換成長因子－β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ）及びアグリンの群から選択される少なくとも１つの成長因子を含む、請求項１３に記載の方法。
17. 胸筋から得られ、細胞壁破壊を呈し、平均サイズが１５０μｍ未満の筋線維断片の集団を含む、肩損傷を修復するための組成物。
18. 標的とする肩の筋部位に移植されると、前記断片から細長い筋線維を再構築することができ、生来の筋線維と整列して配向することができる、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記断片の少なくともいくつかに付着している生存しているサテライト細胞を含む、請求項１７に記載の組成物。
20. 前記筋線維断片の平均サイズが、約８０μｍ～１２０μｍ又は約９０μｍ～１１０μｍである、請求項１７に記載の組成物。
21. 前記筋線維断片のアスペクト比が２：１～１：１である、請求項１７に記載の組成物。
22. 前記筋線維断片の少なくとも７５％が細胞壁破壊を呈する、請求項１７に記載の組成物。
23. 生理的に適合性の流体をさらに含み、注射用に製剤化されている、請求項１７に記載の組成物。
24. アジュバントをさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
25. 前記アジュバントが、幹細胞、筋前駆細胞及び成長因子の群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む、請求項２４に記載の組成物。
26. 前記アジュバントが筋前駆細胞を含む、請求項２５に記載の組成物。
27. 前記アジュバントが、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ－２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子－α、形質転換成長因子－β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ）及びアグリンの群から選択される少なくとも１つの成長因子を含む、請求項２５に記載の組成物。
28. 肩の損傷を治療する方法であって、
    筋線維断片と生理的に適合性の流体とを含む組成物を肩の筋部位に注射すること
    （当該筋線維断片は細胞壁破壊を呈し、平均サイズが１５０μｍ未満のものである）
    を含む、方法。
29. 前記肩の筋部位が回旋筋腱板の筋肉である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記注入部位が、棘上筋部位及び棘下筋部位の少なくとも一方である、請求項２９に記載の方法。
31. 回旋筋腱板補強手術又は肩の損傷の治療のための筋再生組成物を調製するためのキットであって、組織ミキサーと、組織ホモジナイザーと、ろ過システムとを含み、標的とする肩の筋部位への注入用に、生理的に適合性の流体に懸濁した概ね均一なサイズの筋線維断片を提供する、キット。
32. 筋組織生検を切除するための外科用メス若しくは代替的に切除された筋組織を解離（例えば、細分化）して筋線維にするための外科用メスをさらに含む、又は両方の機能を果たすために複数の外科用メスを含み得る、請求項３１に記載のキット。
33. リベラーゼ（登録商標）などの酵素溶液又はノルモソル（登録商標）などの適切な緩衝生理食塩水のいずれか１つ若しくは複数の均質化溶液と、当該均質化溶液及び前記解離した筋線維を混合するための容器とをさらに含む、請求項３１に記載のキット。
34. 前記ろ過システムが、前記均質化した筋線維溶液をフィルタに通して当該線維を断片化し、線維断片のサイズを確実に均一にするための断片化デバイスをさらに含む、請求項３１に記載のキット。

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