JP2017095493A - 心臓治療のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生体由来の化合物を含有する、心臓の治療のための組成物の提供。【解決手段】心臓の組織に由来する消化され脱細胞化された細胞間マトリックスを含む組成物であって、該組成物は当該組成物の１ｍｇ当たり５〜２５μｇの範囲の濃度のグリコサミノグリカンを含み、該組成物は、消化され脱細胞化された細胞間マトリックスを含む、凍結乾燥されたパウダーから再構成されてなる、組成物。該組成物は、内因的な心筋細胞および心臓の細胞の生存を促進する、水、発育因子、合成ポリマー、天然由来のポリマー、セルロース、アルギナート、生物学的適合性の金属又は要素を含むことが好ましく、さらに少なくとも１つの消化酵素、特にペプシン、を含むことが好ましい。【選択図】図１

Description

〈相互参照〉
本出願は、２０１０年８月２４日出願の米国仮特許出願第６１／３７６，６５４号の利益を主張するものであり、それは、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。

心疾患は、アメリカ合衆国における死の主な原因である。心疾患の最も一般的な原因は、心筋梗塞（ＭＩ）であり、冠状動脈が閉塞される時に生じる。ＭＩ患者のおよそ３７％は、１年以内に心不全で死に、生き残る人々の３分の２が、完全には回復しない。ＭＩは、心筋細胞の死滅及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解、その後、瘢痕の堆積をもたらす。最終的に、心不全が発症し、心臓が膨張し、ポンプ作用の減少の原因となる。心臓に心臓の前駆体があまりないと、心臓組織は再生しない。心不全の現在の処置は、侵襲性の外科的処置に強く依存し、損傷を受けた心臓組織を治すことにほとんど効果が無い。

心筋梗塞（ＭＩ）後の心不全を防ぐための現在の努力は、壊死性心筋細胞を交換し、負の左心室（ＬＶ）の再構築を防ぎ、及び心臓組織を再生又は修復するため、細胞の移植に注目した。しかしながら、適切なマトリックスなしでは、インビトロでの心筋細胞の成長及びインビボでの生存は貧弱であった。心臓の修復、不整脈処置及び細胞培養のための心臓細胞外マトリックスのゲル又は溶液の形状を必要とする。

１つの態様において、組成物は、約３０〜４０ミクロンの孔径を備えた材料を含み、当該材料は、２５Ｇ以下の内径を備えたカテーテルを通して注入可能である。

幾つかの例において、材料は：心臓組織に由来する、脱細胞化された（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）細胞外マトリックス；及び水を含む。幾つかの例において、材料は、生理食塩水を更に含む。

幾つかの例において、組成物は、インビボの組織への送達後３０分以内にゲル形状となる。幾つかの例において、材料は、少なくとも１つの消化酵素を更に含む。幾つかの例において、少なくとも１つの消化酵素は、マトリックスを切断し、その結果、前記組成物は、２０、２５、３０、又は３５℃を超える温度でゲル状となる。幾つかの例において、少なくとも１つの消化酵素は、マトリックスを切断し、その結果、前記組成物は、３０、２０、１０、５、又は１分未満でゲル状となる。幾つかの例において、少なくとも１つの消化酵素はペプシンである。

材料は、心室の組織に由来し、更に材料は、左心室の組織に由来し得る。幾つかの例において、材料は、成長因子、合成ポリマー、天然由来のポリマー、又はその組み合わせをさらに含む。幾つかの例において、材料はセルロースを更に含む。幾つかの例において、材料はフィブリン糊を含む。

幾つかの例において、材料は、内因性の心筋細胞及び心臓の細胞の生存を促進する因子、内因性の心筋細胞及び心臓の細胞のアポトーシスを防ぐ因子、新血管新生を促進する因子、細胞浸潤を促進する因子、免疫反応を変更する因子、炎症反応を変更する因子、又はそれらの組み合わせを含む。

別の態様において、組成物は：心臓組織に由来する、脱細胞化された細胞外マトリックス；生体適合性の金属；及び水を含む。幾つかの例において、金属は金属繊維である。幾つかの例において、金属は金属粒子である。

また別の態様において、次のものを含む組成物が開示される：心臓組織に由来する、脱細胞化された細胞外マトリックス；アルギン酸塩；及び水。

１つの態様において、組成物は：心臓組織に由来する、脱細胞化された細胞外マトリックスを含み、ここで、当該マトリックスは、３００ｋＤａ未満、２００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満又は２０ｋＤａ未満の分子量の材料を含む。１つの態様において、組成物は：心臓組織に由来する、脱細胞化された細胞外マトリックスを含み、ここで、当該マトリックスは、３００ｋＤａ未満、２００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満又は２０ｋＤａ未満の分子量の非水性の材料を含む。１つの態様において、組成物は：心臓組織に由来する、脱細胞化された細胞外マトリックスを含み、ここで、当該マトリックスは、３００ｋＤａ、２００ｋＤａ、１００ｋＤａ、５０ｋＤａ又は２０ｋＤａの上限と、０．５ｋＤａ、１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、又は２０ｋＤａの下限の範囲における分子量の材料を含む。

別の態様において、組成物は：心臓組織に由来する、凍結乾燥され、脱細胞化された細胞外マトリックス；及びグリコサミノグリカンを含み、前記組成物は、凍結乾燥されたマトリックスの１ｍｇ当たり、少なくとも５、１０又は１５μｇの量のグリコサミノグリカンを含む。幾つかの例において、組成物は、凍結乾燥されたマトリックスの１ｍｇ当たり、約１５〜２５μｇの間の量でグリコサミノグリカンを含む。

また別の態様において、次のものを含む組織培養デバイスが開示される：心臓組織に由来する、脱細胞化された細胞外マトリックスを含む組成物；及び基質。基質は組織培養プレートであり得る。マトリックスは鋳型の形状をしていてもよい。幾つかの例において、マトリックスは基質の形状へと成型される。例示的な形状は、ステント又はカテーテルなどの生物医学的な製品のものでもよい。他の形状は、インビボにて心臓へと成型するように構成されたものを含み得る。基質はセルロースであり得る。幾つかの例において、セルロースは、被験体への移植のための形状であり得る。幾つかの例において、デバイスは、組織培養培地を更に含む。幾つかの例において、形状は、制限無しで、皿、バイアル、ペトリ皿、プレート、ウェル、及び多重プレートなどの組織培養形状である。

１つの態様において、組成物を製造する方法が本明細書に記載され、当該方法は：心臓の組織を脱細胞化する工程；脱細胞化された心臓の組織を凍結乾燥する工程；凍結乾燥された組織を消化する工程；消化された組織を凍結乾燥する工程；２５℃より低い、０℃より低い、−２０℃より低い、又は−７０℃より低い温度で６か月までの間、消化された組織を貯蔵する工程；及び凍結乾燥されて消化された組織を液体に組み合わせることにより組成物を製造する工程を含む。

別の態様において、心臓の組織を修復する方法は、被験体に、心臓の組織に由来する、脱細胞化された細胞外マトリックスを含む組成物を注入又は移植する工程を含む。幾つかの例において、前記組成物は、心筋梗塞の１か月後よりも早く、注入又は移植される。幾つかの例において、前記組成物は、心筋梗塞後の２週間以内に、注入又は移植される。幾つかの例において、前記組成物は、注入又は移植後の３か月以内に分解される。幾つかの例において、前記組成物は、注入又は移植後の１か月以内に分解される。幾つかの例において、前記組成物の注入又は移植は、先天的欠陥を修復する。幾つかの例において、前記組成物の注入又は移植は、前記被験体が被る心臓の組織への損傷を修復する。損傷は心筋梗塞であり得る。

〈引用による組み込み〉
本明細書において言及される全ての出版物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、又は特許出願が、引用により組み込まれるべきものと具体的及び個々に示されたかのように同じ程度まで、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。

本発明の多くの特徴は、添付の特許請求の範囲において特に明記される。本発明の特徴と利点とのより良い理解は、本発明の多くの原理を利用している、例示の実施形態と、添付図面とに明記される、後述する詳細な説明を参照することによって、得られるであろう。
図１は、本明細書の組成物を送達する例示の方法を示す。 図２は、本明細書に記載の方法及び組成物の様々な実施形態を示す。 図３は、ネズミの心臓への本明細書の組成物の注入からのデータを実証する。 図４は、本明細書に記載されるような組成物を製造する方法の、幾つかの例示の工程を示す。

最近研究された手順は、心筋を再生成及び修復する試みにおいて、左心室（ＬＶ）梗塞壁（ｉｎｆａｒｃｔ ｗａｌｌ）への正常細胞の注入を利用するが、研究は、注入された細胞の生存の乏しさを示した。細胞（成人及び胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び心筋細胞などの分化細胞を含む）は、１つ、又は少数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質で覆われた表面又はスキャフォールド上で典型的には培養された。しかし、インビボで、これらの細胞は非常に複雑な細胞外の環境に存在する；この本来の環境をより綿密に模倣するＥＣＭは、インビトロ及びインビボでの培養細胞生存及び機能／成熟に有益であり得る。

幾つかの天然由来の材料は、フィブリン、コラーゲン、アルギン、マトリゲル及びゼラチンを含む、心筋への注射のために現在調査されている。これらのいずれも、心臓細胞外マトリックスの本来の成分の著しい量を提供しない。不整脈処置について、現在の非切除形態（ｃｕｒｒｅｎｔ ｎｏｎ−ａｂｌａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）は、アルギン、フィブリン及び細胞の注入を含む。心筋細胞、幹細胞及び他の心臓の適切な細胞のためのインビトロでの細胞培養ための既存のマトリックスは、コラーゲン、ラミニン、ＳｕｒｅＣｏａｔ（Ｃｅｌｌｕｔｒｏｎ、コラーゲンとラミニンの混合物）、マトリゲル、及びゼラチンを含む。

末期の心不全のための新しい治療を発達させる必要がある。現在、一般的な処置は心臓移植、左心室（ＬＶ）補助装置、及び／又は現在の薬学的なレジメンである。これらの処置は、後心筋梗塞（ＭＩ）の負のＬＶ再構築を適切に予防しない。細胞の心筋形成術、又は細胞移植は、心筋梗塞と心不全の処置のために調査された；しかし、より最近の無細胞の生体材料は、細胞送達に関連した合併症のない、同様の機能的な利点を提供する際に大きな見込みを示した。ほとんどが具体的に心筋のために製造されていないため、心臓の治療のための生体材料の製品は、限定されていた。心筋への注入のため現在調査中である材料は、制限なしで、フィブリン、コラーゲン、アルギン、マトリゲル、及びゼラチンを含む。

幾つかの例において、本明細書に記載の組成物は、心臓のＥＣＭの成分をほぼすべて含む。幾つかの例において、組成物は、インビボで見出される同様の比率で、心臓のＥＣＭの成分をほぼすべて含む。ＥＣＭタンパク質、糖タンパク質、及びプロテオグリカンは、制限無しで：Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、及びＶＩ型のコラーゲン、エラスチン、フィブリノーゲン、ルミカン、パールカン、フィビュリン、及び／又はラミニンを含み得る。幾つかの例において、本明細書に記載の組成物は、インビボで見出される同様の比率で、心臓のＥＣＭのすべての成分の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％以上を含む。幾つかの場合において、ＥＣＭの模倣が使用される。例えば、人工的なＥＣＭは、自然に生じる又は人工的に生産されるＥＣＭの個々の成分を組み合わせることにより生産することができ、その結果、個々の成分の比率は、自然に生じるＥＣＭにおいて見出される比率を模倣する。

ＥＣＭは、間質のマトリックス及び基底膜材料を含む。幾つかの例において、ＥＣＭを含む組成物は、繊維状タンパク質及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の連動するメッシュから構成される。ＧＡＧは、炭水化物ポリマーであり、プロテオグリカンを形成するために細胞外マトリックスタンパク質に通常は付けられる。本明細書の組成物に含まれ得る例示のＥＣＭ繊維は、制限無しに、パールカン、アグリン、及び以下のものを含む全ての型のコラーゲンを含む：原繊維（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型）；ｆａｃｉｔ（ＩＸ型、ＸＩＩ型、ＸＩＶ型）；短鎖（ＶＩＩＩ型、Ｘ型）、基底膜（ＩＶ型）、及び他のもの（ＶＩ型、ＶＩＩ型、ＸＩＩＩ型）。

心臓の組織への注入のための心臓ＥＣＭを含む組成物が、本明細書に記載される。本明細書に記載の幾つかの例において、本来の心臓細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に由来した組成物の注入可能なゲル形状が、提供される。ゲルはまた、損傷した組織へ細胞を補充するために、又は薬物送達ビヒクルとして単独で使用することができる。ゲルはまた、損傷した組織を支援する又は力学的性質を変更するために使用することができる。本発明の別の使用は、不整脈を処置するための非破壊的な伝導ブロックとして、である。幾つかの例において、本明細書に記載されるような心臓の（ｈｅａｒｔ ｏｒ ｃａｒｄｉａｃ）ＥＣＭ材料は、心筋の組織に由来する。幾つかの例において組成物は心室の組織に由来する。幾つかの例において、組成物は左心室の組織に由来する。幾つかの例において、組成物は左心室及び右心室の組織に由来し得る。幾つかの例において、組成物は、非侵襲性に得られ得る、自己由来の心膜の組織に由来し得る。他の例において、本明細書に記載されるような心臓のＥＣＭ材料は、心膜の組織に由来する。

組成物は、心筋梗塞後に梗塞壁へと細胞を送達するために使用することができる。

幾つかの例において、本明細書の組成物は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）（例えば、梗塞によって損傷されたかもしれないＥＣＭ）を模倣する。組成物は、修復を促進する、複雑で、心筋特有のＥＣＭキューを提供することができる。本明細書の組成物は、カテーテル技術によって送達されるように構成される。

本来の心臓ＥＣＭは、従来の細胞コーティングより多くの成分を有し、従って、コラーゲンとラミニンと比較した時、ＥＣＭ成分のより複雑な混合物を実証することができる。幾つかの例において、本明細書のマトリックスとして調製された組成物は、本来の心臓ＥＣＭを模倣し得る。本明細書の調製された組成物は、心筋細胞の生存率又は成長率を増加させ得る。本明細書の調製された組成物は、心筋細胞培養などの細胞培養を播種するために使用され得る。幾つかの例において、本明細書の組成物上で播種された培養は、拍動し始める。幾つかの例において、本明細書の組成物上で播種された細胞は、コラーゲンのみの上で培養された細胞よりも長く拍動し続ける。例えば、本明細書の組成物上で播種された細胞は、１０、１４、２０、２５、３０、３５、４０、４５、６０、７０、８０又は１００日よりも長く拍動し続け得る。

幾つかの例において、本明細書の組成物上で成長する細胞は、アクチニン、コネキシン４３又はｐａｎ−カドヘリンの量を増加させた。本明細書の組成物上で成長する細胞は、コラーゲン上で成長する細胞と比較して、生存性を増加させ得る。また、本明細書の組成物上で成長する細胞は、コラーゲンに付着するコラーゲン上で成長する細胞と比較して、組成物への付着を増加させ得る。

幾つかの例において、本明細書で提供される組成物は、脱細胞化の後に、様々なＥＣＭタンパク質を含む。ＥＣＭタンパク質、糖タンパク質、及びプロテオグリカンは、限定されないが：Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、及びＶＩ型のコラーゲン、エラスチン、フィブリノーゲン、ルミカン、パールカン、フィビュリン又はラミニンを含む。したがって、脱細胞化された心筋のＥＣＭは、タンパク質とプロテオグリカンの複雑な組み合わせを含み得る。

幾つかの例において、本明細書の組成物は、注入可能な形状で提供される。脱細胞化されたマトリックス粉末は、液体中の製品を可溶性にし、他に組み合わせるために消化され得る。幾つかの例において、組み込まれた製品は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む。例えば、組成物は、凍結乾燥されたマトリックスの１ｍｇ当たり、少なくとも１、２、３、４、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０μｇ以上のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量を含み得る。

幾つかの例において、本明細書の組成物は、心筋の特定のＥＣＭ成分を含む。１つの例において、組成物は、本来の心筋のＥＣＭに由来した注入可能なヒドロゲルである。幾つかの例において、組成物は、任意の細胞の抗原を十分に含まない。幾つかの例において、組成物は、被験体の免疫学の反応を起こさない。幾つかの場合において、組成物は、免疫抑制療法の前、同時、又はその後に、被験体に送達される。幾つかの場合において、免疫抑制療法が使用されない。

幾つかの例において、本明細書に記載の組成物は、既製の方法で治療に提供されるように構成される。実施例において、本明細書の組成物は、乾燥固体形状にあり、棚の上又は部屋或いはユニットの中に貯蔵することができ、その後、処置の直前に、水、食塩水、又は別の液体で可溶性にされ得る。

後ＭＩ環境における修復を促進するためにカテーテルによって送達することができる、心筋の特定の材料を含む組成物が、本明細書に記載される。組成物は、心室のＥＣＭタンパク質、ペプチド及び多糖類の複雑な混合物を含む。多くの例において、組成物は、室温では液体であり、心筋への注入時に多孔性及び繊維状のスキャフォールドを形成する。組成物は、細胞流入を促進し、心筋梗塞へとインビボで送達された時、ＬＶ幾何学及び心臓機能を保存する。

幾つかの例において、本明細書に記載されるような組成物は、不完全又は欠如した心筋を再生或いは修復し、心臓機能を回復するのに役立つ。本明細書において、注射可能な細胞外マトリックス組成物は、哺乳動物又は合成光源に由来し得る。組成物は、細胞をさらに含み得る。本明細書の細胞外マトリックス組成物は、例えば、制限無しで：細胞、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、核酸（ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドなど）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、生物活性の分子のＤＮＡを発現するベクター、ポリマー又は他の材料、架橋剤、及び栄養素又は薬物分子のような他の添加剤、などの追加の成分をさらに含み得る。１つの追加の成分は、組成物又は様々なものに含まれ得る。幾つかの場合において、追加の成分は薬物である。幾つかの場合において、薬物は、細胞外マトリックス組成物の一部、又はＥＣＭの注入された溶液の成分として送達される；幾つかの場合において、薬物は、本明細書に記載の組成物の送達の前、同時、又はその後に送達される。薬物の例は、制限無しで：血圧又は高血圧の医薬（例えば、ＡＣＥ阻害剤、アルファアゴニスト、アルファ遮断薬、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、利尿薬、又はレニン遮断薬）；不整脈治療剤（例えば、ナトリウムチャンネル遮断薬、ベータ遮断薬、カリウムチャンネル遮断薬、カルシウムチャンネル遮断薬）；コレステロール降下薬（例えば、スタチン、コレスチラミン（ｃｈｌｏｅｓｔｙｒａｍｉｎｅ））；抗血小板薬又は抗凝血剤（例えば、アスピリン、アプロチニン、クロピドグレル、エノキサパリン、ヘパリン、ワルファリン、ダビガトラン（ｄａｂｉａｇａｔｒａｎ）エタキレート）；心拍数を制御する医薬（例えば、ジギタリス調合剤）；及び／又は血管拡張剤（例えば、ニトログリセリン）を含む。

１つの態様において、本明細書に記載されるような組成物は：心臓組織に由来する、脱細胞化された細胞外マトリックス；及び水を含む。幾つかの例において、組成物は、生理食塩水を更に含む。本明細書の組成物は、脱細胞化されたＥＣＭが混和する、心臓の組織及び液体の溶液に由来する、脱細胞化されたＥＣＭを含むことができる。

本明細書に記載の組成物は、インビボで多くの因子又はキューを含むことができ、前記因子又はキューは、限定されないが：ＶＥＧＦとｂＦＧＦなどの新血管新生を促進する因子；ＳＤＦなどの細胞浸潤を促進する因子；免疫反応を変更する因子；ＩＬ−１０などの炎症反応を変更する因子；内因性の心筋細胞及び心臓の細胞の生存を促進する因子；及び内因性の心筋細胞及び心臓の細胞のアポトーシスを防ぐ因子を含む。

幾つかの例において、送達の方法が記載され、前記組成物は、不完全又は欠如した心筋に接して置くことができ、心臓筋への収縮性、導電率、又は機能の、心筋の組織再生及び回復をもたらす。幾つかの例において、本明細書の組成物は、内因性の細胞を補充し、新しく補充された又は加えられた細胞の機能を調整することができ、また、組成物内の細胞移動及び増殖を可能にする。本明細書に記載されるように、幾つかの場合において、組成物は、心筋の組織の修復を支援することができる。幾つかの例において、前記修復は、心臓組織、及び／又は、条線、Ｔ−細管又は介在板などの心臓組織の特定の特徴の回復を含む。

本来の細胞外マトリックスのスキャフォールドを含む組成物は、組織移植の手順において哺乳動物における使用のため調製されている。ＥＣＭマトリックスの例は、制限無しで：米国特許第５，２７５，８２６号に記載のスキャフォールドなどの小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、米国特許第５，５５４，３８９号に記載のスキャフォールドなどの膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）、米国特許第６，０９９，５６７号に記載のスキャフォールドなどの胃粘膜下組織（ＳＳ）、及び米国特許第６，３７９，７１０号に記載のスキャフォールドなどの肝臓粘膜下組織（ＬＳ）又は肝臓基底膜（ＬＢＭ）を含む。加えて、哺乳動物由来のコラーゲンは、組織を含有するマトリックスから回収でき、マトリックス組成物を形成するために使用できる。細胞外のマトリックスはまた、細胞培養から合成することができる。心臓の脱細胞化は、全体の心臓を再成長させる目的で公表された（Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２００８）。ブタの膀胱のマトリックスの注入可能なゲル形状も記載された（Ｆｒｅｙｔｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２００８）。

本来の心臓の組織に直接由来する、脱細胞化された心臓の細胞外マトリックスを含む生体適合性の材料が本明細書に開示され、それは、脱細胞した心臓の細胞外マトリックスを含む生体適合性の材料を被験体に注入又は移植することにより、被験体（好ましくはヒト）における不完全な、病気にかかっている、損傷した、又は虚血性の組織又は器官を処置するために使用される。幾つかの例において、材料は、非ヒトの動物被験体に送達される。

図１は、本明細書の組成物を送達する例示の方法を示す。図１は、増加した再生としての前記結果において結果として生じる、再生の増加、梗塞の大きさの減少、ＬＶ再構築の減少、及び心臓機能の改善などの結果をもたらす、心筋梗塞から、本明細書に記載の組成物の導入までの事象の流れを提供する。

図２は、本明細書で提供される方法及び組成物の様々な実施形態を例証するフローダイアグラムである。幾つかの場合において、組織は、動物（２０１）から回収される。組織は、心臓組織（例えば心筋の組織）であるが、他のタイプの組織でもあり得る。組織（２０２）の各種処理工程は、本明細書に記載される。例えば、組織は、所望の液体中で、脱細胞化され、凍結乾燥され、消化され、可溶性にされ得るか、あるいは、本明細書に記載の工程の任意の組み合わせによって処理され得る。その結果、ＥＣＭベースのマトリックス製品が形成される；幾つかの実施形態において、ＥＣＭベースのマトリックス製品は、注入可能なものである。様々な実施形態において、ＥＣＭベースのマトリックス製品は、被験体における損傷した組織のＥＣＭ（例えば、心筋梗塞の患者の心筋のＥＣＭ）を模倣する。

幾つかの実施形態において、ＥＣＭベースのマトリックス製品は、特定の形状に成型され、その後、被験体に移植又は導入され得る。ＥＣＭベースのマトリックス製品は、被験体における所望の領域（例えば、心筋）への移植又は導入に適し得る、所望の形状（例えば、カテーテル、ステント、移植片、パッチなどの形状にある）の支持的マトリックスへと成型され得る。細胞（例えば、種子細胞）は、成型されたＥＣＭベースのマトリックス製品（２０４）上で、随意に植え付けられる又は培養され得る。パッチ、移植片、又はゲルの製品或いは同様の移植構築物は、本明細書に記載の方法（２０５）によって調製され得る。移植構築物は、被験体（２０６）における損傷を受けた領域へと移植又は導入され得る。幾つかの実施形態において、移植（又は導入）は、領域における細胞の増殖又は生存を促進する、又は他に細胞を有する損傷部位を占領する；しばしば、細胞又は組織の成長が、ＥＣＭベースのマトリックス上で直接生じる。

幾つかの実施形態は、ＥＣＭを模倣するＥＣＭベースのマトリックス製品、例えば、心筋のＥＣＭ（２０２）、及び損傷を受けた組織を修復する、又はその使用により組織の損傷を防ぐ方法に関する。多くの場合において、ＥＣＭベースのマトリックス製品は、損傷を受けた組織（例えば、損傷を受けた心筋、心筋梗塞（２０７））へと注入、移植、又は他に導入される。幾つかの場合において、ゲルは、注入前から注入時までに形成することが可能となる。幾つかの実施形態において、ゲル形成は、溶液が被験体（２０８）に入った後に生じる。ゲル形成は、温度の変化（例えば、体温への切換、又は約３７℃の温度への切換）に依存し得る。その後、内因性の細胞などの細胞は、ＥＣＭベースのマトリックス製品（２１１）を占領し得る。随意に、細胞は、ＥＣＭベースのマトリックス製品（２０９）の注入又は移植部位の上で、又はその近くで注入又は他に導入される。様々な実施形態において、ＥＣＭベースのマトリックス製品は、損傷を受けた組織のＥＣＭを模倣し、故に損傷部位（２１０）に対して細胞の増殖、分化又は帰巣を促進する。幾つかの場合において、その結果、損傷部位は、細胞（２１１）によって占められる（しばしば、細胞増殖は、ＥＣＭベースのマトリックス製品上で直接生じる）。様々な実施形態において、ＥＣＭベースのマトリックス製品は、細胞（２１２）を備えた損傷部位を占領するのに十分な時間の後に分解する。

本開示は、組織培養ウェル（２１３）上で組織培養を育てるための組成物及び方法を更に提供する。本明細書に記載の方法及び組成物を使用して生成されたＥＣＭベースのマトリックス製品は、組織培養ウェルをコーティングするために使用され得る。多種類の細胞は、前述のコーティングした培養ウェル上で培養され得る。例えば、心筋細胞は、ＥＣＭベースのマトリックス製品（２１５）でコーティングされたウェル上で培養され得る。幾つかの実施形態において、多能分化能性幹細胞、多能性幹細胞、又は心筋細胞前駆細胞は、コーティングしたウェル（２１４）上で培養される。その後、ＥＣＭベースのマトリックス製品は、培養細胞が特定の組織の細胞に分化するのを奨励又は許容し、例えば、コーティングは、心筋の組織に由来したＥＣＭベースのマトリックス製品を使用して生成され、細胞が心筋細胞（２１６）に分化するように奨励し得る。

また他の実施形態において、人為的に作成されたＥＣＭから生成されたＥＣＭベースのマトリックス製品が使用され得る。そのような場合、前記ＥＣＭベースのマトリックス製品は、組織培養ウェル（２１３）をコーティングするために、損傷した心筋（又は他の種類の損傷を受けた組織）（２０７）へ注入するために、又は所望の形状（２０３）の支持的マトリックスに成型するために使用され得る。

心筋梗塞の後、製薬などの現在の標準的治療及び医療用具（又は治療の不足）は、一般に効果がなく、結局、心筋細胞の死、負のＬＶ再構築、ＬＶ膨脹、及び心不全に繋がる。注入可能な組成物を送達する方法が本明細書に記載される。幾つかの例において、ＬＶへの本明細書の組成物の送達は、再生の増加、梗塞の大きさの減少、ＬＶ再構築の減少、又は心臓機能の改善を提供できる。溶液形状、ゲル形状、及び心臓マトリックスの吸収された形状は、インビボで見出される同様の割合での本来のＥＣＭの成分の多くを提供する。

幾つかの例において、脱細胞化された心臓の細胞外マトリックスは、ヒトの心臓、ブタの心臓、ウシの心臓、又は、限定されないがヤギの心臓、マウスの心臓、ラットの心臓、ウサギの心臓、及びニワトリの心臓を含む他の哺乳動物の心臓から成る群から選択された本来の心臓の組織に由来する。幾つかの例において、脱細胞化された心臓の細胞外マトリックスは、追加の制限無しで、本明細書に記載されるような組織からの胚性又は胎性の源からの本来の組織に由来する。

また別の実施形態において、脱細胞化された心臓の細胞外マトリックスを含む生体適合性の材料は、注入可能なゲル又は溶液の形状であり、心筋梗塞後の梗塞の壁に細胞を移植又は送達することにより、或いは損傷した心臓の組織へ細胞を補充することにより、心臓の修復に使用することができる。他の例において、脱細胞化された心臓のＥＣＭを含む、生体適合性の材料は、例えば、パッチ、乳濁液、強粘液、ゲル、フラグメント、粒子、微小ビーズ、又はナノビーズである。

本明細書に開示される別の態様において、組成物は、約３０〜４０ミクロンの孔径を有する材料を含み、当該材料は、心臓の組織に生体適合性であり、当該材料は、２５Ｇ以下の内径を有するカテーテルによって注入可能である。幾つかの例において、材料は、心臓の組織に由来した、脱細胞化された細胞外マトリックスを含む。幾つかの例において、組成物は、５０ミクロン未満の孔径を有する材料を含む。

幾つかの例において、本明細書の組成物は、移植された細胞の成熟を促進する。例えば、損傷した心筋に移植された未熟な細胞は、本明細書に記載されるようなマトリックス組成物の送達により、又はそのすぐ後に移植することができ、前記マトリックス組成物は、移植された細胞の成熟を促進する。幾つかの例において、組成物は、移植された細胞の分化を促進する。例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、マトリックス組成物の送達により、又はそのすぐ後に移植できる；マトリックス組成物は、ｉＰＳ細胞の分化を促進するために作用する。幾つかの場合において、インビボの因子はまた、分化を促進するためにｉＰＳ細胞に、独立して又はマトリックス組成物と共に作用し得る。別の実施例において、胚性幹（ＥＳ）細胞又は成体幹細胞は、マトリックス組成物の送達と共に、又はその後に移植される；ＥＳ細胞又は成体幹細胞は、その後、より多くの成熟した細胞型へと分化する。幾つかの場合において、インビボの因子はまた、分化を促進するためにＥＳ細胞又は成体幹細胞に、独立して又はマトリックス組成物と共に作用し得る。

また別の実施例において、組成物は、移植された細胞の分化転換を促進し得る。例えば、非心臓の細胞は、（心臓の表現型への細胞の分化転換を促進する）組成物と共に被験体に送達され得る。幾つかの実施例において、本明細書の組成物は、インビボの細胞の成熟を促進及び／又はその分化を促進する。別の実施例において、本明細書の組成物は、インビトロの培養細胞の成熟を促進及び／又はその分化を促進する。

幾つかの例において、本明細書の組成物は、本明細書に記載されるようなマトリックス材料において多糖に結合される成長因子を更に含む。

幾つかの例において、生体適合性の材料（例えば、被験体の免疫反応を誘発しない材料）は、移植前及び心臓の修復の間、研究所、又は臨床設定において、心筋細胞又は他の心臓の関連する細胞を培養するために、開示される。脱細胞化された心臓の細胞外マトリックスにより、組織培養プレート又はウェルの表面を製造及びコーティングする方法も、提供される。また、生体適合性の材料は、患者への移植に適している。

本発明の脱細胞化された心臓の細胞外マトリックスを含む生体適合性の材料を生産する方法が、本明細書で更に提供される。前記方法は、以下の工程を含む：（ａ）被験体から、細胞外マトリックス及び非細胞外マトリックス成分を有する心臓の組織サンプルを得る工程；及び（ｂ）脱細胞化された心臓の細胞外マトリックスを得るために非細胞外マトリックス成分を除去するため、心臓の組織サンプルを処理する工程。特定の実施形態において、心臓の組織サンプルは、非霊長動物（例えば、雌牛、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長動物（例えば、サルとヒト）のような哺乳動物、又は鳥類（ａｖｉａｎ ｓｏｕｒｃｅ）（例えば、ニワトリ、アヒルなど）から分離される。心臓の組織サンプルのための脱細胞手順は、１つ以上の物理的、化学的及び／又は生物学的な技術を使用して行われる。

ヒトの治療に関して、心臓細胞外マトリックス材料のための多くの潜在的な源がある：ヒトの心臓（自己由来、同種異型、又は死体のものを含む）、ブタの心臓、ウシの心臓、ヤギの心臓、マウスの心臓、ラットの心臓、ウサギの心臓、ニワトリの心臓、及び他の動物由来のもの。幾つかの例において、ＥＣＭは、多数の動物（例えば、多数のブタ）又は多数の動物種（例えば、ブタに加え、ウサギなどの異なる種）から供給される。合計の心臓移植と異なり、１つのドナー心臓が、多くの人々を処置するために使用することができる。非ヒト動物は、ヒトドナーの必要のない、心臓細胞外マトリックス由来のものである。調査試薬として、非ヒト動物由来のもの（ブタの心臓、ウシの心臓、ヤギの心臓、マウスの心臓、ラットの心臓、ウサギの心臓、ニワトリの心臓など）は、利用することができる。心臓は、最初に脱細胞化され、細胞外マトリックス及び／又は細胞外タンパク質及び／又は多糖のみを残す。

１つの実施形態において、その後、心臓細胞外マトリックスは、凍結乾燥され、すりつぶされ、低いｐＨのペプシン、又はマトリックスメタロプロテイナーゼなどの酵素を分解する他のマトリックスにより消化された。幾つかの例において、組成物は、ペプシンを更に含む。幾つかの例において、組成物は、消化酵素（例えば、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、又はその組み合わせ）を更に含む。幾つかの例において、組成物は、本明細書に記載されるような複数の消化酵素を更に含む。本明細書の組成物のための消化酵素又は酵素は、酵素（複数可）によって切断されるペプチド結合に基づいて選択することができる。

幾つかの例において、組成物は、体温（例えば３７℃以上）でゲル化するように構成される。幾つかの例において、組成物は、２０、２５、３０、又は３５℃を超える温度でゲル化するように構成される。幾つかの例において、本明細書に記載されるような組成物を製造する方法は、組成物のゲル化の所望の温度に基づいて、酵素を選択する工程を含む。幾つかの例において、本明細書に記載されるような組成物を製造する方法は、インビボで送達された時の組成物のゲル化の所望の時間に基づいて、酵素を選択する工程を含む。幾つかの例において、組成物は、インビボでの組織への送達後、３０、２０、１０、５、１分、又はそれより少ない時間以内でゲル形状になる。幾つかの例において、１つの心臓は、本明細書の方法において脱細胞化される。幾つかの例において、２つ以上の心臓は、本明細書の方法において脱細胞化される。幾つかの例において、心臓組織は、多数の動物（例えば、多数のブタ）又は、多数の動物種（例えば、ブタに加えて、ウサギなどの異なる種）から得られる。１つの態様において、組成物を製造する方法は本明細書で提供され、当該方法は：心臓の組織を脱細胞化する工程；脱細胞化された心臓の組織を凍結乾燥する工程；最初の液体中の酵素により、凍結乾燥された組織を消化する工程；消化した組織を凍結乾燥する工程；及び、凍結乾燥され消化された組織を第２の液体に組み合わせることにより組成物を製造する工程を含む。幾つかの場合において、液体中での組み込みは、可溶性にする工程を含む。幾つかの場合において、方法は、全てではないが、前述の工程の多くを含む。例えば、方法は、心臓の組織を脱細胞化する工程、第１の液体中の酵素により、組織を消化する工程、及び消化した組織を第２の液体に組み合わせる工程を含み得る。幾つかの場合において、方法は、心臓の組織を脱細胞化する工程を含まない。幾つかの場合において、方法は、消化された組織を第２の液体に組み合わせる工程を含まない。

幾つかの例において、脱細胞化は、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）溶液の使用により実行される。幾つかの例において、酵素は、消化酵素（例えば、ペプシン）である。幾つかの例において、第１の液体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、食塩水、又は他の緩衝された溶液である。幾つかの例において、第２の液体は、水（例えば、滅菌水、及び／又は脱イオン水）であり、又は第２の液体は、食塩水でもよい。

別の態様において、組成物は：心臓の組織に由来した、凍結乾燥され、脱細胞化された細胞外マトリックスを含む。凍結乾燥されたマトリックスは、水において混和することができ、それによって、溶液を形成する。幾つかの例において、溶液は、２５、２０、１５、１０、５、又は０℃未満の温度の液体溶液である。幾つかの例において、溶液は、２０、３０、３５、又は３７℃を超える温度のゲルである。幾つかの例において、溶液は、水が組成物と混合され、組成物がインビボで送達される時、液体である。

１つの例において、病理学的に評価された時、本明細書の組成物は、核、ＤＮＡ、ＲＮＡの不足を実証する。別の例において、本明細書の組成物は、約２０ｋＤａより下で結合する分子量を有する心臓の細胞外の材料の小片を含む。幾つかの例において、本明細書の組成物は、凍結乾燥された組成物の１ｍｇ当たり少なくとも５、１０又は１５μｇのグリコサミノグリカン含有量を含む。別の例において、本明細書の組成物は、凍結乾燥された組成物の１ｍｇ当たり約１５〜２５μｇの間のグリコサミノグリカン含有量を含む。

幾つかの例において、本明細書の方法は、組成物を凍結乾燥する工程、及び、２５℃より低い、０℃より低い、−２０℃より低い、又は７０℃より低い温度で６か月までの間組成物を貯蔵する工程をさらに含む。

本明細書に記載される組成物は、被験体に直接注入され、それにより、治療材料として使用できる。例えば、心臓細胞外マトリックスを含む溶液は、中和され、ＰＢＳ／食塩水又は他のバッファーを使用して、適切な濃度までもたらすことができる。その後、心臓細胞外マトリックスを含む溶液は、小さな直径の針を通して心筋に注入することができる。体温では、その後、前記溶液はゲルを形成し得る。細胞又は薬物／タンパク質も、ゲルの内部で、又はゲルにより送達することができる。例えば、未分化の細胞は、ゲルの内部で、又はゲルにより送達することができ、前記細胞は、後にインビボで分化され得る。他の実施例において、部分的又は最終的に分化された細胞は、ゲルの内部で、又はゲルにより送達される。

本明細書で提供される組成物、特にゲル試薬は、組織培養の適用に使用することができる。心臓細胞外マトリックスを含む溶液は、中和され、ＰＢＳ／食塩水を使用して、適切な濃度までもたらされ得る。その後、前記溶液は、組織培養プレート／ウェルに入れることができる。一旦、３７℃以上の室温でインキュベータに入れると、溶液は、細胞培養に使用することができるゲルを形成する。

本明細書の別の態様において、組成物は、心臓の組織に由来した脱細胞化された細胞外マトリックスを含むように提供され、組成物は、鋳型の形状である。実施例において、組成物はインビトロの試薬である。

１つの態様において、組織培養デバイスは、心臓の組織に由来する脱細胞化された細胞外マトリックスを含む組成物を含む。幾つかの例において、デバイスは、組織培養プレートである。幾つかの例において、デバイスのマトリックスは、鋳型の形状である。幾つかの例において、デバイスは、組織培養培地を更に含む。

幾つかの例において、本明細書の方法は、予め定められた形状又は鋳型へと組成物をゲル化する工程をさらに含む。例えば、組成物は、組織培養皿又はプレート内でゲル化することができ、又は組成物は、鋳型の特定の形状に適合するためにゲル化することができる。例示の形状は、ステント又はカテーテルなどの生物医学的な製品のものでもよい。他の形状は、インビボにて心臓へと成型するように構成されたものを含み得る。基質はセルロースであり得る。幾つかの例において、セルロースは、被験体への移植のための形状であり得る。幾つかの例において、デバイスは、組織培養培地を更に含む。幾つかの例において、形状は、制限無しで、皿、バイアル、ペトリ皿、プレート、ウェル、及び多重プレートなどの組織培養形状である。

別の例において、組成物は、組成物でコーティングされたデバイスを作成するための形状又は製品の上でゲル化される。別の例において、組成物は、形状又は鋳型へゲル化され、次に凍結乾燥される。別の例において、この凍結乾燥された形状は、インビボで移植することができ、又はインビトロのスキャフォールドとして使用することができ、或いは、使用前に再水和することができる。

１つの例において、被験体の心臓の修復のための治療方法は、本発明の生体適合性の材料の一部又はその全体において、注入又は移植する工程を含む。本発明は、生体適合性の材料を注入又は移植する工程を含む、被験体の不整脈、又は、他の不完全な、病気にかかった、損傷された、虚血の組織又は器官を処置する治療方法を更に提供する。

本明細書の組成物は、心臓の組織、及び別の成分（複数可）に由来する、脱細胞化されたＥＣＭを含むことができる。幾つかの例において、合計の組成物におけるＥＣＭの量は、組成物の９０重量％又は９５重要％より大きい。幾つかの実施形態において、合計の組成物におけるＥＣＭは、組成物の１重量％、５重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％又は８０重量％より大きい。

本明細書において、脱細胞化された細胞外のマトリックスは、心筋の組織再生に関する生物活性の多くが保存されるように調製される。本明細書の組成物の例示的な生物活性は、制限無しで：細胞粘着の制御又は開始、細胞移動、細胞分化、細胞成熟、細胞組織化、細胞増殖、細胞死（アポトーシス）、血管新生の刺激、タンパク質分解の活性、酵素活性、細胞運動性、タンパク質及び細胞の調節、転写の事象の活性化、翻訳の事象に対する供給、幾つかの生物活性の阻害、例えば、凝結の阻害、幹細胞の引力、走化性、及びＭＭＰ又は他の酵素活性を含む。

本明細書において、組成物は、ほぼ脱細胞化されるマトリックスを含む。幾つかの例において、脱細胞化されたマトリックスは、本来の細胞を含まない。幾つかの例において、脱細胞化されたマトリックスは、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％又は１０重量％未満の細胞の成分を含む。

幾つかの例において、本明細書の組成物は、心臓の組織に由来する、分留され、脱細胞化された細胞外マトリックスを含むことができる。例えば、本明細書の組成物は、３００ｋＤａ未満、２００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、又は２０ｋＤａ未満の分子量を備えたマトリックス材料を含む。別の実施例に関して、本明細書の組成物は、３００ｋＤａ未満、２００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、又は２０ｋＤａ未満の分子量を備えた非水性のマトリックス材料を含む。また別の実施例に関して、本明細書の組成物は、３００ｋＤａ、２００ｋＤａ、１００ｋＤａ、５０ｋＤａ又は２０ｋＤａの上限、及び０．５ｋＤａ、１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ又は２０ｋＤａの下限を備えた範囲における分子量を備えたマトリックス材料を含む。

幾つかの例において、本明細書の組成物は、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｅ）、ホルムアルデヒド、トランスグルタミナーゼ、又はビス−アミンの反応的な分子などの、架橋剤を含む。

幾つかの例において、本明細書の組成物は、ペプチド、タンパク質、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、生存を促進する添加剤、プロテオグリカン、又はグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｌｙｃａｎｓ）を含む。幾つかの例において、組成物はまた、免疫抑制剤を含む。他の場合において、組成物は、免疫抑制剤を含まない。

本明細書に記載されるように、組成物は、脱細胞化されたＥＣＭを含むことができ、異なる組織は、ＥＣＭ、或いは、合成の又は自然に生じるポリマーを脱細胞化した。本明細書の組成物の例示的なポリマーは、限定されないが：ポリエチレンテレフタレートファイバー（Ｄａｃｒｏｎ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、グルタルアルデヒドにより架橋結合した心膜、及びポリラクタート（ｐｏｌｙｌａｃｔａｔｅ）（ＰＬＡ）、ポリグリコール（ＰＧＡ）、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｌｅｎｅ）、ニチノール、並びに動物及び非動物由来のコラーゲン（植物又は合成のコラーゲンなど）を含む。幾つかの例において、組成物のポリマーは、生体適合性並びに生物分解性、及び／又は生物吸収性である。例示的な生物分解性又は生物吸収性のポリマーは、限定されないが：ポリ乳酸、ポリ塩化ビニル−グリコリド、ポリカプロ（ｐｏｌｙｃａｒｐｒｏ）ラクトン、ポリジオキサン、及びそれらのランダム及びブロックコポリマーを含む。生物分解性及び／又は生物吸収性のポリマーは、グリコリド、ラクチド、ジオキサノネ、カプロラクトン、トリメチレンカーボネート、エチレングリコール及びリジンから成る群から選ばれたモノマーを包含することができる。材料は、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、又はモノマーの混合物、ホモポリマー、コポリマー、及び／又はこれらのモノマーを包含するヘテロポリマーであり得る。生物分解性及び／又は生物吸収性のポリマーは、ポリグリコリド（ＰＧＡ）及びそのランダムコポリマーポリ（グリコリド−ｃｏ−ラクチド−）（ＰＧＡ−ｃｏ−ＰＬＡ）などの、生物吸収性及び生物分解性の線形の脂肪族のポリエステルを包含することができる。適切な生体適合性のポリマーの他の例は、メタクリル酸エチル、及びポリビニルピロリドン並びにポリアクリルアミドなどのヒドロゲルを含む、ポリヒドロキシアルキルメタクリレートである。他の適切な生物吸収性材料は、これらの材料の、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、キチン、キトサン、フィブリン、ヒアルロン酸、デキストラン、ポリアミノ酸、ポリリシン及びコポリマーを含むバイオポリマーである。上記の実施例の任意の組み合わせ、コポリマー、ポリマー又はその混合物は、本発明に応じた使用のために熟慮される。前記生物吸収性材料は、既知の方法によって調製され得る。

幾つかの例において、本明細書の組成物は、天然由来のポリマー及びＥＣＭを含む。天然由来のポリマーの例は、限定されないが、アルギン、フィブリン糊、及びヒアルロン酸などの多糖を含む。

１つの例において、本明細書の組成物は、心臓の組織に由来する、脱細胞化された細胞外マトリックスを含み、生体適合性の金属をさらに含む。生体適合性の金属の例は、限定されないが、チタンを含む。１つの実施例において、本明細書の組成物は、生体適合性の金属の小さな直径の繊維又は小さな直径の粒子を含む。組成物内の金属は、材料の構造に対する支持を提供することができる。加えて、脱細胞化されたＥＣＭがインビボで分解する場合、組成物の金属部分は、周囲の組織に支持構造物を提供するために後に残すことができる。

幾つかの例において、本明細書の組成物は、セルロースを更に含む。セルロースは、インビボ及びインビトロの両方で、材料を所望の形状へと形成するために利用できる。例えば、組織培養試薬として使用された時、本明細書に記載されるような組成物は、セルロースを含み、特定の形状へと固化することができる。別の態様において、デバイスが提供され、セルロースは、本明細書に記載されるような組成物が堆積される基質を提供する。その後、前記デバイスは、組織修復のための特定の形状で送達され得る。

市販のＥＣＭ製剤も、本明細書に記載の方法、デバイス、及び組成物において組み合わせることができる。１つの実施形態において、ＥＣＭは、小腸粘膜下組織又はＳＩＳに由来する。市販の製剤は、限定されないが、Ｓｕｒｇｉｓｉｓ（商標）、Ｓｕｒｇｉｓｉｓ−ＥＳ（商標）、Ｓｔｒａｔａｓｉｓ（商標）、及びＳｔｒａｔａｓｉｓ−ＥＳ（商標）（Ｃｏｏｋ Ｕｒｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．； Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄ．）並びにＧｒａｆｔＰａｔｃｈ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｃ．； Ｃａｎｔｏｎ Ｍａｓｓ．）を含む。別の実施形態において、ＥＣＭは真皮に由来する。市販の製剤は、限定されないが、Ｐｅｌｖｉｃｏｌ（商標）（Ｐｅｒｍａｃｏｌ＊ ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅ； Ｂａｒｄ， Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ， Ｇａ．として販売）、Ｒｅｐｌｉｆｏｒｍ（商標）（Ｍｉｃｒｏｖａｓｉｖｅ； Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓ．）及びＡｌｌｏｄｅｒｍ（商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌ； Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， Ｎ． Ｊ．）を含む。

組織に由来する、脱細胞化されたＥＣＭを含む注入可能な組成物の調製の方法が、本明細書に記載される。関連する組成物、デバイス及び使用方法も記載される。組成物の粘性は、約３７℃に近い、生理学的な温度を含む室温上で暖められた時、増加する場合がある。１つの制限しない実施形態によると、ＥＣＭ由来の組成物は、室温及び３５℃未満の他の温度で注入可能な溶液である。別の制限しない実施形態において、ゲルは、３７℃の体温で、又は体温に近い温度で注入することができるが、温度が上昇するとより急速にゲル化する。幾つかの例において、ゲルは、３７℃の生理学的な温度で、５分未満で形成する。幾つかの例において、ゲルは、３７℃の生理学的な温度で、１０分未満で形成する。幾つかの例において、ゲルは、３７℃の生理学的な温度で、１５分未満で形成する。幾つかの例において、ゲルは、３７℃の生理学的な温度で、３０分未満で形成する。幾つかの例において、ゲルは、３７℃の生理学的な温度で、４５分未満で形成する。幾つかの例において、ゲルは、３７℃の生理学的な温度で、１時間未満で形成する。幾つかの例において、ゲルは、インビボで、５分未満で形成する。幾つかの例において、ゲルは、インビボで、１０分未満で形成する。幾つかの例において、ゲルは、インビボで、１５分未満で形成する。幾つかの例において、ゲルは、インビボで、３０分未満で形成する。幾つかの例において、ゲルは、インビボで、４５分未満で形成する。幾つかの例において、ゲルは、インビボで、１時間未満で形成する。

１つの実施形態において、心臓は、最初に脱細胞化され、細胞外マトリックスのみを残す。その後、マトリックスは凍結乾燥され、すり潰され又は砕かれることにより細粉にし、及びペプシン又は他の酵素により可溶性にされる。酵素の例は、限定されないが、マトリックスメタロプロテアーゼ、コラゲナーゼ、及びトリプシンを含む。

１つの態様において、心臓の修復のための材料を送達する方法は：心臓組織に由来する、脱細胞化された細胞外マトリックスを含む、凍結乾燥された組成物を提供する工程；凍結乾燥されたマトリックスを殺菌する工程；液体の溶液を備える凍結乾燥されたマトリックスを可溶性にし、それにより材料を形成する工程；及び心臓の組織に材料を送達する工程を含む。幾つかの例において、マトリックスは、エチレンオキシドにより、又は放射により殺菌される。幾つかの例において、液体の溶液は、水、食塩水又は緩衝溶液である。幾つかの例において、送達は、例えば、経心内膜又は経冠状動脈カテーテルにより組成物が送達される場合、経皮的なものである。幾つかの例において、組成物を送達する工程は、心筋梗塞の約１〜３０日後に生じる。幾つかの例において、組成物を送達する工程は、心筋梗塞の少なくとも１か月又は少なくとも１年後に生じる。組成物を送達する工程は、心筋梗塞の約１〜２４時間後に生じる。幾つかの例において、組成物は、心筋梗塞、心筋梗塞の境界域、又は心筋梗塞から２ｃｍ以下以内に送達される。例えば、組成物を送達する工程は、心室の再構築を変更することができる。

ゲル治療用の実施例において、その後、溶液は中和され、ＰＢＳ又は食塩水を使用して、適切な濃度までもたらされる。１つの実施形態において、その後、溶液は、注射針によって心筋に注入することができる（例えば、カテーテルにより、骨により、又は開胸手順の間に）。針のサイズは、制限無しに、２２ｇ、２３ｇ、２４ｇ、２５ｇ、２６ｇ、２７ｇ、２８ｇ、２９ｇ、３０ｇ以下であり得る。１つの実施形態において、ゲルが注入される針のサイズは２７ｇである。送達はまた、バルーン注入カテーテル又は他の針を使用しないカテーテルによって生じ得る。体温で、その後、溶液はゲルへと形成され得る。

本明細書のまた別の態様において、心臓の組織を修復する方法は、被験体に、心臓の組織に由来する脱細胞化された細胞外マトリックスを含む組成物を注入又は移植する工程を含む。幾つかの例において、組成物は、心筋梗塞後の１か月以内に注入又は移植され、又は組成物は、心筋梗塞後の２週間以内に注入又は移植される。幾つかの例において、組成物は、心筋梗塞後の、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、１０日、２０日、４５日、２か月、３か月、４か月、６か月又は１年以内に注入又は移植される。幾つかの例において、組成物は、注入又は移植後の３か月、又は１か月以内に分解する。幾つかの例において、組成物は、注入又は移植後の６週、２か月、４か月、６か月又は１年以内に分解する。幾つかの例において、前述の組成物の注入又は移植は、先天性欠損を修復する。

他の例において、前述の組成物の注入又は移植は、前記被験体により維持される心臓の組織への損傷を防ぐ又は修復する。損傷は、心筋梗塞であり得る。幾つかの例において、前記修復は、心臓組織の損傷を有し且つ前記組成物の注入又は移植を行わない被験体と比較して、前記心筋梗塞の３カ月後の心室の量において、少なくとも２０％未満の変化を含む。幾つかの例において、前記修復は、心臓組織の損傷を有し且つ前記組成物の注入又は移植を行わない被験体と比較して、前記心筋梗塞の３カ月後の心室の量において、少なくとも５、１０、１５、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％未満の変化を含む。損傷は、心筋梗塞であり得る。幾つかの例において、前記修復は、心臓組織の損傷を有し且つ前記組成物の注入又は移植を行わない被験体と比較して、前記注入又は移植の３カ月後の心室の量において、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％未満の変化を含む。幾つかの例において、修復は、心臓組織の損傷を有し且つ前記組成物の注入又は移植を行わない被験体と比較して、前記心筋梗塞の３カ月後の駆出分画において、２０％の増加を含む。（駆出分画は、心室からの出力の効率を測定する心臓機能の測度である。）幾つかの例において、修復は、心臓組織の損傷を有し且つ前記組成物の注入又は移植を行わない被験体と比較して、前記心筋梗塞の３カ月後の駆出分画において、２０、３０、５０、７５、１００又は２００％より多くの増加を含む。

また別の実施形態において、ゲルは、梗塞領域、境界域、又は心筋単独に注入、或いは、内因性の細胞の内部成長、血管新生及び再生のための上述の成分と組み合わせて注入することができる。また別の実施形態において、ゲルはまた、単独で、或いは、心臓機械的性質を変更する及び／又は負の左心室の再構築を予防するためのマトリックスとして上述の成分と組み合わせて使用することができる。また別の実施形態において、ゲルは、細胞で単独により、或いは、心筋を再生成するための上述の成分と組み合わせて送達することができる。また別の実施形態において、ゲルは、単独で、或いは、不整脈を処理するために伝導ブロックを作成するための上述の成分と組み合わせて使用することができる。

例示的な方法において、組成物は、経心内膜の送達を使用して注入することができる。この実施例において、ＮＯＧＡ ｇｕｉｄｅｄ Ｍｙｏｓｔａｒ Ｃａｔｈｅｔｅｒは、電気機械の機能の三次元の心臓内のマップを作成するために使用することができる。３次元のマップを使用して、組成物の経心内膜の注入は、送達部位にて、又はその近くにて、或いは、心筋梗塞の部位にて実行することができる。

本明細書に記載の別の例示的な方法において、本明細書の組成物は、骨髄細胞の冠内の注入に類似する経冠状動脈の送達を使用して、注入することができる。この実施例において、過剰なワイヤー血管形成術用バルーンは、閉塞部位で膨張することができ、組成物は、ガイドワイヤールーメンによって注入することができる。

可溶性の試薬について、溶液は、限定されないが、０．５Ｍ、０．１Ｍ、又は０．０１Ｍの酢酸、或いは０．１ＭのＨＣｌ、又は所望の濃度のものを含む、低ｐＨ溶液においてもたらされ、その後、組織培養のため、組織培養プレート／ウェル、カバーグラス、又は他の表面／３Ｄ基質に入れられる。３７℃で１時間、又は室温或いは４℃で一晩中、インキュベータの中に入れた後、溶液を除去することができる。プレート／ウェルがＰＢＳによりすすがれた後、細胞は、吸着されたマトリックス上で培養され得る。溶液は、注射／移植の前、その間、又はその後に、ペプチド、タンパク質、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、薬物、栄養素、生存を促進する添加剤、プロテオグリカン、及び／又はグリコサミノグリカンと組み合わせることができる。

本明細書の試薬は、インビトロで心臓細胞外マトリックスのゲル及び吸着された形状の両方にて、細胞の付着及び生存を提供する。心臓細胞外マトリックスの可溶性の試薬の形状は、標準のプレートコーティングと比較して、新生児の心筋細胞に関するより速い拡散、より速い成熟、及び生存の改善を引き起こすために本明細書に示される。

幾つかの例において、本明細書で提供されるような組成物は、マトリックスを含み、細胞を含むことができる。細胞は、細胞の任意の種類であり得る。幾つかの例において、細胞は、以下に限定されないものを含む様々な心臓又は心血管の細胞である：自己由来又は同種異型の源に由来する、幹細胞、前駆天体、心筋細胞、血管細胞、及び繊維芽細胞。

ＥＣＭと細胞を含む本明細書の組成物は、ＥＣＭ中の細胞の培養により調製することができる。加えて、成長因子などのタンパク質が細胞外マトリックスに加えられる場合、タンパク質は組成物に加えられ、又はタンパク質分子は、マトリックス中の分子に共有結合的に又は非共有結合的に結合され得る。マトリックス分子へのタンパク質の共有結合の結合は、当該技術分野で既知の標準の共有結合のタンパク質結合手順によって達成され得る。タンパク質は、１つ以上のマトリックス分子に共有結合的に結合され得る。

１つの実施形態において、細胞を含む組成物を送達する場合、細胞は、自己由来、非自己由来、ＨＬＡに一致した、同種異型、異種間、又は自源性（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）由来のものを含む、心筋を処置するための細胞由来のものであり得る。従って、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、新生児の心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉細胞、自家移植された拡張した心筋細胞、及び脂肪細胞は、本明細書の組成物によって送達することができる。幾つかの例において、本明細書の細胞は、エキソビボで培養され、培養皿環境内で、心臓筋細胞、又は心臓筋細胞になり得る骨髄細胞のいずれかに直接分化することができる。その後、培養細胞は、組成物により、又はスキャフォールド及び他の成分に接触させて、哺乳動物に移植することができる。筋芽細胞は、別の種類の細胞であり、当該細胞は、心筋への移植に対して自身を与えるが、しかしながら、それらは、必ずしもインビボで心筋細胞へと発達するとは限らない。成体幹細胞は、本明細書の組成物の一部となり得る細胞のまた別の種である。成体幹細胞は、新しい部位で他の幹細胞（例えば、心筋に適切なもの）を生成することにより作用すると考えられ、又はそれらは、インビボで心筋細胞に直接分化する。それらはまた、心臓などの器官への導入後に、他の系列に分化し得る。別の例において、間葉系の幹細胞は、サイトカインを活性化することにより投与される。間葉細胞の部分母集団は、インビトロでサイトカイニンに曝露される時、筋原性の細胞株の方へ分化すると示された。

以下の一覧は、本発明の組成物の細胞の成分として使用され得る細胞のうちのいくつかを含む：ヒト胚性幹細胞、胎児の心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉性の幹細胞、自己移植された拡張した心筋細胞、脂肪細胞、全能細胞、多能性細胞、誘発された多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、成体幹細胞、骨髄細胞、間葉細胞、胚性幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、繊維芽細胞、筋線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性の細胞、内因性の細胞、幹細胞、造血幹細胞、多能性幹細胞、骨髄由来の前駆細胞、前駆細胞、心筋細胞、骨格の細胞、胎児の細胞、胚細胞、未分化の細胞、多くの効力のある前駆細胞、分化単能の前駆細胞、単球、心筋細胞、心臓の筋芽細胞、骨格の筋芽細胞、マクロファージ、毛状の内皮細胞、異種細胞、同種異型の細胞、成体幹細胞、出生後の幹細胞、及び分化転換によって生成された心筋細胞。本明細書で注目されるように、分化された細胞は、本明細書で提供される組成物の細胞の成分として使用され得る。分化された細胞の例は、心筋細胞、心臓の筋芽細胞、及び本明細書に記載の又は当該技術分野で既知の他の心臓の細胞を含む。前記細胞は、動物又は人の器官（例えば、心臓）から細胞を分離することにより得られ得る。前記細胞はまた、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、成体幹細胞、又は他の前駆細胞（例えば、心筋細胞の前駆細胞）の分化により得られ得る。分化の方法は、当該技術で既知である。前記細胞はまた、異なる細胞型の細胞の分化転換によってすべて得られ得る（例えば、骨髄細胞）。

ヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞は、心臓のマトリックスを含む本明細書の組成物上で成長することができる。幾つかの例において、本明細書の組成物の存在下で成長させられるｈＥＳＣ由来の心筋細胞は、よりインビボに類似した形態を提供する。幾つかの例において、本明細書の組成物の存在下で成長させられるｈＥＳＣ由来の心筋細胞は、成熟の増加したマーカーを提供する。

本発明はまた、不完全の、病気にかかった、損傷した、又は虚血の組織或いは器官を処置するため、被験体に、細胞、薬物、分子又はタンパク質を送達するための、脱細胞化された心臓の細胞外マトリックスを含む、薬物送達システムに関連付けられる。１つの実施形態において、脱細胞化された心臓の細胞外マトリックスを単独で、又は他の成分と組み合わせて含む生体適合性の材料は、非破壊的な伝導ブロックとして不整脈の処置に使用される。生体適合性の材料はまた、細胞を移植するために使用され、或いは、本来の細胞を補充する又は薬物送達ビヒクルとして作用するために、単独で注入され得る。本明細書の薬物送達システムは、細胞、薬物、タンパク質、或いは、限定されないが、エリトロポイエチン、幹細胞刺激因子（ＳＣＦ）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、軟骨成長因子（ＣＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）、骨格成長因子（ＳＧＦ）、骨芽細胞由来の成長因子（ＢＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、サイトカイニン成長因子（ＣＧＦ）、幹細胞刺激因子（ＳＣＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、内皮細胞成長補足（ＥＧＧＳ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、成長分化因子（ＧＤＦ）、インテグリンを変調する因子（ＩＭＦ）、カルモジュリン（ＣＡＭ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、組織阻害剤マトリックスメタロプロテアーゼ（ＴＩＭＰ）、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、インテグリン、コラーゲン、エラスチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、ヘモネクチン（ｈｅｍｏｎｅｃｔｉｎ）、トロンボスポンジン、ヘパラン硫酸、デルマタン（ｄｅｒｍａｎｔａｎ）、硫酸コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）（ＣＳ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ビトロネクチン、プロテオグリカン、トランスフェリン、サイトタクチン、テネイシン、及びリンホカインから成る群から選ばれた他の生体適合性の材料を含む。

組織培養プレートは、心筋細胞又は心臓の修復に関連する他の細胞タイプを培養するために、本発明の細胞外マトリックスのゲル形状、或いは、本発明の細胞外マトリックスの吸着された形状のいずれかにより、コーティングすることができる。これは、これら細胞を育てるための研究試薬として、又は移植前に細胞を培養するための臨床の試薬として使用することができる。細胞外マトリックス試薬は、他の組織マトリックス及び細胞に適用することができる。

ゲル試薬について、溶液のｐＨは、約６〜約９のｐＨの方にもたらされ得る。幾つかの例において、ｐＨは、約７．４の生理学的なｐＨにまでもたらされる。その後、ゲルは、ＰＢＳ／食塩水又は他のバッファーを使用して適切な濃度までもたらされ、次に、組織培養プレート及び／又はウェルに入れられる。一旦３７℃のインキュベータに入れると、溶液は、細胞培養のため、任意の２Ｄ又は３Ｄの培養基質に使用することができるゲルを、形成することができる。１つの実施形態において、ゲルは、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｅ）、ホルムアルデヒド、ビス−ＮＨＳ分子、又は他の架橋剤により架橋結合し、又は、細胞、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、薬物、栄養素、生存を促進する添加剤、プロテオグリカン、及び／又はグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｌｙｃａｎｓ）と結合され、或いは、更なる使用のため、合成ポリマーと結合及び／又は架橋結合され得る。

本発明は、以下の工程を含む、吸着されたマトリックス上の細胞を培養する方法をさらに提供する：（ａ）限定されないが、０．５Ｍ、又は０．０１Ｍの酢酸、或いは、所望の濃度までの０．１ＭのＨＣ１を含む低ｐＨ溶液中で、本発明の生体適合性の材料を含む溶液を提供する工程、（ｂ）組織培養プレート又はウェルに前記溶液を入れる工程、（ｃ）３７℃で１時間、又は室温或いは４℃で一晩中など、前記組織培養プレート又はウェルをインキュベートする工程、（ｄ）前記溶液を除去する工程、（ｅ）前記組織培養プレート又はウェルをＰＢＳですすぐ工程、及び（ｆ）吸着されたマトリックス上で細胞を培養する工程。本発明の心臓細胞外マトリックスを含む、吸着されたマトリックス上で培養され得る細胞は、心筋細胞、又は、心臓の修復に関連する他の細胞タイプである。

幾つかの例において、組成物は、以下に限定されないものを含む架橋剤を含む：共通のコラーゲン架橋剤、ＨＡ架橋剤、又は変更された分解及び機械的性質を備えた他のタンパク質架橋剤。

１つの例において、本明細書の組成物を作る方法は、電気回転を含む。幾つかの例において、本明細書の方法は、ナノファイバーのサイズ、形状、又は厚みを調節するように構成される。

幾つかの例において、本明細書の組成物は、微小ビーズを包含し得る。微小ビーズは、組成物の一部であり得るか、又は組成物によって送達され得る。例示的な微小ビーズは、例えば、天然又は合成の材料の任意の種類であり得る。幾つかの例において、微小ビーズは、種々の分解特性を有し、例えば、ＭＭＰ阻害剤、増殖因子、又は小分子を含むことができる。

幾つかの例において、組成物は、組成物が送達される場合、接着剤又はアンカーとして作用し得る生物学的な基を含むことができる。

１つの例において、本明細書の組成物は、例えば、傷の修復のために、例えば生体付着性であり得る。幾つかの例において、本明細書の組成物は、細胞粘着性のものとして構成され得る。例えば、本明細書の組成物は、医療デバイス、又は、細胞を含む又は含まない生物学的なデバイスにより、コーティング又は混合され得る。例えば、本明細書の組成物は、合成ポリマー人工血管のためのコーティングであり得る。幾つかの例において、組成物は抗細菌性であり、又は抗菌剤が含まれ得る。

本明細書の方法は、傷の修復デバイスとして、組成物を送達する工程を含むことができる。例えば、心臓の切除後、組成物は、治療を改善するために送達することができる。

１つの例において、本明細書の組成物は、本明細書に記載されるようなＥＣＭ組成物でコーティングされるアルギンビーズを含む。

幾つかの例において、組成物は注入可能である。注入可能な組成物は、制限無しで、粉末、液体、微粒子、フラグメント、ゲル、又は乳濁液であり得る。注入可能な組成物は、心臓に注入され、又は多くの例において、心臓の左心室、右心室、左心房、右心房又は弁に注入され得る。本明細書の組成物は、例えば、制限無しで、内皮、平滑筋、心臓の前駆天体、筋線維芽細胞、幹細胞、及び心筋細胞を補充することができる。

本明細書の組成物を作る方法は、任意の年齢の動物又はヒトからの組織を脱細胞化する工程を含み得る。

本明細書の方法は、ＥＣＭを含む組成物の送達を含む。例示的な方法は、限定されないが：手術中の直接注入；胸壁を通じる直接注入；心内膜を通じた心筋へのカテーテルによる送達；冠状動脈の血管を通る送達；及び注入バルーンカテーテルによる送達を含む。

幾つかの例において、本明細書の組成物はコーティングである。コーティングは、研究及び臨床の両方のため、組織培養の適用に使用することができる。コーティングは、例えば、制限無しで、合成又は他の生物学的なスキャフォールド／材料をコーティングするため、或いは、移植するために使用され得る。幾つかの例において、コーティングは、テクスチャー処理される（ｔｅｘｔｕｒｉｚｅｄ）、又はパターン化される。幾つかの例において、コーティングを作る方法は、吸着又は化学的結合を含む。薄いゲル又は吸着されたコーティングは、組成物の溶液形状を使用して形成することができる。

本開示は、以下の実施例によってさらに例証され、その範囲に対する印象的な制限として、任意の方法で解釈することはできない。様々な修正及び変更が可能であり、本発明の範囲内で熟慮されることは、当業者にとって明白である。

〈実施例１〉
この研究の目的は、インビボでの細胞の粘着、成長、成熟及び送達のための成長プラットフォームとしてゲルの使用を試験することである。本来の心臓細胞外マトリックス組織からなるゲルが、細胞生存の促進により心臓の組織再生を援助できることが規定される。

メスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを安楽死させ、それらの心臓を脱細胞化した。その後、脱細胞化された心臓を凍結乾燥し、再水和し、粉砕し、再び凍結乾燥して、乾燥粉末を形成した。凍った心臓を水で再水和し、その後、液体窒素に浸した。一度冷凍して、心臓を、１０秒間７０ｐｓｉで、ボールとカップの器具内で系統的に砕いた。砕かれた心臓粒子をその後凍結して乾燥させた。一度乾燥して、凍結乾燥された心臓組織を、１％のペプシンと組合せ、１０ｍｇ／ｍＬの濃度にまで０．０１Ｍ ＨＣｌと合わせた。溶液を室温で４８時間攪拌し、細胞外マトリックス組織の可溶化を可能にした。４８時間後、ＨＣｌ溶液を氷の上のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブへ分注し、ｐＨ７．４まで０．１Ｎ ＮａＯＨで中和した。

上述の方法により、本来のネズミの心臓のＥＣＭゲルを形成した。材料の増加した粘着性の性質によって確認されるように、２．５−８ｍｇ／ｍＬのゲルの成功したゲル化が、１５分以内に生じた。増加した強度を、より高い密度のゲルで観察した。ｐＨを調整した溶液を、１ｘＰＢＳによる濃縮のために希釈し、ウェルにつき５０μＬで９６ウェルプレート上に播種し、その後、３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベータに移した。ゲルを形成後、１００μＬの分離された２ｄ新生児の心筋細胞を、ウェルにつき６０，０００の細胞で、ゲルの上にピペットで移した。数日後に、細胞をゲルへの付着のため検査した。

１ｘ１０^４で心臓のＥＣＭゲル上での心筋細胞の播種は、ＥＣＭに対して、細胞の成功した付着及び生存を示した。細胞を、４日までの間、ＥＣＭの上で培養した。

１００ｍＬの心臓のＥＣＭ溶液（７ｍｇ／ｒｎＬ）を、３０Ｇの針により、麻酔をかけられたネズミのＬＶ自由壁に注入した。要するに、研究は、生理学的なｐＨ及び温度にもたらされた時、本来の心臓細胞外マトリックスを分離し、可溶性にし、ゲルへと自己組織化することができることを示す。

〈実施例２〉
ここで、細胞コーティングの使用を、脱細胞化され可溶性にされた成人の心室の本来の心臓細胞外マトリックスのために調査した。利点は、本来の心臓ＥＣＭが、従来の細胞コーティングより多くの成分を有し、他の細胞タイプによる前処理よりも容易に、使用するために利用可能であり得ることである。

心臓を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから除去し、脱細胞化した。脱細胞化された心臓を凍結乾燥し、再水和し、液体窒素中で冷凍した後に粉砕した。その後、ＥＣＭを、０．１Ｍ ＨＣ１中のペプシンにおいて消化した。消化の４８時間後、０．０１Ｍの酢酸を加え、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度にまで希釈した。

本来の心臓ＥＣＭのペプシン消化は、ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｒｏｌ）（ＤＴＴ）を使用して還元条件における垂直のゲル電気泳動を行い、ラミニン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びｃａｌｆ ｓｋｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ（Ｓｉｇｍａ）と比較した。ゲルを、Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ （Ｐｉｅｒｃｅ）で染色した。コラーゲンとラミニンを比較した時、本来の心臓ＥＣＭは、ＥＣＭ成分のより複雑な混合物を実証することができる。

心臓の筋細胞を、分離キット（Ｃｅｌｌｕｔｒｏｎ， Ｈｉｇｈｌａｎｄ Ｐａｒｋ， ＮＪ）を使用して、生後１〜２日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの心室から回収した。最初の上澄みを廃棄したが、後に２０分消化されたものを漉し（ｓｔｒａｉｎｅｄ）、１７％のＭ１９９、１０％のウマ血清、５％のウシ胎仔血清、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンで補われたＤＭＥＭ内で懸濁した。分離後、上澄みを、組織培養ポリスチレン皿上にあらかじめ播種し、繊維芽細胞の選択的接着を通じて心筋細胞の純度を増加させた。

１ｍｇ／ｍｌの本来の心臓のＥＣＭ又はコラーゲンＩ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）のいずれかを、３７℃で１時間、組織培養４８−ウェルプレート上に吸収した。分離された新生児の心筋細胞を、２００，０００／ｃｍ^２の密度で播種し、２４時間後、培地を低い血清維持培地に変更した（ＤＭＥＭ、１８．５％のＭ１９９、５％のＨＳ、１％のＦＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン）。細胞培養を、３７℃及び５％の二酸化炭素で維持し、毎日監視し、新しい培地を２−３日ごとに加えた。培養を２日目、４日目、及び７日目で固定し、アルファアクチニン、コネキシン４３、Ｐａｎ−カドヘリン、アクチン及び核のために染色した。心筋細胞は、２日目の培養中に自発的に拍動し始めた。コラーゲン上で培養された細胞は、８日目でプレートから分離し始めた。本来の心臓ＥＣＭの上で培養された１セットの細胞は、４５日目まで拍動し続けた。コラーゲン上で培養された細胞はすべて、１４日目で拍動を止めた。

本来の心臓のＥＣＭは、他の標準の細胞培養コーティングと比較した時に、より複雑な成分を含有していることが、この研究によって示された。細胞培養のためのコーティングとして本来の心臓ＥＣＭに付けられた新生児のネズミの心筋細胞は、自発的に拍動し始めた。本来の心臓のＥＣＭの上で培養された心筋細胞は、アクチニンの増加、コネキシン４３、及び経時的なＰａｎ−カドヘリン染色を実証した。また、新生児の心筋細胞は、コラーゲンと比較して、本来の心臓ＥＣＭの上の生存性及び付着を増加させた。

〈実施例３〉
左の下行前動脈の閉塞によって、虚血−再かん流モデルを２５分使用して、心筋梗塞をネズミに引き起こした。１週間後ＭＩにて、基線機能をＭＲＩ画像から計算した。ブタの心筋のＥＣＭを、小片中で、数日間１％のＳＤＳにおいて脱細胞化し、その後、一晩中ＤＩリンスを行い、凍結乾燥及び粉砕を行い、粉末を作成した。消化を、ペプシンを備えた０．１ＭのＨＣ１中で行い、材料の可溶化した形態を作成した。

可溶化したＥＣＭを、１Ｍ ＮａＯＨを使用してｐＨ７．４にまでもたらし、注入前に６ｍｇ／ｍＬのＰＢＳで希釈した。ＭＩ手術後、動物を２つのグループに無作為化し、ＥＣＭ又は食塩水を、梗塞手術の２週間後に３０Ｇの針により、オスのＳｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙネズミのＬＶ自由壁に注入した。

注入手術の４週間後（ＭＩの６週間後）に、心臓機能を、ＭＲＩを使用して再び評価した。

ＥＣＭを注入された動物は、６週目にて維持されていた機能（駆出分画に基づいて評価されたように）を示し、一方、食塩水を注入された動物は、心臓機能を維持しなかった。
拡張終期及び収縮終期の容積も、ＥＣＭを注入された動物において保存した。

〈実施例４〉
現在、幹細胞及び他の細胞タイプは、２７Ｇのカテーテルによる心筋の壁への送達による心不全の処置のための、臨床試験中にある。ブタの心室の組織を、ＳＤＳ洗剤を使用して脱細胞化し、マトリックスの可溶化された形態を形成するために処理し、生理学的なｐＨにまで中和し、注入のため６ｍｇ／ｍＬまで希釈した。

２頭のヨークシャー種のブタは、コイルにより引き起こされた（ｃｏｉｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ）心筋梗塞を受け、梗塞の２か月後に、心筋のマトリックスを単独で又は細胞と共に注入した。

胎児の心臓の外植片に由来したものを、組織学的な同定のために、蛍光染料、細胞質の汚染である１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物（ＤｉＩ）により予め標識化した。げっ歯類モデルにおけるｈＥＳＣ生存を向上させると示された、生存促進性のカクテルを使用した。

マトリックス単独、又は細胞を備えたマトリックスを、ＮＯＧＡマッピングによって誘導されるように、カテーテルを通じて３０秒につき０．２ｍＬの臨床的に適切な割合で注入した。０．１ｍＬの５つの注入を各々、梗塞の境界部領域へと、マトリックス単独、又は細胞を備えたマトリックスで行った。

マトリックス単独、又は細胞を備えたマトリックスを、狭いカテーテルを妨げることなく、最小に侵襲的に、ブタの心臓に上手く注入することができた。

〈実施例５〉
ブタの心室の心筋を脱細胞化し、細胞除去を、冷凍されたばかりの脱細胞化した組織切片のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）の染色によって確認する。この脱細胞化手順に従い、ＥＣＭを凍結乾燥し、その後、粉砕して微細な微粒子にする。心筋のＥＣＭ粉末を、タンパク質とプロテオグリカンの同定を可能にする、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して特徴づけた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは様々なＥＣＭタンパク質を明らかにし、脱細胞化の後に保持されたタンパク質含有量を示した。ＥＣＭタンパク質、糖タンパク質、及び同定されたプロテオグリカンは：Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、及びＶＩ型のコラーゲン、エラスチン、フィブリノーゲン、ルミカン、パールカン、フィビュリン及びラミニンを含む。脱細胞化された心筋のＥＣＭ内でのこれらの成分の同定は、タンパク質とプロテオグリカンの保持された複合体の組み合わせを示す。

組成物の注入可能な形態を生成するために、脱細胞化されたマトリックス粉末を、酵素消化により可溶化する。マトリックスを、定常性の攪拌下で４８時間消化させる。可溶化した製品のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量が、マトリックスの１ｍｇ当たり２３．２±４．６３μｇであったことを測定した。

〈実施例６〉
液体の組成物を、ＮａＯＨと１０ＸのＰＢＳの追加により生理学的なｐＨまでもたらし、ＩＸ ＰＢＳにより、その終濃度にまで希釈した。この時点で、製品をすぐに使用し、又は凍結乾燥し、冷凍保存し、使用前に滅菌水により再水和することができる。

組成物は、隔膜の壁及びＬＶ自由壁の全体にわたって、２５の注入部位（各部位０．２ｍＬ）へのインビボの経心内膜の心臓の注入時に、ヒドロゲルへと自ら集まる（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｓ）。ＬＶ自由壁及び隔膜の壁内でのマトリックスの検出は、インビボでのマトリックスのゲル化と同様に、心筋への成功した送達を確認した。材料は、衛星器官（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｏｒｇａｎ）において観察されなかった。

〈実施例７〉
実施例５及び６に従って調製された組成物（この実施例において「組成物」と称する）を、本実施例において使用した。組成物（ｎ＝６）又は食塩水（ｎ＝６）を、梗塞の２週間後に、メスのＳｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットのＬＶ自由壁に注入した。磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を使用し、前処置の基線として、ＭＩの１週間後に、及びＭＩの６週間後に、心臓機能及びＬＶ幾何学を評価した。注入後の４週間でのＬＶ容積及び駆出分画の両方は、組成物を注入された動物における基線測定と統計的に等しいままであったが、一方で、その両方は、表１で実証されるような食塩水の対照動物（ｓａｌｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｉｍａｌ）において悪化した。注入後の４週間でのＬＶ容積及び駆出分画は、注入された動物における基線測定と統計的に等しいままであったが、一方で、その両方は、食塩水の対照動物において悪化した（図３）。図３は、食塩水（ａ、ｂ）並びに組成物（ｃ、ｄ）の、注入前及び注入後を実証する（基線と比較して＊Ｐ＜０．０５；§Ｐ＝０．０５４）。ＥＦと容積において変更された割合において、改善の傾向もあった。

〈実施例８〉
ブタの心室の心筋を脱細胞化し（図４Ａ）、細胞除去を、凍結されたばかりの脱細胞化された組織切片のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）の染色によって、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２による染色、及びＤＮＥａｓｙキットによって確認する。この脱細胞化手順の後、ＥＣＭを凍結乾燥し、その後、粉砕して、微細な微粒子にする（図４Ｂ）。心筋のＥＣＭ粉末を、タンパク質とプロテオグリカンの同定を可能にする、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して特徴づけた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは様々なＥＣＭタンパク質を明らかにし、脱細胞化の後に保持されたタンパク質含有量を示した。ＥＣＭタンパク質、糖タンパク質、及び同定されたプロテオグリカンは、制限無しで：Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、及びＶＩ型のコラーゲン、エラスチン、フィブリノーゲン、ルミカン、パールカン、フィビュリン及びラミニンを含む。これらの成分の同定は、タンパク質とプロテオグリカンの保持された複合体の組み合わせを示す。

注入可能な形態を生成するために、脱細胞化されたマトリックス粉末を、酵素消化により液体へ処理する。マトリックスを、定常性の攪拌の下で４８時間消化させ、液体をもたらす。完全な消化を、ゲル電気泳動を備えた低分子量の種の存在と同様、溶液（図４Ｃ）中の可視の粒子の不足によって確認する。幾つかの例において、本明細書の組成物は、核／ＤＮＡを欠き、２０ｋＤａ未満の分子量バンドを有し、１５−２５μｇ（ｍｇ）のマトリックス間のＧＡＧ含有量、及び消化の４８時間後の可視の粒子の不足を有する。液体を、ＮａＯＨと１０ＸのＰＢＳの追加により生理学的なｐＨまでもたらし、ＩＸ ＰＢＳによりその最終濃度（６ｍｇ／ｍＬ（適切なゲル化の特徴のために既に最適化された））にまで希釈する。この時点で、製品をすぐに使用し、又は凍結乾燥し、冷凍保存し、使用前に滅菌水により再水和することができる。ゲル化をインビトロで引き起こすために、その溶液を、３７℃までもたらし、それは、本来のＥＣＭとして規模と構造において類似する、多孔性及び繊維状のスキャフォールドを形成する（図４Ｄ）。あるいは、材料をまた、ヒドロゲルへと自己組織化するインビボにて注入することができる。本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者には明らかであろう。

多数の変更、変化及び代用は、発明から逸脱することなく、現在当業者に思い浮かばれるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行する際に利用され得ることを理解されたい。以下の請求の範囲が本発明の範囲を定義するものであり、これら請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内の方法及び構造が、それによって包含されることが意図される。

Claims (13)

1. 心臓の組織に由来する消化され脱細胞化された細胞間マトリックスを含む組成物であって、
   前記組成物は当該組成物の１ｍｇ当たり約５乃至約２５μｇの範囲の濃度のグリコサミノグリカンを含み、
   前記組成物は、消化され脱細胞化された細胞間マトリックスを含む、凍結乾燥されたパウダーから再構成されてなる、ことを特徴とする組成物。
2. 内因的な心筋細胞および心臓の細胞の生存を促進する、水、発育因子、合成ポリマー、天然由来のポリマー、セルロース、アルギナート、生物学的適合性の金属又は要素を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物はさらに少なくとも１つの消化酵素を含む請求項１に記載の組成物。
4. 前記少なくとも１つの消化酵素はペプシンである請求項３に記載の組成物。
5. 前記少なくとも１つの消化酵素はマトリックスを切断して、２０℃を超える温度でゲル化し、或いは前記少なくとも１つの消化酵素はマトリックスを切断して、約３０分未満でゲル化する請求項３に記載の組成物。
6. 消化され脱細胞化された細胞間マトリックスは３００未満ｋＤａの分子量の材料を含む請求項１に記載の組成物。
7. 消化され脱細胞化された細胞間マトリックスは２０未満ｋＤａの分子量の材料を含む請求項１に記載の組成物。
8. 前記組成物は当該組成物の１ｍｇ当たり約１０乃至約２０μｇの範囲の濃度でグリコサミノグリカンを含む請求項１に記載の組成物。
9. 心臓の組織に由来する、消化され脱細胞化された細胞間マトリックスを含む組成物を製造する方法であって、
   ａ．脱細胞化された細胞間マトリックスを得るために細胞外マトリックス成分および非細胞外マトリックス成分を持っている心臓の組織試料を処理する工程；
   ｂ．脱細胞化された細胞間マトリックスを凍結乾燥し微粉砕してパウダーにする工程；
   ｃ．液体中の脱細胞化された細胞間マトリックスを含む組成物を生成する工程；
   ｄ．マトリックス減成酵素を使用して、脱細胞化された細胞間マトリックスを消化する工程；
   ｅ．消化され脱細胞化された細胞間マトリックスのｐＨを中和する工程；及び
   ｆ．消化され脱細胞化された細胞間マトリックスを凍結乾燥する工程、
   を含んでなる、心臓の組織に由来する、消化され脱細胞化された細胞間マトリックスを含む組成物を製造する方法。
10. 前記組成物は当該組成物の１ｍｇ当たり約５乃至約２５μｇの範囲の濃度でグリコサミノグリカンを含む請求項９に記載の方法。
11. 前記組成物は当該組成物の１ｍｇ当たり約１０乃至約２０μｇの範囲の濃度でグリコサミノグリカンを含む請求項９に記載の方法。
12. 請求項９乃至１１のいずれか１項に記載の方法で製造された組成物。
13. 筋細胞挙動をインビトロで評価する方法であって、
    ａ．細胞間マトリックス上で筋細胞を平板培養する工程；及び
    ｂ．コラーゲン・タイプ（Ｉ）上に平板培養された筋細胞と比較したとき、アクチニン、コネキシン４３およびｐａｎ−カドヘリンの少なくとも１つで染色の増加が存在するか否かを判断する工程、
    を含んでなる筋細胞挙動を生体外で評価する方法。