CN1777437A - 生物活性天然生物基质组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开内容涉及生物活性生物基质组合物。在一个实施方案中，生物基质组合物来源于人羊膜。该生物基质称作HuBiogelTM。HuBiogelTM组合物精确模拟天然存在的基底膜组合物并且能够在体外和体内支持多种细胞类型。所公开的HuBiogelTM生物基质在一个实施方案中含有层粘连蛋白、胶原蛋白I、和胶原蛋白IV，并且可以还含有下列各项的任意组合：巢蛋白、腱生蛋白、纤连蛋白和蛋白聚糖。生物基质组合物基本上不含内源性生长因子和蛋白水解酶。本发明还描述了使用HuBiogelTM组合物的二维和三维培养系统和生理/病理模型系统。HuBiogelTM组合物可以经修饰以含有所希望的生长刺激剂，如生长因子、多肽和有机小分子，并且可以还含有生长抑制剂和/或治疗剂。
Description
技术领域
本公开内容涉及来源于人羊膜的生物活性生物基质组合物(称作HuBiogelTM)。
背景技术
基膜(BM)是连续的结构屏障，它将上皮组织与邻近的基质分开。BM的主要组分包括层粘连蛋白、I型和IV型胶原蛋白、巢蛋白、腱生蛋白和蛋白聚糖，如硫酸肝素蛋白聚糖。因为细胞经常与它们的细胞外环境相互作用，所以BM参与许多体内过程。这些过程包括生理过程，如组织生长和发育、骨重塑、血管生成、生殖、伤口愈合和神经元再生，以及病理过程，如肿瘤发生/转移(包括细胞迁移、侵染和血管生成)、血管功能异常、关节炎和衰老，和动脉粥样硬化。在这些过程的每一过程中，细胞与细胞外环境的组分相互作用并应答所述组分。结果，为了在体外研究这些过程，细胞外环境(即，BM)的组分必须准确和可再现地再造。考虑到上面讨论的一种过程：肿瘤发生/转移，可以看到BM系统对于体外研究的重要性。BM的侵染是转移的复杂的多步过程中的关键步骤。控制肿瘤通过BM侵染的机理包括多个形态和功能事件，其可以描述为包括：(i)肿瘤细胞通过BM组分的特异细胞表面受体(如，但不限于，层粘连蛋白受体)与BM的粘附；(ii)BM降解酶(如，但不限于，胶原蛋白酶)的分泌；和(iii)肿瘤细胞通过BM缺口迁移到循环系统和淋巴系统中，部分受趋化反应刺激。
为了研究肿瘤细胞侵染的机理，已经开发了体外模型系统。这些模型系统包括天然和人工BM系统。天然存在的BM系统的使用包括使用完整BM，如膀胱壁、羊膜、晶状体囊和鸡胚绒毛尿囊膜中发现的BM。然而，当在体外测定中使用这些天然存在的BM时，必须非常小心以确保所用的BM是完整的(即，BM中没有允许受试细胞穿过而不需要降解BM的缺口)。此外，在各种测定中所用的BM的厚度必须均匀。当使用不同厚度的BM时，侵染测定的结果将显著不同。因此，在体外侵染性测定中使用天然存在的BM是容易遇到显著实验间偏差的困难的过程。这使得用这些测定法得到的结果难以比较。
开发了人工系统以解决这些问题。最初的人工系统利用细胞外基质蛋白的复合层，所述复合层含有BM，如纯化的大鼠纤维蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白。另外的人工BM系统包括重构的BM基质。从小鼠Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤制备的重构BM配制的Matrigel就是一个实例。然而，发现Matrigel制剂在组成上不能模拟天然存在的BM(Matrigel基本上缺少胶原蛋白I，其是细胞-基质相互作用所需的基本蛋白质)并且含有大量生长因子(如表皮生长因子，EGF，血小板来源生长因子，PDGF，和成纤维细胞生长因子，FGF)。已经报导Matrigel含有胶原蛋白酶活性。重要地，Matrigel组合物是肿瘤生成性的和血管生成性的。在许多情况中，当在Matrigel存在下培养时，非转化的细胞类型显示出异常生长特征和侵染性。例如，当Matrigel存在下并且不存在所加的生长因子或者其他刺激剂时，内皮细胞快速形成管状结构，表明Matrigel组合物中的生长因子和/或刺激剂刺激该过程。此外，当存在Matrigel培养时，所加生长因子或者其他刺激剂的缺乏下培养物中NG108-15成神经细胞瘤和神经胶质瘤杂交细胞快速形成长神经炎过程(2小时内)，再次表明Matrigel制剂中内源性生长因子和/或刺激剂刺激该过程。生长因子的存在不令人惊奇，因为Matrigel来源于小鼠肿瘤细胞。结果，制剂如Matrigel不适于确定侵染性或者与肿瘤细胞侵染有关的其他参数，因为由于内源性生长因子和/或其他生长刺激剂的结果，Matrigel提供了人工刺激的环境。尽管上面的讨论作为一个申请描述了肿瘤发生/转移，但是本文描述的HuBiogelTM生物基质也可以用于解决其他生理和病理模型中的缺陷，如上面讨论的那些缺陷。
已经尝试了对原有Matrigel制剂的修饰，包括补加胶原蛋白的Matrigel和含有更少量的生长因子的Matrigel，但是即使这些制剂也不能提供用于多种生理和病理过程的可靠的可再现的体外BM系统。Matrigel的用途由于其物理性能的限制已经受到妨碍。例如，Matrigel的物理形式(即，凝胶或者液体)对温度敏感，其可以对体外测定中的用途产生一定限制。此外，应该指出Matrigel来源于小鼠BM组分，增加了使用该组分用于人模型系统的研究可产生人为结果的可能。
现有技术缺少来源于人组分的确定的、生物活性生物基质。本公开提供了这种生物基质。该生物基质称作HuBiogelTM。
发明概述
因此，本公开的目的是提供生物活性生物基质组合物(HuBiogelTM)，其能够支持多种细胞类型的体外和体内生长和分化。本公开的另一个目的是提供此类HuBiogelTM组合物，其不含生长因子和其他生长刺激剂。本公开的另一个目的是提供在体外和体内鉴定生理和病理过程的抑制剂和候选抑制剂的方法。本公开的另一个目的是提供来源于人BM前体的HuBiogelTM组合物。本公开的另外的目的是提供HuBiogelTM组合物，其在宽范围的使用条件如温度下保持相似的物理性能。
本发明的另一目的是提供制备能够支持多种细胞类型的体外和体内生长和/或分化的HuBiogelTM组合物的方法。其他目的包括使用HuBiogelTM组合物二维和三维培养细胞的方法。
本公开的其他目的包括生产补充的HuBiogelTM组合物，其设计用于特定需要和用途。本公开的另一目的是提供HuBiogelTM用于文中描述的模型系统的方法。
附图简述
图1A-C阐明了使用所述HuBiogelTM组合物的多种二维培养系统。图1A显示了二室系统，图1B显示了圆盘系统，图1C显示了双层系统。
图2A-C阐明了使用所述HuBiogelTM组合物的多种三维培养系统。图2A显示了微珠系统，图2B显示了双层系统，图2C显示了微血管系统。图2D显示了支架系统的实施方案。
图3A-C阐明了使用或不同FGF(15ng/ml)，生长在二维HuBiogelTM基质上的人脐静脉内皮细胞。图3A显示了不存在加入的生长因子或生长刺激剂时如所示的在多种基质上培养的人脐静脉内皮细胞。图3B显示了在存在和缺乏15ng/ml FGF时48小时内HuBiogelTM基质上培养的人脐静脉内皮细胞。图3C显示了在存在15ng/ml FGF时在HuBiogelTM上生长7天后细管和毛细管样结构的形成。
图4A-D阐明了在三维HuBiogelTM基质上生长的人脐静脉内皮细胞。图4A和B阐明了使用微珠系统培养的人脐静脉内皮细胞，图4A显示了细胞聚集物的光学显微术，图4B显示了微珠切片后内皮单层的苏木精-伊红染色。图4C和D显示了使用三维双层系统培养的人内皮细胞，图4C显示了细胞聚集物的光学显微术，图4D显示了双层切片后内皮单层的苏木精-伊红染色。
图5显示了存在FGF(15ng/ml)时生长因子诱导的人脐静脉内皮细胞活化、迁移和分化，使用三维HuBiogelTM圆盘培养系统。
图6显示了bFGF从基本(basic)HuBiogelTM制剂的释放动力学。
图7A和B显示了使用人脐静脉内皮细胞进行的血管生成生物测定。
图7A显示了通过三种人肿瘤细胞系产生的条件培养基中的VEGF浓度。图7B显示了当HuBiogelTM基质存在下培养细胞时VEGF条件培养基对人脐静脉内皮细胞分化的影响。
图8A和8B阐明了通过HuBiogelTM三维支架构造促进神经发生。如所描述的从成年大鼠分离神经球(Neurospheres)并在缺乏(图8A)或存在(图8B)FGF和NGF(每种以10ng/ml存在，加入细胞培养基)下在HuBiogelTM三维支架构造(在三维支架构造中HuBiogelTM浓度为3mg/ml)上培养7天。
图9A和9B显示了用含有神经球和生长刺激剂(NGF+EGF加入到HuBiogelTM)的HuBiogelTM处理后3个月从对照组和处理组动物得到的SCI组织的光学显微照片(10×物镜)。图9A显示了来自未处理的对照组动物的SCI部位神经组织的纵向切割的Nissl染色的切片视图，而图9B显示了来自处理动物的相同视图。
图10A-C显示了用含有神经球和生长刺激剂(NGF+EGF加入到HuBiogelTM)的HuBiogelTM处理后3个月从对照组得到的SCI组织的光学显微照片(25×物镜)。图10A显示了胶原蛋白I特异免疫组织化学，揭示了I型胶原蛋白(HuBiogelTM的主要组分)组织。图10B显示了植入细胞(植入前用CFDA-SE Cell Tracker试剂盒标记)的分布。在图10C中，融合图像表明了植入细胞和SCI部位I型胶原蛋白生物基质结构的关系。
图11A和11B显示了在含有HuBiogelTM的基质上培养的神经胶质瘤细胞。图11A显示了光学显微图像，而图11B显示了使用FITC显微术捕获的图像。
图12A和12B显示了在NGF存在(图12B)和缺乏(图12A)时在HuBiogelTM上培养的MSC细胞。
图13显示了在HuBiogelTM上培养的肝细胞。
发明详述
HuBiogelTM的组成
公开了生物活性生物基质组合物。在一个实施方案中，生物基质来源于人BM组织(羊膜)。在一个实施方案中，生物机基质含有层粘连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV。在备选实施方案中，基质可以还含有巢蛋白和腱生蛋白。在再一个备选实施方案中，生物基质可以含有巢蛋白、腱生蛋白、纤连蛋白和蛋白聚糖，如硫酸肝素蛋白聚糖的任意组合。如本公开中所用的，生物活性指含有保持生存力和允许多种细胞类型在体外培养条件下生长必需的细胞外成分。在一个实施方案中，提取物含有(按重量计)16-21％层粘连蛋白、35-46％胶原蛋白I、19-33％胶原蛋白IV、7.5-14.5％巢蛋白、3.5-7％腱生蛋白、0-2％纤连蛋白和0-1.3％蛋白聚糖。提取物基本上不含生长因子和蛋白聚糖酶(然而，可以如下文讨论的加入生长刺激剂)。该生物活性生物基质组合物称作HuBiogelTM。
在一个实施方案中，HuBiogelTM是来自人起始材料，如胎盘羊膜的天然加工的天然组合物。天然组合物指HuBiogel组合物的组分当从人起始材料加工时，在加工期间没有单独地相互纯化。换句话说，从起始材料一起简单地分离HuBiogelTM基质的组分。然而，在备选实施方案中，HuBiogelTM组合物的单独组分可以单独分离并且再合并用来产生生物基质组合物。
使用文中描述的HuBiogelTM，可以研究多种过程。这些过程包括生理过程，如组织生长和发育、骨重塑、血管生成、衰老、生殖，以及病理过程，如肿瘤发生/侵染(包括迁移和侵染)/血管生成、血管功能异常、关节炎和动脉粥样硬化。HuBiogelTM还可以用于多种恢复方法中。
所公开的HuBiogelTM制剂是独特的，因为其在长时间内保持培养的多种非转化的细胞类型的生存力而不诱导分化。换句话说，HuBiogelTM制剂为非转化的细胞类型提供了这样的环境，在该环境中所述细胞类型不受外来生长因子和/或生长刺激剂的刺激。这是关键的，因为这些细胞类型然后可以受到生长因子和其他试剂的刺激以便研究体内发生的生物过程，而不受到存在于其他生物系统，如Matrigel中的生长因子和/或生长刺激剂的干扰。如下文所讨论的，HuBiogelTM组合物能够支持细胞生长而不刺激这些细胞的分化。尽管本说明书讨论内皮细胞，在一个实施方案中讨论人脐静脉内皮细胞，和神经祖细胞，在一个实施方案，讨论了神经球，但是本公开的详细教导中可以应用于多种细胞类型。本领域技术人员将能够容易地选择目的细胞类型和进行常规细胞培养操作以观察HuBiogelTM促进未转化细胞类型的生长和生存力而不分化。此类实验可以在一周以内完成并且不需要过多负担或者实验。在人脐静脉内皮细胞中，仅在HuBiogelTM制剂中加入特定生长因子，如FGF时才发生分化(如通过出芽/毛细管形成来测量)。从神经球得到类似结果。
使用所公开的HuBiogelTM组合物，可以在体外研究多种生理和病理过程的分子机制。此外，可以鉴定抑制或刺激该过程的治疗剂并研究它们的机理。以前的BM组合物不能提供这种环境。例如，当在Matrigel上培养未转化的细胞时，发现存在的内源性生长因子刺激细胞快速分化，而不可能使用该BM系统研究分析体内发生的关键机制。
对于转化的细胞类型(其经历以自分泌或旁分泌方式刺激的细胞生长和分化)，HuBiogelTM提供了研究肿瘤事件的天然环境，就像它们在体内发生一样。如下文讨论的，在HuBiogelTM基质上培养的人肿瘤细胞粘附到HuBiogelTM基质并开始依赖时间的迁移和侵染过程。该过程在72小时内以时间分离的方式发生。使用HuBiogelTM系统，与迁移和侵染过程有关的事件可以在时间上分离并且单独研究以确定与该过程的每个阶段有关的分子机理。此外，可以加入另外的试剂以明确方式抑制或者刺激这些过程。以前的BM系统不能提供该优点。例如，使用Matrigel基质，整个迁移和侵染过程在5小时时间窗口内发生(在美国专利号4,829,000，实施例2和图10中描述)。已经推测这是由于所加入的生长因子和/或Matrigel组合物中存在的其他生长刺激剂。此外，因为该内源性生长因子和/或生长刺激剂的背景，难以确定迁移和侵染步骤中起作用的生化过程的单独的刺激剂和抑制剂。
HuBiogelTM(来自未转化的人组织)和Matrigel(来自小鼠EHS肿瘤组织)的组成的比较在表1中给出。此外，在表2中给出了所选生物机制制剂的物理性能的比较。如可以看到的，HuBiogelTM和Matrigel的组成非常不同。例如，Matrigel的主要成分是层粘连蛋白，其以总重量的50％以上的浓度存在。相比，按重量计HuBiogelTM制剂的主要成分是胶原蛋白I，其在Matrigel中很大程度地缺乏。除了胶原蛋白I，Matrigel还缺少ECM组分腱生蛋白和纤连蛋白。重要的是，Matrigel含有EGF、TGF-β、bFGF、PDGF和VEGF以及蛋白水解酶如胶原蛋白酶的显著浓度。在HuBiogelTM制剂中检测不到此类生长因子和蛋白水解酶。
这些组成的差异也反映在多种生物基质系统的不同性能中。HuBiogelTM是来源于天然ECM组分的半凝胶。半凝胶形式在温度的宽范围(从4℃到37℃)内是稳定的。结果，HuBiogelTM形成了具有显示出弹性的均匀特征的包被(coating)和结构(二维和三维)。Matrigel可以以液体或者凝胶形式存在并且来源于小鼠肿瘤组织。Matrigel的形式是依赖温度的。结果，Matrigel形成的包被和结构显示出非均匀特征(在本领域中称作例如“渗漏的”包被)。关键是HuBiogelTM提供了未受刺激的细胞生长(不被生长刺激剂激活)的环境并且允许产生明确和受控的环境，其中可以以没有内源因子导致的背景的受控方式调节和研究特定过程。例如，使用HuBiogelTM系统，细胞类型(例如，内皮细胞)可以以这样的方式培养使得细胞保持存活状态并且不分化。此外，通过加入适宜的生长刺激剂，如生长因子(包括但不限于FGF)、多肽、细胞因子或有机小分子，或者通过加入生长抑制剂，可以刺激细胞经历生长分化或者其他生理过程。然后可以分析该过程的调节剂(抑制剂和刺激剂)以便分离潜在的治疗化合物。Matrigel在另一方面含有内源性生长因子和/或生长刺激剂，它们妨碍了使细胞保持在存活状态而不诱导分化或加速生长的能力。由于该激活，使用Matrigel系统难以或者不可能研究单一因子或者因子的组合对特定过程的影响和鉴定这些过程的调节剂。
可以以多种方法修饰所公开的基本HuBiogelTM组合物。可以通过加入所希望的浓度范围的一种或多种所希望的生长刺激剂，如生长因子、细胞因子或多肽来修饰HuBiogelTM组合物。还可以加入生长抑制性组分以及潜在的治疗化合物。生长刺激剂可以单独加入或者联合加入。可以加入的生长因子包括，但不限于，EGF、PDGF、FGF、胰岛素、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NFG)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)、脑来源的神经营养因子(BDNF)、亲神经素(neurotropin)-3和4、CNF(睫状神经营养因子)、胶质细胞生长因子(GGF)、胶质细胞成熟因子(GMF)、胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、本文中公开的其他生长因子和本领域中公知的其他生长因子。靶细胞类型的选择可以影响生长刺激化合物的选择。这些因子富集的HuBiogelTM制剂还可以改造以便以受控方式随时间释放因子。还可以向HuBiogelTM组合物加入生物肽。特定肽可以是基质相关的肽(如经试验阻断肿瘤细胞粘附肿瘤基质的肽)或者生长相关肽(如生长因子、激素或细胞因子)。肽的实例包括，但不限于，粘着肽、层粘连蛋白或者thrombospontin相关肽内皮生长抑素和血管生长抑素。还可以向HuBiogelTM组合物中加入其他基质蛋白。例如，可以加入ECM组分，如，但不限于，血纤蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白II、III、V-VIII和骨桥蛋白。备选HuBiogelTM制剂的开发将允许开发含有所希望过程，如生长、分化或侵染的正和负调节剂的HuBiogelTM制剂。
HuBiogelTM的制备
可以以大规模批量制备HuBiogelTM并且具有优良的成分可重复性。大规模制备方法设计为提供大量HuBiogelTM组合物，其在批与批之间的差异很低并且具有改善的可重复性。此外，该方案经设计为提供有序和有效生产过程的方便的断点。所有步骤都在4℃(或冰上)下进行，保持无菌条件和技术。整个方案需要5-7天。所有溶液都用高压灭菌的Q-水制备并且使用0.2μm滤器除菌。
步骤1羊膜的处理：从正常胎盘(15-20个胎盘，非常寻常，在阴道分娩时间的6-24小时之间每天收集)分离羊膜后，将内部上皮表面(粗糙面)用镊子标记。用湿润棉纱清洁完整羊膜以除去凝血。在如下5个顺序洗涤步骤(每个5-10分钟)期间用湿润纱布进一步冲洗/清洁所有羊膜：用PBS洗涤两次(500ml/洗涤)；用10.5％氢氧化铵/PBS溶液洗涤一次(50ml/洗涤)以除去所有细胞材料；并用PBS最后洗涤两次以除去所有污染物。将羊膜浸泡干燥、称重并在-20℃冷藏。
步骤2羊膜的均化和溶解：将冷冻的羊膜在37℃水浴中快速解冻，浸入含有冰冷的0.5M乙酸溶液的培养皿中并切成小块。最终体积调节为5ml 0.5M乙酸/g(湿重)组织。用Polytron装置(P20发电机)以4000-6000转/分钟将样品在冰上均化2-3分钟，冷却间隔为5分钟。所得均浆应该看上去均匀并且没有任何组织团或块(该步骤可以为20-30分钟)。用1-2NHCl然后用0.1N HCl缓慢调节均浆的pH到2.0。(注意：在该pH调节步骤期间避免任何大体积增加或者沉淀)。通过向该溶液(8.6mg/g羊膜)缓慢加入固体胃蛋白酶粉缓慢实施胃蛋白酶(Sigma Co.)的有限消化。将混合物在冷室中温育32-36小时，使用恒定但是温和搅拌。在该步骤，溶解的溶液应该看起来均匀。
步骤3盐提取#1和酶失活：将溶解的(羊膜)溶液以4,600转/分钟(Beckman J-14转子)在4℃离心18分钟。除去上清液并首先使用5N NaOH调节(最高到pH 6.0)然后用0.1N NaOH调节上清液pH至pH 7.8。之后将HuBiogelTM溶液缓慢调节到50mM Tris(碱)和4M NaCl，该酶失活步骤期间避免任何大体积改变和沉淀。这通过联合固体Tris+NaCl并且恒定搅拌下加入小量来完成。注意将最终体积和温育HuBiogelTM提取物在冷室中温和搅拌下温育18-20小时。如果离心步骤后沉淀蓬松并且很大，那么联合胃蛋白酶和胶原蛋白酶I混合物(1-2mg/ml)提取并温育6-8小时以完全回收剩余胶原蛋白。如上离心后，合并上清液。如果发生沉淀或者分配，可以再用HCl调节溶液pH至2.0并如上重复步骤3。
步骤4盐提取#2：将HuBiogelTM提取物以12,000转/分钟(Beckman转子)离心30分钟。用0.5M乙酸使用快的低速均化(1,000转/分钟/30秒×6)使沉淀重悬浮在一半的测量体积。用NaOH使溶液的pH升高到7.8并如步骤3同样地进行固体Tris/NaCl加入和提取。然而，在4℃搅拌溶液仅2-3小时(不像步骤3中过夜搅拌)。测量终体积并再次以12,000转/分钟离心30分钟。丢弃上清液并用透析溶液(5mM乙酸，5mM KCl和135mMNaCl)将沉淀重悬浮在一半测量体积中并在冷室中温和搅拌过夜。
步骤5透析、消毒和浓缩：将HuBiogelTM溶液置于透析袋(45mm，12,000分子量截留大小)并在冷室中对透析溶液(100倍v/v，6小时更换一次透析溶液，共三次)平衡共24小时。为了保持HuBiogelTM的无菌性，在最后更换透析溶液期间将5-10ml氯仿置于透析容器的底部。为了避免沉淀，将透析袋每隔几小时混合并将HuBiogelTM溶液分装到150-200ml大小的透析袋中。最后，使用Amicon搅拌室(400ml)和12K截留滤膜在氮气压(20-30psi)下通过超滤浓缩HuBiogelTM溶液。通过监视浓缩速度和时间得到高度浓缩的HuBiogelTM母液(3-8mg/ml)。
步骤6HuBiogelTM母液的保存：将HuBiogelTM的母液合并和/或保存在4℃以短期(2-4周)保存和-20℃下以长期(2-4月)保存。用PBS和HEPES(pH 8.5)使用分别为1∶1∶0.5(V/V/V)的稀释比例中和HuBiogelTM母液。此外，HuBiogelTM母液在生物测定之前可以通过透析调节并保存在合成培养基(无菌HBSS或DMEM)中。
提供了HuBiogelTM制备过程的上面描述以允许读者理解与制备方法有关的步骤。本领域技术人员认为显而易见的该方法的改变被本发明包括。
HuBiogelTM组分的分析
通过BCA蛋白质测定法(Pierce，IL)测量HuBiogelTM制剂的总蛋白质含量。在4-10％梯度凝胶上实施HuBiogelTM样品的SDS-PAGE，将所述凝胶进行考马斯蓝染色或者蛋白质印迹分析。使用蛋白质标准测定蛋白质的分子量并通过平行凝胶的免疫印迹证实。通过狭线印迹技术使用针对每种蛋白质的单特异性抗体(Chemicon，Neomarkers，Southem Biotech)测定包括层粘连蛋白、I型和IV型胶原蛋白、腱生蛋白、蛋白聚糖和巢蛋白的蛋白质的量。使用HRP缀合试剂盒(BioRad)探测免疫印迹并通过计算机辅助的数字光密度分析定量。通过标准ELISA试剂盒或者荧光测定法证实多种生长因子(如，但不限于，EGF、TGF、VEGF、FGF、IGF)的量。通过在SDS-PAGE上的明胶酶谱图(zymography)测定蛋白酶活性。使用标准微生物学测试试剂盒分析潜在污染物(病毒、真菌和细菌)。
使用HuBiogelTM进行二维和三维细胞培养方法
HuBiogelTM可以掺入多种细胞培养物、植入物和生物计量塞系统。这是可能的，因为HuBiogelTM在4和37℃下保持其半凝胶状态。靶细胞类型可以封装在所希望的HuBiogelTM制剂中以体内应用。应用包括组织修复、组织/器官再生、伤口愈合/修复和生物工程应用。
多种细胞培养系统可以使用HuBiogelTM系统。这些培养系统包括静止和旋转环境中的二维和三维系统。二维系统的实施方案在图1中显示，三维系统的实施方案在图2中显示。图1公开了二室系统(图1A)、圆盘系统(图1B)和双层系统(图1C)。对于二室系统，插入滤器(具有所希望的孔隙率，在该实施方案中为4μm)置于室的顶部。这些系统可以重复使用或者是一次性的。在一个实施方案中，将HuBiogelTM层铺在盘的顶部。HuBiogelTM的浓度可以是实验目的所希望的。例如，可以在滤器上铺75μg HuBiogelTM。可以使用所希望的其他浓度范围。这些浓度可以通过本领域技术人员通过经验确定而不用过多实验。例如，对于侵染测定，HuBiogelTM基质的厚度将影响侵染基质的细胞数，为每个实验优化适于在特定生长条件下的特定细胞系的浓度。申请人已经使用了25到200μg/滤器的浓度。将目的培养基与待测试的细胞类型(如内皮细胞)置于室顶。培养基可以补加生长刺激剂，如生长因子和多肽，或者所希望的治疗化合物，以及通常使用的培养基补充物。可以使用如上讨论的多种细胞类型，仅为了代表性目的陈述内皮细胞。室的底部可以含有培养基和/或HuBiogelTM/培养基组合并且可以如所希望的补加。在该实施方案中，当将生长因子或其他试剂加入HuBiogelTM或HuBiogelTM/培养基组合时，这些生长因子或其他试剂可以分散到室内与所培养的细胞相互作用。盘上铺的HuBiogelTM的浓度可以与用于该系统底部的HuBiogelTM浓度不同。可以对HuBiogelTM补加上文讨论的生长因子或其他刺激剂、多肽和/或治疗化合物。
在图1B中阐明了二维圆盘系统。圆盘系统含有固体支持体，其上沉积一层HuBiogelTM基质与所希望的细胞类型(如内皮细胞)。HuBiogelTM基质包含在限定的区域中，该区域通过环或者另一种适宜的产生无细胞区域的限制装置产生。将培养基或者HuBiogelTM/培养基组合置于HuBiogelTM基质周围。培养基可以补加生长刺激剂，如生长因子和多肽，或者所希望的治疗化合物，以及常用的培养基补充物。可以使用多种HuBiogelTM浓度并且HuBiogelTM可以补加上文讨论的生长因子或其他刺激物、多肽或治疗化合物。在该实施方案中，当将生长因子或者其他试剂加入到细胞周围的HuBiogelTM层时，这些生长因子或者其他试剂可以扩散以与所培养的细胞相互作用。如上文，与细胞接触的HuBiogelTM的浓度可以与细胞周围的HuBiogelTM浓度不同。
在图1C中阐明了双层HuBiogelTM系统。在该系统中，HuBiogelTM的基质层(其可以如上所述补加)支持HuBiogelTM层，其上放置所希望的细胞类型(如内皮细胞)。将所希望的培养基置于细胞顶部并适当温育细胞。培养基可以补加所希望的生长因子、肽或治疗化合物，以及常用的培养基补充物。在该实施方案中，当向基本HuBiogelTM层加入生长因子或其他试剂时，这些生长因子或其他试剂可以向上扩散以与培养的细胞相互作用。可以使用如上讨论的多种HuBiogelTM浓度。如上文，与细胞接触的HuBiogelTM浓度可以与支持较上HuBiogelTM层的HuBiogelTM浓度不同。
在图2中显示了三维培养系统。这些三维系统可以使用如下文讨论的旋转细胞培养系统。图2A显示了微珠系统，其中HuBiogelTM包被在微珠(可以使用任意大小的珠子，但是在该实施方案中，使用大小10-20μm的珠子)的表面。可以如希望的选择HuBiogelTM浓度，其取决于上面讨论的实验参数，但是申请人已经在这些实施方案中使用了5-25μl/mlHuBiogelTM(25到125μg)。将待测试的细胞类型与HuBiogelTM包被的微珠接触并允许粘着。如上文讨论，可以使用多种细胞类型，仅为了代表性目的使用内皮细胞。然后将微珠置于适宜的培养系统，如具有所希望的培养基配方的旋转细胞培养系统中。HuBiogelTM和/或培养基可以补加上文讨论的生长因子或其他刺激剂、肽和/或治疗化合物。
三维双层系统在图2B中显示。在该系统中，将所研究的细胞置于所示的HuBiogelTM的两个三维半球形结构之间。细胞可以置于直接与HuBiogelTM接触或者通过滤器或其他支持方式支持。HuBiogelTM可以补加上文讨论的生长因子或其他刺激剂、肽和/或治疗化合物。HuBiogelTM浓度可以为所希望的，其取决于实验参数，但是对于所阐明的实施方案，HuBiogelTM双层系统含有5mg/ml HuBiogelTM。HuBiogelTM的物理性能使得在实验条件下，如在4到37℃的温度下在液体培养基中温育的条件下保持双层系统的形状。可以使用文中描述的旋转细胞培养系统。
三维微血管系统在图2C中阐明。在该系统中，微血管完全植入HuBiogelTM三维支持体中。微血管可以含有所要培养的细胞类型。HuBiogelTM浓度可以如所希望的，其取决于实验参数，但是对于所阐明的实施方案，HuBiogelTM具有含有5mg/ml HuBiogelTM的双层系统。HuBiogelTM的物理性能使得在实验条件，如在4到37℃的温度下在液体培养基中温育的条件下保持微血管系统的形状。HuBiogelTM可以补加上文讨论的生长因子或其他刺激剂、肽和/或治疗化合物。可以使用本文中描述的旋转细胞培养系统。
肿瘤侵染测定系统
用侵染室研究转化细胞的细胞侵染。滤器(在一个实施方案中为聚碳酸酯滤器，孔径8μm)在顶部和底部室之间的夹层。将所希望浓度(4-8mg/ml)的HuBiogelTM溶液在PBS和1M HEPES，pH 5.5(比例1∶1∶0.5)中稀释。将目的浓度(在该实施例中为75μg/滤器)的HuBiogelTM包被在滤器上并在室温下无菌通风橱中温育过夜。滤器在无血清培养基中再水化。观察到再水化后HuBiogelTM包被具有均匀厚度。将细胞(5×104个)置于所希望的培养基和BSA中的HuBiogelTM包被的滤器。如果希望，通过标准方案放射标记细胞。下面的室装入培养基，使用或不使用刺激肿瘤侵染的因子。允许细胞吸附24小时，之后除去顶部室中的培养基并用无BSA的培养基代替并在37℃继续温育48小时。
穿越HuBiogelTM包被的滤器的细胞通过置于包被滤器下的滤器收集并通过闪烁计数法计数(如果细胞经放射标记)。
72小时后HT-1080细胞显示出12-15％的侵染速度。HT-1080的侵染性比人包皮成纤维细胞或者人子宫内膜基质细胞(都是未转化的细胞)的侵染性大8-10倍，成纤维细胞或者人子宫内膜基质细胞的侵染性经测定为小于2％。观察到开始2小时后HT-1080细胞粘附到HuBiogelTM基质并且在24-48小时时向下面的滤器室的迁移十分明显。72小时时，侵染细胞显示出在滤器孔周围的细胞扩散，该扩散在HuBiogelTM边缘的界面以及滤器的下边。转化细胞类型的生长为如此方式使得离散事件可以在时间上分离用于研究和观察，该生长在本文中称作“受控的生长”或者“以受控方式生长”。
当从下面室收集迁移穿过HuBiogelTM基质的细胞并再次试验侵染性/转移潜力时，与亲本细胞相比观察到侵染性增加2-3倍。
通过使用含有如本文描述的生长刺激剂，如生长因子或肽，或者治疗化合物或其他试剂的HuBiogelTM组合物可以修饰该基本方案。此外，顶部和/或底部室中的培养基也可以含有此类试剂。因此该测定法可用于评估文中描述的任何实验设置下细胞的侵染性/转移潜力。此外，可以鉴定和研究调节该侵染性/转化潜力的治疗化合物。与用Matrigel进行的类似实验相比，HuBiogelTM的使用提供了模型系统，其中参与侵染和转移的事件在时间上分离和单独研究。
二维HuBiogelTM基质上人脐带血管内皮细胞的生长和分化
肿瘤发生——恶性期间新血管的形成关键取决于宿主细胞-基质相互作用。基质蛋白(胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白)和生长因子(FGF、VEGF)可以为肿瘤来源，它们作为强力血管生成刺激物和调节血管生成过程。该细胞血管生成形态级联包括：(i)内皮细胞迁移；(ii)增殖；和(iii)应答局部产生的血管生成因子分化形成新的毛细血管。活化内皮细胞的芽形成是血管生成的早期阶段，之后发生细胞分化形成管状毛细血管结构。
图3A显示了在没有加入血管生成刺激物的几种确定的生物基质环境(塑料、富含天然胶原蛋白I的生物培养基、HuBiogelTM和Matrigel)上培养人脐带血管内皮细胞(HUVEC，在一个实施方案中约1×104个)的结果。在每种生物基质环境上温育72小时后检查单层HUVEC培养物上的特定形态改变。塑料或者纯化的胶原蛋白I上培养的HUVEC生长很差(＜60％生存力)。图3A表明HuBiogelTM生物基质环境上涂布的细胞正常生长和增殖(＜15％出芽)。相比，培养在Matrigel生物基质环境上的细胞快速分化成管状结构。有趣的是，HUVEC在HuBiogelTM制剂上生长和保持(不分化)长达至少15天且具有高生存力(＞90％)。然而用Matrigel(甚至生长因子减少的Matrigel)观察到快速分化或者血管生成，在确定的、无生长因子的HuBiogelTM条件下内皮细胞不形成表示分化的管状结构。图3B显示向HuBiogelTM制剂加入纯化的血管生成因子的结果。以FGF(15ng/ml)富集HuBiogelTM引发了依赖时间和剂量的管状结构的快速形成(图3B)。通过横截面电子显微术显示明显的腔，证实了管状毛细血管形成。图3(c)显示了存在15ng/ml FGF时在HuBiogelTM上生长7天后小管和毛细管样结构的形成。从而，HuBiogelTM支持正常内皮细胞生长和增殖但是仅在确定的血管生成因子存在下促进细胞分化。结果，对于描绘血管生成过程的功能阶段，HuBiogelTM优于Matrigel和胶原蛋白I基质。
使用三维HuBiogelTM基质的血管生成和肿瘤发生的功能模型
需要开发模拟肿瘤的体内生物学的血管生成和肿瘤发生模型。当前，肿瘤研究多数利用单层细胞培养和动物来源的细胞基质系统。常用的Matrigel和胶原蛋白模型显示出如本文前面讨论的主要组分和生物学限制。此外，还没有确定的功能模型用于检查人中血管生成和肿瘤发生的重要阶段。使用HuBiogelTM的该系统已经由申请人开发。基于HuBiogelTM的生物测定法允许在体外分析肿瘤生长和进展的离散细胞和分子事件。该模型可用于多种应用，包括，但不限于，研究癌症生物学、药物发现和参与血管生成和肿瘤发生(包括侵染和转移潜力)的生理上相关途径的治疗干预。
HuBiogelTM是生物活性的人基质，其模拟细胞-细胞和细胞-基质相互作用的受控的微环境。通过使用HuBiogelTM生物基质的确定制剂和多细胞肿瘤球形体共培养系统，已经建立了血管生成和肿瘤发生的临床上相关的三维功能模型。该新功能生物测定法可用于研究肿瘤发生级联的早期和晚期，包括细胞增殖、侵染和血管生成事件，允许鉴定肿瘤生长/发育的特定正或负调节剂，并且同时允许分析从原发性肿瘤除去的靶细胞的恶性(侵染性、血管生成)行为。
HuBiogelTM制剂还可以用于三维细胞培养系统中。具有确定的基质和基底膜组分的三维培养系统的开发对于多种组织发育的生理相关的研究和机理分析是关键的。使用HuBiogelTM和定制的Lucite微孔板已经开发了三维微珠和圆盘型(具有10-200μm孔径的盘)生物基质制剂。
在三维培养系统的一个实例中，HUVEC生长在旋转细胞培养系统(Synthecon，Austin TX；此类系统的使用方法可以参见美国专利号4,998,632，5,026,650和5,115,034)中在标准条件下生长。旋转细胞培养系统提供了最小化机械应力，如液体剪切应力和表面张应力、细胞的增加的三维自由度和底部空间取向和培养过程期间组织组分在天然空间组织中组织组分保持的增加。HUVEC生长在HuBiogelTM包被的微珠(在一个实施方案中，珠子直径为10-200μm，并且微珠用5-25μl HuBiogelTM制剂包被)(图4A和B)上或者封装在所述的HuBiogelTM双层(5mg/ml HuBiogelTM)中(图4C和D)。内皮细胞培养36-48小时并检查细胞形态。图4A和4C显示了分别生长在微珠上和封装在双层系统中HUVEC的细胞聚集物的光学显微镜图像。HUVEC的组织学检查揭示了活细胞生长，通常为细胞组织和形成多细胞结构。图4B和4D显示了分别生长在微珠上和封装在双层中的细胞进行苏木精和伊红染色(横截面)后正确的内皮细胞形态和单层形成。
最近研究表明用基质成分共培养的固体分层细胞组成的球状体增强细胞组织。从而，富含胶原蛋白的HuBiogelTM环境提供了与提出的体外肿瘤发生研究适宜的确定的生物基质环境。在三维培养系统中使用HuBiogelTM将允许开发和优化三维细胞基质模型以评估肿瘤侵染和血管生成过程的关键阶段。当前可利用的共培养模型利用动物来源的生物基质和生物聚合物支架并且存在本文前面讨论的缺点。使用HuBiogelTM三维共培养系统提供了这样的系统，其中与基膜和基质成分的细胞-细胞相互作用和细胞-基质相互作用得到保留。结果，保存了多细胞组织，提供研究包括，但不限于肿瘤发生和血管生成的多种过程的生理模型。
图5显示了使用三维HuBiogelTM圆盘培养系统(在一个实施方案中，对于具有50μm孔径的圆盘使用5mg/ml HuBiogelTM)得到的生长因子诱导的HUVEC迁移和分化。内皮细胞在标准条件下培养。在第0天，将FGF(60ng/ml)加入培养基并继续温育。在所指定的时间，检查并记录细胞形态。可以看到的，FGF诱导一系列依赖时间的细胞活化、迁移和分化步骤。可以看到，从第0天到第5天，细胞参与活化和迁移步骤。在第5-7天时间之前没有细胞分化。第7天后，看到明显分化，如通过芽形成/毛细血管形成所指示。可以从图3A看到，不存在FGF时在7天期限后没有活化、迁移或者分化。活化迁移和分化步骤的这种时间上离散的时间选择使得利用该系统理想地用于研究与每个步骤有关的生化机理，以及分离所鉴定机理的潜在抑制剂。该时间依赖的、时间上分离的事件顺序与使用Matrigel所见相反，在Matrigel中在不存在所加的生长因子和/或生长刺激物时也快速发生分化事件。
如图6中所示，HuBiogelTM理想地适用于三维培养系统中。图6显示了从基本HuBiogelTM制剂(5mg/ml)释放bFGF(60ng/ml)的释放动力学。bFGF在整个实验过程中恒定释放。这些释放动力学可用于植入物研究、组织修复/再生、伤口愈合和其他体内应用。
我们还已经通过人肿瘤细胞分泌的血管生成因子(即复杂生物环境)研究了血管生成的调节。HUVEC生长在HuBiogelTM三维圆盘培养系统(在一个实施方案中，对具有50μm孔径的圆盘使用5mg/ml HuBiogelTM)，该系统存在来自人神经胶质瘤细胞系(U-87、U-105和U-251)的条件培养基，所述细胞系产生不同水平的血管生成因子VEGF，测试所述因子。图7A显示了每种细胞类型分泌到培养基的以ng/ml表示的VEGF浓度(通过ELISA测定)。在第1和第3天测量了HUVEC的血管生成活性(测定为细胞出芽的百分数)(图7B)。可以看到，发现血管生成活性与每种肿瘤细胞分泌的VEGF的水平正相关(图7A)。由于U-87肿瘤细胞分泌多数VEGF，暴露于U-87条件培养基的HUVEC显示出最强的血管生成。该结果表明由于HuBiogelTM中的正常宿主基质环境，使用HuBiogelTM作为“可控制的”培养模型，在二维和三维细胞培养系统中可以剖析肿瘤发生和血管生成的离散的细胞和分子事件。
用三维HuBiogelTM基质的神经发生的功能模型
医学领域中一直未满足的需求是修复和重建受损的组织。具体地，脊髓损伤(SCI)尤其具有破坏性，因为其破坏受侵害的个体的行动能力和自由。SCI每年影响约12,000美国人。SCI病理复杂并且包括对轴突、神经元和神经胶质损失和脱髓鞘的破坏。以前的策略是增强功能恢复，包括使用阻断剂克服局部抑制信号，通过植入神经元细胞、神经膜细胞和/或嗅细胞的轴突再生长，通过基因治疗递送神经营养因子，和移植胎儿组织和细胞-基质支架。
最近的证据证明存在能够修复成年人脑和脊髓的干细胞。例如，移植神经干细胞和骨髓基质细胞积极促进动物模型中神经元再生。这些研究表明可以利用损伤部位中有利的宿主-细胞微环境开发SCI的新的治疗方案。此外，神经祖细胞的发现和它们的随后分离和增殖，可能替换损失的神经元和提供轴突再生长的适宜的细胞桥。
此外，本领域已经认识到如果提供基质底物或者支架，那么植入的神经细胞或组织的生长和存活得到改善。结果，提供了用于神经组织再生和重建的多种合成和天然的生物可降解的材料，它们提供了细胞生长的结构支持和局部递送治疗剂的管道。用于此类目的的常用植入系统包括合成聚合物(如PLLA、PGA和水凝胶)的载体支架、甲基纤维素和藻酸盐基质。植入系统和载体支架还可以含有纯化的基质涂层或者自组装的肽支架(如血纤蛋白、胶原蛋白I和层粘连蛋白肽)。用神经膜细胞接种的藻酸盐水凝胶和纤连蛋白的载体支架公知支持神经元存活和再生。尽管这些生物聚合物基质系统诱导神经元生长和再生过程，但是它们表现出许多结构和生物学限制(如本文讨论)。
然而，尽管存在这些令人鼓舞的发展，实际的SCI治疗仍然保持难以捉摸，这主要是由于缺少用于体外研究和体内使用的确定的生物基质系统。本公开描述了申请人的新型生物活性人生物基质的用途，用于提供体内营养环境，其允许有效的组织修复、神经元再生和功能恢复。此外，当前不能得到使用人生物基质并且模拟脊髓损伤生物学和重建的适宜的载体支架模型或者基质基体。
尽管基于生物聚合物的植入系统促进神经元生长和组织再生过程，但是它们显示出几种结构和生物学限制。在表3中提供了HuBiogelTM基质与当前可利用的材料性能的比较。
由于HuBiogelTM生物基质的独特组成和配方，其已经导致允许其克服当前可利用的系统的缺点的物理和生物学性能。HuBiogelTM人生物基质组合物的优点包括，但不限于：i)HuBiogelTM制剂的物理性能允许直接将该基质注射到受伤部位；ii)HuBiogelTM基质的确定制剂提供了宿主-细胞环境，其是确定的并且可以通过加入目的化合物，如生长因子精确控制；和iii)该独特HuBiogelTM制剂模拟靶组织的生物学，允许刺激所植入的细胞。由于HuBiogelTM基质的新颖的物理和生物学性能，其极大地改善了SCI后神经组织再生和功能恢复。
尽管如果提供粘附的物理基质，那么多数细胞更好地生长和存活，但是包括可溶性生长因子进一步增强了组织生长和重塑期间细胞组织和分化。已经鉴定了影响神经元存活和生长的许多有效内源调节剂。例如，已经证明将FGF、VEGF、IGF(胰岛素生长因子)和EGF(表皮生长因子)递送到脊髓损伤部位可以产生促有丝分裂、血管生成和神经营养效果。脑衍生神经营养因子(BDNF)有效减小成年大鼠中脊髓对切后坏死区并且支持神经元存活。神经营养蛋白-3(NT-3)增强脊髓损伤后皮质脊髓束细胞的出芽。神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)当掺入到血纤蛋白胶时促进背根再生成脊髓。
一些近期研究使用生长因子的组合。具体地，EGF和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的组合显示出比单独任一种因子更好的功能恢复并且IGF和EGF比单独每一种更好地挽救运动神经元。尽管局部递送生长因子观察到轴突生长的刺激，但是基于聚合物的递送和生长因子的差的生物利用度的生理问题已经限制了它们在SCI研究中的治疗潜力。使用HuBiogelTM将允许恒定的生理学相关的生物活性基质，其具有有利的物理性能，如生长因子的可控的持续释放。
这种HuBiogelTM是有延展性的生物基质，其天然微环境和活性可以通过特定生长刺激化合物，如生长因子和生物肽的富集精确地控制。这些生长刺激化合物可以以可控的方式随时间释放，提供神经发生的更强刺激。为了检查HuBiogelTM生物基质维持神经细胞生长的能力，如文中描述的分离神经球并将其生长在三维HuBiogelTM包被的基质，如圆盘、微珠或者其他表面，存在或缺乏特定刺激化合物。
可以使用的HuBiogelTM三维结构已经在上文中描述并且也在本文的方法部分描述。在关于应用于神经发生的一个实施方案中，使用下面的三维HuBiogelTM系统。使用无菌有机玻璃二室系统(0.2-0.5ml)(其类似于我们的transwell室)制备多种HuBiogelTM三维支架结构(在一个实施方案中，HuBiogelTM以3-5mg/ml的浓度使用)。HuBiogelTM基质三维支架结构将适合多孔培养板。在SCI部位注射或植入研究前，将三维支架结构用合成培养基调节，该培养基富含不同浓度的目的生长因子(5-50ng/ml)或者其他生长刺激化合物并与靶细胞混合(1-2×106个/ml)以诱导受控的细胞生长和分化(即，2-3天共培养)。靶细胞可以包含在三维支架结构内或者可以培养在其顶部。此外，三维支架结构可以置于HuBiogelTM生物基质的顶层，该生物基质可以含有另外的生长刺激化合物。最后，HuBiogelTM三维支架结构可以含有多种生长刺激剂或者其他目的化合物。基于靶细胞(在一个实施方案中为神经球)的所希望的功能状态选择HuBiogelTM三维支架结构的多种实施方案。例如，如果希望未分化的靶细胞生长，那么在HuBiogelTM三维支架结构存在下不加入生长刺激化合物培养细胞。如果希望激活的、促有丝分裂细胞生长，那么可以在三维支架结构存在下加入生长刺激剂，或者其包括在确定的HuBiogelTM基质中的条件下培养靶细胞。该系统的图示代表在图2D中提供。可以使用富含FGF、NGF和EGF或者其他生长刺激化合物(包括当前已知的任意生长因子或者其他生长刺激剂)的HuBiogelTM产生组织特异的生物基质支架和确定的细胞环境。
在该实例中，如所描述的从成年大鼠脑分离神经球并培养在HuBiogelTM三维支架结构(三维支架结构中存在3mg/ml浓度的HuBiogelTM)上7天，该结构中不存在(图8A)或者存在(图8B)FGF和NGF(每种以10ng/ml存在并加入到细胞培养基中)。如图8A中所示，不存在生长刺激化合物时，HuBiogelTM三维支架结构允许神经球的积极细胞生长(无分化)。神经球生存力保持至少15天。如图8B中所示，存在生长刺激化合物时(在该实施例中为NGF和EGF(10ng/ml))，HuBiogelTM三维支架结构支持神经球的生长因子诱导的分化。有趣的是，生长刺激化合物，该实例中生长因子从HuBiogelTM生物基质的缓慢释放与长达15天的共培养的神经发生活性平行。在另一研究中，当神经球与HuBiogelTM接种的间充质干细胞共培养时观察到类似的神经元形成。
为了进一步检查HuBiogelTM支持神经发生、组织和功能恢复的能力，在成年大鼠的建立的SCI模型中评估HuBiogelTM三维支架构型。用于这些研究中的SCI模型系统在本文的方法章节中描述。简言之，使用Noble和Wrathall描述的落重装置在大鼠中诱导SCI。该方法在以可重复的和可控制的方式在大鼠中产生严重SCI。如所描述的诱导SCI后，Sprague-Dawley大鼠在SCI后两个月在损伤部位接收HuBiogelTM三维基质(15-20μl 3mg/ml HuBiogelTM)注射，所述基质含有1×106个神经祖细胞/衍生物(神经球)，有或没有生长刺激剂。在该实例中，将NGF和EGF加入到HuBiogelTM三维基质(每种25ng/ml)。也可以将其他生长刺激剂与HuBiogelTM三维基质联合使用；浓度范围通常为5到50ng/ml。HuBiogelTM处理的动物表现出改善的功能并且损伤部位表现出与未处理的动物显著不同。
与SCI后不接受HuBiogelTM治疗的对照动物相比，HuBiogelTM治疗的动物表现出优良的行为反应。如下文的方法部分详述的为对照动物(无HuBiogelTM治疗)和治疗的动物(接受HuBiogelTM治疗)确定BBS得分。在SCI诱导后2周和SCI诱导后16-21周为两组确定BBS得分(相应于在治疗组中开始HuBiogelTM治疗后8-13周)。SCI诱导后2周对照组的平均BBB预得分(6.8)不与SCI诱导后16-21周对照组的平均得分(6.5)显著不同。SCI诱导后2周治疗组的平均BBB预得分(6.5)(HuBiogelTM治疗前)类似于对照组的平均BBB预得分，表明SCI的程度是相等的。然而，SCI诱导后16-21周或者HuBiogelTM治疗后8-13周治疗组的平均BBS预得分(7.5)与SCI诱导后2周从对照组得到的平均BBS预得分(6.5)在统计学上显著不同(t检验，p＝0.012)。这表明HuBiogelTM治疗能够支持神经发生、组织修复和功能恢复。
还进行了来自对照组和治疗组动物的SCI组织的免疫原化学分析(图9A和9B)。图9A和9B显示了SCI部位处神经组织的纵向切割的Nissl染色的切片的低倍视图(10×目镜)，显示了未处理的对照组动物(图9A)和来自用含有神经球的HuBiogelTM治疗3个月后治疗组的动物(图9B)。具有严重SCI的未处理的大鼠的损伤部位显示出由白质薄边—白质抑制性神经胶质斑包围的一个或多个大囊腔。在来自治疗组的大鼠的组织切片中，载玻片显示出典型的神经细胞形态，其含有许多小腔与许多径列条。
还对来自用含有神经球的HuBiogelTM处理后3个月的治疗组动物的SCI组织进行了免疫组织化学研究(图10A-C)。图10A-C显示了SCI脊髓损伤部位处神经组织的显微照片(25×目镜)。在图10A中，使用抗胶原蛋白I抗体和罗丹明标记的二级抗体通过免疫组织化学揭示I型胶原蛋白(HuBiogelTM的主要成分)组织。图10C显示了植入细胞的分布(植入前，植入的细胞用Molecular Probes的CFDA-SE Cell Tracker试剂盒标记)。存在HuBiogelTM时植入后3个月大量细胞是存活的。在图10C中显示了融合的图像，其显示了SCI部位处经标记的植入细胞和胶原蛋白I生物基质结构的关系。可以看到，存活的植入细胞和胶原蛋白I基质共定位，表明HuBiogelTM基质能够支持SCI模型中神经球的生长。这表明HuBiogelTM生物基质将在其他体内应用中也会成功。在未处理的组织切片中观察到低水平背景染色。
HuBiogelTM支架和植入物的实际应用将其应用延伸到神经发生和本文中描述的其他应用。另外的用途包括治疗头和颈损伤、烧伤、关节和骨重建、整形手术和血管手术。通常，HuBiogelTM生物基质在修复医学领域中具有广泛应用，因为其能够保持和促进多种细胞类型的生长(有和没有活性促有丝分裂生长和分化)并且可以以多种形状和大小提供用于多种用途中。此外，HuBiogelTM可以定制配制以为目的细胞类型或系统提供生长刺激、分化信号或其他生理信号。
三维HuBiogelTM基质上的另外的细胞类型的生长
HuBiogelTM基质上也可以培养其他细胞类型，上面的细胞类型仅是自然中代表性细胞类型。这些其他细胞类型包括神经元、肝细胞、支持细胞等等。例如，图11A和B显示了含有HuBiogelTM的基质上培养的神经胶质瘤细胞。图11A显示了光学显微镜成像，而图11B显示了使用FITC显微术捕获的图像。图12A和B显示了在存在(图12B)和不存在15ng/mlNGF(图12A)时HuBiogelTM上培养的间叶干细胞(MSC)。可以看到，仅在存在NGF时发生神经元分化。图13显示了含有HuBiogelTM的基质上肝脏的生长。
方法
成年干细胞分离
干细胞和/或祖细胞是多能或者全能细胞类型，其能够自我更新、以未分化状态增殖，和产生特定组织的所有细胞类型(多能)和生物体的所有细胞类型(全能)。本领域中详细描述来自大鼠脑组织的神经祖细胞(神经球)的标准制备和分离方案。可以用多种方法分离适于用于本公开的神经元干细胞。在一个实施方案中，使用Perduzi博士描述的方案(Woerly，等人，J.Neurosci.Research，66，1187(2000)；Woerley等人，Neurosurg Rev.，23，59，(2000)；Peduzzi，等人，J.Neurotrauma 18：1146(2001))。简言之，将大鼠皮质切除并将切碎的组织用0.05％胰蛋白酶-0.5nM EDTA洗涤并温育10分钟。将细胞沉淀物重悬浮在含有10％FCS(胎牛血清)的DMEM中，通过74mm网孔过滤并在含有10％FCS的DMEM中37℃下5％CO2中过夜温育。如果希望，可以从分离的细胞富集干细胞(用FACS选择的Nestin-Ab阳性细胞)。细胞将以未分化的、激活的或者分化的神经球(使用文中描述的技术)在37℃下5％CO2中生长。对于未分化的、激活的或者分化的神经球，细胞将保持在确定的无血清培养基DMEM/F12(1∶1，含有15mM HEPES缓冲液、碳酸氢钠和L-谷氨酰胺)，该培养基含有胰岛素(20mg/ml)和有/没有特定生长因子(5-50ng/ml)，这取决于神经球的目的功能状态。如果希望植入后通过免疫组织化学研究细胞，处理即刻前，可以使用CFDA-SE Cell Tracker试剂盒(Molecular Probes)标记细胞。
干细胞的维持和增殖
干细胞祖细胞和它们的衍生物(神经球)单独在含有急性或亚急性SCI的大鼠中产生一定的功能改善，但是不能在慢性损伤的大鼠中产生功能改善。可能与抑制性神经胶质斑有关的囊腔的形成为细胞生长提供了不合适的环境。我们认为显示处受控的生物基质组织和刺激细胞生长的确定的3D支架(HuBiogelTM)可以避免这些问题并且允许重建神经元组织。为了试验该命题，我们制备了HuBiogelTM共培养物内的GF-激活的和/或分化的干细胞群(见上表)。这些3D细胞基质支架将在SCI移植研究前在合成培养基中保持1-2天。在一些研究中，如果需要，可以用含有EGF和/或视黄酸的培养基处理所培养的细胞以刺激分化。除了神经球模型，我们还可以利用富集的干细胞(Nestin-Ab选择的)用于进一步的验证研究。
手术步骤
0.25ml/kg盐酸氯胺酮(100mg/ml)肌内施用于Sprague-Dawley大鼠(200-250g)。用氟烷麻醉后，剃除动物的背部，将软膏应用于眼睛以防止干燥并挤压膀胱。然后将动物在手术期间置于用无菌毛巾覆盖的水循环加热毯上。以较低胸部水平暴露脊柱后，在T8进行椎板切除术。2.6mm的区域将暴露于脊髓的表面。硬脑膜将保持完整。在脊柱处理的T6和T10使用非创伤性Ellis夹子悬浮胸腔。所有动物都接受使用如Noble &Wrathall(Noble等人，Exp Neurol.，95，530(1987))描述的落重装置产生的严重的脊髓损伤。落重装置的impounder将小心降低到脊柱表面并且重物精确地下降7.5cm以产生严重SCI。将小片凝胶膜置于损伤部位上面。用可吸收缝线缝合肌肉组织并用伤口夹封闭皮肤。在手术期间，密切监视动物的呼吸速率和疼痛反应。如果注意到对疼痛的任何反应，则给予追加麻醉。在手术期间，还对每只动物做记录。
手术后，监视动物直到动物醒来(10分钟内)，然后在接下来的3-4小时内每30分钟监视动物。如果动物表现疼痛，那么施用盐酸叔丁啡(0.01ml/kg)。最初恢复期后，将动物返回到动物照料设施。手术后大鼠单独关在笼中。每天膀胱手工挤压至少4次直到损伤后7-14天内膀胱弹性恢复。
SCI研究设计和行为试验
如所描述的接受SCI的所有动物将在治疗前后使用BBB试验(Basso，等人，J.Neurotrauma 12，1(1995))每周检查行为。损伤1-2个月后，将动物随机分配以接受含有祖细胞制剂(加入或不加入生长刺激剂)的HuBiogelTM三维支架制剂或者作为未手术的损伤对照。
BBB运动试验/打分是仔细评估大鼠运动的一种方法，其为21点评定量表。在露天区评估动物4分钟。该试验是基于轻微脊髓损伤后所见到的正常恢复。其包括详细分析运动，包括特定关节的运动程度、运动期间躯干的稳定性、承重能力和运动期间脚爪放置。
还使用斜面试验(Rivlin等人，J.of Neurosurgery.47，577(1977))。将动物头朝上放在橡胶垫覆盖的可调节的斜面上。增加斜面角度直到动物不能在其位置保持5秒。正常大鼠可以在45°角度斜面上保持。
HuBiogelTM三维支架和干细胞移植
将神经祖细胞(如上分离)在HuBiogelTM三维支架制剂中共培养(2-5天)或者植入确定的生物基质(无生长刺激化合物或者富含生长刺激化合物)制剂以在SCI部位直接注射或者植入。如所描述的制备确定的HuBiogelTM三维支架制剂与神经祖细胞并在植入前在冰上保持。SCI后1-2个月，将大鼠用含有神经祖细胞(有或没有生长刺激剂(10只大鼠/组))的HuBiogelTM制剂处理。治疗组中的每只动物接受1×106个细胞。用CFDASE Cell Tracer试剂盒(Molecular Probes)标记神经祖细胞以鉴定所植入的细胞并帮助双标记实验。使用立体定位框稳定的小号注射器用于递送半凝胶HuBiogelTM三维支架制剂。
组织的组织学检查
将深度麻醉的大鼠用盐水然后用4％多聚甲醛通过心脏灌注。然后将损伤部位用30％蔗糖冷冻保护后在恒冷切片机上切片或者包埋在石蜡后在恒冷切片机上切片。使用标准方案用针对目的标记和蛋白质的标准抗体进行免疫组织化学。在一些情况中，使用双重荧光显微镜和组织化学分析显现干细胞衍生物。
统计学数据分析
通过常规公式按照我们以前的出版物，通过计算机软件程序(例如，Statview，Anova)计算算术平均值、标准差和斯氏t检验数据显著性。认为P值＞5％是统计学显著的。将比较功能效果、细胞活性、生物标记图、诱导率和剂量-时间依赖性数据组。
本公开中对文章、书本、专利、网站和其他出版物的所有参考认为并入本文作为参考。所附权利要求书仅用于要求保护国外优先权。
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表1 HuBiogelTM与Matrigel的比较
| HuBiogelTM1 | Matrigel2 | |
| 总蛋白质(mg/ml) | 5-8 | 10-15 |
| 层粘连蛋白 | 260+/-24 | 810 |
| 胶原蛋白I | 478+/-32 | n.s. |
| 胶原蛋白IV | 312+/-18 | 450 |
| 巢蛋白 | 164+/-20 | 120 |
| 腱生蛋白 | 68+/-6 | n.s. |
| 纤连蛋白 | 18+/-4 | n.s. |
| 蛋白聚糖 | 14+/-6 | 25 |
| EGF | 无 | 0.7ng |
| TGF-B | 无 | 3ng |
| BFGF | 无 | 0.2pg |
| PDGF | 无 | 12pg |
| VEGF | 无 | 16ng |
| 胶原蛋白酶 | 无 | 可检测到 |
1-指3-4小量制备物的浓度
2-来自Becton-Dickinson公司的数据
n.s.-未说明，但是假定接近0
表2多种生物基质系统的物理性能的比较
| 性能 | HuBiogelTM | Matrigel | Col./Fib.凝胶 |
| 来源/起源： | 人胎盘(羊膜) | 小鼠EHS肿瘤 | 大鼠或小鼠组织 |
| 物理形式： | 半凝胶，天然ECM | 液体/凝胶重构的ECM | 液体/凝胶纯化的ECM |
| 凝胶化/包衣： | 均匀，有弹性 | 不均匀或渗漏 | 不均匀或渗漏 |
| 处理： | 稳定凝胶(4℃到37℃) | 温度敏感 | 温度敏感 |
| ECM-环境： | 确定的，生理的 | 肿瘤发生的和血管生成的 | 人工的 |
| 主要ECM组分： | 胶原蛋白I和IV、层粘连蛋白、巢蛋白、腱生蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖 | 层粘连蛋白、胶原蛋白IV、巢蛋白、蛋白聚糖 | 天然或变性的ECM蛋白质 |
| 生长因子： | 无，不可检测 | TGF、EGF、PDGF、IGF、FGF | - |
| 蛋白酶： | 无，不可检测 | 胶原蛋白酶活性 | - |
| 功能优点： | 正常细胞生长，定向或受控的信号环境 | 不受控的细胞活化、分化 | 需要诱导或其他修饰 |
表3-多种生物支架和植入系统的性能比较
| HuBiogelTM系统 | 生物聚合物系统 | 纯化的基质系统 | |
| 来源/环境 | 人，生理的ECM组成 | 合成的移植物人工基质 | 动物来源的ECM蛋白质或肽 |
| 当前系统 | 新的、确定的生物基质系统 | PLA、PLGA、水凝胶、Neurogel | 血纤蛋白、胶原蛋白I、藻酸盐、层粘连蛋白 |
| 结构性能 | 半凝胶和可注射的制剂 | 固体植入物，不可注射 | 凝胶植入物，不可注射 |
| 生物学性能 | 受控的细胞生长、分化和组织 | 需要生长通道、差的生物相容性和不受控的环境 | 形成血栓或者疤痕形成效果、弱的细胞存活和组织 |
Claims (103)
1.生物基质组合物，其含有胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白、巢蛋白和腱生蛋白。
2.权利要求1的生物基质组合物，其还含有纤连蛋白和蛋白聚糖。
3.权利要求1的组合物，其中胶原蛋白I以大于胶原蛋白IV、层粘连蛋白、巢蛋白和腱生蛋白的浓度的浓度存在。
4.权利要求1的组合物，其中两种最丰富的组分是胶原蛋白I和胶原蛋白IV，胶原蛋白I以大于胶原蛋白IV、层粘连蛋白、巢蛋白和腱生蛋白的浓度的浓度存在。
5.权利要求2的组合物，其中胶原蛋白I以按重量计35-46％的范围存在，胶原蛋白IV以按重量计19-33％的范围存在，层粘连蛋白以按重量计16-21％的范围存在，巢蛋白以按重量计7.5-14.5％的范围存在，腱生蛋白以按重量计3.5-7.0％的范围存在，纤连蛋白以按重量计0-2.0％的范围存在，蛋白聚糖以按重量计0-1.3％的范围存在。
6.权利要求2的组合物，其中胶原蛋白I以按重量计36％的浓度存在，胶原蛋白IV以按重量计24％的浓度存在，层粘连蛋白以按重量计20％的浓度存在，巢蛋白以按重量计12.5％的浓度存在，腱生蛋白以按重量计5％的浓度存在，纤连蛋白以按重量计1％的浓度存在，蛋白聚糖以按重量计1.0％的浓度存在，
7.权利要求2的组合物，其中所述蛋白聚糖为硫酸肝素蛋白聚糖。
8.权利要求1的组合物，其中所述组合物是来源于人起始材料的天然组合物。
9.权利要求1的组合物，其中所述组合物是来源于人基膜组织的天然组合物。
10.权利要求1的组合物，其中所述组合物是来源于人胎盘羊膜的天然组合物。
11.权利要求1的组合物，其中所述组合物基本上不含内源性生长刺激剂和蛋白水解酶。
12.权利要求11的组合物，其中生长因子选自EGF、NGF、FGF、bFGF、VEGF、HGF、BDNF和GDNF。
13.权利要求11的组合物，其中蛋白水解酶是胶原蛋白酶。
14.权利要求1的组合物，其还含有生长刺激剂或生长抑制剂。
15.权利要求14的组合物，其中生长刺激剂是生长因子、细胞因子、肽因子或有机化合物。
16.权利要求15的组合物，其中生长因子选自EGF、PDGF、bFGF、FGF、VEGF、NGF、KGF、HGF、BDNF、亲神经素-3、亲神经素-4、CNF、GGF、GMF、GDNF和前述各项的组合。
17.权利要求1的组合物，其还包括加入在细胞外基质中发现的至少一种蛋白质。
18.权利要求17的组合物，其中所述蛋白质选自血纤蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白II、胶原蛋白III、胶原蛋白V、胶原蛋白VI、胶原蛋白VII、胶原蛋白VIII、骨桥蛋白和前述各项的组合。
19.权利要求1的组合物，其中所述组合物能够支持未转化的靶细胞类型的生长而不诱导分化。
20.权利要求19的组合物，其中靶细胞类型选自：上皮细胞、干细胞、内皮细胞、转基因细胞、肝细胞和神经细胞。
21.权利要求20的组合物，其中干细胞是全能或多能的。
22.权利要求1的组合物，其中所述组合物能够支持转化细胞类型的受控生长。
23.权利要求1的组合物，其中所述组合物可用于研究生理和病理过程。
24.权利要求23的组合物，其中生理过程选自：组织生长、组织发育、骨重塑、伤口愈合、血管生成、生殖和衰老。
25.权利要求23的组合物，其中病理过程选自：肿瘤发生、转移、血管生成、血管功能异常、关节炎和动脉粥样硬化。
26.权利要求1的组合物，其中所述组合物在4℃到37℃温度范围内形成凝胶。
27.生物基质组合物，其含有胶原蛋白I、胶原蛋白IV和层粘连蛋白。
28.权利要求27的组合物，其中胶原蛋白I以按重量计35-46％的范围存在，胶原蛋白IV以按重量计19-33％的范围存在，层粘连蛋白以按重量计16-21％的范围存在。
29.权利要求27的组合物，其还含有巢蛋白和腱生蛋白。
30.权利要求29的组合物，其中胶原蛋白I以按重量计35-46％的范围存在，胶原蛋白IV以按重量计19-33％的范围存在，层粘连蛋白以按重量计16-21％的范围存在，巢蛋白以按重量计7.5-14.5％的范围存在，腱生蛋白以按重量计3.5-7.0％的范围存在。
31.权利要求29的组合物，其还含有纤连蛋白和蛋白聚糖。
32.权利要求31的组合物，其中胶原蛋白I以按重量计35-46％的范围存在，胶原蛋白IV以按重量计19-33％的范围存在，层粘连蛋白以按重量计16-21％的范围存在，巢蛋白以按重量计7.5-14.5％的范围存在，腱生蛋白以按重量计3.5-7.0％的范围存在，纤连蛋白以按重量计0-2.0％的范围存在，蛋白聚糖以按重量计0-1.3％的范围存在。
33.生物基质组合物，其用于促进靶细胞的生长和分化，所述组合物通过一种方法从多个胎盘羊膜得到，所述方法包括以下顺序步骤：
a.通过清洁所述羊膜处理多个胎盘羊膜以除去不希望有的物质，将所述羊膜在PBS中冲洗至少1次，在含有氢氧化铵溶液的第一种缓冲液中冲洗所述羊膜，在PBS中冲洗所述羊膜至少一次并干燥所述羊膜；
b.在含有0.5M乙酸的冰冷的第二种缓冲液中通过将所述羊膜切成许多小块来溶解和均化所述羊膜，在含有0.5M乙酸的所述第二种缓冲液中均化所述羊膜以产生外观均匀的第一种均浆，升高第一种均浆的pH到pH2.0，和用蛋白水解酶消化第一种均浆并将蛋白水解酶与第一种均浆在4℃温育至少12小时；
c.离心所述第一种均浆以分离第一种上清液并调节所述第一种上清液到pH 7.8；
d.通过调节所述第一种均浆至50mM的Tris-碱浓度和4M盐浓度并将第一种上清液在4℃温育至少12小时提取第一种上清液；
e.离心所述第一种上清液以分离第一种沉淀并将所述第一种沉淀重悬浮在含有0.5M乙酸的第三种缓冲液中以产生第一种混悬液并调节所述第一种混悬液至pH 7.8；
f.通过调节所述第一种混悬液至50mM的Tris-碱浓度和4M盐浓度并在4℃温育第一种混悬液至少3小时提取第一种混悬液；
g.离心所述第一种混悬液以分离第二种沉淀并将所述第二种沉淀重悬浮在含有0.5M乙酸的透析缓冲液中产生第二种混悬液并在4℃温育所述第二种混悬液至少12小时；
h.将第二种混悬液置于透析袋中并在4℃对适宜的透析缓冲液透析所述第二种混悬液至少24小时，多次更换透析液，以产生透析物；和
i.从步骤(h)回收透析物并通过超滤浓缩透析物，所述最终透析物含有胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白、巢蛋白和腱生蛋白。
34.权利要求33的组合物，其还含有纤连蛋白和蛋白聚糖。
35.权利要求34的组合物，其中胶原蛋白I以按重量计35-46％的范围存在，胶原蛋白IV以按重量计19-33％的范围存在，层粘连蛋白以按重量计16-21％的范围存在，巢蛋白以按重量计7.5-14.5％的范围存在，腱生蛋白以按重量计3.5-7.0％的范围存在，纤连蛋白以按重量计0-2.0％的范围存在，蛋白聚糖以按重量计0-1.3％的范围存在。
36.权利要求33的组合物，其中所述羊膜在所述均化步骤前在-20℃冷冻。
37.权利要求33的组合物，其中蛋白水解酶为胃蛋白酶并且胃蛋白酶与所述第一种均浆的所述温育发生至少24小时。
38.权利要求33的组合物，其中步骤(d)重复至少一次。
39.权利要求33的组合物，其中透析缓冲液含有5mM乙酸、5mM KCl和135mMNaCl。
40.权利要求33的组合物，其中步骤(h)还包括消毒量的消毒试剂。
41.权利要求40的组合物，其中消毒试剂是氯仿。
42.权利要求33的组合物，其中第一种缓冲液是PBS并且所述氢氧化铵以至少0.1N的浓度存在。
43.权利要求33的组合物，其中第二种缓冲液和第三种缓冲液是PBS。
44.一种通过三维培养与所述生理过程细胞有关的靶细胞群体来分析目的生理过程的方法，所述方法包括：
a.在基质上铺上一层足够浓度的生物活性生物基质组合物以产生生物基质包被的盘，所述生物基质含有胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白、巢蛋白和腱生蛋白；
b.将所述生物基质包被的基质与缓冲细胞培养基中的一定量的靶细胞温育以产生靶细胞培养物；
c.在确定条件下培养所述靶细胞培养物；和
d.随时间观测与所述靶细胞培养物的所述生理过程有关的至少一种特征。
45.权利要求44的方法，其中生物基质还含有纤连蛋白和蛋白聚糖。
46.权利要求45的方法，其中胶原蛋白I以按重量计35-46％的范围存在，胶原蛋白IV以按重量计19-33％的范围存在，层粘连蛋白以按重量计16-21％的范围存在，巢蛋白以按重量计7.5-14.5％的范围存在，腱生蛋白以按重量计3.5-7.0％的范围存在，纤连蛋白以按重量计0-2.0％的范围存在，蛋白聚糖以按重量计0-1.3％的范围存在。
47.权利要求44的方法，其中生理过程是组织生长、组织发育、骨重塑、伤口愈合、血管生成、生殖或衰老。
48.权利要求44的方法，其中靶细胞是经转化的细胞或者未转化的细胞。
49.权利要求44的方法，其中靶细胞是上皮细胞、干细胞、内皮细胞、肝细胞、转基因细胞或者神经细胞。
50.权利要求49的方法，其中干细胞是全能或多能的。
51.权利要求44的方法，其中基质是微珠或圆盘。
52.权利要求51的方法，其中所述圆盘为多孔的并且所述生物基质组合物以3到5mg/ml的浓度存在。
53.权利要求51的方法，其中所述生物基质组合物以25到125μg/珠的浓度存在并且所述微珠在无重力条件下温育。
54.权利要求44的方法，其中缓冲的细胞培养基还含有生长刺激剂。
55.权利要求54的方法，其中生长刺激剂是生长因子、细胞因子、肽因子或者有机化合物。
56.权利要求44的方法，其中生物基质组合物还含有生长刺激剂。
57.权利要求56的方法，其中生长刺激剂是生长因子、细胞因子、肽因子或者有机化合物。
58.权利要求44的方法，其还包括加入能够正调节所述生理过程或负调节所述生理过程的化合物并确定所述化合物对所述内皮细胞群体显示的所述生理过程的至少一种特征的影响。
59.权利要求44的方法，其还包括加入转化的细胞类型与所述靶细胞共培养。
60.权利要求44的方法，其中所述方法用于研究病理过程。
61.权利要求60的方法，其中所述病理过程选自：肿瘤发生、转移、血管生成、血管功能异常、关节炎和动脉粥样硬化。
62.一种通过三维培养内皮细胞的群体来分析血管生成的方法，所述方法包括：
a.在基质上铺上一层足够浓度的生物活性生物基质组合物以产生生物基质包被的微珠，所述生物基质含有胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白、巢蛋白和腱生蛋白；
b.将所述生物基质包被的基质与在缓冲的细胞培养基中的一定量的内皮细胞温育以产生内皮细胞培养物；
c.在确定条件下培养所述内皮细胞培养物；和
d.随时间观察所述内皮细胞培养物的至少一种血管生成特征。
63.权利要求62的方法，其中生物基质还含有纤连蛋白和蛋白聚糖。
64.权利要求63的方法，其中胶原蛋白I以按重量计35-46％的范围存在，胶原蛋白IV以按重量计19-33％的范围存在，层粘连蛋白以按重量计16-21％的范围存在，巢蛋白以按重量计7.5-14.5％的范围存在，腱生蛋白以按重量计3.5-7.0％的范围存在，纤连蛋白以按重量计0-2.0％的范围存在，蛋白聚糖以按重量计0-1.3％的范围存在。
65.权利要求62的方法，其中所述内皮细胞群体的所述至少一种血管生成特征选自：细胞活化、芽形成、毛细血管形成、细胞迁移、细胞形态、细胞分化和前述各项的任意组合。
66.权利要求62的方法，其中基质是微珠或圆盘。
67.权利要求66的方法，其中所述圆盘为多孔的并且所述生物基质组合物以3到5mg/ml的浓度存在。
68.权利要求66的方法，其中所述生物基质组合物以25到125μg/珠微珠的浓度存在并且所述微珠在无重力条件下温育。
69.权利要求62的方法，其中内皮细胞群体含有许多人脐静脉内皮细胞。
70.权利要求62的方法，其中缓冲的细胞培养基还含有生长刺激剂。
71.权利要求70的方法，其中生长刺激剂是生长因子、细胞因子、肽因子或者有机化合物。
72.权利要求62的方法，其中生物基质还含有生长刺激剂。
73.权利要求72的方法，其中生长刺激剂是生长因子、细胞因子、肽因子或者有机化合物。
74.权利要求62的方法，其还包括加入能够促进或抑制血管生成的化合物和确定所述化合物对所述内皮细胞群体的至少一种血管生成特征的影响。
75.权利要求74的方法，其中所述内皮细胞群体的所述至少一种血管生成特征选自：细胞活化、芽形成、毛细血管形成、细胞迁移、细胞形态、细胞分化和前述各项的任意组合。
76.一种通过三维培养神经来源的细胞群体来分析神经发生的方法，所述方法包括：
a.在基质上铺上一层足够浓度的生物活性生物基质组合物以产生生物基质包被的圆盘，所述生物基质含有胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白、巢蛋白和腱生蛋白；
b.将所述生物基质包被的基质与缓冲的细胞培养基中的一定量的神经来源的细胞温育以产生神经细胞培养物；
c.在确定条件下培养所述神经细胞培养物；和
d.随时间观察所述神经细胞培养物的至少一种神经学特征。
77.权利要求76的方法，其中生物基质还含有纤连蛋白和蛋白聚糖。
78.权利要求77的方法，其中胶原蛋白I以按重量计35-46％的范围存在，胶原蛋白IV以按重量计19-33％的范围存在，层粘连蛋白以按重量计16-21％的范围存在，巢蛋白以按重量计7.5-14.5％的范围存在，腱生蛋白以按重量计3.5-7.0％的范围存在，纤连蛋白以按重量计0-2.0％的范围存在，蛋白聚糖以按重量计0-1.3％的范围存在。
79.权利要求76的方法，其中所述内皮细胞群体的至少一种神经学特征选自：轴突形成、神经突形成、细胞活化、细胞形态、细胞迁移、细胞分化和前述各项的任意组合。
80.权利要求76的方法，其中基质是微珠或圆盘。
81.权利要求80的方法，其中所述圆盘为多孔的并且所述生物基质组合物以3到5mg/ml的浓度存在。
82.权利要求80的方法，其中所述生物基质组合物以25到125μg/珠的浓度存在并且所述微珠在无重力条件下温育。
83.权利要求76的方法，其中所述神经来源的细胞选自：干细胞、神经球、神经元、和前述各项的任意组合。
84.权利要求76的方法，其中缓冲的细胞培养基还含有生长刺激剂。
85.权利要求84的方法，其中生长刺激剂是生长因子、细胞因子、肽因子或者有机化合物。
86.权利要求76的方法，其中生物基质还含有生长刺激剂。
87.权利要求86的方法，其中生长刺激剂是生长因子、细胞因子、肽因子或者有机化合物。
88.权利要求76的方法，其还包括加入能够促进或抑制神经发生的化合物和确定所述化合物对所述内皮细胞群体的至少一种神经学特征的影响。
89.权利要求88的方法，其中所述内皮细胞群体的至少一种血管生成特征选自：轴突形成、神经突形成、细胞活化、细胞形态、细胞迁移、细胞分化和前述各项的任意组合。
90.一种在需要该治疗的受试者中治疗脊髓损伤的方法，所述方法包括：
a.制备三维生物基质支架，所述生物基质支架含有神经前体并且所述生物基质支架含有胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白、巢蛋白和腱生蛋白；和
b.将所述生物基质支架导入需要此类治疗的受试者。
91.权利要求90的方法，其中生物基质还含有纤连蛋白和蛋白聚糖。
92.权利要求91的方法，其中胶原蛋白I以按重量计35-46％的范围存在，胶原蛋白IV以按重量计19-33％的范围存在，层粘连蛋白以按重量计16-21％的范围存在，巢蛋白以按重量计7.5-14.5％的范围存在，腱生蛋白以按重量计3.5-7.0％的范围存在，纤连蛋白以按重量计0-2.0％的范围存在，蛋白聚糖以按重量计0-1.3％的范围存在。
93.权利要求90的方法，其中受试者是哺乳动物。
94.权利要求90的方法，其中受试者是人。
95.权利要求90的方法，其中神经祖细胞是神经干细胞。
96.权利要求95的方法，其中所述干细胞是全能或多能的。
97.权利要求90的方法，其中所述神经祖细胞是神经球。
98.权利要求90的方法，其中所述生物基质支架以15到300μg的浓度存在。
99.权利要求90的方法，其中通过在所述脊髓损伤部位注射完成所述导入。
100.权利要求90的方法，其中生物基质支架还含有生物刺激剂。
101.权利要求100的方法，其中生长刺激剂是生长因子、细胞因子、肽因子或者有机化合物。
102.权利要求90的方法，其中生物基质支架还含有多种佐细胞类型。
103.权利要求102的方法，其中佐细胞类型是神经膜细胞或者间充质细胞。
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